JPH0387175A - リパーゼ及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、エステル分解反応、エステル合成反応、エ
ステル交換反応に用いられるリパーゼ酵素及びその遺伝
子に関するものである。

遺伝子は組み換えＤＮＡ法によりリパーゼを大量に生産
することを可能にし、また遺伝子改変によってより機能
的なリパーゼを作り出す事を可能にする。リパーゼの用
途としては、脂肪酸の製造、牛脂の分解、カカオ代用脂
の製造、グリセリド合成、テルペンアルコールエステル
合成、シュガーエステル合戒、ラセミ体エステルの光学
分割等がある。

〔従来の技術〕

リパーゼを生産する生物は、動物、植物、微生物に広く
分布しており、それらのリパーゼは、その給源によって
、また組織によって特徴的な性質を持っている。これら
のリパーゼの中には、アミノ酸全配列の分かっているも
のや、部分的に配列の分かっているものがあり、それら
は次にあげる通りである。動物由来には、ｒａｔ　Ｌｉ
ｎｇａｌ　１ｉｐａｓｅ（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ、Ａ、Ｊ、
Ｐ、ＨＢｏｄｍｅｒ、Ｍ、Ｗ、；八ｎｇａ１．ｓ、；Ｖ
ｅｒｇｅｒＲ，ＨＲ４ｖｉｅｒｅ、　ｃ、　；Ｌｏｗｅ
、　Ｐ、Ａ、　；Ｌｙｏｎｓ＋　Ａ、　；Ｅｍｔａｇｅ
、　Ｊ、Ｓ。

；ｌ１ａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｊ、Ｒ，：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３（６）＋１８９１−９０３
（１９８５））、ｒａｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｌｉｐａｓ
ｅ（Ｋｏｍａｒｏｍｙ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ，；５ｃｈ
ｏｔｚ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ，：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、八、、８４（６）、１５２
へ−３０（１９８７））、ｈｕｍａｎ　　ｇａｓｔｒｉ
ｃｌｉｐａｓｅ（Ｂｏｄｍｅｒ、Ｍａｒｋ　　Ｈ，；八
ｎｇａｌ、５ａｒｏｊａｎｉ；Ｙａｒｒａｎｔｏｎ、Ｇ
ｅｏｆｆｒｅｙ　　Ｔ、；ｌ１ａｒｒｉｓ、Ｔｉｍｏｔ
ｈｙ　　Ｊ、Ｒ，；Ｌｙｏｎｓ、八１ａｎ；Ｋｉｎｇ、
Ｄａｖｉｄ　Ｊ、；Ｉ’１ｅｒｏｎｉ、Ｇｅｒａｒｄ；
Ｒ４ｖｉｅｒｅ、Ｃ１ａｕｄｅ；Ｖｅｒｇｅｒ＋Ｒｏｂ
ｅｒｔ；Ｌｏｗｅ、Ｐｅｔｅｒ　Ａ、：Ｂｉｏｃｈｉｍ
、ＢｉｏｐｈｙＳ、八ｃｔａ、　　９０９　　（３）、
２３７−４４（１９８７））、ｂｏｖｉｎｅ　　ｂｒａ
ｉｎ　　ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ　１ｉｐａｓｅ
（Ｆａｒｏｏｑｕｉ、Ａｋｈｌａｑ　Ａ、ＨＣｈｅｎｇ
、　Ｓｈ　１ｙｕａｎ　；Ｒａｍｍｏｈａｎ　、　Ｋｏ
ｔｔｉ　Ｉ　；ＫｏＩａ　ｔｔｕｋｕｄｙ、　Ｐａｐａ
ｃｈａｎ；１ｌａｒｒｏｃｋｓ、Ｌｌｏｙｄ　Ａ、：Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、　１６（３）、２
９３（１９８８））、ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　１
ｉｐａｓｅ　（Ｄａｔｔａ、５ａｎｔａｎｕ；Ｌｕｏ、
Ｃｈｉ　　Ｃｈｅｎｇ；ＬｉＪｅｎ　Ｉｌｓｉｕｎｇ；
Ｖａｎ　Ｔｕｉｎｅｎ　ＰｅｔｅｒＨＬｅｄｂｅｔｔｅ
ｒ、Ｄａｖｉｄ　Ｈ，；Ｂｒｏｉｙｎ、Ｍａｒｙ　Ａ、
；Ｃｈｅｎ、Ｓａｎ　ＨｗａｎＨＬｉｕ、５ｈｙａｎ　
Ｗｏｅｉ；Ｃｈａｎ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ：Ｊ、Ｂｉｏｌ
、ｃｈｅｍ、、　２６３　（３）、１１０７４０（１９
８８））、などがあり、これらは全アミノ酸配列が知ら
れている。またバクテリア由来では５ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ　１ｉｐａｓｅ（Ｇｏｅ　ｔ
ｚ　、　Ｆｒ１ｅｄｒｉｃｈ　；Ｐｏｐｐ、　Ｆｒ　ｉ
　ｔｚ　；　Ｋｏｒｎ　＋　Ｅｄｄａ　；Ｓｃｈ　１ｅ
ｉｆｅｒ＋Ｋａｒｌ　Ｈｅ１ｎｚ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３（１６）、５８９５−９０６
（１９８５））＋　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇ
ｉ　ｌｉｐａｓｅ（Ｋｕｇｉｍｉｍａ＋　Ｈａ　ｔａｒ
ｕ　；Ｏｔａｎ　ｉ、　Ｙａｓｕｏ　；ｌｌａｓｈｉｍ
ｏｔｏ、　Ｙｕｋｉｋｏ　；Ｔａｋａｇｉ、　Ｙａｓｕ
ｙｕｋ　ｉ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　
、Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ、　＋　１４１（１）　、　
１８５−９０　（１９８６）　）などがあり、これらも
全アごノ酸配列が決定されている。糸状菌由来では、Ｒ
ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　１ｉｐａｓｅ（Ｂ
ｏｅｌ、ＥｓｐｅｒＨＨｕｇｅｊｅｎｓｅｎ。

