JPH0383585A - 酵素又は微生物の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素及び触媒活性を有する微生物の固定化に関
するものであって、製薬、食品製造。

汚水処理、ファインケミカル、一般化学品製造等の分野
で酵素、微生物などの生体触媒を固定化し、バイオリア
クターとして利用できる酵素及び微生物の固定化法に関
する。

〔従来の技術〕

生体触媒を固定化して使用する方法が種々提案されてい
る。一般に用いられる生体触媒としては、酵素もしくは
微生物がその代表的なものであり、これらの固定化法と
しては高分子マトリックス中に固定化する包括法、固定
化担体に直接化学結合する担体結合法、酵素相互間を架
橋不溶化する架橋法の６種の方法が挙げられる。

担体結合法では例えば多孔質担体表面を、化学修飾して
官能基を導入し酵素との間で化学反応により結合する〜
。この方法では酵素と担体を化学結合により直接結合さ
せるため、酵素の脱落はねいが、固定化時に有害な試薬
を使用したり、反応操作が複雑であり、使用可能な担体
が限定される。

架橋法では例えばグルタルアルデヒドなどの架橋試薬を
用いて酵素相互間に架橋反応を行わせて不溶固定化する
方法がよく知られている。

た後、グルタルアルデヒドの架橋試薬を添加して架橋反
応を行わせ、酵素を架橋不溶化する。

この方法では架橋試薬濃度と酵素濃度の設定が難しく、
担体表面を酵素からなる膜で均一に覆うことは困難であ
る。

包括法については２種の手法があり、高分子ゲルの細か
い格子の中に微生物を包み込む格子型と多孔質の高分子
皮膜によって酵素、微生物を被覆するマイクロカプセル
型に大別できる。

包括法は固定化材料と酵素、微生物とは結合を起こして
いないこと、また固定化条件が比較的温和な条件である
ことから多くの酵素、微生物の固定化に応用できる可能
性を有する有望な方法である。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

酵素もしくは微生物を利用する反応は、通常水溶液反応
であるためこれを包括固定するための担体としては含水
ゲルが一般的に用いられる。

含水ゲルとして使用される材料（以後ゲル基材と略す）
としては天然高分子（寒天、Ｋ−力ラギーナン、アルギ
ン酸カルシウム）や合成高分子（ポリビニルアルコール
、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、光硬化樹脂）等
がある。これらのゲル基材はゲル化する前に固定化すべ
き酵素、微生物と混合した後、ゲル化剤により固定化し
球状、円柱状、板状等に成形して用いる。

しかし、このようにして固定化した担体の表面は平滑で
あり、基質透過性が低く、ゲル内部での微生物の活動は
低く、固定化した酵素、微生物の一部しか利用できない
という問題があった。

また天然多糖類を用いた場合、合成高分子材料に比べ機
械的強度が弱く微生物の増殖により破壊を受けたり、変
形、膨潤しやすく耐久性に劣る欠点があった。これらの
強度及び耐久性を向上する目的で２種以上の材料を組み
合せる方法（特公昭６３−２１４７４号公報、特開昭６
３−６８０８５号公報）、あるいは鉱物等の生物により
分解代謝されない物質を混合する方法（特開昭５７−１
４１２９１号公報）、反応に寄与する表面積の増大方法
として、ゲルを多孔化するためにゲル化工程において、
ゲル原料凍結物を真空乾燥する方法（特開昭６０−１８
０５８７号公報）等も提案されている。

しかし２種以上の材料を組み合わせる方法は基質透過性
が低り１、ゲル内部の酵素、微生物が有効に利用できな
い問題があった。また凍結乾燥による表面積の増大法は
製造作業性が悪く、コストの高騰を招くことから大量生
産に適しないという問題があった。本発明はこれらの従
来の問題点を解決するためになされたもので機械的強度
が大きく、耐久性が良く、反応に寄与する表面積の大き
々固定化酵素又は固定化微生物の固定化法を提供するこ
とを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ゲル形成能を有する高分子重合体の水溶液に
酵素又は触媒活性を有する微生物を溶解もしくは懸濁さ
せて混合ゾルとなし、水不溶性高分子を水不溶性溶媒に
溶解した溶液にこの混合ゾルを添加、混合、撹拌し、粒
径５μ以下の水含有カプセルとして分散させて乳濁液を
調製し、次いで、この乳濁液を用い、乾式紡糸又は脱溶
媒可能な凝固浴への滴下もしくは湿式紡糸により多孔質
な繊維状担体又は粒状担体に包括固定した後、ゲル化剤
により水含有カプセル中のゲル形成能を有する高分子重
合体をゲル化させることを特徴とする酵素又は微生物の
固定化法である。

