JPH0378375B2 - - Google Patents

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JPH0378375B2
JPH0378375B2 JP56089420A JP8942081A JPH0378375B2 JP H0378375 B2 JPH0378375 B2 JP H0378375B2 JP 56089420 A JP56089420 A JP 56089420A JP 8942081 A JP8942081 A JP 8942081A JP H0378375 B2 JPH0378375 B2 JP H0378375B2
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JP
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plasminogen
pharmaceutical composition
thrombolysis
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activated product
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Desire J Collen
Dingeman C Rijken
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Katholieke Universiteit Leuven
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    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は血栓溶解活性を持つ薬剤、特に細胞培
養体から分離され、かつ比較的大規模で製造され
得る、新規なプラズミノゲン活性化物
（Plasminogen Activator）を有効成分として含
有し、かつ凝固の不調、特に血栓塞栓症を治療す
るのに用いることができる血栓溶解用医薬組成物
に関する。 外科手術、分娩、大きい外傷、及び伝染性の疾
病が血栓症即ち血管内に血液の塊を形成する危険
の増大につながることは周知である。 坑凝血剤たとえばヘパリン、クマリン誘導体、
蛇毒成分あるいはインダンジオールなどを投与す
ることによつて血塊の形成を阻止することを試み
てもよい。しかしながら、血栓症が生じた後は、
形成された血塊を溶解（リーシス）して血管から
除去せしめる機能を有する血栓溶解剤を用いるこ
とになろう。 以下の理解をより良くするため、血塊は酵素ト
ロンビンの作用によつてフイブリノゲンから形成
されたフイブリンで構成されていることを特記す
る。正常な血液はプラズミノゲンを含んで居り、
これはプラズミンに活性化された後にフイブリン
を溶解してそれを酵素作用によつて分割する能力
をもつている。プラズミノゲン活性化物は通常の
血液中に天然に存在するかまたは血液中へ放出さ
れて、循環する血液は血管内に血塊が生ずれば直
ちにこれを崩壊させて取除くために必要なすべて
の含有物を含むようになる。しかし、実際には身
体の自己血栓溶解の潜在能力はこの目的には不充
分なことが多いように思われる。即ちそれは少く
とも部分的には血中のプラズミノゲン活性化物の
不充分な濃度に起因すると云える。このことは、
血管内の血栓を適切に除去するには体外から投与
された血栓溶解剤の使用を必要とすることがある
ことを意味する。 今日まで、尿からまたは培養腎細胞から分離さ
れたプラズミノゲン活性化剤であるウロキナーゼ
を主とし、かつストレプトコツキから採つたプラ
ズミノゲン活性化剤であるストレプトキナーゼが
血栓溶解剤として用いられて来た。両剤とも比較
的大規模に製造することができ、そして今日では
多用されている。しかし、ウロキナーゼもストレ
プトキナーゼも血液から採つた正常のプラズミノ
ゲン活性化物とは異るものであり、またそれらは
フイブリンに対して特殊な親和性を持つていない
ので、血栓症の治療におけるウロキナーゼ及びス
トレプトキナーゼの使用結果はすべての点で満足
ではない。所望の効果を得るためにはこれらの薬
剤を比較的大用量に必要とし、そしてこのことは
フイブリノゲン溶解とか内出血などの副作用の高
い危険率につながる。このようなわけで、比較的
大規模にも製造できて血栓症を治療するるのに一
層効果がある血栓溶解活性のある薬剤及び物質に
対する恒常的な必要性がある。 本発明の目的は血液から採つた正常のプラズミ
ノゲン活性化物と強い関係を持ち、大規模で提供
できかつ血栓症の治療について以前の薬剤よりも
