JPH037906B2 - - Google Patents
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Description
本発明は改良螢光測定法に関する。
臨床医学診断分野における普通の非同位元素分
析法には以後配位子とよばれる臨床的に重要物質
の分光又は螢光測定法がある。この方法は非常に
敏感で特殊であり、光学的性質、即ち試験溶液中
の特定配位子の存在で生ずる試験溶液の透光性又
は螢光性変化の測定に基づく。 分光試験における試験溶液内の測定される配位
子と配位子に特定の試薬系間の相互作用は試験溶
液の透光性に測定できる変化を生ずる。透過性の
変化とは既知強さの光線が試験溶液をとおつた時
の特定波長帯内の試験溶液によつて吸収された又
は散乱された光量をいう。試験溶液の透過性の変
化は既知強さをもつ単色光を試験溶液にとおし透
過又は散乱光強さの入射光強さに対する比率を検
査して測定する。試験溶液の透過性の検出できる
変化を生成するため殆んど全配位子が特定波長の
エネルギーを吸収するか又は試験溶液中特定試薬
系と相互作用するかいづれかである事実は多数の
特殊分光測定法の開発となつている。試験溶液中
の配位子測定として試験溶液の透光性の変化測定
に基づく分光測定には例えば試験溶液の色変化に
よる比色試験および試験溶液内の濁度変化による
濁度又は比濁試験がある。比色試験では試験溶液
の透光性の変化は一般に試験溶液の吸光度といい
測定する配位子と配位子に特定の試薬系の相互作
用による試験溶液の色の変化によるのである。試
験溶液の吸光度はその中の配位子濃度に比例す
る。比色試験は試験溶液の透光性、特に色の検出
できる変化を生成するため試験溶液中で問題の特
定配位子と相互作用しうる発色試薬系を利用す
る。特定配位子測定に便利な発色試薬系が多数開
発されており市販されている。比濁試験の原理は
試験溶液を光が通過する際特定物質により散乱さ
れる又は阻止される光量の測定にある。比濁試験
において問題の配位子は試験溶液中に粒子の懸濁
物をつくるため配位子に特定の試薬系と相互に作
用する。既知強さをもつ光線が試験溶液をとおる
際配位子と試薬系の相互作用で生じた粒子懸濁液
は入射光を阻止又は散乱して試験溶液をとおる光
強さを減少する。濁度測定における透光性変化は
試験溶液をとおる光強さの減少をいい、粒子懸濁
物によつて散乱又は阻止された入射光量に比例し
存在する粒子数とこの粒子の断面積による。比濁
試験は問題の配位子が配位子に特定の試薬系と相
互作用して試験溶液中粒子懸濁物を生成する点で
濁度試験と同じである。比濁試験では試験溶液の
透光性変化も粒子懸濁物によつて散乱され又は阻
止される入射光量に比例にするが、試験溶液をと
おる光強さを測定する濁度試験とちがつて試験溶
液への光入射角における散乱又は阻止された光を
測定する。したがつて比濁試験では透光性の変化
は試験溶液に入る光と入射光に対する角で散乱さ
れた光との強さの差をいう。濁度試験と比濁試験
は血液、尿、脊髄液等の分析で有効な発色試薬系
のないため比較する比色試験のない蛋白質の様な
配位子測定に使われる。ヨーエとクリムマンはニ
ユーヨーク市ウイレイ アンド サンズ社編
Photoelectric Chemical Analysis巻：
Nephelometry（1929）に種々の比濁試験につい
て記載している。 一般に螢光試験においては試験溶液中の配位子
は化学的に又は免疫学的に螢光性複合物又は共役
物に変えられて試験溶液の螢光性に検知できる変
化を生ずる。試験溶液の螢光性変化は生成した螢
光性複合物又は共役物を螢光体の励起波長帯内の
波長をもつ単色光で励起し螢光体の放射波長帯内
の波長をもつ放射光強さを測定してえられる。放
射光の螢光強さは配位子濃度に比例する。しかし
試験溶液によつて放出された螢光強さは測定する
配位子が試料中にある蛋白質又はりん酸塩の様な
非螢光性妨害物と複合する場合又は測定する配位
子を含む試料がフイルターとして働らくに十分な
色をもつて放射螢光強さを減少する場合抑制され
る。螢光測定試験の感度と特異性を最大とするた
めこれらの抑制要素があるならば分析前に非螢光
性妨害物又は色生成物質を除去するか又は試料の
第２部分に加えた内部標準を用いてこの要素の存
在を補償しまた内部標準をもつ試料を用いて全試
験法を行なうかいづれかでこれら抑制要素をなく
す必要があることがよくわかる。 本発明の目的は試験溶液によつて放射された螢
光強さが測定する配位子と配位子の存在で試験溶
液の透光性の変化を生じうる試薬系との相互作用
により生ずる透光性変化に比例する様な試験溶液
中の配位子の螢光測定法を提供するものである。
また本発明の目的は試験溶液中の配位子濃度の分
光測定か螢光測定のいづれかを利用できる新規の
試薬組成物の提供にある。 本発明は配位子を含むと思われる試料中の配位
子測定法に関するもので、その方法は上記試料、
螢光体の有効量および測定する配位子の存在で螢
光体の励起および（又は）放射波長帯となる波長
帯内で試験溶液の透光性を変えうる試薬系の有効
量を混合して試験溶液を生成し、試験溶液を螢光
体の励起波長帯内の波長をもつ光で照射した後試
験溶液によつて放射された螢光強さを試料中の配
位子濃度の尺度として測定することより成る。 本発明は更に配位子を含む溶液の透光性変化を
生じうる試薬系の有効量および試薬と配位子を含
む溶液の透光性変化と関聯した波長帯と重複する
励起および（又は）放射波長帯をもつ螢光体の有
効量より成る上記配位子を含むと思われる料中の
配位子螢光測定用新規試薬組成物に関する。 本発明の方法により生物学的試料中の配位子は
試験溶液中に上記試料、試薬系有効量および螢光
体有効量を混合して測定される。試験溶液を螢光
体の励起波長帯内の波長をもつ光で照射し試験溶
液によつて放出された螢光強さを試料中の配位子
濃度の指示として測定するのである。試験溶液に
よつて放出された螢光強さは配位子と試薬系の相
互作用から生ずる試験溶液の透光性変化に比例す
る。 本明細書で使う“試験溶液の透光性変化”とは
既知強さの光線が試験溶液をとおる時特定波長帯
内で試験溶液により吸収又は散乱された光量をい
い、一般に試験溶液の色又は濁度の変化による。
特に透過性の変化は配位子と配位子に特定な試薬
系の相互作用から実質的に生ずる様な特定波長帯
内の試験溶液により吸収された又は散乱された光
量変化をいう。透過性の変化は一般に既知強さを
もつ単色光を試験溶液にとおし入射光強さに対す
る透過又は散乱光強さの比を測定して求められ
る。透過性変化、即ち特定波長帯内の試験溶液に
より吸収又は散乱された光量変化は試験溶液中の
配位子濃度に比例する。今や配位子、試薬系およ
び螢光体を含む試験溶液において螢光体の励起お
よび（又は）放射波長帯と重なる波長帯内で配位
子と試薬系の相互作用から生ずる透過性の変化も
試験溶液から放出される螢光強さの比例的変化と
なることがわかつている。故に本発明の方法によ
り試験溶液により放出される螢光強さの変化は試
験溶液の配位子濃度に比例する。重要なことは本
発明の方法による測定する配位子、試薬系および
螢光体を含む試験溶液により放出された螢光強さ
の変化は試薬系と螢光体のみを含む試験溶液から
放出される螢光強さと比べると全く配位子と試薬
系の相互作用によつて生じた透過性変化によるも
のである。試験溶液中螢光体と他のどの成分、即
ち測定する配位子又は試薬系との間には化学的又
は免疫学的のいづれの反応もない。故に試験溶液
により放出された螢光強さは螢光体と試験溶液内
にあるかもしれない発色物質又は懸濁粒子との間
の分子間距離によるものではない。 本発明の方法によつて測定できる配位子には比
色的、濁度的又は比濁的に測定できる臨床的に重
要な物質がある。即ち配位子は試験溶液中の配位
子濃度に比例して透過性の検出できる変化を生ず
る様試薬系と相互作用しうるものでなければなら
ない。本発明の方法により分析できる代表的配位
子には例えばグルコース、ウル酸、コレステロー
ル、クレアチニン、ラクテイト、ラクテイト デ
ヒドロジエナーゼ（LDH）、トリグリセリド、イ
ムノグロブリン、ユリネステラーゼ、血清グルタ
メイト オキサラクテイトトランスアミナーゼ、
（SGOT）、血清グルタメイト ピルヴエイトトラ
ンスアミナーゼ（SGPT）、クレアチンホスホキ
ナーゼ（CPK）、エタノール、全蛋白質、アルブ
ミン、カルシウム、ビリルビン、血液尿素窒素
（BUN）、アンモニア、マグネシウム、りん、塩
化物等がある。 “螢光体”とは試薬系と配位子を含む溶液の透
光特性に関連した螢光特性をもつ化合物又はは組
成物をいう。特に螢光体と関連した励起又は放射
波長帯は配位子と試薬系の相互作用から生ずる試
験溶液の透光性変化と関連した波長帯と重複する
必要がある。また上記のとおり螢光体と測定する
配位子又は試薬系の間の化学的又は免疫学的結合
はない。他の考えは試薬系のPHに関する。螢光体
は試薬系に対し測定する配位子と相互反応するに
有効なPH範囲内で螢光を発しなければならない。
また本発明の方法に有効な螢光体は非結合および
非複合状態において螢光性である。比色試験にお
いて螢光体と関連する励起波長帯又は放射波長帯
は少なくともある程度配位子と呈色試薬系の相互
作用に関連する吸収波長帯と重複する必要があ
る。最大試験感度のためには配位子と呈色試薬系
の相互作用から生ずる吸収波長帯が螢光体に関連
する励起波長帯と放射帯の両方と重複することが
好ましい。濁度試験又は比濁試験では螢光体に関
連した励起又は放射波長帯は少なくもある程度配
位子と濁度測定又は比濁測定試薬系を含む試験溶
液の濁度が測定される様な波長帯と重複する必要
がある。本明細書で透光性変化と関連した波長帯
および螢光体の励起および（又は）放射波長帯の
“重複”はそれぞれの波長帯の一部又は全部の重
複のいずれかをいう。 本発明の方法には広く種々の螢光体が使用でき
る。すでに述べたとおり螢光体の選択は測定する
特定配位子と使用する試薬系によるだろう。本発
明の方法に使用できる螢光体の代表的なものは例
えばフルオレシイン、ローダミン、フラビン、ク
ーマリン、ナフタレン、アクリジン、アンスラセ
ン、多核溶融炭化水素、スチルベン、アントラニ
ル酸、アミノスチリルピリジン、キノリン、サリ
チル酸、シアニン、オクソノール、フエナンチジ
ン、フルオレスカミン並びにその誘導体と塩があ
る。使用できる螢光体の特例には例えばエオシ
ン、ローダミン、アミノナフタレンスルホネイ
ト、アクリフラビン、フルオレシイン、ジヒドロ
キシ安息香酸、ヒドロキシキノリン、NADH、
リボフラビン、ブリリアントサルフアフラビン、
キニン、ナフトールスルホン酸、チオフラビン、
クーマリン、アクリジンオレンジ、８−キノリン
−１−ナフタレンスルホン酸、オキサジン、ウン
ベリフエロン、アクリジン、レゾルフインおよび
これらの誘導体と塩がある。本発明の方法に有効
な螢光体の選択はこの分野の技術をもつ者には容
易に確認できるだろう。本明細書で使う“螢光体
の有効量”とは試験溶液に配位子とそれに特定の
試薬系を加えた場合試験溶液によつて放出される
螢光強さの認められる変化を生ずるに十分な試験
溶液中の螢光体濃度をいう。この有効量は一般に
この技術分野の知識ある者によつて確かめられ、
例えば特定試薬系、測定する配位子、特定螢光体
又は螢光強さ測定器械の様な１又は２以上の要素
による。 本明細書で使う“試薬系”とは問題の配位子の
存在で螢光体の励起および（又は）放射波長帯と
重なる波長帯内の試験溶液の透過性変化を生ずる
