JPH0383522A - ベシキュラー・アービュスキュラー菌根菌の大量製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産果よ立豆旦発見 本発明は、ＶＡ菌根菌をタンク内で大量に製造する方法
に関する。

丈来立挟比 ＶＡ菌根菌は、植物と共生することによって、その共生
植物の養分吸収（特にリン）を促したり、共生植物を土
壌の病ｒ！に菌から保護する等、好ましい影響を与える
ことが現在までに多数報告されている。そこで、工業的
にＶＡ菌根菌を生産し共生させることができれば、作物
への施肥量軽減、悪い栽培環境に対する抵抗性の向上、
農産物の品質の向上が期待できる。

しかし、ＶＡ菌根菌は植物と共生していなければ増殖し
ない絶対共生菌で純粋培養できないことから、効率良く
大量に生産する技術の開発が大変困難となっている。

現在までに提案されたＶＡ菌根菌の培養方法には、大き
く分けて次の２つの方法がある。

１つは圃場、鉢、水耕栽培等の無菌化しない条件下で植
物根とＶＡ菌根菌の共生を行ない培養する方法で、その
ために好適な培養基体、例えば多孔性構造を有する物質
等を用いたり（特開昭６０−２３７９８７号公報）、水
耕栽培の際の培養液を薄膜状にする（特開昭５５−１１
８３９０号公報）等の方法が開発されている。

しかしこの方法では、共生植物の生育が遅く、ＶＡ菌根
菌の大量製造が困難であり、また、ＶＡ菌根菌以外の微
生物による汚染の危険があつた・ ２つめの方法は、無菌的な容器内で植物を培養しＶＡ菌
根菌との共生を行なう方法である。

この場合は十分な栄養分を与えることができるので１通
常の植物体の他に、生育の良い根の器官培養物（特開昭
６２−１９０２８号公報）、毛状根（特公昭６２−４９
０３７号公報）等の組織培養物をＶＡ菌根菌の共生相手
とすることができる。

毛状根とは毛根病菌アグロバクテリウム・リゾジェネス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
）を植物の茎、葉、根等に接種すると感染部位から発生
する根で、アグロバクテリウム・リゾジェネス中に存在
する巨大プラスミド（Ｒｉプラスミド）の遺伝子の一部
が植物の遺伝子に組み込まれることにより発生する。毛
状根は通常の根に比べて生育が非常に速く１通常の根の
器官培養で必要な植物ホルモンを使用しなくても良い生
育が得られるので、コストを低減することができる。

また、毛状根はＶＡ菌根菌の胞子の発芽と菌糸体の生長
を刺激したり、ＶＡ菌根菌の感染しやすい箇所である根
の先端に近い若い部分を多く持つことが知られており、
共生相手としては好適であることが示されている。さら
に、毛状根の大量培養については液体培地を入れたエア
リフトタイプ等の発酵槽で行なうことも知られている（
特公昭６２−４９０３７号公報）。

しかしながら、毛状根を用いる方法も、工業的に有利な
大量培養におけるＶＡ菌根菌胞子の接種方法や、共生状
態での培養方法に関しては、未だ開発されていない。

が　　しようとする課 本発明の目的は、毛状根とＶＡ菌根菌を大量に共生させ
る方法を開発し、工業的なＶＡ菌根菌の生産方法を提供
することにある。

見里立豊處 本発明のＶＡ菌根菌の大量製造方法は、タンク培養下で
得られた毛状根に、タンク内でＶＡ菌根菌を接種、共生
させることを特徴とする。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明に用いる毛状根を作らせるために利用できるアク
ロバクテリウム・リゾジェネスとしては、以下のものが
例示される。

アグロバクテリウム・リゾジェネス　ＡＴＣＣ″１１Ｎ
ｎ２５８１８アグロバクテリウム・リゾジェネス　ＡＴ
ＣＣ”　　４１５８３４アグロバクテリウム・リゾジェ
ネス　ＡＴＣＣ１１１Ｎｎ４３０５７アグロバクテリウ
ム・リゾジェネス　ＮＣＰＰＢ”　ＮＱ８１９６アグロ
バクテリウム・リゾジェネス　ＮＩＡＥＳ″１３　Ｈα
１７２４菌寄託機関名 ※ｌ）　ＡＴＣＣ：　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