効力の大きい血栓溶解活性のある組成物を製造す
ることである。 本発明の基盤を形成した研究中に、驚くべきこ
とに血液から得たプラズミノゲン活性化物と極め
て同様のプラズミノゲン活性化物を人間の黒色腫
細胞（melanoma cells）の培養液からかなり多
量に分離することができることが見出された。黒
色腫細胞は着色した腫瘍細胞であり、これを細胞
培養の形で連続的に培養し、それによつて比較的
大きい割合のプラズミノゲン活性化物を分泌させ
る。これによつて細胞が分泌したプラズミノゲン
活性化物を比較的大規模に製造する機会が得られ
る。得られる活性化物はいくつかの点で血液活性
化物と緊密に関係があるように見えるが、ウロキ
ナーゼやストレプトキナーゼのような公知の物質
とは関係が薄い。このことはこれを薬剤に利用す
ることについて良好な見込を与えるものである。
新規な活性化物について、実験中に事実強力な血
栓溶解効力が見出され、そしてウロキナーゼを用
いるよりも少い用量で充分であると思われ、また
副作用も実質的にないように思われた。その結果
として、新規な活性化物を含む組成物は血栓症疾
患の治療に利用して良好な結果を得ることができ
る。 それゆえ、本発明は第一に人間の黒色腫細胞か
ら得たプラズミノゲン活性化物を提供する。更に
このプラズミノゲン活性化物の有効量を含有する
血栓溶解活性性薬剤を提供する。また本発明は活
性化物の製造及び精製の方法、組成物の製造方
法、及び新規組成物を用いて血栓症状の治療の方
法を提供する。 いくつかの型の腫瘍細胞は細胞培養の培養中に
プラズミノゲン活性化物を分泌することは知られ
ていた（クライストマンらによる「哺乳動物の細
胞及び組織におけるプロテイナーゼ」（A.J.バレ
ツト版）91−149頁、エルゼヴイエル、アムステ
ルダム）。しかしこれらのプラズミノゲン活性化
物の大がいはウロキナーゼと関係があり（フエツ
テルラインらによるジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー誌、254、575−578（1979）
参照）、そして更に、それらはこれまでまだ充分
な量で分離されなかつた。それゆえ、細胞培養中
の人間の黒色腫細胞が血液中を循環する活性化物
と緊密に連係のあるプラズミノゲン活性化物を分
泌すること、またその上、それらが活性化物を大
規模に回収しかつ精製できるような量で分泌する
ことは、驚くべきことであつた。 本発明によるプラズミノゲン活性化物は適当な
成育媒体中で人間の黒色腫細胞を培養し、活性化
物を含む培養液を回収し、得られる液を精製する
ことによつて製造することができる。 得られる培養液の精製は原則として任意の適当
な方法で行なつてよいが、これには蛋白質化学に
おいて通常である各々の分離方法を含む。例えば
塩、有機溶剤またはポリエチレングリコールなど
を用いる分別沈澱法、異つた緩衝液及び担体を用
いる電気泳動法、架橋結合したデキストラン、架
橋結合したあるいは架橋結合しないアガロース、
架橋結合したポリアクリルアミド、またはそれら
の混合物などによるゲル過、及び仕切りまたは
吸着／脱着に基づく他のクロマトグラフイー操作
などである。後者の操作はバツチ方式あるいはカ
ラムで行なつてよい。仕切クロマトグラフイまた
は吸着／脱着クロマトグラフイは例えばイオン交
換、疎水性相互反応、配位子交換または生物特異
的親和性の方法で行なつてよい。これらの方法に
おいては、ゲル過に対すると同じ媒体を静相と
して用いてもよいが、粒子の内表面または外表面
に適当な基をつけてする。無機または有機塩、有
機溶媒、表面活性剤、及び／または分離系の１つ
以上は干渉する物質、のようないくつかの添加物
を含む水性緩衝物を可動相として用いてもよい。 好ましい実施態様においては、好ましくは金属
キレート・アガロースを静相として用いて、配位
子交換クロマトグラフイを用いる。たとえば、精
製するべき液をPH7.5で亜鉛キレート・アガロー
スのカラムに通すと、吸着されたプラズミノゲン
活性化物がイミダゾール含有緩衝液で溶出でき
る。亜鉛キレート・アガロースはイミノジ酢酸を
アガロースと結合させて生成物を塩化亜鉛で飽和
させることによつて製造してもよい。カラムを利
用すればバツチ方式よりも良い結果が得られる。
他の好ましい実施態様においては、前記の実施態
様に加えてまたはその代わりに、好ましくはレク
チン・アガロースを静相として用いて、親和クロ
マトグラフイーを用いる。例えば、精製するべき
液をPH7.5でレクチン・アガロースのカラムに通
すと、吸着されたプラズミノゲン活性化物が、α
−Ｄ−メチルマンノシド及びチオシアンカリを含
む緩衝液で、同じPHで溶出する。 主として最終段階として用いられる第３の好ま
