JPH0381223A - Ｔｎｆ誘導剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は腫瘍に対して強い壊死作用のあるＴＮＦαを誘
導させるＴＮＦ誘導剤に関するものである。

［従来の技術］ 最近、ガン治療の分野においてＢ　ＲＭ　（ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　ｒａｓｐｏｎｓａ　ｍｏｄｅｆｉｅｒｓ　
）の概念が脚光を浴びるようになってきた。ＢＲＭとは
腫瘍に対する宿主の生物学的な反応性を修飾することに
よりガンの治療を行うための物質をさす。これとよくに
たものに免疫療法剤がある。免疫療法剤もＢＲＭとほぼ
同じ意味と解してよいが、厳密には、免疫療法剤は宿主
の癌に対する免疫学的監視機構を増強することにより、
結果として癌の治療を行なうものである。しいて免疫療
法とＢＲＭＩＩ法との相違をいうなら、免疫療法におい
て免疫療法剤自体は直接抗腫瘍能はないが、ＢＲＭはそ
れ自身で抗腫瘍性を持っていることである。

現在、インターフェロン（以下、ＩＦＮと略称す）の治
療効果が特定の患者に限定されることが判明するに伴な
い、このＴＦＮに代って最も注目されているリンホカイ
ンには、インターロイキン−２とＴＮＦとがある。

腫瘍に対して強い破壊力があることから腫瘍壊死因子（
ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　）と名
付けられたＴＮＦは、１９７５年に発見されたリンホカ
インの一つである。

ヒトＴＮＦは分子量７０．Ｇｏｏで、低あるいは高ＤＨ
のもとで１２時間処理すると失活するが、ｐＨ６〜８の
間では安定であり、熱に対しても５６℃、６０分の処理
では安定であり、７０℃、６０分で失活することが知ら
れている。最近、遺伝子組換え技術を用いて、ヒトＴＮ
ＦのＤＮＡクローニングがなされ、ヒトＴＮＦの全塩基
配列が決定された（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ。

ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１２，７２４（１９８
４）　）　、それによると、ＴＮＦは　１５６個のアミ
ノ酸からなり、しかも培養細胞に対し細胞障害性を示す
因子であるヒドリンホトキシンの遺伝子配列と似ている
ことがあきらかとなった。この結果から分子量を計算す
ると、１７，３５８になるものと推測され、また天然型
のＴＮＦの分子量から、おそら＜ＴＮＦ分子は多量体と
なっているものと思われる。尚、現在ではこのヒトＴＮ
ＦをＴＮＦａ、ヒドリンホトキシンをＴＮＦａと称する
場合もある。

ＩＦＮとは異って種特異性がない特徴を有するＴＮＦａ
は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対して細胞障害性に
働き、正常な細胞はＴＮＦａに対して抵抗性を示す、Ｔ
ＮＦａに対しては感受性のある細胞と非感受性の細胞が
みられる。例えば、Ｌ−９２９細胞はＴＮＦａに感受性
が高く、ＴＮＦの力価測定に用いられている培養細胞系
である。

ＴＮＦａの作用機構に関しては、まだよく解っていない
が、主たる作用は活発に代謝を営んでいる腫瘍細胞に直
接働くことによるものと思われている。他にはＲＮＡ合
成を亢進させることが報告されている（Ｏｓｔｒｏｖｅ
、Ｊ、Ｍ、　、Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ、Ｅ、、Ｐｒｏｃ、
Ｓｏｃ。

Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、１６０，３５４（１９７
９）　　）　、即ち、　Ｌ−９２９細胞に代謝阻害剤と
ＴＮＦａを併用すると、ＴＮＦａによる壊死効果が強ま
ることが示されており、ＴＮＦａが細胞に働くと、細胞
がＴＮＦａの障害効果に抵抗を示し、代償的に　ＲＮＡ
合成を高めていると解釈している。また、細胞周期に対
するＴＮＦａの影響を検討した報告（Ｄａｒｚｙｎｋｉ
ｅｗｉｃｘ。

Ｚ、　ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４４．
８３（１９８４）’）では、ＴＮＦａをＬ細胞に作用さ
せると、０２期で細胞周期が停止し、６１期や８期には
影響を与えないことが解った。ＴＮＦａによる細胞障害
はたぶん、分裂期の晩期か細胞質分裂の直後に起こり、
　ＤＮＡ合戒やタンパク質合成にも影響を与えないもの
と思われている。

一方、カンプトテンシン（以下、ＣＰＴと略称す）は、
落葉喬木喜樹（Ｃａｍｐｔｏｔｈｐｃａ　ａｃｕｍｉｎ
ａｔａＮｙｓｓａｃａａｅ　）等から抽出・単離された
アルカロイドで、強力な核酸合成阻害作用を有し、その
作用は迅速かつ可逆性を示すことが特徴で、既存の制癌
剤と交叉耐性を示さないという独特な作用機作をもつ抗
腫瘍性物質である。即ち、その作用機構はＤＮＡ　）ボ
イソメラーゼＩ（）−ボ■）を細胞内標的としてＤＮＡ
−トポＩ複合体を固定化することにより、腫瘍細胞のＯ
Ｎ＾代謝を阻害し細胞を死に至らしめるものである。

更に、天然のＣＰＴに化学修飾を施すことにより、その
薬理学的活性及び毒性を改善したＣＰＴ誘導体を得る試
みが種々行われている（特開昭６０−１９７９０号、特
開昭６１−８５３１９号）。

［発明が解決しようとする課題］ このＣＰＴ及びその誘導体の腫瘍細胞遺伝子での転写時
の作用機構を検討していた時に、ＣＰＴ及びその誘導体
が転写抑制のみならず、幾つかの遺伝子の新たな発現誘
導を起すことを見出した。

更に、本発明者らは、鋭意努力の結果、発現される遺伝
子を解析してその中の一つがＴＮＦα遺伝子であること
を突き止め、零〇ＰＴ及びその誘導体が良好なＴＮＦ誘
導能を有することを確認して本発明に至ったものである
。

更に付言すると、本発明者らは、ヒト急性Ｔリンパ球性
白血病細胞（Ｔ−ＡＬＬ　）由来の培養細胞であるＲＰ
ＭＩ８４０２細胞をＣＰＴ及びその誘導体で処理した際
に、ＴＮＦαのｍＲＮＡが特異的に誘導合成され、且つ
活性を持ったＴＮＦαタンパクとして培養培地中に放出
されることを確認して本発明に至ったものである。