Ｂｉｒｇｉ　ｔｔｅ　；Ｃｈｒｉｓ　ｊｅｎｓｆ３ｎ＋
　Ｍｏｇｅｎｓ　ＨＴｈｉｍ、　Ｌａｒｓ　；Ｆｉ　１
１゜Ｎ１ｅｌｓ　Ｐ、：Ｌｉｐｉｄｓ、２３，７０１（
１９８Ｂ））、Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｎ１ｖｅｕｓ　１ｉ
ｐａｓｅ（特開昭６４−８０２９０号公報）、Ｇｅｏｔ
ｒ４ｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　１ｉｐａｓｅ（特開
昭６３−３２４８９号公報）等があり、前二者はその全
アミノ酸配列が、後者はそれをコードするＤＮＡの配列
が明らかになっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところで、糸状菌由来のリパーゼはバクテリア由来のも
のと違って、基質であるトリグリセリドの１．３位に特
異的に作用する性質を持つ。この性質は、エステル交換
を利用したカカオ代用脂の製造にはなくてはならない性
質である。動物由来のリパーゼも同様な特異性を持つも
のが多いが、培養の容易さの点などを考えると糸状菌リ
パーゼのほうが利用しやすいと考えられる。

本発明の目的は、リパーゼを精製し、そのＮ末端アミノ
酸配列を決定して、本リパーゼの分子構造を明らかにす
るとともに、トリグリセリドの１゜３位に特異的に作用
するリパーゼを遺伝子工学的手法によって純粋な形で安
価に大量供給しうる手段を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、糸状菌の１つであるＲｈ　ｉｚ亜
■ｄｅｌｅｍａｒの生産するリパーゼを、エステル交換
反応などに利用するために、その性状、構造を明らかに
する目的で精製し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した
。この配列はこれまでに知られた上記リパーゼとは全く
異なっており、新しい蛋白質構造をもつリパーゼである
ことがわかった。

また、さらに、本発明者らはリパーゼ生産菌としてＲｈ
１ｚｏｐｕｓ　　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ　６０４５（本
菌株はＦＥＲＭ　Ｐ１０５５０として寄託されている。

） を選び、この培養上澄中に存在するリパーゼを精製した
。この菌株の生産するリパーゼの精製についてはすでに
岩井ら（Ｉｗａｉ、　Ｍｉｅｋｏ；Ｔｓｕｊ　１ｓａｋ
ａ＋　ＹｏｓｉＯ：八ｇｒ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　、
　３８．１２４１　（１９７４））によって報告されて
いるが、本発明者らはその精製方法を大幅に簡略化し、
しかもＮ末端アミノ酸配列を決定するのに十分な純度を
持つサンプルを得ることに成功し、Ｎ末端アミノ酸配列
を決定した。