しい態様は、好ましくは架橋結合したデキストラ
ン粒子上で、ゲル過によつて形成される。 これらの精製方法においては、プラズミノゲン
活性化物がガラス器の表面に吸着する強い傾向を
防止するため及び製品の安定度を増進させるため
に用いるすべての緩衝液に表面活性剤または洗剤
を加えることがすゝめられる。最終濃度0.01パー
セント（容積比）あるいは0.001パーセント（容
積比）の非イオン性洗剤で良好な結果が得られて
いる。これらの非イオン性洗剤は主として脂肪酸
アルコールのポリグリコールエーテル、アルキル
フエノールのポリグリコールエーテル、または脂
肪酸のポリグリコールエステルから成る。 更に、かような操作中にプラズミノゲン活性化
物の劣化を防止するためにアプロチニンの存在
下、これらの精製方法、ならびに黒色腫細胞の最
初の培養を行なうことがすゝめられる。アプロチ
ニンは牛の膵臓組織から分離された高分子量トリ
プシン阻止剤である。それは下記のようにプラズ
ミノゲン活性化物の分子量に影響を与えるように
思われる。 記述したような精製方法を利用することによつ
て良好な精製ならびに特殊な活性の明瞭な増大を
達成することができ、そして精製物は固定試験用
に及び薬剤への転化に適するものとなる。 黒色腫細胞から生成したプラズミノゲン活性化
物は、SDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
法で測定した場合、非還元形態で約72000の分子
量を持つように思われる。還元形態では、培養及
び精製がアプロチニンの不在下で行なわれた場
合、それぞれ約33000及び約39000の分子量を持つ
２つの帯域を示すか、あるいは培養及び精製がア
プロチニンの存在下で行なわれた場合、約72000
の分子量を持つ１つの帯域を示すことがある。最
初の生成物は蛋白質加水分解の劣化物のようであ
るが、後者は天然物である。かように、アプロチ
ニンは活性化物分子の劣化を防止すると思われ
る。 アプロチニンの不在及び存在下に製造された活
性化物のアミノ酸組成物はそれぞれ第１表及び第
３表に掲げてあり、大きい類似性を示す。更に、
生成するプラズミノゲン活性化物は強くフイブリ
ンに結合するようである。 これらの性質すべての結果、新規なプラズミノ
ゲン活性化物は人間の血液から得た正常のプラズ
ミノゲン活性化物に極めて類似していると述べる
ことができる。 免疫学的な点では、新規な活性化物はウロキナ
ーゼとは相異を示す。 試験管中で発生させた血塊での実験中は、黒色
腫細胞からのプラズミノゲン活性化物はウロキナ
ーゼよりも高い繊維素溶解及び血栓溶解効果を持
ち、その上より低いフイブリノゲン溶解の副作用
を持つように思われる。このことは新規なプラズ
ミノゲン活性化物が血栓溶解組成物として利用す
る上にウロキナーゼよりも一層適当であることを
示している。 精製されたプラズミノゲン活性化物から通常の
方法で、塩化ナトリウム、グルコース、マンニト
ール、アルブミンの添加物を用いまたは用いない
で、ガレヌス組成物を作ることができる。組成物
は大がい、静脈内または動脈内注射または注入を
含む非経口投与に適する。 生成した組成物は適当な用量で患者に投与して
よく、そして副作用が少いかまたはない潜在力及
び有効血栓溶解力を持つ。それゆえ、組成物は深
部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋硬塞、動脈閉塞、
体外循環、及び動脈静脈閉鎖の場合に遭遇するよ
うな異つた血管床の急性及び漫性の血栓閉塞を治
療するのに用いることができる。 本発明を更に新規な活性化物の特徴づけのため
の試験を含む下記の実施例によつて説明する。 実施例 １ 培養及び採取 人間の黒色腫細胞ライン（患者BO.）を米国ニ
ユーヨーク州ニユーヨークのロツクフエラー大学
のD.B.リフキン博士から入手した。この細胞ラ
インに用いた成育培体は、重炭酸ナトリウム（16
ml，培体１リツトル当り6.5パーセント溶液）、Ｌ
−グルタミン（10ml，培体１リツトル当り
200mNの溶液）、及び熱不活性化した新生仔牛の
血清（英国ペイズリーのギブコ）（最終濃度10パ
ーセント）を補足した修正イーグルの必須培体
（英国のフロー・ラボラトリーズ）であつた。 黒色腫細胞は上記の成育培体中で合流する単層
になるように成育させた。それからこれらを仔牛
の血清のない成育培体で洗つて、同じ無血清の成
育培体中で３日間接種した。毎日の後、培養液を
採取し、取替え、7000×ｇで20分間遠心分離し、
そして使用時まで−20℃で貯蔵した。結合した培
養液は約61μｇ／mlの蛋白質含有量と約20IU／ml
（あるいは約330IU／mg）のプラズミノゲン活性