本発明では、酵素又は触媒活性を有する微生物をゲル基
材を含んだ水溶液に溶解もしくは懸濁させ混合ゾルを調
製する。これとは別に水不溶性高分子を水不溶性溶媒に
溶解して水不溶性高分子溶液を得る。次いで得られた混
合ゾルを水不溶性高分子溶液に添加、混合、撹拌すると
、酵素又は微生物を含んだ水溶液がこれと相溶性のない
水不溶性高分子溶液中に微小粒子となって分散する。こ
のとき粒子表面は水不溶性高分子によって被覆されてお
り、水含有マイクロカプセルが生成する。これにより混
合液は乳濁液となる。この乳濁液を用いて、乾式紡糸又
は脱溶媒可能な凝固浴への滴下もしくは湿式紡糸するこ
とにより、多孔質な繊維状担体又は粒状担体とした後ゲ
ル化剤により水含有マイクロカプセル中のゲル基材をゲ
ル化させる。

〔作用〕

本発明方法は、前記のように水不溶性高分子溶液中へ酵
素又は微生物含有水溶液を添加、混合、撹拌することに
より粒径５μ以下の水含有カプセルを分散させた乳濁液
を調製し、次いで脱溶媒により不溶化担体とした後、ゲ
ル化剤により不溶化担体中のゾルをゲル化することを特
徴とする。

本発明方法によって製造した担体内部と表面には孔径５
μ以下の微孔が多数存在し、担体の活性を支配する有効
表面積が一般と増大し、かつ担体強度を大きく向上させ
ることができる。

本発明方法は下記の工程で示される。

（−ゲル基材を水溶液とし、酵素もしくは微生物、安定
剤を混合し混合ゾルを造る工程。

（ｂ）水溶性高分子を水不溶性溶媒に溶解し水不溶性高
分子溶液を造る工程。

（ｃ）混合ゾルを分散剤とともに水不溶性高分子溶液に
添加、混合、撹拌し、粒径５μ以下の水含有マイクロカ
プセルを製造する工程。

（ｄ）脱溶媒し不溶化担体な製造する工程。

＋６＞不溶化担体中のゾルをゲル化剤によりゲル化する
工程。

工程（ａ）のグル基材としては辱天、Ｋ−カラギーナン
、アルギン酸塩、アルブミン、キサンタンガム等の天然
高分子、及びその誘導体もしくはボリアミド、光硬化性
樹脂、ポリビニルアルコール、ポリスチレン等の合成高
分子もしくはましくは０．２〜１０重量％である。酵素
及び微生物はいかなる種類のものでもよく、酵素又は微
生物濃度は０．１〜５０重量％好ましくは０．２〜１０
重量％であり、安定剤、保護剤、ｐＨ調整剤を一緒に用
いてもよい。

安定剤としては、各種の培地やグリセリン等の多価アル
コール、ポリエチレングリコール、蛋白質、核酸、ショ
糖等の糖類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ
酸類、リンゴ酸等の有ｉ酸、マグネシウム、マンガン、
コバルト、カルシウム等の金属塩類、粉末活性炭、珪藻
土、ラテックス等の微少な固形物が挙げられる。

工程（ｂ）において、水不溶性高分子を水不溶性溶媒に
溶解して水不溶性高分子溶液を調製する。

水不溶性高分子としてはセルロース、セルロースアセテ
ート等のセルロース誘導体、ポリアミド、アクリロニト
リル、アクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリル酸エス
テル、ビニルエステル、メタクリル酸エステル、ビニル
クロリド、等 ビニリデンクロリド及びスチレンより得られる重合体及
び共重合体が用いられる。濃度として０．５〜８０重量
％好ましくは３〜４０重量％である。

水不溶性溶媒としては、塩化メチレンなどのハロゲン化
炭化水素、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族
炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族
炭化水素、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ノルマ
ル酪酸ブチル、イソ酪酸ブチル、イン酪酸アミル、プロ
ピオン酸メチル、インプロピオン酸ブチル、蟻７類など
が挙げられる。これらの溶媒は２種以上混合して用いて
もよい。