このデータをもとに、合成ＤＮＡプローブを作製し、Ｒ
ｈ１ｚｏｐｕｓ　　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ　６０４５菌
体より抽出したゲノムＤＮＡよりリパーゼゲノム遺伝子
を、また抽出精製したｍＲＮＡより台底したｃ　ＤＮＡ
遺伝子の中からリパーゼゲノム遺伝子を取得した。そし
てそのＤＮＡの全構造を決定した。

以下に方法を説明する。

培養方法は従来の肋ｕ亜！属の培養方法と特に変わらな
い。すなわち培地としては炭素源、窒素源、無機イオン
、さらに必要に応し硝酸塩、リン酸塩等を含有する通常
のものである。炭素源としてはグルコース及びこれらを
含有する澱粉加水分解物、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてはポリペプトン、トリプトン、肉エキス、酵母エ
キス等が使われる。培養は好気的条件下で培地のｐｌ＋
及び温度を適宜調節することが望ましいが、必ずしもそ
の必要はない。培養時間は培地中のリパーゼ活性が最高
になるところまで行われる。

培養上澄よりリパーゼを精製するには以下の様な方法が
用いられる。培養液のｐｌ＋を塩酸により４．６に調整
し、沈澱を除く。この時調整するｐｎの範囲は４．６付
近であれば良い。また用いる酸は塩酸でなくともかまわ
ない。得られた上澄を硫安沈澱し、脱塩した後、ファル
マシアＰｈｅｎｙｌ　５ｅｐｈａｒ。

５ｅＣＬ４Ｂオープンカラムにかけ分画を行う。このカ
ラムは、充填剤の基材につけた疎水性基と試料の疎水性
官能基との相互作用の違いにより分離を行う担体ならば
他のものでも使用することが可能である。また、このス
テップを省略してしまうことが可能である。分画したサ
ンプルを高速液体クロマトグラフィーを用い（ここで言
う高速液体クロマトグラフィーとは、常圧以上でクロマ
トを行う装置であって、ファルマシアＦＰＬＣを含む）
、東ソー製Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇ　Ｅ　Ｌ　、、Ｐｈｅｎｙ
ｌ−５ＰＷカラムを使って分画した。このカラムはやは
り充填剤の基材につけた疎水性基と試料の疎水性官能基
との相互作用のちがいにより試料を分離するクロマトグ
ラフならば他のものでも使用可能である。この段階を経
たサンプルはすでにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一バンドになっている。

次に、高速液体クロマトグラフィーで東ソー製Ｇ３００
０ＳＷカラムを使ってゲル濾過を行った。このカラムは
、ゲル濾過の特性を持つカラムであれば他のものでも使
用可能である。またこのステップは省略することも可能
である。しかし省略した場合、次のステップのために脱
塩をする必要がある。ここで得られたサンプルをさらに
２成分に分離するため、高速液体クロマトグラフィーで
、ファルマシア陽イオン交換カラムＭｏｎｏ　Ｓを使っ
て分画を行った。この時使用するカラムは陽イオンを分
離する陽イオン交換の性質を持つものならば他のもので
も使用可能である。

精製したサンプルをアミノ酸配列アナライザーにかけ、
以下に示す２つのＮ末端アミノ酸配列を決定した。

八ｓｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　
ＡｓｐＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒ
ｏ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＋及びＶａｌ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＡｌａＶａｔ　　Ｓｅｒ　　Ａｌ
ａ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ａｌ
ａ　　Ｌｅｕこのア藁ノ酸配列は今回初めて明らかにさ
れたものである。同一リパーゼであっても、上記アごノ
酸配列のうち、数個が別のアごノ酸に置換することは可
能である。

本発明のリパーゼをコードする遺伝子はＲｈ１ｚｏｐｕ
ｓ　　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ６０４５菌体から抽出して
もよくまた合成することもできる。抽出する場合には菌
体を１　〇− 磨砕等の手段により破壊してプロテアーゼ処理等を行っ
た後、ＤＮＡを抽出する。得られたＤＮＡを制限酵素で
切断し、λベクターに結合し、インビトロパッケージン
グしてライブラリーを作製する。一方、前記のアミノ酸
配列からＤＮＡ自動自動合成装置用いて対応するＤＮＡ
プローブを台底しておく。そこでこの台底プローブを用
いて前記ライブラリーからゲノムＤＮＡクローンを分離
する。