〔課題を解決するための手段］ 本発明に係るＴｌｒＦ誘導剤では、下記の構造で表され
るＣＰＴ及びその誘導体を有効成分とするものである。

（但し、式中Ｒ１は水素原子、塩素原子もしくは炭素原
子１〜４を有する低級アルキル基である。

Ｒ２は水素原子もしくは、式−ｏｃｏ−ｘで表される基
である。このＲ２はカンプトテンシン骨格の９位、１０
位、１１位及び１２位のいずれに位置していてもよい。

このＸは塩素原子もしくは、式−ＮＲ３Ｒ４で表される
基である。Ｒｓ、　Ｒａは各々水素原子又は、置換又は
非置換のアルキル基であり、また、Ｒ３゜Ｒ４とは一緒
になってそれらが結合しているＮ原子とともに複素環を
形成してもよく、その複素環は該Ｎ原子の他に異種原子
を含んでもよい）具体的な誘導体は、　９−（４−（イ
ソプロピルカルバモイルメチル）−１−ピベラジノ）カ
ルボニロキシカンプトテンシン、　１Ｏ−（４−（イソ
プロピルカルバモイルメチル）−１−ビベラジハカブボ
ニＯキシカンプトテンシン　１．１Ｏ−（１−ピペリジ
ノ）−１−ピペリジノ）カルボニロキシカンプトテンシ
ン、　１ｌ−（４−（イソプロピルカルバモイルメチル
）−３−ピペラジノ）−カルボニロキシカンプトテンシ
ン、　１ｌ−（４−エチル−１−ピペラジｎカルボニロ
キシカンプトテンシン　、　１２−（４−（１−ピペリ
ジノ）−１−ピペラジｎカルボニロキシカンプトテンシ
ン　、　１２−（４−（イソプロピルカルバモイルメチ
ル）−ｌ−ピペラジノ）カルボニロキシカンプトテンシ
ン　、　７−メチル−９−（４−（イソプロピルカルボ
モイルメチル）−１−ピペラジｎカルボニロキシカンプ
トテンシン、　７−ニチルー９−（４−（１−ピペリジ
ノ）−１−ピペリシバカルボニロキシカンプトテンシン
、　７−ニチルー１Ｏ−（４−（イソプロピルカルバモ
イルメチル）−１−ピペラジノ）カルボニロキシカンプ
トテンシン　、　７−ニチルー１Ｏ−（４−（１−ピペ
リジノ）−１−ピペリジノ）カルボニロキシカンプトテ
ンシン（略称ｃ　　Ｐ　　Ｔ　−１ｌ）、　７−ニチル
ー１Ｏ−（１−ビベラジハカルボニロキカンプトテンシ
ン、　７−ニチルー１Ｏ−（４−プロピル−１−ピペラ
ジノ）カルボニロキシカンプトテンシン、　１Ｏ−（４
−ベンジル−１−ピペラジノ）−カルボニロキシ−７−
エチルカンプトテンシン　、　７−ニチルー１Ｏ−（４
−（３−ヒドロキシプロピル）−１−ピペラジノ）カル
ボニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチルー１Ｏ−
（Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ジメチル７ミノエチル））ア
ミノカルボニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチル
ー１Ｏ−（Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチル−４−ピペリ
ジノ）アミバーカルボニロキシカンプトテンシン　、１
Ｏ−（１＝（４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミハビペリジノ）
カルボニロキシ−７−エチルカンプトテンシン　、　　
１Ｏ−（１−（４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）ピペリジ
ノ）カルボニロキシ−７−エチルカンプトテンシン、　
１０−　（１−（４−Ｎ、Ｎ−ジ−ハーブ１０−　（１
−（４−Ｎ、Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミノ）ピペリジノ
）カルボニロキシ−７−エチルカンプトテンシン、　１
Ｏ−（１−（４−Ｎ、Ｎ−ジ−ｎ−ブチル７ミハピペリ
ジハカルポニ０キシ−エチルカンプトテンシン　、　７
−ニチルー１０−　（１−（４−（１−ピロリジノ））
ピペリジノ）カルボニロキシカンプトテンシン、　７−
ニチルー１Ｏ−（４−（１−モルホリノ））ピペリジノ
）カルボニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチルー
１ｌ−（４−（１−ピペリジ刀−１−ピペリシバカルボ
ニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチルー１２−（
４−（１−ピペリジノ）−１−ピペラジｎカルボニロキ
シカンプトテンシン　、　７−ニチルー１２−（４−（
イソプロピルカルバモイルメチル）−１−ピペラジｎカ
ルボニロキシカンプトテンシン　、　９−（１−ピペラ
ジノ）カルボシロキシ−７−プロビルカンプトテンシン
　、　　１（１：（４−（イソプロピルカルバモイルメ
チル）−１−ピペラジノ）−カルボニロキシ−７−プロ
ビルカンプトテンシン　、　７−プチルー１２−（４−
（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ）カルボニロキシ
カンプトテンシン　、　７−プチルー１２−（４−ジメ
チル７ミノー１−ピペリジノ）カルボニロキシカンプト
テンシン　、　７−りａロー１０−　（４−（１−ピペ
リジバー■−ピペリジノ）カルボニロキシカンプトテン
シン　、　ｌＯ−クロロカルボニロキシ−７−エチルカ
ンプトテンシン　、　１０−クロロカルボニロキシカン
プトテンシン　、　１Ｏ−７ミノカルボニロキシー７−
エチルカンプトテンシン　、１Ｏ−（２−ジエチル７ミ
ハエチル７ミノカルボニＯキシ−７−エチルカンプトテ
ンシン　、ｌＯ−ジエチルアミノカルボニロキシ−７−
エチルカンプトテンシン　、　７−ニチルー１Ｏ−（１
−モルホリノ）カルボニロキシカンプトテンシン　、　
７−ニチルー１Ｏ−（１−ピペラジノ）カルボニロキシ
カンプトテンシン　、　７−ニチルー１Ｏ−（４−メチ
ル−１−ピペラジノ）カルボニロキシカンプトテンシン
　１．７−ニチルー１Ｏ−（４−エチル−１−ピペラジ
ノ）カルボニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチル
ー１Ｏ−（４−（ｐ−メトキシフェニル）−１−ピペラ
ジノ）カブロニロキシカンプトテンシン、　７−ニチル
ー１０−　（４−（３−ヒドロキシプロピル）−１−ピ
ペラジノ）カルボニロキシカンプトテンシン　、　７−
ニチルー１Ｏ−（４−（イソプロピルカルバモイルメチ
ル）−１−ピペラジノ）カルボニロキシカンプトテンシ
ン　、　７−トチルー１Ｏ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メ
チル−４−ピペリジノ）アミノカルボニロキシカンプト
テンシン、　１Ｏ−（１−モルホリノ）カルボニロキシ
カンプトテンシン　、　１Ｏ−（４−メチル−１−ピペ
ラジｎカルボニロキシカンプトテンシン　、　７−ニチ
ルー１Ｏ−（４−プロピル−■−ピペラジノ）カルボニ
ロキシカンプトテンシン等がある。　なお、　前記誘導
体の具体的な構造は次の第１表に示す。