※２）　ＮＣＰＰＢ　：　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
　Ｂａｃｔｅｒｉａ。

Ｕ、Ｋ。

※３）　ＮＩＡＥＳ　：農林水産省農業環境技術研究所 また、大腸菌などの他の菌にＲｉプラスミドまたはその
一部を遺伝子導入した菌も使用できる。

植物をアグロバクテリウム・リゾジェネスで処理すると
、リゾジェネス菌中のＲｉプラスミドの一部（Ｔ−ＤＮ
Ａ）が植物細胞の核ＤＮＡの中に導入（形質転換）され
る。

植物の茎、根、葉等にＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡを導入
し形質転換させた毛状根を得る方法としては、例えば、
次の方法が挙げられる。

１、植物個体への直接接種法 ２、葉片を用いたリーフディスク法 （Ｒ，Ｂ、Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ、ａｌ、、５ＣＩＥＮＣ
Ｅ　２２７゜１２２９（１９８５）） ３、植物体のプロトプラストを利用した共存培養法 （Ｚ、Ｍ、Ｗｅｌ　ｅｔ、ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｐ、＋５：９３−９６（１９８６）） ４、植物体のプロトプラストと７グロバクテリウム・リ
ゾジェネスのスフ二ロプラスト法 （Ｒ，Ｈａｉｎ　４Ｉｔ、ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｒａｐ、。

３．６０（１９８４）） ５、　アグロバクテリウム・リゾジェネスのＲｉプラス
ミドまたはその一部のＴ− ＤＮＡを、マイクロインジェクション等の方法で、直接
細胞内に注入する方法 Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネスの除菌処理が
必要で、その方法としては下記のものがある。

ｌ）高温処理（４０℃） ２）抗生物質処理 ３）毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ 以上の方法により得られた毛状根の培養方法としては下
記のものが有効である。

本発明では、例えば、従来から植物の組織培養に用いら
れている培地、つまり、無機成分および炭素源を必須成
分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類およびアミ
ノ酸類から選ばれる少なくとも１種以上の成分を添加し
必要に応じてその他の成分も添加されている培地を用い
ることができる。

上記培地中の無機成分としては、窒素、亜鉛、鉄、鋼、
モリブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素等があり、具体的には、硝酸アンモニウ
ム、リン酸２水素アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝
酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、エチ
レンジアミン４酢酸鉄、硫酸銅、モリブデン酸、モリブ
デン酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、リン酸１ナトリウ
ム、リン酸カリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸３ナ
トリウム、塩化コバルト、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マンガン
、ヨウ化カリウム等が例示される。

また炭素源には、ショ糖および他の炭水化物、その誘導
体、脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコール
等が例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸 （ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（Ｎ　Ａ　Ａ）、ｐ−クロ
ロフェノキシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン、ベン
ジルアデニン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイト
カイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ、）
、ピリドキシン（ビタミンＢ、）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
等が例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティン等が例示される。

この他に、ビタミン、ホルモン等が含まれると言われて
いる天然物１例えばココナツツミルク、酵母エキス等も
用いることができる。

本発明では上記成分を含有する種々の培地を用いること
ができるが、液体培地を用いるのが好ましい。なお、液
体培地中の成分の濃度は、広い範囲で変えることができ
る。通常は、無機成分を約０．１μＮ〜約１００ｍＭ程
度、炭素源を約１　ｇ／　Ｑ　”　１２０ｇ／　Ｑ程度
、さらに植物ホルモン類を約０．０１μ阿〜約１０μＨ
程度、ビタミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約０．
１ｍｇ／Ｑ〜約１００ｍｇ／　Ｑ程度とすることができ
る。