１又は２以上の試薬を含む化学系をいう。本発明
の方法に有効な試薬系は測定する特定配位子に依
りまた測定する透過性変化が試験溶液の色又は濁
度の変化によるかどうかである。試験溶液の色変
化が試験溶液の透光性変化と関連する比色試験で
は呈色試薬系が試薬系として使われる。濁度、即
ち懸濁粒子によつて阻止又は散乱される光量が試
験溶液の透過性変化と関連する濁度又は比濁試験
では濁度測定試薬系又は比濁測定試薬系がそれぞ
れ使われる。 本明細書で使用する“呈色試薬系”とは透過
性、特に螢光体の励起および（又は）放射波長帯
と重なる波長帯内で試験溶液の比色性の認められ
る変化を生ずる様測定する配位子と特定反応順序
によつて反応する１又は２以上の試薬を含む化学
系をいう。本発明の目的のためこの呈色試薬系を
含む種々の試薬はその添加順序が特定反応順序に
よつて制限されない限り単独で又は混合して試験
溶液に添加できる。配位子の比色測定に利用でき
る呈色試薬系はこの分野ではよく知られており、
例えばニユーヨーク、ヘーバーメデイカルデイビ
ジヨン、ハーパー アンド ロー（1964）のヘン
リーらのClivical Chemistry、Principles and
Techniques；W.B.サウンダース カンパニー
（1970）のテイーツのFundamentals of Clinical
Chemistryの文献がある。種々の試験道具箱と試
薬系が市販されており標準法と試薬を用いる。一
般にこの比色法は配位子が発色試薬を含む呈色試
薬系と反応して試験溶液中に認めうる変化を生じ
るという原理に基づく。代表的呈色試薬系には例
えば終点と運動測定を含むオキシダーゼ反応系と
NADH／NAD反応系がある。例えばオキシダー
ゼ反応系は配位子と反応して過酸化水素を放出し
それが次いでペルオキシダーゼの存在で染料と反
応して試料中の配位子量の指示として試験溶液の
比色性変化を生ずる酸化性酵素を利用する。
NADH／NAD反応系はNADのNADHへの還元
又はNADHのNADへの酸化とつづく染料系との
反応による試料中の配位子濃度尺度としての試験
溶液の比色性変化生成に基づく。本明細書で使う
“試薬系の有効量”とは配位子の存在において試
験溶液の比色性の認めうる変化を生ずるに十分な
試薬系の量をいう。この有効量はこの技術知識を
もつものには容易に確かめられるだろう。 次は本発明の方法により使用できる種々の呈色
試薬系とその反応順序を示すに役立つだろう。次
の記号を本明細書で使用している： DHBS ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム、 AAP ４−アミノアンチピリジン、 HRPO 西洋わさび ペルオキシダーゼ、 NAD 酸化されたニコチンアミド−アデニンジ
ヌクレオチド、 NADH 還元されたニコチンアミド−アデニン
ジヌクレオチド、 LDH ラクテイト デヒドロジエナーゼ、 SGOT 血清グルタミツク オキザルアセチツク
トランスアミナーゼ、 SGPT 血清グルタミツク ピルヴイツク トラ
ンスアミナーゼ、 CPK クレアチン ホスホキナーゼ、 INT ２−（ｐ−アイオドフエニル）−３−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウ
ム塩化物、 ATP アデノシン トリホスフエイト ADP アデノシン ジホスフエイト EGTA エチレングリコール−ビス（β−アミ
ノエチレンエーテル）−Ｎ，N′−テトラ酢酸 また次の反応順序のある生成物の特定構造が不
確実なため試験溶液の色を生じ分光測定試験で測
定される特定反応順序の生成物は詳しく固定しな
い限り一般に本明細書では“発色体”という。
NADH／NAD系を示している反応順序11−16に
おいて試験溶液の色を生ずる生成物はフオルマジ
ンである。血液尿素窒素の試験を示す反応順序21
において試験溶液の色を生ずる生成物はインドフ
エノールである。塩化物の試験を示す反応順序24
においては試験溶液の色を生ずる生成物はチオシ
アン酸第２鉄である。 １ 配位子：グルコース 発色試薬系：グルコースオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： Ｄ−グルコース＋O2＋H2Oグルコースオキシダーゼ ―――――――――――――→ Ｄ−グルコン酸＋H2O2 2H2O＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ２ 配位子：ウル酸 発色試薬系：ウリカーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： ウル酸＋O2＋2H2Oウリカーズ ――――――→ アラントイン＋CO2＋H2O2 2H2O＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ３ 配位子：コレステロール（コレステロールと
コレステロールエステル） 発色試薬系：コレステロールエステラーゼ コレステロールオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： コレステロールエステルコレステロールエステラー
ゼ ――――――――――――――――→ コレステロール コレステロール＋O2コレステロールオキシダーゼ ――――――――――――――――→ △4コレステロン＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ４ 配位子：クレアチニン 発色試薬系：クレアチニナーゼ クレアチナーゼ サルコシンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： クレアチニン＋H2Oクレアチニナーゼ ――――――――――→ クレアチン クレアチン＋H2Oクレアチナーゼ ―――――――――→ サルコシン＋尿素 サルコシン＋H2O＋O2サルコシンオキシダーゼ ――――――――――――――→ 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ５ 配位子：ラクテイト 発色試薬系：NAD LDH ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序 ラクテイト＋NADLDH ――――→ ピルヴエイト＋NADH ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ アセチルホスフエイト＋CO2＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ６ 配位子：トリグリセリド 発色試薬系：リパーゼ グリセロールキナーゼ グリセロールホスフエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： トリグリセリド＋3H2Oリパーゼ ―――――→ グリセロール＋脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ――――――――――――→ グリセロール−３−ホスフエイト＋ADP グリセロール＋３−ホスフエイト グリセロールホスフエイトオキシダーゼ ――――――――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエイト＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ７ 配位子：コリネステラーゼ 発色試薬系：アセチルコリネステラーゼ コリンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アセチルコリンアセチルコリネステラーゼ ―――――――――――――――→ コリン＋アセテイト コリン＋O2コリンオキシダーゼ ―――――――――――→ 2H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ８ 配位子：SGOT 発色試薬系：アスパレイト α−ケトグルタレイト オキサロアセテイトデカルボキシラーゼ ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アスパレイト＋α−ケトグルタレイトSGOT ―――――→ グルタメイト＋オキサロアセテイト オキサロアセテイトオキサロアセテイトデカルボキ
シラーゼ ――――――――――――――――――――――→ ピルヴエイト＋CO2 ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ H2O2＋アセチルホスフエイト＋CO2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ９ 配位子：SGPT 発色試薬系：Ｌ−アラニン α−ケトグルタレイト ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アラニン＋α−ケトグルタレイトSGPT ―――――→ グルタメイト＋ピルヴエイト ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ アセチルホスフエイト＋H2O2＋CO2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 10 配位子：CPK 配色系：クレアチンホスフエイト クレアチナーゼ サルコシンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： クレアチンホスフエイト＋ADPCPX ――――→ クレアチン＋ATP クレアチン＋H2Oクレアチナーゼ ――――――――→ サルコシン＋尿素 サルコシン＋H2O＋O2サルコシンオキシダーゼ ――――――――――――――→ Ｏ ‖ グリシン＋HCH＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 11 配位子：エタノール 発色試薬系：NAD アルコールデヒドロジエナーゼ INT デイアフオラーゼ 反応順序： エタノール＋NADアルコールデヒドロジエナーゼ ―――――――――――――――――→ NADH＋アセタルデヒド NADH＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 12 配位子：SGOT 発色試薬系：アスパラテイト α−ケトグルタレイト NAD グルタメイトデヒドロジエナーゼ デイアフオラーゼ INT 反応順序： アスパレイト＋α−ケトグルタレイトSGOT ―――――→ グルタメイト＋オキサロアセテイト NAD＋グルタメイト＋H2Oグルタメイトデヒドロジエ
ナーゼ ――――――――――――――――→ NADH＋２ −オクソグルタレイト＋NH3 NADA＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 13 配位子：SGPT 発色試薬系：Ｌ−アラニン α−ケトグルタレイト NAD グルタレイトデヒドロジエナーゼ デイアフオラーゼ INT 反応順序 アラニン＋α−ケトグルタレイトSGPT ―――――→ グルタメイト＋ピルヴエイト グルタメイト＋NAD＋H2Oグルタメイトデヒドロジエ
ナーゼ ――――――――――――――――――→ NADH ＋２−オクソグルタレイト＋NH3 NADH＋INTデイアフオラーゼ ――――――――――→ NAD＋ホルマジン 14 配位子：グルコース 発色試薬系：ATP ヘクソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエイトデヒドロジエナ
ーゼ INT デイアフオラーゼ 反応順序： グルコース＋ATPヘクソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−ホスフエイト＋ADP グルコース−６−ホスフエイト ＋NADグルコース‐６‐ホスフエイトデヒドロジエ
ナーゼ ＋NADグルコース‐６‐ホスフエイトデヒドロジエ
ナーゼ ―――――――――――――――――――――――――
――――→ NAD＋グルコネイト−６−ホスフエイ
ト NADH＋INHデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 15 配位子 CPK 発色試薬系 クレアチンホスフエイト ADP グルコース ヘクソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエイトデヒドロジエナ
ーゼ INT デイアホラーゼ 反応順序： クレアチンホスフエイト＋ADPCPK ――――→ クレアチン＋ATP グルコース＋ATPヘクソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−ホスフエイト＋ADP グルコース−６−ホスフエイト＋NAD グルコース‐６‐ホスフエイト ―――――――――――――――――――→ NADH＋グルコネイト−６−ホスフエイト NADH＋INTデイアホラーゼ ――――――――→ NAD＋ホルマジン 16 配位子：LDH 発色試薬系：Ｌ−ラクテイト NAD INT デイアホラーゼ 反応順序： Ｌ−ラクテイト＋NADLAD NADH＋ピルヴエイト NADH＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 17 配位子：全蛋白質 発色試薬系：銅タータレイト ナトリウムタータレイト リチウムアセテイト 反応順序： 蛋白質＋銅タータレイト＋ナトリウムタータレイト
＋リチウム水酸化物→発色体 18 配位子：アルブミン 発色試薬系：ブロムクレオゾルグリーン 反応順序： アルブミン＋ブロムクレオゾルグリーン→発色
体 19 配位子：カルシウム 発色試薬系：Ｏ−クレゾールフタレインコンプ
レクソン ８−キノリノ硫酸塩 反応順序： カルシウム＋Ｏ−クレゾールフタレイン＋８−キノ
リノル硫酸塩→発色体 20 配位子：ビリルビン 発色試薬系：２，４−ジクロロアニリンのジア
ゾニウム塩 メタノール スルフアミン酸 反応順序： ビリルビン＋２，４−ジクロロアニリンのジアゾニ
ウム塩メタノール ――――――――→ スルフアミン酸発色体 21 配位子：血液尿素窒素（尿素） 発色試薬系：ウレアーゼ 次亜塩素酸ナトリウム フエノール 水酸化ナトリウム ナトリウムニトロプルシド 反応順序： 尿素ウレアーゼ ――――――→ 2NH3＋CO2 2NH3＋2NaClO→2NH2Cl＋2NaOH 2NH2Cl＋２フエノール＋2NaOH→2p−アミノフエノ
ール＋2NaCl＋2H2O ２ｐ−アミノフエノール＋２フエノール＋O2→２イ
ンドフエノール＋2H2O 22 配位子：マグネシウム 発色試薬系：塩化カリウム カルマガイト シアン化カリウム 水酸化カリウム EGTA 反応順序： マグネシウム＋KCl＋カルマガイト＋KCNKOH ――――→ 発色体 23 配位子：りん 発色試薬系：モリブデン酸 硫 酸 触 媒 反応順序： ホスフエイト＋モリブデン酸 ＋硫酸触媒 ―――→ 発色体 24 配位子：塩化物 発色試薬系：尿素 チオシアン酸カリウム 塩化第２水銀 過塩素酸 過塩素酸第２水銀 過塩素酸第２鉄 反応順序： 2Cl-＋Hg（SCN）2→HgCl2＋2SCN- 3SCN-＋Fe++→Fe（SCN）3 本明細書で使つている“濁度測定試薬系”とは
特定方法により測定する配位子と相互作用して螢
光体の励起および（又は）放射波長帯と重なる波
長帯内で試験溶液の透光性、特に濁度の認めうる
変化を生ずる様な１又は２以上の試薬を含む化学
系をいう。本発明の目的のため濁度測定試薬系を
含む種々の試薬は特定反応順序によつてその添加
順序が制限されなければ単独で又は他と混合して
試験溶液に添加できる。種々の濁度測定試薬系は
この技術分野でよく知られている。濁度測定試薬
系を用いる重要な１試験は人のイムノグロブリン
の濁度測定試験である。この試験の基本原理は測
定するイムノグロブリンに特定の抗血清より成る
濁度測定試薬系と問題のイムノグロブリンの反応
による懸濁粒子より成る特殊複合物の生成に基づ
く。抗血清−イムノグロブリン複合物の生成によ
る懸濁粒子は試験溶液の濁度変化を生ずる。故に
試験溶液に人のイムノグロブリン以上に過剰の抗
血清を使用すると試料中のイムノグロブリン濃度
が増すにつれて懸濁液をとおる光は減少する。本
明細書で使う“比濁測定試薬系”とは特定方法に
より測定する配位子と相互作用し螢光体の励起お
よび（又は）放射波長帯と重なる波長帯内で試験
溶液の透光性、特に濁度の認めうる変化を生ずる
様な１又は２以上の試薬を含む化学系をいう。比
濁測定試験は濁度測定試験と同じ原理に基づく
が、但し試験溶液の比濁測定は濁度測定とちがつ
て入射光に対する角度における散乱光を測定する
のである。多くの濁度および比濁測定法がこの分
野で知られているが、この試験に使う試薬系はこ
の分野の知識ある者には容易に確かめられるであ
ろう。 本発明の方法を行なうには試験溶液を螢光計セ
ル中に入れる。励起波長の選択は使う螢光体、配
位子および試薬系による。放射スペクトルを測定
する特定波長又は帯波長は一般に放射最大によ
る。一定強さの光源を使つて放射スペクトルを検
べ特定波長又は波長の特定帯における放射強さを
測定してこの結果を既知標準と比較できる。本発
明の試験方法を測定する配位子の既知量を含む標
準と実質的に同じ方法で未知試料について行なつ
て未知試料中にある配位子量を定性的に又は定量
的に測定できるのである。 本発明の方法により測定できる配位子濃度が殆
んど使う特定螢光計と使う特定試薬系によるが、
0.01乃至0.1ｍＭの濃度の配位子を含む試料が測
定されている。 試験溶液のPHは一般に使う特定試薬系による。
試薬系のPH範囲内で螢光体が螢光を出すことが必
要である点で試薬系のPHは螢光体選択の条件であ
ろう。 ある配位子と螢光体においては配位子と螢光体
の蛋白質への非特定結合が少量であるが問題にな
らぬ量あつてもよい。蛋白質妨害が問題であれば
試料の超過、ゲル過、沈澱、透析等による予
備処理によつて試験溶液の蛋白質濃度を最少とす
ればよい。また配位子又は螢光体の蛋白質への非
特定結合は試験溶液にトリトンＸ−100などの様
な表面活性剤の添加によつて最少にできる。 本発明の方法は一般に約15−40℃、好ましくは
約25乃至40℃の温度範囲で行なわれる。試験を一
定温度で行なうことも好ましい。 次の実施例は本発明の方法を示すに役立つであ
ろう。試薬濃度と他の種々の助変数は本発明の方
法を示すのみで本発明を限定するものではない。
市販箱、即ちアボツトＡ−Gent臨床化学試薬を
用いる試験は一般に箱に用意された内容物により
試薬系として使われる。唯一の追加試薬は使用す
る特定螢光体である。また次の実施例における各
試験溶液の螢光強さ（FI）はアボツトTDX分析器
を用いて励起用485nｍと放射用525nｍの波長に
おいて測定している。次の実施例の標準曲線は各
標準液について測定した螢光強さ対標準溶液濃度
をプロツトしてつくることができる。また直線標
準曲線を望むならば各標準溶液について測定した
螢光強さ対標準液濃度の対数の負数をプロツトす
ればよい。 実施例 １ グルコース試験 未知又はグルコース標準を含む試料5μにグ
ルコースオキシダーゼ2200単位／mlを含む液25μ
、0.2MDHBSおよび10-5Mフルオレシインを
含む液25μ、および0.1％４−アミノアンチピレ
ンと西洋わさびペルオキシダーゼ400単位／mlを
含む液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん
酸塩緩衝液（PH7.5）205mlを加えた。えた試験溶
液を35℃において最大色生成をさせた。吸光度と
螢光強さを測定し０−500mg／dlグルコースを含
む標準液に対してえた結果を次表に示している。
析法には以後配位子とよばれる臨床的に重要物質
の分光又は螢光測定法がある。この方法は非常に
敏感で特殊であり、光学的性質、即ち試験溶液中
の特定配位子の存在で生ずる試験溶液の透光性又
は螢光性変化の測定に基づく。 分光試験における試験溶液内の測定される配位
子と配位子に特定の試薬系間の相互作用は試験溶
液の透光性に測定できる変化を生ずる。透過性の
変化とは既知強さの光線が試験溶液をとおつた時
の特定波長帯内の試験溶液によつて吸収された又
は散乱された光量をいう。試験溶液の透過性の変
化は既知強さをもつ単色光を試験溶液にとおし透
過又は散乱光強さの入射光強さに対する比率を検
査して測定する。試験溶液の透過性の検出できる
変化を生成するため殆んど全配位子が特定波長の
エネルギーを吸収するか又は試験溶液中特定試薬
系と相互作用するかいづれかである事実は多数の
特殊分光測定法の開発となつている。試験溶液中
の配位子測定として試験溶液の透光性の変化測定
に基づく分光測定には例えば試験溶液の色変化に
よる比色試験および試験溶液内の濁度変化による
濁度又は比濁試験がある。比色試験では試験溶液
の透光性の変化は一般に試験溶液の吸光度といい
測定する配位子と配位子に特定の試薬系の相互作
用による試験溶液の色の変化によるのである。試
験溶液の吸光度はその中の配位子濃度に比例す
る。比色試験は試験溶液の透光性、特に色の検出
できる変化を生成するため試験溶液中で問題の特
定配位子と相互作用しうる発色試薬系を利用す
る。特定配位子測定に便利な発色試薬系が多数開
発されており市販されている。比濁試験の原理は
試験溶液を光が通過する際特定物質により散乱さ
れる又は阻止される光量の測定にある。比濁試験
において問題の配位子は試験溶液中に粒子の懸濁
物をつくるため配位子に特定の試薬系と相互に作
用する。既知強さをもつ光線が試験溶液をとおる
際配位子と試薬系の相互作用で生じた粒子懸濁液
は入射光を阻止又は散乱して試験溶液をとおる光
強さを減少する。濁度測定における透光性変化は
試験溶液をとおる光強さの減少をいい、粒子懸濁
物によつて散乱又は阻止された入射光量に比例し
存在する粒子数とこの粒子の断面積による。比濁
試験は問題の配位子が配位子に特定の試薬系と相
互作用して試験溶液中粒子懸濁物を生成する点で
濁度試験と同じである。比濁試験では試験溶液の
透光性変化も粒子懸濁物によつて散乱され又は阻
止される入射光量に比例にするが、試験溶液をと
おる光強さを測定する濁度試験とちがつて試験溶
液への光入射角における散乱又は阻止された光を
測定する。したがつて比濁試験では透光性の変化
は試験溶液に入る光と入射光に対する角で散乱さ
れた光との強さの差をいう。濁度試験と比濁試験
は血液、尿、脊髄液等の分析で有効な発色試薬系
のないため比較する比色試験のない蛋白質の様な
配位子測定に使われる。ヨーエとクリムマンはニ
ユーヨーク市ウイレイ アンド サンズ社編
Photoelectric Chemical Analysis巻：
Nephelometry（1929）に種々の比濁試験につい
て記載している。 一般に螢光試験においては試験溶液中の配位子
は化学的に又は免疫学的に螢光性複合物又は共役