［作用］ 本発明においては、ＣＰＴ及びその誘導体を有効成分と
するものである。

ホ乳類の［ｌＮＡ　トポイソメラーゼＩ（トポＩ）阻害
作用を有するＣＰＴは、酵素作用の中間体である　ＤＮ
Ａ−トポＩ共有結合複合体を蓄積させることにより、Ｄ
ＮＡ及びＲＮＡの合成を阻害する抗腫瘍性植物アルカロ
イドであることが知られている。

本実施例では、ＣＰＴによってトポＩ阻害の結果、転写
誘導される遺伝子について、ノーサンプロット法により
解析し、ＴＮＦａがその一つであることを見出した。

（１）ＣＰＴにより、ヒトーＡＬＬ細胞でＴＮＦａ−ｍ
ＲＮＡが誘導され、ＨＬ−６０細胞などでＴＮＦａを発
現させることが知られているホルボールエステル（以下
、ＴＰＡと略称す）により相乗的に増強された。その誘
導はアクチノマイシンＤで阻害され、シクロヘキシミド
で増強はなかった。また、細胞周期依存的でなかった。

一方、ＣＰＴ耐性株であるＣＰＴ−に５では、その誘導
はなかった。

（２）発現誘導は、プロティンキナーゼＣ以外のキナー
ゼの関与が示唆された。

（３）ＣＰＴ及びその誘導体ＣＰ　Ｔ−１１により、Ｔ
ＮＦα活性は培養中に放出され、その活性はＴＮＦαモ
ノクローナル抗体で中和された。ＴＮＦａの分子量は、
イムノプロット法により１７にｄで標準ＴＮＦαと同じ
であった。

以上のことより、ＣＰＴ及びその誘導体はトポＩ阻害を
介して、ＴＮＦａの遺伝子発現を誘導し、活性型ＴＮＦ
αを産出することが判明した。

即ち、比較的低濃度のＣＰＴ及びその誘導体ででＴＰＡ
と同程度、更にＴＰＡとの併用では相乗的にＴＮＦａが
誘導合成された。

ＴＮＦａは生体の免疫担当細胞の一つマクロファージが
主に産生ずるモノカインであり、抗腫瘍作用のほか、白
血病細胞の分化、エンドキシン掻起炎症作用等多様な生
理活性を持っている。このような多彩な作用を持つＢ　
ＲＭ　（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｍｏ
ｄａｆｉｅｒｓ　）としてのＴＮＦａがＣＰＴ及びその
誘導体により誘導、されることは、本薬剤が生体に投与
された時、直接腫瘍細胞を攻撃するほか、ＴＮＦα、そ
の他のリンホカインの誘導を介して抗腫瘍活性をあられ
している可能性があり、本研究では培養白血病細胞にお
いて観察された事実であるが、生体に投与された場合に
も、ＣＰＴ及びその誘導体により、ＴＮＦαを誘導し、
ＴＰＡのようなプロモーターとの相乗効果を有する有用
性のある抗癌剤となる可能性が大いにある。

［実施例］ 以下に、本発明に至る実施例を示す。実施例において、
ＴＰＡ、アクチノマイシンＤ、シクロヘキシミド、ＭＯ
ＰＳはシグマ社製、グアニジンチオシアネートはフルカ
社製、Ｈ７は生化学工業■社製、他の試薬は和光純薬■
社製を使用した。ＣＰＴ及びその誘導体はヤクルト本社
製、スタウロスポリンは協和発酵■社製を使用した。ま
た、ＴＰＡ、ＣＰＴ、スタウロスポリンは使用濃度の１
００倍濃度でＤＭＳＯに溶かして使用した。

実施例−１（ＣＰＴｊＬ独処理によるＴＮＦαの発現及
びＣＰＴ、ＴＰＡ併用によるＴＮ Ｆαの相乗的発現） ［細胞及び培養］ ヒトＴ細胞性急性リンパ球性白血病細胞（Ｔ−ＡＬＬ）
由来の培養細胞であるＲＰＭ１８４０２及びそのＣＰＴ
耐性株ＣＰＴ−に５は、ＲＰＭ１１６４０培地（日永製
薬■製１０．４ｇに重曹１．０ｇ、ペニシリンＧ−カリ
ウム６０ａ＋ｇ添加、蒸留水ｉＩＬ、濾過滅菌）に、牛
胎児血清を１０％濃度加えた培地中で培養し、３目間隔
で継代培養して用いた。

［ＲＮＡの調製］ 細胞数５　ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、各薬剤、各
時間処理後、５　Ｘ　１０’細胞をＰＢＳで洗浄後、全
ＲＮＡをピトー・コムジンスキー（Ｐｉｔｏｒ　（：ｈ
ｏｍｚｙｎｓｋｉ）らの方法（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ、
Ｐ、ａｎｄ　５ａｃｃｈｉ、Ｎ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、１６２１５８−１５９　（１９８７））で分離
した。細胞の沈殿を７５０μＡの５ａｌｎＤ　（４Ｍグ
アニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸Ｎａ　（ｐ
Ｈ７，０）、　０．５％Ｎ−ラウロリザルコシン、０．
１Ｍ２−メルカプトエタノール）に溶解後、７５μＪ２
の２Ｍ酢酸Ｎａ　（ｐＨ４，０）、７５０μ℃の水和フ
ェノール、　１５０μ℃のクロロホルム：イソアミール
アルコール（４９：１）を加え、攪拌後、水中にて１５
分間放置した。ｘ　１０，０００ｇで２０分間遠心後Ｒ
ＮＡを回収した。ＲＮＡを再び５ｏｌｎＤに溶かしたの
ち、イソプロパツール沈殿さらに７５％エタノール洗浄
後、全ＲＮＡを　０．１％ＳＤＳ、２５ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ
　Ａ、　（９Ｈａ、ｏ）に溶かし、サンプルとした。