本発明の毛状根の培養において、光は必ずしも必要では
なく、かえって暗所での培養が生育には望ましい。培養
温度は約り０℃〜約３５℃、特に約り３℃〜約２８℃が
好適である。約１０℃未満では毛状根の増殖速度が小さ
く、約３５℃を越えても同様に毛状根の増殖速度が小さ
くなるからである。

本発明では、液体培地中の毛状根の初期植え付は量を広
い範囲で変えることができる。通常は液体培地５０ｍ　
Ｑに対して、毛状根を約１０ｍｇ〜約１ｇ（新鮮重量）
程度植え付けすることが望ましい。

本発明では種々の培養装置（タンク）を用いることがで
きる。微生物培養用、動植物細胞培養用の培養槽（ファ
ーメンタ−）には様々なタイプがあり、特に培養物への
酸素供給の方法、培地（栄養物〉との接触方法、培地成
分制御の方法を改良した多くの培養槽が開発されている
。毛状根は微生物に比べて非常に大きいという形態上の
特徴があるので、高速で回転する撹拌翼を備えた培養装
置等の物理的衝撃の大きなものは用いることができない
が、適当な培地と酸素が供給され培養物への物理的衝撃
が大きくない装置であれば、非常に良い生育を得ること
ができる。

ただしＶＡ菌根菌の接種以降の段階では、液体中でＶＡ
菌根菌が増殖、胞子生産し難いため、−貫して一つの装
置で培養を行なう場合はこのことを考慮しながら装置を
決めなければならない。

本発明において用いられるＶＡ菌根菌としては、ギガス
ポラ属（Ｇｉｇａｓｐｏｒａ）、グロマス属（Ｇｌｏｍ
ｕｓ）、スクレロシスチス属（Ｓｃｌｅｒｏｃｙｓｔｉ
ｓ）、７カウロスポラ属（Ａｃｃａｕｌｏｓｐｏｒａ）
、エントロホスボラ属（Ｅｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ）
などが挙げられる。

これらのうち、土壌からギガスポラ・グレガリアの胞子
を分離する方法を以下に示す。

まず圃場または植物の鉢植えの土壌を採取し、水に懸濁
する。これを１〜２ｍｍメツシュの篩で大きなごみ、石
等を除き、さらに通過液を０．１ｍ１１メツシユの篩に
通す。０．１ｍｍメツシュの篩に残ったものを流水で洗
浄後集め、少量の水に懸濁しシャーレに移す。これを実
体顕微鏡下でごみと胞子とに選別し、胞子のみをピペッ
トで吸い取り別のシャーレに移す。この操作を３回繰り
返し、遠沈管に移した後、水を加えて超音波を数秒当て
てごみを分散させ、水を捨てることにより胞子を洗浄す
る。これを数回繰り返す。

洗浄した胞子の無菌化は、滅菌水で２０〜３０回洗浄す
るか、ストレプトマイシン等の抗生物質、種々の殺菌剤
等を用いることによって行なう。

無菌培養下で得られた胞子についてはもちろんその必要
は無い。

以上のようにして単離した胞子を、無菌化の確認や予備
発芽のために１毛状根に接種する前に適当な固体培地上
で培養してもよい。

以上のようにしてタンク培養下で得られた毛状根と、Ｖ
Ａ菌根菌をタンク内で共生させるため、ＶＡ菌根菌の接
種を行なう。接種するＶＡ菌根菌は上記の方法で得た胞
子または予備発芽した胞子が通常用いられるが、他の物
質との混合物の状態や、根または毛状根と共生している
ものをそのまま分離せずに接種源として用いることも可
能である。

タンク内でのＶＡ菌根菌の接種は、ＶＡ菌根菌接種源を
水、緩衝液等の液体、またはケイソウ士等の粉体、粒状
体に懸濁し、タンク内に注入することによって行なうこ
とができる。また、空気等の気体に分散して一緒に吹き
込むことにより、タンク内にＶＡ菌根菌を注入して接種
することもできる。