ＲＮＡの抽出は、ゲノムＤＮＡの抽出と同様であるか、
全ての段階においてＲＮａｓｅの混入を防ぐ、もしくは
ＲＮａｓｅの活性を阻害する工夫が必要である。抽出さ
れたＲＮＡの中が、オリゴｄＴセルロースカラムを用い
ることにより、ポリＡ　ＲＮＡ画分を精製し、これをも
とに、リハーストランスクリプクーゼによって、ｃＤＮ
Ａを台底する。得られたｃＤＮＡをλベクターに結合し
、インビトロパッケージングしてライブラリーを作製す
る。あとはゲノムＤＮＡの時と同様の方法でクローンを
分離する。

以上のようにして得られたゲノムＤＮＡ及びＣＤＮＡを
遺伝子構造解析の結果、コードされる蛋白質は２種類有
り、その片方は特開昭６４−８０２９０号公報に示ず跳
ｕ並ｕｓ　　ｎ１ｖｅｕｓ　　１ｉｐａｓｅと１つのア
ミノ酸を除き同一であった。

〔実施例］ 実施例１ （１）リパーゼ生産菌Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａ
ｒ　ＡＪ６０４５（本菌株はＦＥＲＭＰ−１０５５０と
して寄託されている）の培養。

リパーゼ生産菌ハｎ皿用」１竺肛ＡＪ６０４５　ヲ２０
０Ｉ！、スケールで培養した。培地ポリペプトン５％、
ＮａＮＯ３０，１％、ＫｔｌｚＰＯａ　０．１％、Ｍｇ
５Ｏａ　０．０５％、Ｇｌｕｃｏｓｅ　２％、ｐｌ＋約
６゜温度２７°Ｃ０（２）リパーゼの精製 活性測定法は専ら簡便法（大日本製薬製すパーゼキッ）
Ｓ）によったが、最終精製標品についてばオリーブ油を
用いた活性測定法（Ｆｋｕｍｏｔｏ、Ｊｕｉｃｈｉｒｏ
；ｒｗａｉ、旧ｅｋｏ；Ｔｓｕｊｉｓａｋａ、Ｙｏｓｈ
ｉｏ：Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
１０，２５７（１９６４））で活性のあることを確認し
た。以下に示すＵ（ユニット）とは、リバーゼギッ＋−
Ｓで測定した時の、サンプルとブランクの吸光度の差を
、１分当りの量に換算したものである。またＢはバッフ
ァーを意味する。

■得られた培養ブロス１８０　ｊ２を２４φ振切にかけ
、８ｋｇの菌体を分離した。上澄液に濃塩酸を加えｐＨ
４，６に調整したところ、わずかに沈澱を生じた。

生じた沈澱をシャープレスによって除き、上澄液１６０
１を得た。これに硫安８０ｋｇ（７０％飽和）を加え４
°Ｃ１１６ｈｒ放置したところ、塩析物が液表面に浮い
た。この沈澱物をすくい取り、７８０ｇの硫安沈澱物を
得た。

この沈澱物を５０ｇ取り、それを最小液量の０．０２Ｍ
酢酸Ｂ　（ｐ＋＋５．２）に溶解、不溶物を遠心により
除去した後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５Ｍｅｄｉｕｍ
で脱塩した。脱塩したサンプルを凍結乾燥し、４．７２
ｇのリパーゼパウダーを得た。このリパーゼパウダーは
、１６００ｕ／ｇパウダーであり活性回収率８５％、こ
れを０．０２Ｍ酢酸Ｂ　（ｐＨ５，６）に溶かした時の
比活性は６５ｕ／■であった。