［ゲル電気泳動法］ アガロースＭＥ（牛丼化学製）Ｉｇに滅菌蒸留水７４１
１１１を加え、オートクレーブを１２０℃、３分間行い
溶解した。アガロースゲルを６０ｔまで冷やした後、１
０１１７７）　１０倍ＭＯＰＳハｙ７７−Ｆ　（２００
ｍＭＭ　ＯＰ　Ｓ　Ｎａ　（ｐＨ７，０）　、５０＋＋
＋１酢酸Ｎａ、　　１０＋ａＭＥ　Ｄ　ＴＡ）、続いて
１６．５＋ａＭの３７％ホルムアルデヒドを加え（最終
濃度２．２Ｍ　）　、水平型電気泳動装置にアガロース
ゲルを流し込んだ。全ＲＮＡは、　９．３μ角当り１５
μｇとなるようにし、２０μｌのミックスト・ベツド・
レジン（ｍｉｘｅｄ　ｂａｄ　ｒｅｓｉｎ）’　ＡＧ５
０１−Ｘ８（Ｄ）（パイロラド社製）で脱イオン化した
ホルムアミドを加え混合した（最終濃度５０％）。

次に６．７μｌの脱イオン化３７％ホルムアルデヒド（
最終濃度２．２Ｍ）、４μ℃のｌＯ倍バッファーＦを加
え混合した。６０℃、５分間加熱後直ちに氷冷した１０
ＩＩＡのサンプルバッファー（２０％フィコール、２０
ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、エチジュウムブロ主ド　１００
μｇ／ｉｆ）を加えゲルに添加した。ゲル上をラップで
覆い、５０Ｖ定電圧、室温で８時間泳動を行った。

［ノージンブロッティング］ 泳動後、ゲルを２５０１１１７７）２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ
（ｘ　Ｉ　Ｓ　ＳＣ；　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０
１５１４クエン酸Ｎａ）に３０分間浸し、新たに２０Ｘ
　Ｓ　Ｓ　Ｃ１００ｍ１ｌＯ分間浸した。トランスファ
ー装置心、下から順に２枚のワットマン３ＭＭベーパー
（ワットマン社製）、前記ゲル、ハイボンドＮ（アマジ
ャム社製）、２枚のワットマン３ＭＭベーパを置き、次
いでベーパタオルを約１５ｃｍの厚さに重ねる。回りを
ラップで覆い、ベーパータオルを約１５ｃｍの厚さに重
ね、その上にガラス板を載せ、更にその上に約１　ｋｇ
の重しを置き、−夜トランスファーを行った。ハイボン
ドＮを乾燥後、Ｕ■トランスイルくネータ−（２５４ｎ
ｉ＋）上にフィルターのＲＮＡ付着面側を下面にして置
き、５分間照射し、固定した。

［ハイブリダイゼーション］ ＲＮＡを固定したハイボンドＮフィルターは、５０％ホ
ルム７１ド、５ｘＳＳＰＥ　（１ｘＳＳＰＥ　；０．１
８ｍ　ＮａＣ１，０，０１Ｍリン酸Ｎａ　（ｐＨ７，７
）　、０．００１ＭＥＤＴＡ）、５Ｘデンハルド（Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ）の溶液（１００ｘ濃度液：２％ＢＳＡ、
２％フィコール、２％ポリビニールピロリドン）、　０
．１％ＳＯ３，２０ａｇ／ｍｌ熱変性大腸菌ＤＮ＾で４
２℃、４時間プレハイブダイゼーションを行った。次に
、新たなブレハイブリダイゼーションバッファーに最終
濃度１０％デキストラン及びランダムブライマー〇Ｎ＾
ラベリングキット（タカラ酒造■製）により”Ｐ　−ｄ
　ＣＴＰ（アマジャム社製３（１（ｌＯｃｉ／ｍｏｌ）
でラベルしたＴＮＦａ遺伝子第４エキソンを含むＰｓｔ
　Ｉ　／　ＥｃｏＲｌ　　８５０ｂｐフラグメント（ｓ
　ｘ　ｔｏ’　ｃｐｒａ／ｕ　ｇ）を加え、４２℃で１
６時間、ハイブリダイゼーションを行った。

次に６０℃、２ｘＳＳＰＥ、　　０．１％ＳＤＳで１５
分間ずつ２回洗浄後、同温で１ｘＳＳＰＥ、０．１％Ｓ
ＤＳで３０分間洗浄した。更に、０．ｌｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ
Ｅ、　　０．１％ＳＤＳで室温で洗浄し、コダックＸＡ
Ｒ−５フィルム（コダック社製）でコルネックスインテ
ンシイファイングスクリーンと共に一８０℃で露光した
。

以上の操作を経て、親株ＲＰＭＩ８４０２　（ａ　）及
びＣＰＴ耐性株ＣＰＴ−に５　（ｂ）の薬剤処理後のＴ
ＮＦα遺伝子発現の時間的変化を見た。

第１ａ、ｂ図はＣＰＴ％ＴＰＡ単独及びその併用の結果
を示す説明図である。

図において、レーン１〜６は３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　、　
レーン７〜１２は３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　＋　４　μＭ　
ＣＰ　Ｔ　、　　レーン１３〜１８は４ａＭＣＰＴであ
り、レーン１，７．１３は薬剤！Ａ埋０時間、レーン２
，８．１４は薬剤処理３０分、レーン３，９．１５は薬
剤ＩＡ理１時間、レーン４、１０．１６は薬剤処理２時
間、レーン５．１１．１７は薬剤処理４時間、レーン６
、１２．１８は薬剤処理８時間で後での全ＲＮＡを調製
し、ノージンブッティング法で解析した結果を模式的に
示した。尚矢印はＴＮＦα−ｍＲＮＡのサイズを示す。

ヒトＴ細胞性急性リンパ球性白血病細胞（Ｔ−ＡＬＬ）
由来の培養細胞ＲＰＭＩ８４０２において、ＴＮＦαを
発現させることが知られているＴＰＡ（’ホルボールエ
ステル）（第１ａ図レーン１〜６）、及びＤＮ八へ−ボ
イソメラーゼＩ特異的阻害剤ＣＰＴ（ｌ１８図レーン１
３〜ｔａ）処理によりＴＮＦα遺伝子の発現がノージン
プロット法により同程度認められた。またそれら薬剤の
同濃度併用（第１ａ図レーン７〜１２）により、添加後
４時間をピークとする（第１ａ図レーン１１）相乗的な
発現誘導が認められた。

一方、ＲＰＭ１８４０２を親株とし、トポＩタンパク質
自身が変異したと考えられるＣＰＴ高度耐性株ＣＰＴ−
に５においては、ＣＰＴによる発現誘導は認められず（
第１ｂ図レーン１３〜１８）、ＴＰＡでのみＴＮＦαの
発現が認められた（第１ｂ図レーン１〜６）、ＴＰＡと
の併用Ｃよる発現（第１ｂ図レーン７〜１２）はＴＰＡ
車独処理とほぼ同量であった６以上よりＣＰＴは、トポ
■阻害を介してＴＮＦα−ａ＋ＲＮＡを誘導したと考え
られた。