さらに、毛状根にＶＡ菌根菌接種源を付着、固定するこ
とにより、感染を容易にすることもできる。この方法は
、ある条件に変化させるとゲル化する等毛状根に付着し
やすい形態になる液体にＶＡ菌根菌接種源を懸濁して、
毛状根に与えた後、条件を変化させてゲル化等する方法
である。

例えば、アルギン酸ナトリウムを含む溶液にＶＡ菌根菌
接種源を懸濁し、懸濁液を毛状根に与えた後、これをゲ
ル化する目的で塩化カルシウム等の水溶性カルシウム水
溶液を与える。このようにすればアルギン酸ナトリウム
がゲル化し、ＶＡ菌根菌はゲルにより毛状根に付着する
。

また、同様に二価の金属イオン等によってゲル化するゲ
ランガム水溶液（通常粉末で販売されているので水に懸
濁した後加熱して水溶液を得る）にＶＡ菌根菌接種源を
懸濁し、毛状根に散布した後、イオン水溶液を与えても
よい。これら以外にもカラギーナン、寒天、キトサン等
の天然高分子物質や、ポリビニルアルコール、ポリアク
リルアミド等の合成高分子物質も使用できる。

ＶＡ菌根菌接種以降の段階において用いられる培養装置
（タンク）には、以下のものが挙げられる。ここで注意
しなければならないことは、前述の通り液体中ではＶＡ
菌根菌が増殖、胞子生産し難く、気相を必要とすること
である。

第１の例は、液体培地の水位をコントロールしながら培
養する装置である。すなわち、常に毛状根が培地中に入
ったままにならないように、培地の水位を低くできる装
置である。水位の上げ下げを定期的に行うことにより、
毛状根に栄養分を与え、かつ、ＶＡ菌根菌の増殖に必要
な気相を供給することができる。この場合、装置の高さ
を低くし、底面積を広くする。ただし、装置を何段階か
重ねるか、装置内を水平に仕切ることによって培養槽を
複数持つ装置とすることが可能である。水位の調節は、
適宜予備タンクやパイプを設置することによって行なう
。

第２の例は、毛状根を支持する支持体を用いた装置であ
る。第１の装置とは逆に毛状根の方を液体中から引き上
げておくものである。網等の毛状根を支持できてかつ液
体を通す支持体を用いて、毛状根を液体中から引き上げ
て気相に接触させる。支持体は上下運動または水面に垂
直方向に回転運動させるようにしてもよい。この場合に
おいて、上述の如く培地の水位をコントロールすること
も可能な装置を用いてもよい。

第３の例は、多孔性構造を有し内部に気相、液相を保持
できるバーミキュライト等の物質を充填した装置である
。これらの多孔性物質は、その中で増殖される毛状根に
気相と液相（液体培地）を供給することができる。

第４の例は、液体培地を水滴または霧状にして与える装
置である。必要に応じてノズル等が設置され、毛状根が
液体中に無くとも、毛状根に栄養を与えることができる
。

その他、毛状根に必要な栄養を与える液相と、ＶＡ菌根
菌の好率的な増殖が可能な気相雰囲気とを併存せしめる
タンクであれば、いずれもが使用しうるが、同一のタン
クを用いて、−貫して毛状根の培養、ＶＡ菌根菌の接種
、毛状根とＶＡ菌根菌の共生下での培養を行なうことが
好適である。

毛状根とＶＡ菌根菌の共生状態での培養は、前述の毛状
根の培養に用いた培地、培養温度その他を、そのまま、
または改変して用いることができる。培地のｐＨに関し
ては、毛状根培養では４〜７の弱酸性が好ましいが、共
生した場合には６〜８の中性付近が好ましい。

見旦立塾果 本発明によれば、タンク培養下で得られた毛状根に、タ
ンク内でＶＡ菌根開を接種、共生させることにより、Ｖ
Ａ菌根菌を効率的に製造できる。よって、本発明の方法
は、工業的なＶＡ菌根菌の製造方法として極めて好適で
ある。