■■で得たリパーゼパウダー２．３６ｇを２３．６ｄの
３ ０．０２Ｍ山酸Ｂ　（ｐＨ５，２）に溶解し、それにぺ
Ｍ硫安１４．７５　ｍ９．を加え硫安濃度を１．５Ｍに
調整した。これを内径２．３ｃｍ、長さ５０ｃｍ、ヘッ
ド体積２１０蔵のファルマシアＰｈｅｎｙｌ　ＣＬ　４
　Ｂにチャージし、１．５Ｍ硫安、０．０２Ｍ酢酸Ｂ　
（ｐｌ＋５．２）で洗浄後、０．０２Ｍ酢酸Ｂ　（ｐＨ
５，６）で吸着画分を溶出した。活性は全て０．０２Ｍ
酢酸Ｂ　（ｐＨ５，６）溶出画分にあり、活性画分を回
収後フォローファイバーで濃縮し液量１３０成にした。

この時比活性７７ｕ／■、全活性２０００　ｕ、活性回
収率５３％であった。次にこのうち７１ｍｆｔを、ＨＰ
　Ｌ　Ｃ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍ６００マルチソルベントシ
ステム〉、カラムＴ　Ｓ　Ｋｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ　−
５Ｐ　Ｗ７．５　ｍｍ　Ｉ　ＤＸ７．５ｃ＋ｎを用い、
条件Ｏ分→３０分、１．５Ｍ硫安、０．０２Ｍ酢酸Ｂ　
（ｐＨ５，２）アイソクラチック、流速１ｍＲ／ｍ１ｎ
０３０分→９０分、１．５００Ｍ硫安、０．０２Ｍ酢酸
Ｂ１グラデイエンド、流速１ｍＲ／ｍｉｎで分画した。

（チャージは２０ｍ１＋１１ｍｆｌ＋１１ｍＲ−１−１
７ｍＱＢ　　４回に分け、それぞれ４Ｍ硫安を加えて行
った。）活性フラクションは互いに混合せず、液体チッ
素で瞬間凍結後−７０°Ｃで保存した。このサンプルの
比活性４ は２４０〜３００ｕ／■で、全活性は５００　ｕ　、活
性回収率４４％であった。この段階のサンプルをＳＤＳ
　ＰＡＧＥにかけたものが第１図である。図中、ａは分
子量マーカーであり、上から９７４００．６６２００．
４２６９９．３１０００．２１５００．１４４００　（
７）分子量で示しテいる。

ｂはサンプルである。この時すでにクマジ染色で単一バ
ンドになっている。

■■で得られた各活性フラクションを相互に混合せずに
、全活性として６００ｕ分を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ
　Ｍ６００マルチソルベントシステム）、カラム、Ｔ　
Ｓ　Ｋｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ　７．５ｍｍ　Ｉ　Ｄ　
Ｘ６０ｃｍに０．５ｍｆｌ〜０．１ｍＲづつチャージし
てゲル濾過を行った。（条件、平衡Ｂ　０．２ＭＮａＣ
ｌ、　０．０２Ｍ酢酸Ｂ１流速１　ｍｌ／ｍｉｎ、　）
これによって得られたサンプルは、比活性１４２　ｕ　
／■、活性回収率は８０％であった。またゲル濾過によ
る分子量は、同条件でスタンダードサンプルを流した結
果から、９８０００と計算された。

■■で得られたサンプルのうち、全活性３３０　ｕ分を
ファルマシアＦＰＬＣ，カラムＭｏｎｏ　Ｓ　ｌｌＲ５
１５（陽イオン交換）にかけた。ゲル濾過したサンプル
は０．２ＭのＮａＣ１を含むため、■部はＦＰＬＣ、フ
ァーストデイツルティングカラムをＩＩＲＩＯ／１０を
用い脱塩し、また１部はサンプルを３倍に希釈すること
によってＭｏｎｏ　Ｓに通ずサンプルを調整した。なお
ファーストデイツルティングカラムを通した時の活性回
収率は７５％であった。またその条件は、流速２　ｍｌ
／ｍｉｎ、平衡Ｂ、０．０２Ｍ酢酸Ｂ０（Ｍｏｎｏ　Ｓ
の条件は、０．０２Ｍ酢酸Ｂ→Ｉ　ＭＮａＣ］　、　０
．０２Ｍ酢酸Ｂ　（ｐＨ５，２）６０分グラデイエンド
、流速１　ｍＲ／ｍｉｎ　０）Ｍｏｎｏ　Ｓによって蛋
白のピークが２つに分かれたが、その両方にリパーゼ活
性が一致した。これをＡリパーゼとＣリパーゼと言う。