実施例−２（ＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡ発現誘導
のアクチノマイシンＤによる阻害〉 ＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡ発現誘導がＲＮＡ合戒
を介した誘導か否かをＲＮＡ合威合成剤であるアクチノ
マイシンＤ（以下、ＡＭＤと略称す）を用いて検討した
。

第２図はＣＰＴ社よるＴ　Ｎ　Ｆ　ａ−ｍＲＮＡ発現誘
導のＡＭＣによる阻害の結果を示す説明図であり、図に
おいて、レーン１〜５は３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａで４５分処
理、レーン６〜ｌＯは３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　＋４　ｕ　
Ｍ　ＣＰ　Ｔで、レーン１１〜１５は４ａＭＣＰＴで４
時間処理した時に誘導されるＴＮＦα−ｍＲＮＡ合成の
ＡＭＤによる阻害を示した。レーン２，７．１２はｏ、
ｏｏａｕ　ｇ／ｍｌ、　　レーン３，８．１３は０．０
４ａｇ／ｍｌ、　　レーン４．９．１４は　０．２μｇ
／＋１．　　レーン５．　１０．　１５は１μｇ／ｌａ
ｌのＡＭＤを誘導５分前に加えた。処理後、全ＲＮ＾を
調製し、ノージンブロッティングを行い解析した結果を
模式的に示した。

第２図レーン１はＴＰＡ単独、第２図レーン６はＴＰＡ
、ＣＰＴ併用、第２図レーン１１はＣＰＴ単独処理によ
る発現誘導を示し、第２図レーン２〜５．レーン７〜１
０．レーン１２〜１４はそれぞれＴＰＡ車独、ＣＰＴ、
ＴＰＡ併用、ＣＰＴ単独処理時に種々の濃度のＡＭＤを
添加したものである。

ＴＮＦα−ｍＲＮＡの合成量は、いずれの場合もＡＭＤ
の濃度依存的に減少し、１℃ｇ／ｍｌＡ　Ｍ　Ｄで完全
に阻害された（第２図レーン５．１０．１５）。以上の
事は、ＣＰＴのＴＮＦα−ｍＲＮＡの誘導が、新たな転
写を誘導することにより発現されたことを示している。

実施例−３（ＣＰＴｅよるＴＮＦα−ｍＲＮＡ発現誘導
のシクロヘキシミドによる増強作 用） タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（以下、ＣＨＸ
と略称す）によるスバ、−インダクションの有無を検討
した。

第３図はＣＰＴによるＴ　Ｎ　Ｆ　ａ−ｍＲＮＡ発現誘
導のＣＨＸによる増強作用の結果を示す説明図であり、
図において、レーン１．２は３０ｎＭＴＰＡ。

３０分間、レーン４，５は３０ｎＭ　Ｔ　Ｐ　Ａ　＋　
４　ｐ　Ｍ　ＣＰＴ、４時間、レーン７．８は４℃ＭＣ
ＰＴ、４時間処理した。レーン２，５．８は前述の各種
薬剤処理３０分前にＣＨＸＩＯμｇ／ｍｌの濃度で添加
した。コントロールとして３は６０分間、レーン６は４
時間３０分ＣＨＸ単独で処理したものである。各細胞よ
り全ＲＮ＾を調製し、ノージンブロッティングでＴＮＦ
α発現量を解析した結果を模式的に示した。

ＣＨＸ処理のみでは、ＴＮＦα−ｍＲＮＡの誘導は見ら
れなかった（第３図レーン３，６）。ＴＰＡによる誘導
では、ＣＨＸによる増強はわずかに認められた（第３図
レーン２）。ＴＰＡとＣＰＴの併用及びＣＰＴによるＴ
ＮＦα−ｍＲＮＡ誘導は、ＣＨＸにより増強されなかっ
た（第３図レーン５゜８）。

以上のことは、タンパク賞合成阻害剤ＣＨＸによりＴＮ
Ｆα−ｍＲＮＡの不安定化を促進する不安定なタンパク
質が減少した結果、ＴＮＦα−ｍＲＮＡが蓄積した事で
ない事を強く示唆した。また、ＡＭＤ処理の結果を考え
合わせるとＴＮＦα−ｍＲＮＡ転写がＣＰＴにより誘導
されたものと考えられた。

実施例−４（ＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡ発現誘導
の細胞周期における変化） ＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡ発現の細胞周期依存性
を調べるため、過剰チくジン法によりＧ　、／Ｓ境界に
細胞を同調させた（第４図ａ−１）。

［Ｇ　Ｉ／Ｓ境界への同調］ 培養細胞の同調は、対数増殖期にある細胞にｌｌ１１Ｍ
チミジンを１６時間処理した後、ノーマル増殖培地で１
５時間増殖させ、さらに１　ａ＋Ｍチミジンを添加し１
６時間培養を行ない細胞周期のＧ　、／Ｓ境界付近に同
調した。同調度はフローサイトメトリーにより確認した
。

［フローサイトメトリー法］ フローサイトメトリーは、クリシャン（Ｋｒｉｓｈａｎ
）等の方法（Ｋｒ１ｓｈａｎ、Ａ、：Ｊ、ｃｅｌｌ、Ｂ
ｉｏｌ、６６．１８８−１９３　（１９７５））により
行った。各細胞集団は（ｌｘ１０’細胞）は、Ｐ　Ｂ　
Ｓ　１０ｎｌで洗浄後、４℃の７０％エタノールを攪拌
しながら加え固定した。固定した細胞は、ＰＢＳで１ｍ
ｇ／ｍｌとしたＲ　Ｎ　ａｓｅで３７℃、３０分間保温
した。次に細胞を蒸留水で洗浄後、ＤＮＡをプロビジウ
ムイオダイド（０，１％クエン酸ナトリウムで０．０５
ｍｇ／ｍｌ　としたもの）で染色した。染色細胞は、Ｅ
　Ｐ　Ｉ　ｃ　ｓ　ＩＩ　（コールタ−社）セルソータ
ーで分析した。

第４ａ、ｂ図はＣＰＴによるＴ　Ｎ　Ｆ　ａ−ｍＲＮＡ
発現誘導の細胞周期における変化の結果を示す説明図で
あり、ａ図において１は過剰チミジン同調法によりＧｄ
Ｓ境界に同調し、チよジン洗浄除去直後の細胞のフロサ
イトメトリーパターンである。