化物活性を持つていた。 本実施例及び他の実施例における液の蛋白質含
有量は280nmでの光吸収によつて測定した。プラ
ズミノゲン活性化物の特異活性は、プラズミノゲ
ン含有牛フイブリン板を使用し、アストラツプ
（Astrup）ら：Arch.Biochem.Biophys.40，346
〜351（1952）記載の方法で測定し、国際単位
（IU）で表した。なお、この際ウロキナーゼの世
界保健機構第１国際標準品（WHO 1st
International Reference Preparation）（66／
46）を標準として用いた。他の実施例にも同じ測
定方法を用いた。 実施例 ２ 精製 実施例１の結合培養液を３段階精製処理にかけ
た。そのすべての段階は４℃で実施した。これら
の段階に用いた緩衝液に対して、ガラス器に対す
るプラズミノゲン活性化物の吸着を防止するため
に、J.T.ベーカー・ケミカルズの非イオン性洗剤
「トウイーン80」を少量加えた。 ａ） 第１段階では、結合培養液を亜鉛キレー
ト・アガロースのクロマトグラフイにかけた。
この材料はイミノジ酢酸をアガロース粒子（ス
エーデン国、アプサラのフアルマシア・フアイ
ン・ケミカルズの「セフアロース4B」）に結合
させ、そして生成物を塩化亜鉛で飽和させるこ
とによつて製造された。結合方法はNature，
258，598−599（1975）にポラスらによつて開示
されている。使用後、亜鉛キレート・アガロー
スをPH8.5の0.05Mエチレンジアミンテトラ酢
酸（EDTA）、PH10.5の0.05MのNH4HCO3、及
び水で順次洗浄し、これを塩化亜鉛で再飽和さ
せることによつて再生させることができた。 亜鉛キレート・アガロースのカラム（５×10
cm）を1MのNaClを含むPH7.5の0.02Mトリス
HClと0.01パーセント（容積比）の「トウイー
ン80」とで平衡させた。この緩衝液において
は、トリスはトリヒドロキシメチルアミノメタ
ンである。10リツトルの結合培養液を平衡させ
た亜鉛キレート・アガロース・カラムにかけ
た。流速は200ml／時であつた。カラムを平衡
緩衝液で洗浄し、次に直線グラジエント（０か
ら0.05Mまで）のイミダゾールを含む同一の緩
衝液（合計量１リツトル）で溶出した。10mlの
分画は流速120ml／時で収集し、そしてすベて
の分画はプラズミノゲン活性化物活性と蛋白質
濃度（上記参照）とに基づいて分析した。これ
によつてプラズミノゲン活性化物は大蛋白質ピ
ークから僅かに部分的に分離されて、分画28−
42の単一ピークとして脱着されたことがわかつ
た。活性化物を含む分画は貯蔵された（151
ml）。これらは約305μｇ／mlの蛋白質含有量と
1100IU／mlまたは3600IU／mgの特異活性を持
つていた。従つて、合計収率は83パーセント、
精製比率は11であつた。 ｂ） 第２段階では、第１段階から生成したプラ
ズミノゲン活性化物溶液をレクチン・アガロー
ス（スエーデン国、アプサラのフアルマシア・
フアイン・ケミカルズから出ている「コンカナ
ヴアリンＡセフアロース」）のクロマトグラフ
イーにかけた。 コンカナヴアリンＡアガロースのカラム
（0.9×25cm）を1MのNaClと0.01％（容量比）
のトウイーン80とを含むPH7.5の0.01Mのりん
酸塩緩衝液で平衡させた。段階(a)の貯留された
活性化物を含有する分画をこのカラムにかけ
た。４mlの分画を８ml／時の流速で収集した。
カラムを平衡緩衝液で洗浄して、α−Ｄ−メチ
ルマンノシド（０乃至0.6M）とチオシアンカ
リ（０乃至2M）を含む同じ緩衝液（合計量200
ml）で溶出した。４mlの分画を再び収集してそ
れぞれをプラズミノゲン活性化物活性及び蛋白
質濃度について分析した。プラズミノゲン活性
化物は約0.3Mのα−Ｄ−メチルマンノシド及
び1Mのチオシアンカリで脱着されたようであ
つた。活性化物は清澄な蛋白質ピークから分離
した単一ピークで回収された。分画を含む活性
化物のピークを貯留した（84ml）。それらは約
54μｇ／mlの蛋白質含有量と1300IU／mlあるい
は約25000IU／mgの特異活性を持つていた。従
つて、全体の収率は56パーセント、全体の精製
率は77であつた。 ｃ） 第３段階では、第２段階から生成したプラ
ズミノゲン活性化物溶液を架橋結合したデキス
トラン粒子のゲル過にかけた。用いた材料は
スエーデン国、アプサラのフアルマシア・フア
イン・ケミカルズから出ているセフアデツクス
Ｃ−150（極小）であつた。 ゲル過に先立つて、固型チオシアンカリを
プラズミノゲン活性化物液に加えて最終濃度が
1.6Mに達するようにし、そして溶液を固型ポ
リエチレングリコール20000に対する透析によ