次いで混合ゾルを分散剤とともに水不溶性高分子溶液に
添加、混合、撹拌し１粒径５μ以下の水含有マイクロカ
プセルを製造する。

工程（Ｃ）の混合、撹拌方法としては、ホモジナイザー
が好ましく、回転数は１０００〜８００口「−好ましく
は２５００〜６０００ｒｌ）ｌＸ３０分である。これに
より粒径５μ以下の乳濁液が得られ、エマルジョンの分
散状態は光学顕微鏡で容易に観察できる。

分散剤の使用も効果があり、非イオン系の界面活性剤が
好ましく、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレンノニル７エ二ルエーテル、ポリエチレン
グリコールラウレト、ソルビタンモノラウレート、グリ
セリンモノステアレート、ラウリル酸シュガーエステル
などが用いられる。

次いで水含有マイクロカプセル分散液を脱溶媒し、不溶
化担体を製造する。

工程（ｄｌの脱溶媒法としては一般的な乾式紡糸法、湿
式紡糸法及び凝固浴への滴下が用いられる。乾式紡糸法
では酵素又は微生物の耐熱温度以上の温度で行うことが
できる。このことは高温にとどまる時間が非常に短いこ
とによるためである。湿式紡糸及び凝固浴への滴下によ
る脱溶媒法の場合、凝固剤としては酵素、微生物に害の
ないものから選ぶ必要があり、好ましくは水不溶性の性
質を有する溶媒であり、水不溶性高分子の不溶性溶媒に
属するものであればよい。

第１図は脱溶媒により得られた担体の横断面の走査型電
子顕微鏡写真図、第２図は同じ担体の側面の走査型電子
顕微鏡写真図である。第１図及び第２図にみられるよう
に、担体は横断面及び側面に５μ以下の微孔を多数備え
ている。

工程ｔｅ）のゲル化剤としては、ゲル基材がアルギン酸
及びアルギン酸塩の場合、塩化カルシウム、酢酸カルシ
ウム、硫酸カルシウム、塩化アルミニウム等が、通常１
〜１０％（Ｗ／ｖ）程度の濃度で用いられる。

ゲル基材かに一カラギーナンの場合、塩化カリウム、炭
酸カリウム、リン酸−カリウム塩、リン酸二カリウム塩
等のカリウム塩並びに塩化カルシウム、酢酸カルシウム
等のカルシウム塩、硫酸アルミニウム等のアルミニウム
塩が、通常１〜１０％（ｗ／　ｖ　）程度の濃度で使用
される。

ゲル基材カポリビニルアルコールノｔｌＡ合１５℃以下
の低温にて凍結するだけでゲル化する。

こうして得られた担体は内部に酵素又は微生物を固定化
したゲルを含有し、非常に多孔質な構造を保持している
ことを粋色としている。

得られた担体は粒状で用いてもよく、また繊維状及び繊
条状で用いてもよい。

〔実施例〕

以下、本発明に、ついて詳細に説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

第３図は本発明の固定化酵素又は微生物を得るための装
置の一例を示す構成図である。

ゲル基材、酵素、微生物を所定濃度の水溶液になるよう
調整して混合ゾル槽に蓄え、ここから取り出した混合ゾ
ルを水不溶性高分子溶液槽２に蓄えられた高分子溶液と
ともに混合槽３で撹拌・混合し、５μ以下の水含有カプ
セルを含んだ乳濁液とする。不溶化槽４で水含有マイク
ロカプセル分散液を脱溶媒した後、ゲル化槽５で水含有
カプセル中のゲル基材をゲル化させる。また不溶化槽４
の代わりに一般的に乾式紡糸装置を用いて紡糸してもよ
い。次にこの装置を用いた固定化法について述べる。

実施例１ 酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（天野製薬社製ラ
クターゼＦ「アマノＪＳＤ）１．５％（Ｗ／、）、Ｋ−
カラギーナン（三菱レイヨン社製ソアギーナンＭＶ１０
１　）２．０重量％含む混合ゾル２５ｇを調製し、トリ
アセチルセルロース（ダイセル社製、置換度２．９）１
００．９を塩化メチレン９００ｇに溶解させた溶液に添
加・混合し、ホモジナイザーにて７５００ｒｐ１ｘ３０
分撹拌混合した。得られた混合液は白濁した状態であり
、光学顕微鏡により５μ以下の微粒子であることが確認
できた。