このサンプルの比活性はＡリパーゼが２８０　ｕ／ｍｇ
、　Ｃリパーゼが１００ｕ／ｍｇで活性回収率は５０％
であった。

Ａ、Ｃリパーゼは、電気泳動より分子量３３０００と予
測される。ここまでの精製のまとめを表１に示す。

表１ リパーゼ精製のまとめ（各ステップとも最終標品を得る
ための量に換算されている。〉（３）Ｎ末端アミノ酸配
列の決定 ■（２）で精製したＡ、Ｃリパーゼをシーフェンス分析
の結果、この蛋白は、２種のサブユニットからなってお
り、その構成量比は１：１であった。表２に配列を示す
。また、この配列はＡ、Ｃ両すパーゼで同一であった。

表２　　ＭｏｎｏＳサンプルのＮ末端アミノ酸配列１　
２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１１２　１
３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１
７ ■Ｍｏｎｏ　Ｓで精製したサンプルは２種のサブユニッ
トを含んでいるため、等重点電気泳動を用いて分離を行
った。Ａ＋Ｃリパーゼ画分（Ａ＋Ｃリパーゼ画分とはＰ
ｈｅｎｙｌ　ＳＰＷ後のサンプルを言う）を内径６胴、
長さ１３ｃｍのガラス管カラムで等電点電気泳動しクマ
ジ染色の後、単一ハンドであるｐＨ９，３０のハンドを
切り出した。プロッティングにより、この蛋白をミリポ
アイモピロントランスファーメンブレン（材質Ｐｏ１ｙ
ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｃａｔ
。

Ｎｏ、　ＩＰＶＨ３０４ＦＯ）に移し、メンブレンごと
アごノ酸シークエンサーにかけＮ末端アごノ酸配列を決
定した。結果を表３に示す。

表３　　Ｔ　Ｅ　Ｆ　ｐＨ９，３０バンドのＮ末端アミ
ノ酸配列１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　
１１八ｓｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ
　　Ａｓｎ１２　１３　１４　１５　１６　１７　１８
　１９　２０　２１Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ａ
ｓｐ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｌｅｕこの結果は表２の片方の配列に一致して
いる。

表３の配列と（表２）−（表３）の配列とから以下に示
すα、βＮＮ末端アミノ配列を決定した（表４）。

表４　α、βサブユニットのＮ末端アミノ酸配列１　２
　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１１２　１３
　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１実
施例２ （１）ゲノムＤＮＡの調整 Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ　ＡＪ６０４５菌体
１６ｇを液体窒素存在下、乳鉢と乳棒により破砕し、１
５０ｍの０．５ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−１１ｃｌｚ＜　ラフｙ　−（ｐｌ＋８．０
）を加えよく懸濁させた。数秒間ポリトロンをかけた後
１５０ｍｊ！の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）２００μｇ／ｒｄＰｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ、　１％５ａｒｃｏｓｙ＋を加え
、５０°Ｃで３時間放置した。バッファー飽和フェノー
ルを等量加え、撹拌し、遠心機にかけた後、水相を取る
操作（以後フェノール処理という）を３回繰り返した。

水相を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｌ＋８．０）、１０ｍＭ
　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣｌ　に対して透析し、得
られたサンプルにＲＮａｓｅを１００　μｇ／ｍｆｌ加
え３７°Ｃ１３時間反応させた。

フェノール処理の後、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０
）、１ｍＭＴｉＤＴＡ溶液に対して透析し、１０分の１
体積の２．５ＭＳｏｄｉｕｍ　Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５
，２）を加え、２倍量のエタノールを加えて、−２０°
Ｃで１夜放置した。遠心して沈澱を集め（以後この操作
をエタノール沈澱という）その沈澱をＣｓＣ１−Ｅｔｄ
Ｂｒ平衡密度勾配超遠心し、ＤＮＡのバンドを回収し、
それを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８゜０）、１　ｍＭＥ
ＤＴＡに対し透析しゲノムＤＮＡを得た。