つて約10mlに濃縮した。小さい沈澱物を10000
×ｇで15分間の遠心分離によつて除去した。 セフアデツクスＣ−150（極小）カラム（2.5
×90cm）を1.6Mのチオシアンカリと0.01％
（容積比）のトウイーン80を含むPH7.5の0.01M
のりん酸塩緩衝液で平衡させた。それから、濃
縮された活性化物溶液をカラムにかけてこれを
通して過し、次に平衡緩衝液を通した。3.4
mlの分画を6.8ml／時の流速で収集し、そして
プラズミノゲン活性化物活性及び蛋白質濃度に
ついて分析した。プラズミノゲン活性化物が蛋
白質ピークと一致する単一ピークとしてカラム
から出たように思われた。活性化物を含む分画
を貯留した（37ml）。これらは約27μｇ／mlの
蛋白質含有量と約2432IU／mlあるいは約
90000IU／mgの特異活性を持つていた。（なお、
この値は前記のとおり、ウロキナーゼの世界保
健機構第１国際標準品を検定標準とし、プラズ
ミノゲン含有牛フイブリン板検定法で測定した
ものであるが、上記ウロキナーゼに代えてｔ−
PA（組織プラズミノゲンアクチベータ）の世界
保健機構第１国際標準品を検定標準とした場合
には、約500000IU／mgの特異活性を示す。）従
つて、合計収率は46パーセントであり、出発物
質と比較した精製比率は263であつた。 得られた活性化物溶液を−20℃で貯蔵して、
特徴化及び利用試験に用いた。 実施例 ３ 特徴化 実施例２から得られた精製されたプラズミノゲ
ン活性化物溶液を数種の特徴化試験にかけた。 ａ） SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
にかけた場合、新しい活性化物は予想分子量
72000を持つた一帯域を示した。ジチオトレイ
トールで還元した後、それぞれ約33000と約
39000の分子量で２つの帯域が認められた。 この試験では、７％ゲルを用いて、ウエーバ
ー・アンド・オズボーン、J.Biol.Chem.244，
4406−4412（1969）の方法に従つてSDS−アク
リルアミドゲル電気泳動を実施した。分子量は
フオスフオリラーゼｂ（94000）、血清アルブミ
ン（67000）、オヴアルブミン（43000）、炭酸ア
ンハイドラーゼ（30000）、トリプシン阻止剤
（20000）、及びα2−ラクトアルブミン（14400）
を含む検量キツト（スエーデン国、アプサラの
フアルマシア・フアイン・ケミカルズ）によつ
て想定された。 ｂ） 真空中の6MのHClで110℃で20時間加水分
解し、続いてアミノ酸測定をした場合、新規な
活性化物は下記のアミノ酸組成（合計のパーセ
ントで）を示した。 第 １ 表アミノ酸 含有量 アスパラギン酸 10.1 トレオニン 5.0 セリン 11.4 グルタミン酸 11.5 プロリン 5.7 グリシン 11.2 アラニン 7.8 システイン 未測定 ヴアリン 4.4 メチオニン 1.5 イソロイシン 3.1 ロイシン 7.6 チロシン 4.1 フエニルアラニン 3.3 リシン 4.6 ヒスチジン 3.3 アルギニン 5.6 トリプトフアン 未測定 ｃ） フイブリン結合試験を行なつた場合、全く
結合しなかつたウロキナーゼと対照的に、新規
な活性化物はフイブリンと結合したように思わ
れた。 試験はフイブリノゲンとトロンビンとを活性
化物溶液に加えることによつて行なつた。37℃
で30分間インキユベートした後に、フイブリン
を遠心分離によつて除去し、洗浄し、チオシア
ンカリ（1.6M）で抽出した。結果を第２表に
要約する。
【表】 ｄ） 免疫拡散分析にかけた場合、新規の活性化
物は人間のウロキナーゼ（Mr＝54000）とは免
疫学的に異つているように思われた、なぜなら
ば新規の活性化物と活性化物に対する抗体との
間にプレシピチンラインズが発現したが、ウロ
キナーゼと同じ活性化物抗体との間にはかよう
なプレシピチンラインズはなかつたからであ
る。この免疫拡散分析はオーキターロニイ、
「アレルギーの進歩」第５巻（カロス、Ｐ、
ed.）第１頁、カーガー、バーゼル／ニユーヨ
ーク、1958の方法によつて実施した。トウイー
ン80をアガロースに加えて最終濃度が0.1パー
セント（容積比）に達するようにした。 ｅ） プラズミノゲンを含有する牛フイブリン・
プレートについてクエンチング実験をした場
合、同様の結果が得られた。新規なプラズミノ
ゲン活性化物の繊維素形成活性に対する抗体
（IgG分画）によつて完全にクエンチしたが、
ウロキナーゼ溶液（同一の活性を持つもの）の
繊維素溶解活性はそれによつてクエンチされな
かつた。更に、対照の抗血清物のIgG分画は実
験の濃度範囲において繊維素溶解活性をクエン
チしなかつた。 クエンチング実験をアストラツプらのArch.