物に変えられて試験溶液の螢光性に検知できる変
化を生ずる。試験溶液の螢光性変化は生成した螢
光性複合物又は共役物を螢光体の励起波長帯内の
波長をもつ単色光で励起し螢光体の放射波長帯内
の波長をもつ放射光強さを測定してえられる。放
射光の螢光強さは配位子濃度に比例する。しかし
試験溶液によつて放出された螢光強さは測定する
配位子が試料中にある蛋白質又はりん酸塩の様な
非螢光性妨害物と複合する場合又は測定する配位
子を含む試料がフイルターとして働らくに十分な
色をもつて放射螢光強さを減少する場合抑制され
る。螢光測定試験の感度と特異性を最大とするた
めこれらの抑制要素があるならば分析前に非螢光
性妨害物又は色生成物質を除去するか又は試料の
第２部分に加えた内部標準を用いてこの要素の存
在を補償しまた内部標準をもつ試料を用いて全試
験法を行なうかいづれかでこれら抑制要素をなく
す必要があることがよくわかる。 本発明の目的は試験溶液によつて放射された螢
光強さが測定する配位子と配位子の存在で試験溶
液の透光性の変化を生じうる試薬系との相互作用
により生ずる透光性変化に比例する様な試験溶液
中の配位子の螢光測定法を提供するものである。
また本発明の目的は試験溶液中の配位子濃度の分
光測定か螢光測定のいづれかを利用できる新規の
試薬組成物の提供にある。 本発明は配位子を含むと思われる試料中の配位
子測定法に関するもので、その方法は上記試料、
螢光体の有効量および測定する配位子の存在で螢
光体の励起および（又は）放射波長帯となる波長
帯内で試験溶液の透光性を変えうる試薬系の有効
量を混合して試験溶液を生成し、試験溶液を螢光
体の励起波長帯内の波長をもつ光で照射した後試
験溶液によつて放射された螢光強さを試料中の配
位子濃度の尺度として測定することより成る。 本発明は更に配位子を含む溶液の透光性変化を
生じうる試薬系の有効量および試薬と配位子を含
む溶液の透光性変化と関聯した波長帯と重複する
励起および（又は）放射波長帯をもつ螢光体の有
効量より成る上記配位子を含むと思われる料中の
配位子螢光測定用新規試薬組成物に関する。 本発明の方法により生物学的試料中の配位子は
試験溶液中に上記試料、試薬系有効量および螢光
体有効量を混合して測定される。試験溶液を螢光
体の励起波長帯内の波長をもつ光で照射し試験溶
液によつて放出された螢光強さを試料中の配位子
濃度の指示として測定するのである。試験溶液に
よつて放出された螢光強さは配位子と試薬系の相
互作用から生ずる試験溶液の透光性変化に比例す
る。 本明細書で使う“試験溶液の透光性変化”とは
既知強さの光線が試験溶液をとおる時特定波長帯
内で試験溶液により吸収又は散乱された光量をい
い、一般に試験溶液の色又は濁度の変化による。
特に透過性の変化は配位子と配位子に特定な試薬
系の相互作用から実質的に生ずる様な特定波長帯
内の試験溶液により吸収された又は散乱された光
量変化をいう。透過性の変化は一般に既知強さを
もつ単色光を試験溶液にとおし入射光強さに対す
る透過又は散乱光強さの比を測定して求められ
る。透過性変化、即ち特定波長帯内の試験溶液に
より吸収又は散乱された光量変化は試験溶液中の
配位子濃度に比例する。今や配位子、試薬系およ
び螢光体を含む試験溶液において螢光体の励起お
よび（又は）放射波長帯と重なる波長帯内で配位
子と試薬系の相互作用から生ずる透過性の変化も
試験溶液から放出される螢光強さの比例的変化と
なることがわかつている。故に本発明の方法によ
り試験溶液により放出される螢光強さの変化は試
験溶液の配位子濃度に比例する。重要なことは本
発明の方法による測定する配位子、試薬系および
螢光体を含む試験溶液により放出された螢光強さ
の変化は試薬系と螢光体のみを含む試験溶液から
放出される螢光強さと比べると全く配位子と試薬
系の相互作用によつて生じた透過性変化によるも
のである。試験溶液中螢光体と他のどの成分、即
ち測定する配位子又は試薬系との間には化学的又
は免疫学的のいづれの反応もない。故に試験溶液
により放出された螢光強さは螢光体と試験溶液内
にあるかもしれない発色物質又は懸濁粒子との間
の分子間距離によるものではない。 本発明の方法によつて測定できる配位子には比
色的、濁度的又は比濁的に測定できる臨床的に重
要な物質がある。即ち配位子は試験溶液中の配位
子濃度に比例して透過性の検出できる変化を生ず
る様試薬系と相互作用しうるものでなければなら
ない。本発明の方法により分析できる代表的配位
子には例えばグルコース、ウル酸、コレステロー
ル、クレアチニン、ラクテイト、ラクテイト デ
ヒドロジエナーゼ（LDH）、トリグリセリド、イ
ムノグロブリン、ユリネステラーゼ、血清グルタ
メイト オキサラクテイトトランスアミナーゼ、
（SGOT）、血清グルタメイト ピルヴエイトトラ
ンスアミナーゼ（SGPT）、クレアチンホスホキ
ナーゼ（CPK）、エタノール、全蛋白質、アルブ
ミン、カルシウム、ビリルビン、血液尿素窒素
（BUN）、アンモニア、マグネシウム、りん、塩
化物等がある。 “螢光体”とは試薬系と配位子を含む溶液の透
光特性に関連した螢光特性をもつ化合物又はは組
成物をいう。特に螢光体と関連した励起又は放射
波長帯は配位子と試薬系の相互作用から生ずる試
験溶液の透光性変化と関連した波長帯と重複する
必要がある。また上記のとおり螢光体と測定する
配位子又は試薬系の間の化学的又は免疫学的結合
はない。他の考えは試薬系のPHに関する。螢光体
は試薬系に対し測定する配位子と相互反応するに
有効なPH範囲内で螢光を発しなければならない。
また本発明の方法に有効な螢光体は非結合および
非複合状態において螢光性である。比色試験にお
いて螢光体と関連する励起波長帯又は放射波長帯
は少なくともある程度配位子と呈色試薬系の相互
作用に関連する吸収波長帯と重複する必要があ
る。最大試験感度のためには配位子と呈色試薬系
の相互作用から生ずる吸収波長帯が螢光体に関連
する励起波長帯と放射帯の両方と重複することが
好ましい。濁度試験又は比濁試験では螢光体に関
連した励起又は放射波長帯は少なくもある程度配
位子と濁度測定又は比濁測定試薬系を含む試験溶
液の濁度が測定される様な波長帯と重複する必要
がある。本明細書で透光性変化と関連した波長帯
および螢光体の励起および（又は）放射波長帯の
“重複”はそれぞれの波長帯の一部又は全部の重
複のいずれかをいう。 本発明の方法には広く種々の螢光体が使用でき
る。すでに述べたとおり螢光体の選択は測定する
特定配位子と使用する試薬系によるだろう。本発
明の方法に使用できる螢光体の代表的なものは例
えばフルオレシイン、ローダミン、フラビン、ク
ーマリン、ナフタレン、アクリジン、アンスラセ
ン、多核溶融炭化水素、スチルベン、アントラニ
ル酸、アミノスチリルピリジン、キノリン、サリ
チル酸、シアニン、オクソノール、フエナンチジ
ン、フルオレスカミン並びにその誘導体と塩があ
る。使用できる螢光体の特例には例えばエオシ
ン、ローダミン、アミノナフタレンスルホネイ
ト、アクリフラビン、フルオレシイン、ジヒドロ
キシ安息香酸、ヒドロキシキノリン、NADH、
リボフラビン、ブリリアントサルフアフラビン、
キニン、ナフトールスルホン酸、チオフラビン、
クーマリン、アクリジンオレンジ、８−キノリン
−１−ナフタレンスルホン酸、オキサジン、ウン
ベリフエロン、アクリジン、レゾルフインおよび
これらの誘導体と塩がある。本発明の方法に有効
な螢光体の選択はこの分野の技術をもつ者には容
易に確認できるだろう。本明細書で使う“螢光体
の有効量”とは試験溶液に配位子とそれに特定の
試薬系を加えた場合試験溶液によつて放出される
螢光強さの認められる変化を生ずるに十分な試験
溶液中の螢光体濃度をいう。この有効量は一般に
この技術分野の知識ある者によつて確かめられ、
例えば特定試薬系、測定する配位子、特定螢光体
又は螢光強さ測定器械の様な１又は２以上の要素
による。 本明細書で使う“試薬系”とは問題の配位子の
存在で螢光体の励起および（又は）放射波長帯と
重なる波長帯内の試験溶液の透過性変化を生ずる
１又は２以上の試薬を含む化学系をいう。本発明
の方法に有効な試薬系は測定する特定配位子に依
りまた測定する透過性変化が試験溶液の色又は濁
度の変化によるかどうかである。試験溶液の色変
化が試験溶液の透光性変化と関連する比色試験で
は呈色試薬系が試薬系として使われる。濁度、即
ち懸濁粒子によつて阻止又は散乱される光量が試
験溶液の透過性変化と関連する濁度又は比濁試験
では濁度測定試薬系又は比濁測定試薬系がそれぞ
れ使われる。 本明細書で使用する“呈色試薬系”とは透過
性、特に螢光体の励起および（又は）放射波長帯
と重なる波長帯内で試験溶液の比色性の認められ
る変化を生ずる様測定する配位子と特定反応順序
によつて反応する１又は２以上の試薬を含む化学
系をいう。本発明の目的のためこの呈色試薬系を
含む種々の試薬はその添加順序が特定反応順序に
よつて制限されない限り単独で又は混合して試験
溶液に添加できる。配位子の比色測定に利用でき
る呈色試薬系はこの分野ではよく知られており、
例えばニユーヨーク、ヘーバーメデイカルデイビ
ジヨン、ハーパー アンド ロー（1964）のヘン
リーらのClivical Chemistry、Principles and
Techniques；W.B.サウンダース カンパニー
（1970）のテイーツのFundamentals of Clinical
Chemistryの文献がある。種々の試験道具箱と試
薬系が市販されており標準法と試薬を用いる。一
般にこの比色法は配位子が発色試薬を含む呈色試
薬系と反応して試験溶液中に認めうる変化を生じ
るという原理に基づく。代表的呈色試薬系には例
えば終点と運動測定を含むオキシダーゼ反応系と
NADH／NAD反応系がある。例えばオキシダー
ゼ反応系は配位子と反応して過酸化水素を放出し
それが次いでペルオキシダーゼの存在で染料と反
応して試料中の配位子量の指示として試験溶液の
比色性変化を生ずる酸化性酵素を利用する。
NADH／NAD反応系はNADのNADHへの還元
又はNADHのNADへの酸化とつづく染料系との
反応による試料中の配位子濃度尺度としての試験
溶液の比色性変化生成に基づく。本明細書で使う
“試薬系の有効量”とは配位子の存在において試
験溶液の比色性の認めうる変化を生ずるに十分な
試薬系の量をいう。この有効量はこの技術知識を
もつものには容易に確かめられるだろう。 次は本発明の方法により使用できる種々の呈色
試薬系とその反応順序を示すに役立つだろう。次
の記号を本明細書で使用している： DHBS ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム、 AAP ４−アミノアンチピリジン、 HRPO 西洋わさび ペルオキシダーゼ、 NAD 酸化されたニコチンアミド−アデニンジ
ヌクレオチド、 NADH 還元されたニコチンアミド−アデニン
ジヌクレオチド、 LDH ラクテイト デヒドロジエナーゼ、 SGOT 血清グルタミツク オキザルアセチツク
トランスアミナーゼ、 SGPT 血清グルタミツク ピルヴイツク トラ
ンスアミナーゼ、 CPK クレアチン ホスホキナーゼ、 INT ２−（ｐ−アイオドフエニル）−３−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニルテトラゾリウ
ム塩化物、 ATP アデノシン トリホスフエイト ADP アデノシン ジホスフエイト EGTA エチレングリコール−ビス（β−アミ
ノエチレンエーテル）−Ｎ，N′−テトラ酢酸 また次の反応順序のある生成物の特定構造が不