２．５は洗浄後４時間及び１６時間培養後のパターンを
示した。４，７は２．５の時点で４℃ＭＣＰＴ＆び３．
６はコントロールとして　０．１％ＤＭＳＯを４時間処
理したパターンである。ｂ図において、レーン１は対数
増殖期の細胞の４ａＭＣＰＴ及びレーン２は０．１％Ｄ
ＭＳ０，４時間処理の全ＲＮＡ、レーン３．４はａ−３
，４の各時点での全ＲＮＡ、レーン５．６はａ−６，７
の各時点での全ＲＮ＾のノージンプロテイングによるＴ
ＮＦαの発現量の解析した結果を模式的に示した。

チミジン洗浄除去後４時間すなわち５期の初期（第４図
ａ−２）及び１６時間後の大部分の細胞が０３期（第４
図ａ−５〉にある時にそれぞれＣＰＴ、４時間処理を行
ない、ＴＮＦα−ｍＲＮＡ誘導を調べた。ｂ）図は、そ
のノージンブロッティングである。第４ｂ図レーン１．
２はそれぞれ対数増殖期、第４ｂ図レーン３．４はそれ
ぞれ５期、第４ｂ図レーン５．６はそれぞれほとんどが
０１期細胞の全ＲＮＡのノージンプロットを示した。第
４ｂ図レーン、４，６はコントロールとしてＤＭＳＯ１
第４ｂ図レーン１，３．５は４μＭのＣＰＴで４時間処
理したものである。５期及びＧ１期共にＴＮＦα−ｍＲ
ＮＡ誘導が認められた。

以上により、ＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡの誘導に
は、細胞周期依存性は認められなかった。

実施例−５（タンパク質リン酸化酵素阻害剤存在下、Ｃ
ＰＴによるＴ　Ｎ　Ｆ　ａ−ｍＲＮＡ誘導の阻害） ＴＰＡはタンパク貿リン酸化酵素Ｃ−キナーゼ（以下、
プロティンキナーゼＣ、ＰＫ−Ｃと略称す）の活性化を
通してＴＮＦα遺伝子の活性化をする事が知られている
。そこでＣＰＴあるいはＴＰＡとの併用によるＴＮＦα
の転写誘導においてもＰＫが関与するか否かを調べた。

第５ａ、ｂ図はタンパク質リン酸化酵素阻害剤存在下で
のＣＰＴによるＴＮＦα−ｍＲＮＡ誘導阻害の結果を示
す説明図であり、図において、ａはＨ７ＩＡ理であり、
ｂはスタウロスポリン処理である。

ａ図において、レーン１〜５及びレーン６〜１０は各々
３０ｎＭＴＰＡ＋４μＭ　ＣＰＴ及び４ａＭＣＰＴで４
時間処理した時のＴＮＦα−ｍＲＮＡの発現であり、レ
ーン１，６はＯμＭ１　レーン２．７は５ａＭ１　レー
ン３，８は１０μＭ１　レーン４．９は２０μＭル−ン
５．ｌＯは４０μＭのＨ７をＣＰＴその他誘導剤を添加
する３０分前に加えた。処理後金ＲＮＡを調製後、ノー
サンブロッティング法で発現を解析した結果を模式的に
示した。

ｂ図において、レーン１〜７及びレーン８〜１４は各々
３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　＋　４　μＭ　ＣＰ　Ｔ及び４ａ
ＭＣＰＴで４時間処理した時のＴＮＦα−ｍＲＮＡの発
現であり、レーン１，８はＯｎｇ／ｍｌ　、レーン２，
９は０．５ａｇ／ｍｌ　　　レーン３．ｌＯは１　ｎｇ
／ｍｌ　　　レーン４．１１は２ａｇ／ｍｌ、　　レー
ン５．１２は４ａｇ／ｍｌ、　　レーン６．１３は８ａ
ｇ／ｍｌ、　　レーン７．１４は１６ｎｇ／Ｉ！１１の
スタウロスポリンを誘導剤処理前に添加した。

処理細胞より全ＲＮＡを調製しノージンブロッティング
でＴＮＦαの発現量の解析をした結果を模式％式％ ）、ｐｋ−Ｇ　（ｃＧＭＰ依存ＰＫ）を同程度阻害する
事が知られているＨ７、比較的ＰＫ−Ｃに特異的な阻害
剤スタウロスポリンがＴＮＦαの誘導を阻止するか否か
を調べた。

第５ａ図はＨ７，第５ｂ図はスタウロスポリンの結果で
ある。第５ａ図レーン１〜５．第５ｂ図レーン１〜７は
ＴＰＡ、ＣＰＴ併用、第５ａ図レーン６〜ｌＯ１第５ｂ
図レーン８〜１０はＣＰＴ単独処理による誘導である。

タンパク質リン酸化酵素阻害剤Ｈ７でＣＰＴ及び併用で
処理した場合いずれも５〜ｌＯμＭの低濃度でＴＮＦα
−ｍＲＮＡ誘導を阻害した（第５ａ図レーン２〜５．７
〜１０）。Ｈ７の細胞毒性は、薬剤未処理ＲＰＭＩ８４
０２の増殖を１００％とした時、５０％増殖阻害する濃
度すなわちＩＣｓ。は１７μＭであった。一方、ＰＫ−
Ｃの阻害剤スタウロスポリンは、いずれの場合もｆａｎ
ｇ／ｍｌまでは阻害しなかった。スタウロスポリンの細
胞毒性Ｉａｓ。は、４ａｇ・／　ａｌｌであった。以上
より、ＣＰＴ単独及び併用によるＴＮＦα−ｍＲＮＡ誘
導はＰＫ−Ｃ以外のタンパク質リン酸化酵素活性化が関
与していることが示唆された。

実施例−６（ＣＰＴｆ１理細胞の培養上清中のＬ−２９
９に対する細胞障害活性及びヒトＴＮＦαモノクローナ
ル抗体による中 和） 以上ＴＮＦα−ｍＲＮＡがＣＰＴにより転写誘導される
ことを示したが、ＣＴＰ及びその誘導体でこのｍＲＮＡ
が翻訳された活性を有するＴＮＦαが生成されるか否か
を調べた。ＣＴＰの誘導体として、抗腫瘍効果の高い誘
導体のうち、７−ニチルー１Ｏ−（４−（１−ピペリジ
ノ）−１−ビペリジハカルポニロキシカンプトテンシン
　　（４称ｃｐ　　Ｔ−１１）を用いて行なった。