Biochem.Biophys.，40，346−351（1952）に従
つて実施した。プラズミノゲン活性化物
（140IU／ml）を、0.15MのNaClと0.01％のト
ウイーン80を含むPH7.5の0.02Mトリス／CHlに
溶解させた。 試験(d)及び(e)のために必要とした抗体は下記
のようにして作成された。即ち、新規なプラズ
ミノゲン活性化物に対する抗血清体を、0.5ml
の生理食塩水に溶解しフロイントのコンプリー
ト・アジユヴアント0.5mlで乳化した精製活性
化物100μｇを注射することによつてうさぎに
生成させた。50μｇのブースター注射を２週間
の間隔で行なつた。２回目のブースターから１
週間後に血清を収集した。抗血清体のIgG分画
がプロテインＡセフアロースの親和クロマトグ
ラフイーによつて分離されて、0.15MのNaCl
溶液に対して透析された。 (f) 安定性 プラズミノゲン活性化物はドデシル硫酸ナト
リウム、尿素、グアニジンHcl中において完全
な変性に対して高度に抵抗性を有する。高濃度
のアルギニンはプラズミノゲン活性化物を安定
化し、溶液状態に保持する。 Ａ PHの影響 プラズミノゲン活性化物がPH5.5、6.0、
7.0、7.5および8.5において0.2Mのアルギニ
ン−リン酸緩衝液中で透析された。最終的に
プラズミノゲン活性化物の濃度は約0.085
mg／mlであつた。試料は35℃で貯蔵され、２
週間の間定期的に検定された。実験の全期間
にわたつて全プラズミノゲン活性化物の活性
は可なり一定であつた。PHの関数としての全
プラズミノゲン活性化物活性の損失速度をみ
ると、最も中性に近いPHにおいて最小であつ
たので、酸−塩基が反応を触媒したことを示
唆する。最悪の場合（PH5.5）における分解
の程度はわずかにおよそ20％であつた。 Ｂ 温度の影響 プラズミノゲン活性化物の二つの製剤を４
℃、20℃、37℃および45℃で30日間貯蔵した
後、それぞれ−20℃に貯蔵したものを対照と
して、その力価を比較した。これらの二つの
プラズミノゲン活性化物は、その貯蔵中の挙
動において次のように変化があつた。
【表】 (g) 基質特異性 天然基質のそれに類似のアミノ酸配列を有す
るｐ−ニトロアニリンとカプリングされた合成
発色性トリペプチドがプラズミノゲン活性化物
活性の検定のために使用された。３種のそのよ
うなトリペプチドの反応動力学定数は次の通り
である。
【表】
【表】 (h) 酵素的性質に影響を与えるプラズミノゲン活
性化物 Ａ 阻害 プラズミノゲン活性化物のフイブリン分解
活性はジイソプロピルフルオロフオスフアー
ト（DFP）とともにインキユベートするこ
とによつて阻害される。 Ｄ‐Phe‐Pro‐Arg‐クロロメチルケト
ンはプラズミノゲン活性化物をプラズミノゲ
ンの水溶性の不可逆的阻害剤である。 プラズミノゲン活性化物のアミド分解活性
に対する尿素の影響の検定に直接発色試験法
が使用された。尿素濃度の増加とともに活性
の減少が観察された。1M尿素において50％
の活性損失が起つた。 同様の試験法が活性に対するPHの影響を測
定するために使用された。PHを５〜10の間で
変化させたところ、PH8.5で最大値が観察さ
れた。プラズミノゲン活性化物製剤は、6.0
で本質的に不活性である。 温度の影響が25℃から51℃で調べられた。
アミド分解活性は温度に直接関係することが
見いだされた。アレニウス・プロツトの傾斜
から求められた活性化エネルギーはプラズミ
ノゲン活性化物に対して1.56±0.11Kcal／
molであつた。 Ｂ 活性 プラズミノゲン活性化物のフイブリン分解
活性はリン酸塩濃度に依存する。PH7.4リン
酸塩濃度0.06Mで、プラズミノゲン濃度に無
関係に最高活性が得られる。低プラズミノゲ
ン濃度では、みかけの活性はリン酸塩濃度の
変化に著しく影響される。クロツト溶解反応
の強いイオン強度依存性は多分、活性化物と
プラズミノゲンとフイブリンの間の相互作用
による効果に関係している。このことはプラ
ズミノゲンの種々の濃度におけるリン酸濃度
の依存性における観察された変化によつて裏
付けられる。 プラズミノゲン活性化物によつて誘起され
るクロツト溶解はPHに依存する。0.06Mリン
酸緩衝溶液中で、最適PHは7.4であり、PH6.4
でも最高活性の50％は残り、PH8.2でも最大
活性の70％残る。 実施例 ４ アプロチニンの存在下での方法 アプロチニン（ドイツ連邦共和国、レーフエル
クーセンのバイエル）を血清含有及び無血清の成
育培体（最終濃度20KIU／ml、即ちml当り20カ
リクライン阻止剤単位）に共に加えたほかは、実