確実なため試験溶液の色を生じ分光測定試験で測
定される特定反応順序の生成物は詳しく固定しな
い限り一般に本明細書では“発色体”という。
NADH／NAD系を示している反応順序11−16に
おいて試験溶液の色を生ずる生成物はフオルマジ
ンである。血液尿素窒素の試験を示す反応順序21
において試験溶液の色を生ずる生成物はインドフ
エノールである。塩化物の試験を示す反応順序24
においては試験溶液の色を生ずる生成物はチオシ
アン酸第２鉄である。 １ 配位子：グルコース 発色試薬系：グルコースオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： Ｄ−グルコース＋O2＋H2Oグルコースオキシダーゼ ―――――――――――――→ Ｄ−グルコン酸＋H2O2 2H2O＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ２ 配位子：ウル酸 発色試薬系：ウリカーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： ウル酸＋O2＋2H2Oウリカーズ ――――――→ アラントイン＋CO2＋H2O2 2H2O＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ３ 配位子：コレステロール（コレステロールと
コレステロールエステル） 発色試薬系：コレステロールエステラーゼ コレステロールオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： コレステロールエステルコレステロールエステラー
ゼ ――――――――――――――――→ コレステロール コレステロール＋O2コレステロールオキシダーゼ ――――――――――――――――→ △4コレステロン＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ４ 配位子：クレアチニン 発色試薬系：クレアチニナーゼ クレアチナーゼ サルコシンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： クレアチニン＋H2Oクレアチニナーゼ ――――――――――→ クレアチン クレアチン＋H2Oクレアチナーゼ ―――――――――→ サルコシン＋尿素 サルコシン＋H2O＋O2サルコシンオキシダーゼ ――――――――――――――→ 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ５ 配位子：ラクテイト 発色試薬系：NAD LDH ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序 ラクテイト＋NADLDH ――――→ ピルヴエイト＋NADH ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ アセチルホスフエイト＋CO2＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ６ 配位子：トリグリセリド 発色試薬系：リパーゼ グリセロールキナーゼ グリセロールホスフエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： トリグリセリド＋3H2Oリパーゼ ―――――→ グリセロール＋脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ――――――――――――→ グリセロール−３−ホスフエイト＋ADP グリセロール＋３−ホスフエイト グリセロールホスフエイトオキシダーゼ ――――――――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエイト＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ７ 配位子：コリネステラーゼ 発色試薬系：アセチルコリネステラーゼ コリンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アセチルコリンアセチルコリネステラーゼ ―――――――――――――――→ コリン＋アセテイト コリン＋O2コリンオキシダーゼ ―――――――――――→ 2H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ８ 配位子：SGOT 発色試薬系：アスパレイト α−ケトグルタレイト オキサロアセテイトデカルボキシラーゼ ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アスパレイト＋α−ケトグルタレイトSGOT ―――――→ グルタメイト＋オキサロアセテイト オキサロアセテイトオキサロアセテイトデカルボキ
シラーゼ ――――――――――――――――――――――→ ピルヴエイト＋CO2 ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ H2O2＋アセチルホスフエイト＋CO2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 ９ 配位子：SGPT 発色試薬系：Ｌ−アラニン α−ケトグルタレイト ピルヴエイトオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： アラニン＋α−ケトグルタレイトSGPT ―――――→ グルタメイト＋ピルヴエイト ピルヴエイト＋O2ピルヴエイトオキシダーゼ ―――――――――――――――→ アセチルホスフエイト＋H2O2＋CO2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 10 配位子：CPK 配色系：クレアチンホスフエイト クレアチナーゼ サルコシンオキシダーゼ DHBS AAP HRPO 反応順序： クレアチンホスフエイト＋ADPCPX ――――→ クレアチン＋ATP クレアチン＋H2Oクレアチナーゼ ――――――――→ サルコシン＋尿素 サルコシン＋H2O＋O2サルコシンオキシダーゼ ――――――――――――――→ Ｏ ‖ グリシン＋HCH＋H2O2 2H2O2＋DHBS＋AAPHRPO ―――――→ 発色体 11 配位子：エタノール 発色試薬系：NAD アルコールデヒドロジエナーゼ INT デイアフオラーゼ 反応順序： エタノール＋NADアルコールデヒドロジエナーゼ ―――――――――――――――――→ NADH＋アセタルデヒド NADH＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 12 配位子：SGOT 発色試薬系：アスパラテイト α−ケトグルタレイト NAD グルタメイトデヒドロジエナーゼ デイアフオラーゼ INT 反応順序： アスパレイト＋α−ケトグルタレイトSGOT ―――――→ グルタメイト＋オキサロアセテイト NAD＋グルタメイト＋H2Oグルタメイトデヒドロジエ
ナーゼ ――――――――――――――――→ NADH＋２ −オクソグルタレイト＋NH3 NADA＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 13 配位子：SGPT 発色試薬系：Ｌ−アラニン α−ケトグルタレイト NAD グルタレイトデヒドロジエナーゼ デイアフオラーゼ INT 反応順序 アラニン＋α−ケトグルタレイトSGPT ―――――→ グルタメイト＋ピルヴエイト グルタメイト＋NAD＋H2Oグルタメイトデヒドロジエ
ナーゼ ――――――――――――――――――→ NADH ＋２−オクソグルタレイト＋NH3 NADH＋INTデイアフオラーゼ ――――――――――→ NAD＋ホルマジン 14 配位子：グルコース 発色試薬系：ATP ヘクソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエイトデヒドロジエナ
ーゼ INT デイアフオラーゼ 反応順序： グルコース＋ATPヘクソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−ホスフエイト＋ADP グルコース−６−ホスフエイト ＋NADグルコース‐６‐ホスフエイトデヒドロジエ
ナーゼ ＋NADグルコース‐６‐ホスフエイトデヒドロジエ
ナーゼ ―――――――――――――――――――――――――
――――→ NAD＋グルコネイト−６−ホスフエイ
ト NADH＋INHデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 15 配位子 CPK 発色試薬系 クレアチンホスフエイト ADP グルコース ヘクソキナーゼ NAD グルコース−６−ホスフエイトデヒドロジエナ
ーゼ INT デイアホラーゼ 反応順序： クレアチンホスフエイト＋ADPCPK ――――→ クレアチン＋ATP グルコース＋ATPヘクソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−ホスフエイト＋ADP グルコース−６−ホスフエイト＋NAD グルコース‐６‐ホスフエイト ―――――――――――――――――――→ NADH＋グルコネイト−６−ホスフエイト NADH＋INTデイアホラーゼ ――――――――→ NAD＋ホルマジン 16 配位子：LDH 発色試薬系：Ｌ−ラクテイト NAD INT デイアホラーゼ 反応順序： Ｌ−ラクテイト＋NADLAD NADH＋ピルヴエイト NADH＋INTデイアフオラーゼ ―――――――――→ NAD＋ホルマジン 17 配位子：全蛋白質 発色試薬系：銅タータレイト ナトリウムタータレイト リチウムアセテイト 反応順序： 蛋白質＋銅タータレイト＋ナトリウムタータレイト
＋リチウム水酸化物→発色体 18 配位子：アルブミン 発色試薬系：ブロムクレオゾルグリーン 反応順序： アルブミン＋ブロムクレオゾルグリーン→発色
体 19 配位子：カルシウム 発色試薬系：Ｏ−クレゾールフタレインコンプ
レクソン ８−キノリノ硫酸塩 反応順序： カルシウム＋Ｏ−クレゾールフタレイン＋８−キノ
リノル硫酸塩→発色体 20 配位子：ビリルビン 発色試薬系：２，４−ジクロロアニリンのジア
ゾニウム塩 メタノール スルフアミン酸 反応順序： ビリルビン＋２，４−ジクロロアニリンのジアゾニ
ウム塩メタノール ――――――――→ スルフアミン酸発色体 21 配位子：血液尿素窒素（尿素） 発色試薬系：ウレアーゼ 次亜塩素酸ナトリウム フエノール 水酸化ナトリウム ナトリウムニトロプルシド 反応順序： 尿素ウレアーゼ ――――――→ 2NH3＋CO2 2NH3＋2NaClO→2NH2Cl＋2NaOH 2NH2Cl＋２フエノール＋2NaOH→2p−アミノフエノ
ール＋2NaCl＋2H2O ２ｐ−アミノフエノール＋２フエノール＋O2→２イ
ンドフエノール＋2H2O 22 配位子：マグネシウム 発色試薬系：塩化カリウム カルマガイト シアン化カリウム 水酸化カリウム EGTA 反応順序： マグネシウム＋KCl＋カルマガイト＋KCNKOH ――――→ 発色体 23 配位子：りん 発色試薬系：モリブデン酸 硫 酸 触 媒 反応順序： ホスフエイト＋モリブデン酸 ＋硫酸触媒 ―――→ 発色体 24 配位子：塩化物 発色試薬系：尿素 チオシアン酸カリウム 塩化第２水銀 過塩素酸 過塩素酸第２水銀 過塩素酸第２鉄 反応順序： 2Cl-＋Hg（SCN）2→HgCl2＋2SCN- 3SCN-＋Fe++→Fe（SCN）3 本明細書で使つている“濁度測定試薬系”とは