［ＴＮＦα活性誘導］ 対数増殖期のＲＭＩ８４０２をＲＰＭ１１６４０培地（
血清不合）で洗浄し、同培地（血清不合）で２×１０’
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。Ｘ　１０００倍濃度のＴＰＡ
、ＣＰＴ−１１及びＴＰＡ、ＣＰＴ−１１混合液を１／
１０００加え、３７℃で培養を行ない、その培養上清を
サンプルとした。サンプルをＰＢＳに対して透析しＴＮ
Ｆα活性を測定した。また必要に応じてサンプルをセン
トリブレツブ（アミコン社）で２０倍濃縮した。

［ＴＮＦα活性測定法］ ＴＮＦａ活性測定はカースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　
）等の方法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　、　Ｅ、＾、：Ｐｒ
ｏ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ。

７２．３６８６−３６７０　（１９７５）　）を一部改
良して用いた。末法は、　Ｌ−９２９細胞の接着性を利
用し、ＴＮＦαによ、り損害を受は接着性を失った細胞
を洗うことで除去し、残った生細胞を染色して、その染
色濃度を測定し損害率を測る方法である。標的ａ胞Ｌ−
９２９細胞を４　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／　１００μ
ｌを９６穴マイクロタイタープレート上に巻き込み４時
間、３７℃ＣＯ２インキュベーターで培養を行ない細胞
を付着させた。続いて、５０μｌの希釈サンプル及び４
μｇ／＋ｎｌアクチノマイシンＤ　（ＡＭＤ）溶液５０
μｍ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加え３７℃、１８時間
培養を行なった。各ウェル・をＰＢＳで洗浄後、　０．
１％クリスタルバイオレット、１％ＭｅＯＨのＰＢＳ溶
液で２０分間染色後、水道水でプレートを洗浄し、０．
１％　５ＤＳ１００μｌに溶かし５７０ｎｍの吸光度を
測定した。ＴＮＦαの活性は、サンプルを加えないコン
トロールの吸光度との割合から生存率を求めた。

第６図はＣＰＴ処理細胞の培養上清中のＬ−２９９に対
する細胞障害活性の結果を示す線図、第７図はヒトｒＴ
ＮＦαに対するモノクローナル抗体での中和の結果を示
す線図である。

第６図において、縦軸は、薬剤未処理培養上清のＬ−９
２９に対する細胞生存率を　１００％とした時の処理培
養上清の細胞障害活性を生存率で示す。横軸は、薬剤添
加後の処理時間を示す。・は４μＭＣＰＴ、ムは３０ｎ
ＭＴ　Ｐ　Ａ　、■は３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　＋　４　μ
ＭＣＰＴを示す。

第７図において、縦軸は薬剤未処理培養上清のＬ−９２
９に対する細胞生存率を１００％とした。横軸はＴＮＦ
αモノクローナル抗体（以下、ｍＡｂと略称す）の希釈
倍数を示す０ｍＡｂは培養上清と同時に添加し１８時間
後に判定した。・は未処理培養上清、○はＴＰＡＩＡ理
培養上清、ムはＣＰＴｌｆ！１理培養上清、△はＴＰＡ
＋ＣＰＴＩＡ理培養上清、■はヒトｒＴＮＦαを示す。

図右端の各点はｍＡｂ非存在下での細胞障害活性を示し
た。

細胞障害活性は、ＴＰＡ、ＣＰＴＪＩＬ独及びその併用
で誘導され、薬剤処理後、培養上清中に出現し、経時的
に上昇し、８時間でプラトーに達した（第６図）。その
活性誘導は、はぼＴＮＦα−ｍＲＮＡ量と相関していた
。一方、コントロールとしてのＤＭＳＯ単独では、その
活性は検出できなかった。

またＴＰＡ、ＣＰＴ及び併用で誘導される細胞障害活性
はヒトＴＮＦαのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により
濃度依存的に阻害され、高濃度で完全に中和された（第
７図）。

実施例−７（ＴＰＡ、ＣＰＴ　（−１１）単独及びその
併用による誘導ＴＮＦα分子のイム ノブロッティングによる同定） ［イムノプロット法によるＴＮＦαの同定］各薬剤でＴ
ＮＦαを誘導後、培養上清をγ−グロブリンを標準とし
て、バイオラッドタンパク質アッセイキットによりタン
パク定量を行なった。

即ち、総タン、バク質量１００μｇ心相当する培養土清
をとり、　１００％トリクロロ酢酸を最終濃度が１０％
になるように加えタンパク質を凝集させた。１０分間水
中で放置後、ｘ　１０，０００ｇ　、　４℃で遠心し、
沈殿とした。その沈殿にサンプルバッファー（５４０ｍ
Ｍ　　’ｔ−リスー塩酸（ｐ）Ｉ　８．０）　、　５０
１１１Ｍジチオスレイトール、１％ＳＤＳ、　　７．５
％グリセロール。

０．００６％ブロモフェノールブルー）　１０μｌを加
え熔かした後、　１００℃、３分間加熱し５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（１０％〜２０％グラジェントゲル　第一化学薬品
）を行なった。泳動後、セミトライ転写装置（アトー社
）を用い、０．１Ｍ　トリス、０．１９２Ｍグリシン、
０．０２％ＳＤＳ、２０％ＭｅＯＨ溶液で１　ｃｎ’当
り２ｍＡで９０分間、室温でフィルター（クリアプロッ
トＰ膜；アトー社）に転写した。フィルターは、ＴＴＢ
Ｓ（１００１ｎＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）　　０．
９％ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０）で３０分
間洗浄後、ＴＴＢＳで希釈した一次血清（２，５μｓ／
ｍｌ）を４℃で１２時間反応させた。以下、ベクタステ
ィンＡＢＣキットマニアル：ベルオキシターゼ染色法（
ベクター社）で検出した。発色は、　１００ｍＭ）−リ
ス塩酸（ｐ）Ｉ　７．５）　２０ｍ１に２０ｍｇ／ｍｌ
のジアミノベンジジン８００μｍ、８％塩化ニッケル１
００μｌ及び３％過酸化水素水１５μｌを加え、室温で
１５分間反応させ行なった。

第８図は薬剤処理培養上滑中のＴＮＦαのイムノブロッ
ティングによる検出を示した説明図であり、図において
、各薬剤２４時間処理培養上清について、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分離後、イムノプロット法でＴＮＦα分子種の検
討を行った結果を模式的に示した。レーン１はヒトｒＴ
ＮＦα、レーン２は３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　、レーン３は
３０ｎＭＴ　Ｐ　Ａ　＋　４μＭＣＰＴ、レーン４は４
μＭＣＰＴ、レーン５は　０．１％ＤＭＳＯ，レーン６
は　１６０μＭＣＰＴ−１１ル−ン７は１６０μＭ　Ｃ
Ｐ　Ｔ　−１１＋　３０ｎＭＴ　ＰＡを示す。レーン１
はヒトｒＴＮＦαタンパク質として０．４μｇ、レーン
２〜７の総タンパク質量は１００μｇである。右矢印は
サイズマーカを示す。