施例１の方法に従つて黒色腫細胞を培養した。 各日の終りに培養液を収集ならびに取替して連
続３日間インキユベートさせた後に、結合培養液
は約180μｇ／mlの蛋白質含有量と約60IU／ml
（あるいは約330IU／mg）のプラズミノゲン活性
化物を持つていた。 液の蛋白質含有量及びプラズミノゲン活性化物
の活性は前実施例で行なつたと同じ方法で測定し
たが、プラズミノゲン活性化物溶液中に存在する
アプロチニンはフイブリン板上の応答を減じるよ
うに思われたので、適当な量のアプロチニン（こ
の場合は最終濃度が20KIU／mlになるまで）を
アストラツプらの方法における標準として用いる
ウロキナーゼ溶液に加えた。 アプロチニンを第１及び第２の精製段階の緩衝
液（最終濃度10IUK／ml）に加えるほかは、実
施例２と同様にして結合培養液を３段階精製方法
にかけた。アプロチニンのない最終製品を得るた
めに、このアプロチニンは第３段中では省いた。
アプロチニンの存在はクロマトグラフイー上の挙
動にもプラズミノゲン活性化物の収率及び特殊活
性にも影響しなかつた。そしてこのことは実施例
２におけると同様の結果が得られたことを意味し
た。 精製されたプラズミノゲン活性化物溶液を実施
例３と同様にいくつかの特徴化試験にかけた。 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た場合、活性化物は想定分子量72000で１帯域を
示した。ジチオトレイトールで還元した後には再
び想定分子量約72000を持つた１帯域が観察され
た。これは天然の非劣化物であることを示して居
り、これに対し実施例３において試験した製品は
蛋白質分解の劣化物であるかもしれない。 6MのHClで真空中で110℃で20時間加水分解
し、続いてアミノ酸測定した場合、本実施例の活
性化物は下記のアミノ組成を示した（合計のパー
セントで表わす）。 第 ３ 表アミノ酸 含有量 アスパラギン酸 9.8 トレオニン 5.4 セリン 9.2 グルタミン酸 13.1 プロリン 7.1 グリシン 10.4 アラニン 6.6 システイン 未測定 ヴアリン 4.1 メチオニン 0.9 イソロイシン 3.0 ロイシン 8.1 チロシン 4.0 フエニルアラニン 3.7 ヒスチジン 3.3 リシン 5.5 アルギニン 5.9 トリプトフアン 未測定 更に、本実施例の活性化物はフイブリンに対す
る充分な結合能力を持つているように思われ、そ
して免疫拡散分析及びクエンチング実験に付した
場合、実施例２の製品と同様に挙動した。 実施例 ５ 繊維素溶解、フイブリノゲン溶解、及び血栓溶
解効果 新規のプラズミノゲン活性化物及びウロキナー
ゼの関係繊維素溶解効果を新鮮な冷凍血液銀行血
漿で構成された塊溶解方式で比較した。二重試験
管中で、0.4mlの血漿を合わせて50μの活性化物
溶液（最終濃度は１mlにつき10乃至200IUに亘
る）及び50mlの人間のトロンビン（最終濃度は１
mlにつき1NIH単位）（NIHとは米国メリーラン
ド州ベセスダのナシヨナル・インステイテユー
ト・オブ・ヘルスをいう）と混合した。活性化物
は一方の系統においては実施例２から生成した新
規なプラズミノゲン活性化物であり、他の系統の
実験においてはウロキナーゼであつた。血塊形成
後、混合物を37℃でインキユベートし、そして完
全に血塊が溶解するのに要した時間を記録した。 この方式においては、フイブリンの塊が血漿フ
イブリノゲンに加えたトロンビンの作用によつて
形成され、そして血漿プラズミノゲンのプラズミ
ンへの転化を生じさせる加えられた活性化物によ
つて血塊の溶解が行なわれ得る。この血塊の溶解
は血漿中にアンチプラズミンを存在させることに
よつて拮抗させてもよい。 両活性化物とも血塊の溶解を生じさせ、そして
それゆえ繊維素溶解の効果を持つように見えた
が、しかしこれらの効果の性格は異つていた。活
性化物の濃度が高い場合は溶解の時間は匹敵する
ものであつたが、低濃度の場合は新規のプラズミ
ノゲン活性化物はウロキナーゼよりもはるかに効
果が大きかつた。１ml当り80単位のウロキナーゼ
濃度においては血漿塊は24時間で溶解しなかつた
が、新規なプラズミノゲン活性化物20単位で生じ
させた溶解時間は２時間未満であつた。 ｂ） 新規なプラズミノゲン活性化物とウロキナ
ーゼとのフイブリノゲン溶解効果を血漿系にお
いて比較した。1.8mlの人間の血漿に0.2mlの活
性化物溶液（最終濃度は５乃至200IU／mlに亘
る）を加えた。異つた時間々隔で、0.2mlの試
料を採つて、ヴアーミレンらによるClin.Chim.