特定方法により測定する配位子と相互作用して螢
光体の励起および（又は）放射波長帯と重なる波
長帯内で試験溶液の透光性、特に濁度の認めうる
変化を生ずる様な１又は２以上の試薬を含む化学
系をいう。本発明の目的のため濁度測定試薬系を
含む種々の試薬は特定反応順序によつてその添加
順序が制限されなければ単独で又は他と混合して
試験溶液に添加できる。種々の濁度測定試薬系は
この技術分野でよく知られている。濁度測定試薬
系を用いる重要な１試験は人のイムノグロブリン
の濁度測定試験である。この試験の基本原理は測
定するイムノグロブリンに特定の抗血清より成る
濁度測定試薬系と問題のイムノグロブリンの反応
による懸濁粒子より成る特殊複合物の生成に基づ
く。抗血清−イムノグロブリン複合物の生成によ
る懸濁粒子は試験溶液の濁度変化を生ずる。故に
試験溶液に人のイムノグロブリン以上に過剰の抗
血清を使用すると試料中のイムノグロブリン濃度
が増すにつれて懸濁液をとおる光は減少する。本
明細書で使う“比濁測定試薬系”とは特定方法に
より測定する配位子と相互作用し螢光体の励起お
よび（又は）放射波長帯と重なる波長帯内で試験
溶液の透光性、特に濁度の認めうる変化を生ずる
様な１又は２以上の試薬を含む化学系をいう。比
濁測定試験は濁度測定試験と同じ原理に基づく
が、但し試験溶液の比濁測定は濁度測定とちがつ
て入射光に対する角度における散乱光を測定する
のである。多くの濁度および比濁測定法がこの分
野で知られているが、この試験に使う試薬系はこ
の分野の知識ある者には容易に確かめられるであ
ろう。 本発明の方法を行なうには試験溶液を螢光計セ
ル中に入れる。励起波長の選択は使う螢光体、配
位子および試薬系による。放射スペクトルを測定
する特定波長又は帯波長は一般に放射最大によ
る。一定強さの光源を使つて放射スペクトルを検
べ特定波長又は波長の特定帯における放射強さを
測定してこの結果を既知標準と比較できる。本発
明の試験方法を測定する配位子の既知量を含む標
準と実質的に同じ方法で未知試料について行なつ
て未知試料中にある配位子量を定性的に又は定量
的に測定できるのである。 本発明の方法により測定できる配位子濃度が殆
んど使う特定螢光計と使う特定試薬系によるが、
0.01乃至0.1ｍＭの濃度の配位子を含む試料が測
定されている。 試験溶液のPHは一般に使う特定試薬系による。
試薬系のPH範囲内で螢光体が螢光を出すことが必
要である点で試薬系のPHは螢光体選択の条件であ
ろう。 ある配位子と螢光体においては配位子と螢光体
の蛋白質への非特定結合が少量であるが問題にな
らぬ量あつてもよい。蛋白質妨害が問題であれば
試料の超過、ゲル過、沈澱、透析等による予
備処理によつて試験溶液の蛋白質濃度を最少とす
ればよい。また配位子又は螢光体の蛋白質への非
特定結合は試験溶液にトリトンＸ−100などの様
な表面活性剤の添加によつて最少にできる。 本発明の方法は一般に約15−40℃、好ましくは
約25乃至40℃の温度範囲で行なわれる。試験を一
定温度で行なうことも好ましい。 次の実施例は本発明の方法を示すに役立つであ
ろう。試薬濃度と他の種々の助変数は本発明の方
法を示すのみで本発明を限定するものではない。
市販箱、即ちアボツトＡ−Gent臨床化学試薬を
用いる試験は一般に箱に用意された内容物により
試薬系として使われる。唯一の追加試薬は使用す
る特定螢光体である。また次の実施例における各
試験溶液の螢光強さ（FI）はアボツトTDX分析器
を用いて励起用485nｍと放射用525nｍの波長に
おいて測定している。次の実施例の標準曲線は各
標準液について測定した螢光強さ対標準溶液濃度
をプロツトしてつくることができる。また直線標
準曲線を望むならば各標準溶液について測定した
螢光強さ対標準液濃度の対数の負数をプロツトす
ればよい。 実施例 １ グルコース試験 未知又はグルコース標準を含む試料5μにグ
ルコースオキシダーゼ2200単位／mlを含む液25μ
、0.2MDHBSおよび10-5Mフルオレシインを
含む液25μ、および0.1％４−アミノアンチピレ
ンと西洋わさびペルオキシダーゼ400単位／mlを
含む液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん
酸塩緩衝液（PH7.5）205mlを加えた。えた試験溶
液を35℃において最大色生成をさせた。吸光度と
螢光強さを測定し０−500mg／dlグルコースを含
む標準液に対してえた結果を次表に示している。
【表】
これらの結果から未知試料中のグルコース濃度
が決定できる様な標準曲線をえることができる。 実施例 ２ ウル酸試験 未知又はウル酸標準を含む試料20μにウリカ
ーゼ10単位／mlを含む液25μ、0.2M DHBSと
10-5Mフルオレシインを含む液25μおよび0.1％
４−アミノアンチピレンと西洋わさびペルオキシ
ダーゼ400単位／mlを含む液25μを含む牛ガン
マグロブリンとのりん酸塩緩衝液（PH7.5）2.05
mlを加えた。えた試験溶液を35℃で５分間培養し
試験溶液の螢光強さを測定した。０−９mg／dlの
ウル酸を含む試料からえられた結果を次表に示
す。 ウル酸濃度（mg／mg） FI ０ 57588 ２ 54440 ４ 52431 ５ 51426 ６ 50774 ９ 47767 この結果から未知試料中のウル酸濃度を決定で
きる様な標準曲線をつくることができる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolおよび化学調整試料
について測定したウル酸濃度を表わす。
が決定できる様な標準曲線をえることができる。 実施例 ２ ウル酸試験 未知又はウル酸標準を含む試料20μにウリカ
ーゼ10単位／mlを含む液25μ、0.2M DHBSと
10-5Mフルオレシインを含む液25μおよび0.1％
４−アミノアンチピレンと西洋わさびペルオキシ
ダーゼ400単位／mlを含む液25μを含む牛ガン
マグロブリンとのりん酸塩緩衝液（PH7.5）2.05
mlを加えた。えた試験溶液を35℃で５分間培養し
試験溶液の螢光強さを測定した。０−９mg／dlの
ウル酸を含む試料からえられた結果を次表に示
す。 ウル酸濃度（mg／mg） FI ０ 57588 ２ 54440 ４ 52431 ５ 51426 ６ 50774 ９ 47767 この結果から未知試料中のウル酸濃度を決定で
きる様な標準曲線をつくることができる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolおよび化学調整試料
について測定したウル酸濃度を表わす。
【表】
実施例 ３
コレステロール試験
未知又はコレステロール標準を含む試料10μ
をコレステロールエステラーゼ110単位／ml、コ
レステロールオキシダーゼ100単位／ml、20％ト
リトンＸ−100および0.2Mコレイトを含む液25μ
；約１×10-5Mフルオレシインと0.2M DHBS
を含む液25μ；0.1％４−アミノアンチピレンお
よび西洋わさびペルオキシダーゼ400μ／mlを含
む液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん酸
塩緩衝液（PH7.5）2.05mlを加えた。 えた試験溶液を35℃で５分間培養した。コレス
テロール０−400mg／dl含む標準液からえた結果
は次表のとおりである： コレステロール酸濃度（mg／dl） FI ０ 65175 50 56909 100 49998 200 38404 300 29149 400 22273 この結果から未知試料中のコレステロール濃度
が決定できる様な標準曲線をえられる。 次表は上記表中の結果からつくつた標準曲線を
用いてDade Moni−Trol とについて決定
したコレステロール濃度を示す。
をコレステロールエステラーゼ110単位／ml、コ
レステロールオキシダーゼ100単位／ml、20％ト
リトンＸ−100および0.2Mコレイトを含む液25μ
；約１×10-5Mフルオレシインと0.2M DHBS
を含む液25μ；0.1％４−アミノアンチピレンお
よび西洋わさびペルオキシダーゼ400μ／mlを含
む液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん酸
塩緩衝液（PH7.5）2.05mlを加えた。 えた試験溶液を35℃で５分間培養した。コレス
テロール０−400mg／dl含む標準液からえた結果
は次表のとおりである： コレステロール酸濃度（mg／dl） FI ０ 65175 50 56909 100 49998 200 38404 300 29149 400 22273 この結果から未知試料中のコレステロール濃度
が決定できる様な標準曲線をえられる。 次表は上記表中の結果からつくつた標準曲線を
用いてDade Moni−Trol とについて決定
したコレステロール濃度を示す。
【表】
実施例 ４
全蛋白質試験
1.5×10-7Mフルオレシインを含む様調節され
た再構成されたアボツトＡ−Gent全蛋白質試薬
３mlに未知又は標準を含む試料50μを加えた。
試薬と試料を混合し少なくも10分間20℃で培養し
た。試験溶液の螢光強さを測定し蛋白質０−８
ｇ／dlを含む標準液についてえた結果を次表に示
している。 蛋白質濃度（mg／dl） FI ０ 54068 ４ 37383 ６ 32760 ８ 27792 この結果から未知試料中の全蛋白質濃度を決定
できる様な標準曲線をえられる。 実施例 ５ LDH試験 未知又は標準液を含む試料20μにリチウム−
Ｌ−ラクテイト250mg／mlとNAD125mg／mlを含
む液25μ、INT25mg／mlと１×10-5Mフルオレ
シインを含む50％エタノール溶液25μおよびジ
アホラーゼ100単位／mlを含む50％グリセロール
液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん酸塩
緩衝液2.05mlを加えた。試料と試験溶液を混合し
えた試験溶液を35℃で14分間培養し試験溶液の螢
光強さを測定した。LDH0−500単位／を含む
標準液でえた結果を次表に示している。 LDH活性（単位／ml） FI ０ 45797 50 43170 100 41470 200 38484 300 35909 500 28021 この結果から未知試料中のLDH濃度を決定で
きる様な標準曲線がえられる。 実施例 ６ クレアチニン試験 ピクリン酸5.5mlと2.5N水酸化ナトリウム1.1ml
を含む水溶液20mlに10-5Mフルオレシイン200μ
を加えて10-7Mフルオレシインを含む試薬液をつ
くつた。上記試薬液２mlに未知又は標準を含む試
料100μを加えた。えた試験溶液を35℃で約15
分間培養し試験溶液の螢光強さを測定した。クレ
アチニン０−10mg／dlを含む標準液についてえた
結果を次表に示す： クレアチニン濃度（mg／dl） FI ０ 8282 ２ 7665 ６ 6159 10 4972 この結果から未知試料中のクレアチニン濃度を
決定できる様な標準曲線がえられる。 実施例 ７ BUN試験 未知又は標準を含む試料20μに0.1Mりん酸カ
リウム（PH7.5）緩衝液；牛ガンマグロブリン；
0.1％アジ化ナトリウム；ウレアーゼ130単位／ml
を含む５％グリセロール液25μ；１ml水にナト
リウムニトロプルシツド300mgの液をフエノール