左矢印はＴＮＦα標準タンパク貿（１７，５Ｋｄ）を示
す。

ＣＰＴ及びその誘導体ＣＰＴ−１１により、ＴＮＦαｍ
Ａｂと免疫学的に交叉する分子種が誘導された（第８図
レーン４．６）。またＴＰＡとの併用によっても、同様
に相乗的に誘導された（第８図レーン３．７）、第８図
レーン１は、標準ヒトＴＮＦαであり、それと同一分子
量１７．５にｄのものと、それより低分子（１７Ｋｄ）
に主生成物及びいくつかのｉＡｂと交叉する低分子量の
ものが数種検出された。一方、低分子量生成物は、タン
パク質分解酵素阻害剤、トランサミン、ＦＯＹ、アプロ
チニン、キモスタチン、アンチパイン、ロイペプチン、
及びそれらの混合物の存在下でも同程度に誘導された。

以上の実施例で、ＣＰＴ及びその誘導体によってトポ■
阻害の結果、転写銹、導される遺伝子について、ノーサ
ンプロット法により解析し、ＴＮＦαがその一つである
ことを見出した。即ち、（１）ＣＰＴにより、ヒトー＾
ＬＬ細胞でＴＮＦα−ｍＲＮ＾が誘導され、　ＨＬ−６
０細胞などでＴＮＦαを発現させることが知られている
ホルボールエステル（以下、ＴＰＡと略称す）により相
乗的に増強された。その誘導はアンチパインＤで阻害さ
れ、シクロヘキシミドで増強はなかった。また、細胞周
期依存的でなかった。一方、ＣＰＴ耐性株であるＣＰＴ
−に５では、その誘導はなかった。

（２）発現誘導は、プロティンキナーゼＣ以外のキナー
ゼの関与が示唆された。

（３）ＣＰＴ及びその誘導体ＣＰ　Ｔ−１１により、Ｔ
ＮＦα活性は培養中に放出され、その活性はＴＮＦαモ
ノクローナル抗体で中和された。ＴＮＦαの分子量は、
イムノプロット法により１７Ｋｄで標準ＴＮＦαと同じ
であった。

以上のことより、ＣＰＴ及びその誘導体はトポＩ阻害を
介して、ＴＮＦαの遺伝子発現を誘導し、活性型ＴＮＦ
αを産出することが判明した。

即ち、比較的低濃度のＣＰＴ及びその誘導体ででＴＰＡ
と同程度、更＆：ＴＰＡとの併用では相乗的にＴＮＦα
が誘導合成された。

ＴＮＦαは生体の免疫担当細胞の一つマクロファージが
主に産生ずるモノカインであり、抗腫瘍作用のほか、白
血病細胞の分化、エンドキシン様起炎性作用等多様な生
理活性を持っている。このような多彩な作用を持つＢ　
ＲＭ　（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍ
ｏｄｅｆｉｅｒｓ　）としてのＴＮＦａがＣＰＴ及びそ
の誘導体により誘導されることは、本薬剤が生体に投与
された時、直接腫瘍細胞を攻撃するほか、ＴＮＦａ、そ
の他のリンホカインの誘導を介して抗腫瘍活性をあられ
している可能性があり、本研究では培養白血病細胞にお
いて観察された事実であるが、生体に投与された場合に
も、ＣＰＴ及びその誘導体により、ＴＮＦａを誘導し、
ＴＰＡのようなプロモーターとの相乗効果を有する有用
性のある抗癌剤となる可能性が大いにある。

［発明の効果］ 本発明は以上説明したように、カンプトテンシン（ＣＰ
Ｔ）又はその誘導体が、ＤＮＡトポイソメラーゼ■　（
トポ■）を細胞内標的として　ＤＮＡ−トポＩ複合体を
固定化することにより、腫瘍細胞のＤＮＡ代謝を阻害し
細胞を死に至らしめるだけでなく、腫瘍に対して強い壊
死作用のあるＴＮＦａを誘導させるＴＮＦ誘導能が確認
された。このため、単なる化学療法剤及び免疫療法剤と
してでなく腫瘍に対する宿主の生物学的な反応性を修飾
することによりガンの治療を行うＢ　ＲＭ　（ｂｉｏｌ
ｏｇｔｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　１ｏｄｅｆｉｅｒｓ
　）として末剤を利用することにより有効なガン治療を
行なうことができる等の効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ、ｂ図はＣＰＴ％ＴＰＡ単独及びその併用の結果
を示す説明図、′ｓ２図はＣＰＴによるＴＮＦａ−ｍＲ
ＮＡ発現誘導のＡＭＤによる阻害の結果を示す説明図、
第３図はＣＰＴによるＴＮＦａ−ｍＲＮＡ発現誘導のＣ
ＨＸによる増強作用の結果を示す説明図、第４ａ、ｂ図
はＣＰＴによるＴＮＦａ−ｍＲＮＡ発現誘導の細胞周期
における変化の結果を示す説明図、第５ａ、ｂ図はタン
パク貿リン酸化酵素阻害剤存在下、でのＣＰＴによるＴ
ＮＦａ−ｍＲＮ＾誘導阻害の結果を示す説明図、第６図
はＣＰＴ処理細胞の培養上清中のＬ−９２９に対する細
胞障害活性の結果を示す線図、第７図はヒトｒＴＮＦα
に対するモノクローナル抗体での中和の結実を示す線図
、第８図は薬剤処理培養上清中のＴＮＦａのイムノブロ
ッティングによる検出を示した説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の構造で表されるカンプトテンシン（ＣＰＴ）又は
   その誘導体を有効成分とするＴＮＦ誘導剤。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、式中Ｒ＿１は水素原子、塩素原子もしくは炭素
   原子１〜４を有する低級アルキル基である。 Ｒ＿２は水素原子もしくは、式−ＯＣＯ−Ｘで表される
   基である。このＲ＿２はカンプトテンシン骨格の９位、
   １０位、１１位及び１２位のいずれに位置していてもよ
   い。このＸは塩素原子もしくは、式−ＮＲ＿３Ｒ＿４で
   表される基である。Ｒ＿３、Ｒ＿４は各々水素原子又は
   、置換又は非置換のアルキル基であり、また、Ｒ＿３、
   Ｒ＿４とは一緒になってそれらが結合しているＮ原子と
   ともに複素環を形成してもよく、その複素環は該Ｎ原子
   の他に異種原子を含んでもよい）