Acta，８，418−424，（1963）の方法によつて
そのフイブリノゲン準位を測定した。 ウロキナーゼと新規な活性化物との間には挙
動において差があるように思われた。１mlにつ
き100ユニツトにおいて、僅かな程度のフイブ
リノゲン破断がウロキナーゼについては認めら
れたが、新規なプラズミノゲン活性化物につい
ては認められなかつた。 ｃ） 新規なプラズミノゲン活性化物とウロキナ
ーゼとの血栓溶解効果を、活性化物を徐々に注
入した循環する血液の血漿の量にけん濁させた
放射性の人間の血栓から成る人工の系について
測定した。活性化物の注入開始前と８−12時間
の時間間隔で血漿の試料を採取した。血栓溶解
の程度を放出された放射能から推定してパーセ
ントで表わした。 血漿１ml当り10単位以上の新規なプラズミノ
ゲン活性化物では12時間で著しい血栓溶解が得
られたが、１ml当り20単位のウロキナーゼでは
これが得られないようであつた。この系におけ
る新規な活性化物の特殊血栓溶解効果はウロキ
ナーゼの効果よりも約10倍高い。更に、活性化
物注入が終わつた後はウロキナーゼによる血栓
溶解の速度は低下する傾向にあるのに対して、
新規なプラズミノゲン活性化物によつて生起さ
せた血栓溶解はこれよりもずつと進行性があ
る。 実施例 ６ 薬剤 0.001％のトウイーン80と0.01−１％のアルブ
ミンまたはマンニトールを含む燐酸塩緩衝生理食
塩水溶液に入れた新規活性化物の溶液を静脈内注
射用剤として用いることができる。 本発明の組成物は、血栓除去のため、自体常套
の投与剤形において人体に投与される。発症（血
栓形成に伴う症状の発生）後、可及的速やかに投
与するのが好ましい。前記したところから明らか
なように、有効成分であるプラズミノゲン活性化
物は、元来人体に存在する天然物質であつて、イ
ン・ビトロ検定法で測定されたその特異活性
（IU／mgは実験誤差が比較的大であり、時におよ
そ35％にも達することがある。通常の合成薬がし
ばしば示すようなタイプの著しい毒性は有してい
ないが（マウスやラツトにおける静脈注射時の急
性毒性LD50＞200万IU（ｔ−PAの世界保健機構第
１国際標準品基準）／Kg）、他方、その特有の生
理活性（血栓溶解作用）に鑑み、過剰な投与は避
けるべきである。現実の投与量は、予め行つた臨
床実験結果を前提に、個々の患者についてその症
状に応じて広い範囲から適量を経験的に決めれば
よいが、通常は、成人の場合体重１Kg当たり20万
〜50万IU（ｔ−PAの世界保健機構第１国際標準
品を基準にして）、特に25万〜45万IUを使用し、
これを生理学的に許容し得る水性溶液の形で静脈
注射する。普通、上記の量の約10％を急速に（た
とえば数分以内）投与した後、残りの量を比較的
長い時間をかけて（たとえば約２〜３時間）投与
する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a)下記性質を有する、本質的に純化された、
    ヒトメラノーマ細胞から得られうるヒトプラズミ
    ノゲン活性化物と、(b)医薬的に許容し得る担体ま
    たは希釈剤を含むことを特徴とする、血栓溶解用
    医薬組成物： (1) ウロキナーゼとは免疫学的に異なる； (2) フイブリンに対する結合能力を有する； (3) プラズミノゲン含有牛フイブリン板検定法に
    より測定したとき、ウロキナーゼの世界保健機
    構第１国際標準品を検定標準とした場合の特異
    活性が約90000IU／mgである； (4) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
    よつて測定された分子量が約72000である。 ２ 非経口的投与に適した剤形を有する特許請求
    の範囲第１項記載の血栓溶解用医薬組成物。 ３ プラズミノゲン活性化物が非劣化分子である
    特許請求の範囲第１項〜第２項のいずれかに記載
    の血栓溶解用医薬組成物。 ４ プラズミノゲン活性化物が1.6Mチオシアン
    カリおよびトウイーン80非イオン性界面活性剤
    0.01％（Ｖ／Ｖ）を含有するPH7.5の0.01Mリン酸
    塩緩衝液の溶液として、架橋結合したデキストラ
    ン粒子（セフアデツクスＧ−150）のゲル濾過に
    かけた場合、単一の濾過蛋白ピークを与えるもの
    である特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
    に記載の血栓溶解用医薬組成物。 ５ プラズミノゲン活性化物がSDS−ポリアクリ
    ルアミドゲル電気泳動法によつて測定された場
    合、還元状態においてそれぞれ約33000および約
    39000の分子量を持つ二つのバンドを与えるもの
    である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか
    に記載の血栓溶解用医薬組成物。 ６ プラズミノゲン活性化物が該血清のIgG分画
    と反応するものである特許請求の範囲第１項〜第
    ５項のいずれかに記載の血栓溶解用医薬組成物。 ７ プラズミノゲン活性化物がプラズミノゲン含
    有牛フイブリン板上におけるその繊維素溶解活性
    が該抗血清または該抗血清のIgG分画によつてク
    エンチされるものである特許請求の範囲第１項〜
    第６項のいずれかに記載の血栓溶解用医薬組成
    物。 ８ プラズミノゲン活性化物が第１表によるアミ
    ノ酸組成を有するものである特許請求の範囲第１
    項〜第７項のいずれかに記載の血栓溶解用医薬組
    成物。 ９ プラズミノゲン活性化物が第３表によるアミ
    ノ酸組成を有するものである特許請求の範囲第１
    項〜第７項のいずれかに記載の血栓溶解用医薬組
    成物。
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