５ml、グリセロール１mlおよびエタノール１mlお
よび十分なフルオレシインに加えてつくつた
10-5Mフルオレシイン液25μ；および5.7％次亜
塩素酸ナトリウムを含む液50mlに水酸化ナトリウ
ム25ｇを加えてつくつた液25μより成る試験溶
液2.050mlを加えた。試料と試験溶液を混合しえ
た試験溶液を35℃で約５分間培養した。試験溶液
の螢光強さを測定し尿素０−100mg／dlを含む標
準液の螢光強さを次表に示している：尿素濃度（mg／dl） FI ０ 31847 6.25 28713 12.5 25745 25 20962 50 15538 100 8798 この結果から未知試料中の尿素濃度を決定でき
る様な標準曲線がえられる。 実施例 ８ ビリルビン試験 10-7Mフルオレシインを含む様調整された再構
成されたアボツトＡ−Gentビリルビン試薬２ml
に未知又は標準を含む試料50μを加えた。試薬
と試料を混合し37℃で約10分間培養した。えた試
験溶液の螢光強さを測定しビリルビン０−20.2
mg／dlを含む標準液についてえた結果を次表に示
している：ビリルビン濃度（mg／dl） FI ０ 65256 ４ 59371 10.1 50353 20.2 32740 この結果から未知試料中のビリルビン濃度を決
定できる様な標準曲線がえられる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolと化学調整試料につ
いて決定したビリルビン濃度を表わす。
た再構成されたアボツトＡ−Gent全蛋白質試薬
３mlに未知又は標準を含む試料50μを加えた。
試薬と試料を混合し少なくも10分間20℃で培養し
た。試験溶液の螢光強さを測定し蛋白質０−８
ｇ／dlを含む標準液についてえた結果を次表に示
している。 蛋白質濃度（mg／dl） FI ０ 54068 ４ 37383 ６ 32760 ８ 27792 この結果から未知試料中の全蛋白質濃度を決定
できる様な標準曲線をえられる。 実施例 ５ LDH試験 未知又は標準液を含む試料20μにリチウム−
Ｌ−ラクテイト250mg／mlとNAD125mg／mlを含
む液25μ、INT25mg／mlと１×10-5Mフルオレ
シインを含む50％エタノール溶液25μおよびジ
アホラーゼ100単位／mlを含む50％グリセロール
液25μを含む牛ガンマグロブリンとのりん酸塩
緩衝液2.05mlを加えた。試料と試験溶液を混合し
えた試験溶液を35℃で14分間培養し試験溶液の螢
光強さを測定した。LDH0−500単位／を含む
標準液でえた結果を次表に示している。 LDH活性（単位／ml） FI ０ 45797 50 43170 100 41470 200 38484 300 35909 500 28021 この結果から未知試料中のLDH濃度を決定で
きる様な標準曲線がえられる。 実施例 ６ クレアチニン試験 ピクリン酸5.5mlと2.5N水酸化ナトリウム1.1ml
を含む水溶液20mlに10-5Mフルオレシイン200μ
を加えて10-7Mフルオレシインを含む試薬液をつ
くつた。上記試薬液２mlに未知又は標準を含む試
料100μを加えた。えた試験溶液を35℃で約15
分間培養し試験溶液の螢光強さを測定した。クレ
アチニン０−10mg／dlを含む標準液についてえた
結果を次表に示す： クレアチニン濃度（mg／dl） FI ０ 8282 ２ 7665 ６ 6159 10 4972 この結果から未知試料中のクレアチニン濃度を
決定できる様な標準曲線がえられる。 実施例 ７ BUN試験 未知又は標準を含む試料20μに0.1Mりん酸カ
リウム（PH7.5）緩衝液；牛ガンマグロブリン；
0.1％アジ化ナトリウム；ウレアーゼ130単位／ml
を含む５％グリセロール液25μ；１ml水にナト
リウムニトロプルシツド300mgの液をフエノール
５ml、グリセロール１mlおよびエタノール１mlお
よび十分なフルオレシインに加えてつくつた
10-5Mフルオレシイン液25μ；および5.7％次亜
塩素酸ナトリウムを含む液50mlに水酸化ナトリウ
ム25ｇを加えてつくつた液25μより成る試験溶
液2.050mlを加えた。試料と試験溶液を混合しえ
た試験溶液を35℃で約５分間培養した。試験溶液
の螢光強さを測定し尿素０−100mg／dlを含む標
準液の螢光強さを次表に示している：尿素濃度（mg／dl） FI ０ 31847 6.25 28713 12.5 25745 25 20962 50 15538 100 8798 この結果から未知試料中の尿素濃度を決定でき
る様な標準曲線がえられる。 実施例 ８ ビリルビン試験 10-7Mフルオレシインを含む様調整された再構
成されたアボツトＡ−Gentビリルビン試薬２ml
に未知又は標準を含む試料50μを加えた。試薬
と試料を混合し37℃で約10分間培養した。えた試
験溶液の螢光強さを測定しビリルビン０−20.2
mg／dlを含む標準液についてえた結果を次表に示
している：ビリルビン濃度（mg／dl） FI ０ 65256 ４ 59371 10.1 50353 20.2 32740 この結果から未知試料中のビリルビン濃度を決
定できる様な標準曲線がえられる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolと化学調整試料につ
いて決定したビリルビン濃度を表わす。
【表】
実施例 ９
カルシウム試験
1.5×10-7Mフルオレシインを含む様調整され
た再構成アボツトＡ−Gentカルシウム試薬３ml
に未知又はカルシウム標準を含む試料100μを
加えた。試薬と試料を混合し20℃で約10分間培養
した。試験溶液の螢光強さを測定しカルシウム０
−12mg／dlを含む標準液についてえた結果を次表
に示している：カルシウム酸濃度（mg／dl） FI ０ 41881 ８ 30762 10 29029 12 26416 この結果から未知試料中のカルシウム濃度を決
定できる様な標準曲線がえられる。 実施例 10 アルブミン試験 ５×10-5Mブリリアントサルフアフラヴインを
含む様調整された再構成アボツトＡ−Gentアル
ブミン試薬２mlに未知又は標準を含む試料10μ
を加えた。試薬と試料を混合し20℃で５分間培養
した。えた試験溶液の螢光強さを測定しアルブミ
ン０−８ｇ／dlを含む標準液についてえた結果は
次表の通りである：アルブミン濃度（mg／dl） FI ０ 2888 ３ 2430 ８ 2056 この結果から未知試料中のアルブミン濃度を決
定できる様な標準曲線がえることができる。 実施例 11 塩化物試験 ５×10-5Mブリリアントサルフアフラヴインを
含む様調整されたハーレコ塩化物デペローピング
試薬２mlに未知又は標準を含む試料20μを加え
た。えた混合物に0.2M過塩素酸第２水銀溶液１
滴を加ええた試験溶液の螢光強さを測定した。塩
化物０−200meq／を含む標準液についてえた
結果を次表に示す：塩化物濃度（meq／） FI ０ 54047 50 48959 100 23900 200 10368 この結果から未知試料中の塩化物濃度を決定で
きる様な標準曲線がえられる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolと化学調整試料につ
いてえた塩化物酸濃度を示している：
た再構成アボツトＡ−Gentカルシウム試薬３ml
に未知又はカルシウム標準を含む試料100μを
加えた。試薬と試料を混合し20℃で約10分間培養
した。試験溶液の螢光強さを測定しカルシウム０
−12mg／dlを含む標準液についてえた結果を次表
に示している：カルシウム酸濃度（mg／dl） FI ０ 41881 ８ 30762 10 29029 12 26416 この結果から未知試料中のカルシウム濃度を決
定できる様な標準曲線がえられる。 実施例 10 アルブミン試験 ５×10-5Mブリリアントサルフアフラヴインを
含む様調整された再構成アボツトＡ−Gentアル
ブミン試薬２mlに未知又は標準を含む試料10μ
を加えた。試薬と試料を混合し20℃で５分間培養
した。えた試験溶液の螢光強さを測定しアルブミ
ン０−８ｇ／dlを含む標準液についてえた結果は
次表の通りである：アルブミン濃度（mg／dl） FI ０ 2888 ３ 2430 ８ 2056 この結果から未知試料中のアルブミン濃度を決
定できる様な標準曲線がえることができる。 実施例 11 塩化物試験 ５×10-5Mブリリアントサルフアフラヴインを
含む様調整されたハーレコ塩化物デペローピング
試薬２mlに未知又は標準を含む試料20μを加え
た。えた混合物に0.2M過塩素酸第２水銀溶液１
滴を加ええた試験溶液の螢光強さを測定した。塩
化物０−200meq／を含む標準液についてえた
結果を次表に示す：塩化物濃度（meq／） FI ０ 54047 50 48959 100 23900 200 10368 この結果から未知試料中の塩化物濃度を決定で
きる様な標準曲線がえられる。 次表は上記表の結果からつくつた標準曲線を用
いてDade Moni−Trolと化学調整試料につ
いてえた塩化物酸濃度を示している：
【表】
実施例 12
マグネシウム試験
５×10-7Mフルオレシインを含む様調整された
マグネシウム染料試薬（P.L.バイオケミカルズ
社）1.0mlにマグネシウム主体試薬（P.L.バイオ
ケミカルズ社）1.0mlと未知又は標準を含む試料
20μを加えた。えた試験溶液を20℃で少なくも
１分間放置し試験溶液の螢光強さを測定した。マ
グネシウム０−6.0meq／を含む標準液につい
てえた結果を次表に示している：マグネシウム濃度（meq／） FI ０ 31612 2.0 22510 4.0 17330 6.0 12802 この結果から未知試料中のマグネシウム濃度を
決定できる標準曲線がえられる。 次表は上記の結果からつくつた標準曲線を用い
てDade Moni−Trolおよび化学調整試料に
ついて測定したマグネシウム濃度を示している：
マグネシウム染料試薬（P.L.バイオケミカルズ
社）1.0mlにマグネシウム主体試薬（P.L.バイオ
ケミカルズ社）1.0mlと未知又は標準を含む試料
20μを加えた。えた試験溶液を20℃で少なくも
１分間放置し試験溶液の螢光強さを測定した。マ
グネシウム０−6.0meq／を含む標準液につい
てえた結果を次表に示している：マグネシウム濃度（meq／） FI ０ 31612 2.0 22510 4.0 17330 6.0 12802 この結果から未知試料中のマグネシウム濃度を
決定できる標準曲線がえられる。 次表は上記の結果からつくつた標準曲線を用い
てDade Moni−Trolおよび化学調整試料に
ついて測定したマグネシウム濃度を示している：
【表】
実施例 13
グルコース試験
未知又はグルコース標準を含む試料5μにグ
ルコースオキシダーゼ2200単位／ml、チメルゾル
0.025mg／mlおよび1.5M硫酸アンモニウムを含む
液25μ；0.2MDHBS、0.1％フエリシアン化カ
リウム、0.1％４−アミノアンチピレン、0.1％ト
リトンＸ−100、チメルゾル0.025mg／mlおよびリ
ボフラヴイン5.633×10-4モル／を含む0.1Mり
ん酸塩緩衝液25μ；および西洋わさびペルオキ
シダーゼ400単位／ml、10％子牛血清、0.6ｍ
MEDTA、0.1％ANS、１％トリトンＸ−100、
リパーゼ2000単位／ml、チメルゾル0.025ｇ／ml
を含む0.1Mりん酸塩緩衝液25試料を含み牛ガン
マグロブリンを含むりん酸塩緩衝液（PH7.0）
2.05mlを加えた。えた試験溶液を35℃で最大色生