失凰盟 シロクローバ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅｐｅｎｓ）の
種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液の殺菌剤で滅菌したの
ち、ショ糖を３％含有するムラシゲ・スクーグ（ＭＳ−
３と略す）の固型培地上に播種し、発芽した無菌植物の
茎、葉部等にＲｉプラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム・リゾジェネス（ＮＩＡＥＳ　Ｎ［Ｌ１７２４）菌
を接種した。

５週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り、ク
ラホラン０．５ｇ／　Ｑを含むＭＳ−３の固型培地上に
移植し、２週間で同じ組成の新しい培地に移植した。３
回この操作を繰り返して、除菌された毛状根を得た。

２Ｑのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝子株式
会社ｆＡ）のタンクに、ＭＳ−３の液体培地ｌＱ（毛状
根培養用）を入れた。また、ペリスタ−・ポンプ、ガラ
ス管およびシリコン管で培養中に培地水位を任意に変え
られるように装置を組み立て、別に改変培地（毛状根と
ＶＡ菌根菌の共生培養用）を入れたガラスびんを設置し
た。すなわち、ガラスびんに新鮮な改変ＭＳ（塩濃度半
分に、ショ糖濃度２％に、ＰＨを６に改変）の液体培地
を３Ｑ入れ、タンク底部とガラス管およびシリコン管で
つなぎ、途中にペリスター・ポンプを設置して液体培地
をどちらの方向にも移動させられるようにした。なおタ
ンク底部の開口部には毛状根が管に侵入しないようにガ
ラスフィルターを設けた。装置は１２０℃で６０分間滅
菌した。

シロクローバ−（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅｐｅｎｓ）
の毛状根を上記培地に約１ｇ（新鮮重量）植え付け、２
５℃で２０日間暗黒下に培養した。

ポット栽培したアルファルファの土壌を篩分けした後、
実体顕微鏡下でギガスポラ・グレガリアの胞子を採取し
、滅菌水で３０回洗浄して無菌の胞子を得た。単離した
胞子を、無菌化の確認と予備発芽のために、改変ＭＳの
固型培地上で２週間培養した。

毛状根培養後、毛状根培養用のＭＳ−３液体培地はタン
ク外へ捨てた。

ペリスタ−・ポンプを作動させて改変ＭＳ培地をガラス
びんからタンクに導入し１毛状根およびタンク内を洗浄
して、この培地を捨てた。

この操作を３回繰り返した後、改変ＭＳ培地をタンク内
に３００ｍ　Ｑ導入した。

無菌であることと、発芽することが確認できたギガスポ
ラ・グレガリアの胞子１０００個を改変ＭＳ培地に懸濁
し１毛状根に散布した。

５日毎に培地を交換しながら５週間培養した後、タンク
内部の毛状根を取り出し、新鮮重量を調べた。感染率の
調査は、１ｃｍ１以上の分校した根をランダムに５０本
採取し、トリパンブルーによって染色し、顕微鏡下でＩ
ｔ察して感染したものの割合を調べることによって行な
った。

比較例として次の実験を行なった。

実施例で用いたタンクを１２０１１Ｑの固体培地を入れ
た内径１５ｃｍのガラスシャーレ−とし、その他の条件
は実施例と同様に行なった。

実施例と比較例における毛状根の培地ＩＱあたりの新鮮
重量と、ＶＡ菌根菌感染率を次に示す。

表−１ また、重量測定、感染率調査を行なわずに、実施例の方
法により６ケ月間培養を続けたところ、圃場や植木鉢等
を用いる従来の方法に比べて非常に多くの胞子生産が認
められた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、タンク培養下で得られた毛状根に、タンク内でベシ
   キエラー・アービュスキュラー菌根菌（のう状体と樹枝
   状体を有する内生菌根菌類：以下ＶＡ菌根菌と称す）を
   接種、共生させることを特徴とするＶＡ菌根菌の大量製
   造方法。