６重量％ＫＣＩ水溶液に浸漬し担体中のゾルをゲル化さ
せた。得られたビーズを洗浄後オルトニトロフェノール
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（東京化成工業社製、以
下０ＮＰＧと略す）を基質としｐＨ４，５，５０°Ｃ，
５分間反応させ、酵素反応により生成したオルトニトロ
フェノール量を分光光度計（日立製作所社Ｕ−１１００
）を使い波長４２０　ｎｍの吸光度で定量し評価したと
ころ、添加酵素の２７％の酵素活性が認められ、繰返し
評価により固定化酵素であると確認できた。

実施例２ 実施例１と同様に調製した混合液を口径１００μの孔６
０ホーんを有する紡糸口金を用い２１０ｍ／分で捲取っ
た。

得られた繊維の酵素活性は実施例１と同様に０ＮＰＧを
基質として評価した結果、添加した酵素量の６４％の活
性が得られた。

比較例１ 実施例１と同様な方法でに一カラギーナンを含まない混
合ゾルを実施例２と同様な方法でトルエン中に湿式紡糸
し脱溶媒後６重量％ＫＣｌｆｆ１液で処理し１０ｍ／分
で捲取った。酵素評価の結果、添加酵素量の３％しか酵
素活性がみられなかった。

実施例３ （ａ）　　日本醸造協会ワイン酵母３号をグルコース１
．０重量％、ペプトン０．５重量％、酵母エキス０．３
重量％、マルトエキス０．３重量％を含有する■培地（
ｐＨ４，６）に植菌し２５℃で２４時間振盪培養した。

培養液を遠心分離（３０００ｒｐｌＸ１０分）集菌して
得た菌体２ｇをに一カラギーナン２．０重量％含む■培
地（ｐＨ４，６）４０ｇに分散させた。

（ｂ）トリアセチルセルロース１５０ｇを塩化メチレン
ａｓｏＩｉに溶かした溶液に前記（ａ）で調製した酵母
含有■培地４２ｇを添加し、ホモジナイザーで分散せし
めた（１５００ｒｐｓｘ２０分）得られた液は乳濁液で
あった。

次いで実施例２と同様の紡糸口金を用いｎ−へキサン中
に湿式紡糸し脱溶媒後、６重量％のＫＣＩ溶液でゲル化
し繊維を得た。この繊維２１Ｉを滅菌水でよく洗浄した
後、■培地（ｐＨ４，６）　１５０　、Ｆ中に浸漬し２
５℃で、５日間培養した結果０．３％のエチルアルコ−
ル発生が認められたので、ＹＭ培地より固定化繊維を取
り出し滅菌水２００ｇで５回洗浄した後、グルコース濃
度を１０％に上げた■培地（ｐＨ４，６）　１５０　ｆ
ｉに浸漬し、さらに２５°Ｃで２日間振盪培養を続けた
結果、４．８％のエタノールの発生がみられた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、酵素及び微生物は水カプセル中に存在
するため固定化の際に影響を受けることが少なく、酵素
活性を失うことがなくかつ強度が大きく耐久性のある固
定化酵素又は固定化微生物菌体が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られた繊維断面の走査型電顕写
真図、第２図は得られた繊維側面の走査型電顕写真図、
第３図は本発明の装置の概念図であって、第３図中の記
号１はゲル基材、酵素又は微生物の混合ゾル槽、２は溶
液槽、３は混合槽、４は不溶化槽、５はゲル化槽を示す
。 第７図 項ｒ白 纂３ 凹 ７ｋｌ昏由馴４溶喰槽

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ゲル形成能を有する高分子重合体の水溶液に酵素又は触
   媒活性を有する微生物を溶解もしくは懸濁させて混合ゾ
   ルとなし、水不溶性高分子を水不溶性溶媒に溶解した溶
   液にこの混合ゾルを添加、混合、撹拌し、粒径５μ以下
   の水含有カプセルとして分散させて乳濁液を調製し、次
   いで、この乳濁液を用い、乾式紡糸又は脱溶媒可能な凝
   固浴への滴下もしくは湿式紡糸により多孔質な繊維状担
   体又は粒状担体に包括固定した後、ゲル化剤により水含
   有カプセル中のゲル形成能を有する高分子重合体をゲル
   化させることを特徴とする酵素又は微生物の固定化法。