成をえる迄培養した。吸光度と螢光強さを測定し
グルコース０−500mg／dlを含む標準液について
えた結果は次表のとおりである：グルコース濃度（mg／dl） FI ０ 37432 50 28731 100 22019 200 12547 300 7291 500 2269 実施例 14 イムノグロブリンＧ（IgG）試験 アボツトＡ−GentイムノグロブリンＧ臨床化
学診断箱で供給された試薬を使い山羊抗−人間
IgG抗血清400μを４％ポリエチレングリコール
を含むりん酸塩緩衝塩溶液11.6mlと混合してつく
つた働らく抗血清試薬2.5mlに箱で供給された標
準を用いてアボツトＡ−Gentイムノグロブリン
Ｇ臨床化学診断箱の指示によりつくつた標準液
100μを加えた。混合物に10-5Mフルオレシイン
液25μを加え試験溶液の螢光強さを測定しイム
ノグロブリンG382−6093mg／dlを含む標準液か
らえた結果は次表のとおりである：IgG濃度（mg／dl） FI 382 10556 761 10262 1526 10132 3046 9397 6093 8849 前記した実施例で明白なとおり、本発明の方法
は広範な試験に応用できるのである。既知発色試
薬系を用いて未知配位子の螢光測定を可能にする
他に本発明の方法は発色試薬系を用いて試験の直
線性を増す。特に本発明の方法は高吸光度値にお
ける試験の直線性範囲を増す。器械の制限によつ
て比色試験の直線性は2.0以上の吸光度をもつ発
色体濃度において実質的に減少することはよく知
られている。本発明の方法を用いて2.0以上の吸
光度をもつ発色体濃度をつくる試薬系と配位子の
濃度を用いて試験の直線性を拡張することは可能
である。 上述のとおり本発明は試験溶液中の配位子濃度
の分光測定又は螢光測定のいづれかに利用できる
新規の試薬組成物に関する。この様な試薬組成物
は配位子に特定の試薬系、即ち測定する配位子を
含む溶液の透光性に変化を与えうる試薬系の有効
量および試薬系と測定する配位子を含む溶液の透
光性変化と関連する波長帯と重なる励起および
（又は）放射波長帯をもつ螢光体の有効量より成
る。本発明の方法により配位子を螢光測定するに
便利な試薬組成物生成に要する螢光体有効量は試
験溶液の透光性測定を妨害しないことはわかつて
いる。故に測定する配位子とその配位子に特定の
本発明の試薬組成物を含む試験溶液はその中の配
位子濃度決定のため分光測定又は螢光測定でき
る。 本発明を特定実施態様について記述したが、本
発明の真意や範囲から逸脱しない限り種々の同等
法、変更法および修正法もできることは明らかで
あろうから、実施態様が本発明を限定するものと
考えるべきでないしまた同等の実施態様も本発明
に包含されるものと考えるものである。
ルコースオキシダーゼ2200単位／ml、チメルゾル
0.025mg／mlおよび1.5M硫酸アンモニウムを含む
液25μ；0.2MDHBS、0.1％フエリシアン化カ
リウム、0.1％４−アミノアンチピレン、0.1％ト
リトンＸ−100、チメルゾル0.025mg／mlおよびリ
ボフラヴイン5.633×10-4モル／を含む0.1Mり
ん酸塩緩衝液25μ；および西洋わさびペルオキ
シダーゼ400単位／ml、10％子牛血清、0.6ｍ
MEDTA、0.1％ANS、１％トリトンＸ−100、
リパーゼ2000単位／ml、チメルゾル0.025ｇ／ml
を含む0.1Mりん酸塩緩衝液25試料を含み牛ガン
マグロブリンを含むりん酸塩緩衝液（PH7.0）
2.05mlを加えた。えた試験溶液を35℃で最大色生
成をえる迄培養した。吸光度と螢光強さを測定し
グルコース０−500mg／dlを含む標準液について
えた結果は次表のとおりである：グルコース濃度（mg／dl） FI ０ 37432 50 28731 100 22019 200 12547 300 7291 500 2269 実施例 14 イムノグロブリンＧ（IgG）試験 アボツトＡ−GentイムノグロブリンＧ臨床化
学診断箱で供給された試薬を使い山羊抗−人間
IgG抗血清400μを４％ポリエチレングリコール
を含むりん酸塩緩衝塩溶液11.6mlと混合してつく
つた働らく抗血清試薬2.5mlに箱で供給された標
準を用いてアボツトＡ−Gentイムノグロブリン
Ｇ臨床化学診断箱の指示によりつくつた標準液
100μを加えた。混合物に10-5Mフルオレシイン
液25μを加え試験溶液の螢光強さを測定しイム
ノグロブリンG382−6093mg／dlを含む標準液か
らえた結果は次表のとおりである：IgG濃度（mg／dl） FI 382 10556 761 10262 1526 10132 3046 9397 6093 8849 前記した実施例で明白なとおり、本発明の方法
は広範な試験に応用できるのである。既知発色試
薬系を用いて未知配位子の螢光測定を可能にする
他に本発明の方法は発色試薬系を用いて試験の直
線性を増す。特に本発明の方法は高吸光度値にお
ける試験の直線性範囲を増す。器械の制限によつ
て比色試験の直線性は2.0以上の吸光度をもつ発
色体濃度において実質的に減少することはよく知
られている。本発明の方法を用いて2.0以上の吸
光度をもつ発色体濃度をつくる試薬系と配位子の
濃度を用いて試験の直線性を拡張することは可能
である。 上述のとおり本発明は試験溶液中の配位子濃度
の分光測定又は螢光測定のいづれかに利用できる
新規の試薬組成物に関する。この様な試薬組成物
は配位子に特定の試薬系、即ち測定する配位子を
含む溶液の透光性に変化を与えうる試薬系の有効
量および試薬系と測定する配位子を含む溶液の透
光性変化と関連する波長帯と重なる励起および
（又は）放射波長帯をもつ螢光体の有効量より成
る。本発明の方法により配位子を螢光測定するに
便利な試薬組成物生成に要する螢光体有効量は試
験溶液の透光性測定を妨害しないことはわかつて
いる。故に測定する配位子とその配位子に特定の
本発明の試薬組成物を含む試験溶液はその中の配
位子濃度決定のため分光測定又は螢光測定でき
る。 本発明を特定実施態様について記述したが、本
発明の真意や範囲から逸脱しない限り種々の同等
法、変更法および修正法もできることは明らかで
あろうから、実施態様が本発明を限定するものと
考えるべきでないしまた同等の実施態様も本発明
に包含されるものと考えるものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) 試験溶液を生成するため (i) 配位子を含むと思われる試料； (ii) 螢光体の有効量； (iii) 測定する配位子の存在で螢光体の励起およ
び（又は）放射波長帯と重複する波長帯内で
試験溶液の透光性に変化を与えうる様な試薬
系の有効量 を混合し、 (b) 試験溶液を螢光体の励起波長帯内の波長をも
つ光で照射した後、 (c) 試験溶液により放射された螢光強さを試料中
の配位子濃度の尺度として測定する ことを特徴とする配位子を含むと思われる試料中
の配位子測定法。 ２ 試薬系が発色試薬系又は濁度測定試薬系であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 試薬系が発色試薬系である特許請求の範囲第
２項に記載の方法。 ４ 試験溶液の透光性変化と関連する吸光波長帯
が螢光体の励起波長帯と重複する特許請求の範囲
第３項に記載の方法。 ５ 試験溶液の透光性変化と関連する吸光波長帯
が螢光体の放射波長帯と重複する特許請求の範囲
第３項に記載の方法。 ６ 試験溶液の透光性変化と関連した吸光波長帯
が螢光体の励起および放射波長帯と重なる特許請
求の範囲第３項に記載の方法。 ７ 配位子を含んでいると思われる試料と配位子
の存在で波長帯内で試験溶液の透光性変化を与え
うる試薬系の有効量を含む試験溶液中の配位子測
定用の改良螢光測定法において、試験溶液にその
透光性変化と関連した波長帯と重複する励起およ
び（又は）放射波長帯をもつ螢光体の有効量を加
え、試験溶液を螢光体の励起波長帯内の波長をも
つ光で照射した後試験溶液によつて放射された螢
光を試料中の配位子濃度の尺度として測定するこ
とを特徴とする改良法。 ８ 試薬系が発色試薬系又は濁度測定試薬系であ
る特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９ 試薬系が発色試薬系である特許請求の範囲第
８項に記載の方法。 １０ 螢光体が試験溶液の透光性変化と関連した
吸光波長帯と重複する励起波長帯をもつ特許請求
の範囲第９項に記載の方法。 １１ 螢光体が試験溶液の透光性変化と関連した
吸光波長帯と重複する放射波長帯をもつ特許請求
の範囲第９項に記載の方法。 １２ 螢光体が試験溶液の透光性変化と関連した
吸光波長帯と重複する励起波長帯と放射波長帯を
もつ特許請求の範囲第９項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/469,323 US4495293A (en) | 1983-02-24 | 1983-02-24 | Fluorometric assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60202361A JPS60202361A (ja) | 1985-10-12 |
| JPH037906B2 true JPH037906B2 (ja) | 1991-02-04 |
Family
ID=23863331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5456784A Granted JPS60202361A (ja) | 1983-02-24 | 1984-03-23 | 改良螢光測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60202361A (ja) |
| AU (1) | AU564398B2 (ja) |
| ZA (1) | ZA841911B (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1237645A (en) * | 1982-12-21 | 1988-06-07 | John H. Fisher | Assay technique |
| US5370114A (en) * | 1992-03-12 | 1994-12-06 | Wong; Jacob Y. | Non-invasive blood chemistry measurement by stimulated infrared relaxation emission |
-
1984
- 1984-03-13 AU AU25556/84A patent/AU564398B2/en not_active Ceased
- 1984-03-14 ZA ZA841911A patent/ZA841911B/xx unknown
- 1984-03-23 JP JP5456784A patent/JPS60202361A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60202361A (ja) | 1985-10-12 |
| AU2555684A (en) | 1985-09-19 |
| AU564398B2 (en) | 1987-08-13 |
| ZA841911B (ja) | 1984-09-07 |
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