（２）ゲノムライブラリーの作製 ゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（２３０μｇ／ｍ℃）２３０μｉ！
、１ｏ×Ａバツフアー（ベーリンガーマンハイム社製５
−バッファーシステム）４６μｊ、　ＩＩｚＯ２３０μ
ｆｆ、　５ａｕ３＾Ｉ（宝社製制限酵素）１．６μｅを
加え３７°Ｃ１６５秒反応した後、フェノール処理をし
、溶液中のフェノールをエーテルによって除いた。エタ
ノール沈澱の後、１　ｍｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８，０）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡを加え、その内の６μｅ
に、λファージＥＭＢＬ３　（プロメガ社より購入〉　
２μｅ（ｌμｇ）、１　ｐ（ｌの０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ（
ｐｌ＋７．４）、０．１ＭＤＴＴ。

１０ｍＭ　ＡＴＰ、０．１　ＭＭｇＣＩｚ　、及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝社より購入）を加え、１１°Ｃ１１
夜放置した。

この反応液を、インビトロパッケージングキット（アマ
ジャム社より購入）の指示に従ってパンケージソゲし、
ライブラリーを作製した。

（３）合成りＮＡプローブの作製 決定されたＮ末端アミノ酸配列をもとに第２図に示すよ
うにＤＮＡを設計し、アプライドバイオシステムズ社製
３ＢＯＡ　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザーを用いてフォスフ
ォアミグイド法でプローブを作製した。

但し、βサブユニツトプローブに関しては、初期のＮ末
端アミノ酸配列データをもとに作製した。

後の正確なアごノ酸シークエンサーでの分析結果よりβ
Ｎ末端配列は、ＶＳＧＫＳＧＳＳＮＴＡＶＳＡＳＤＮＡ
Ａと決定された。

（４）プローブのアイソトープラベル 合成ＤＮＡプローブ５０ｐｍｏｌｅに３４の０．５ＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７，６）、０．１ＭＭｇＣｈ　、０．０５
ＭＤＴＴ　、０．００１Ｍ　ＩＥＤＴ八、１μｍ！Ｔ４
ポリヌクレオチドカイネース（宝社より購入）１０μｅ
〔γ−”　Ｐ　）　ＡＴＰ（アマジャム社１ より購入）を混合し、１１□０で液量を３０μｅにした
。

３７°Ｃ１６０分反応させた後、フェノール処理を行い
、セファデックスＧ−５０によるゲル濾過を行ってアイ
ソトープラベルしたプローブを得た。

（５）スクリーニング インビトロパッケージングキット（アマジャム社製）に
示された方法に従ってファージをブレーティングし、プ
レートを４°Ｃに冷やした後、表面にニトロセルロース
フィルターを密着させてファージをフィルター上に移し
た。フィルターを１．５ＭＮａＣ１，０，５ＭＮａＯＨ
溶液に浸し、付着したＤＮＡを変性させ、１．５ＭＮａ
Ｃｌ、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）溶液で中和し
た。さらに０．３６ＭＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｎａ１ｌｚ
ＰＯ４（ｐｉ（７，４）　、　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ７，４）でリンスした後乾燥させた。このフィルタ
ーを以下に示す溶液に浸し５０°Ｃ１１夜ハイブリダイ
ゼーシヨンを行った。〔溶液：５ｍＲのＣａｒｒｉｅｒ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓａｌｍｏｎ　５　ｒｎｇ／　ｍＲ）
、２５ｍ１．の１　ｍＭ　ＥＤＴＡを加え１００°Ｃ５
分処理し角、冷した。

５０ｍＮの１０　Ｘ　ＳＳＣ（１０Ｘ　ＳＳＣとばＮａ
Ｃｌ３７．５ｇ　、　Ｎａ”ｃｉｔｒａｔｅ　４４ｇ　
、　１ｌｚｏを加え１１とする）０．２％ＳＤ２ Ｓ　、　２０ｍＭ　ＥＤＴＡを加え、２０ｍｆｌの１％
ＢＳＡ　、１％ｐｖｐ（ｐｖｐ−３６０）　１％Ｆｉｃ
ｏｌ１４００を加えたものにアイソトープラベルしたプ
ローブを加えたもの。〕ハイブリダイズ終了後２．５Ｘ
ＳＳＣで洗浄し、乾燥させオートラジオグラフをとった
。オートラジオグラフィーの結果、約６０株のポジティ
ブクローンを得た。

（６）塩基配列決定 ポジティブクローンよりプレートライゼット法によって
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））ファージＤＮ
Ａを調整し、挿入されたＤＮＡをｐ［Ｊｃ１８（宝社よ
り購入）に乗せ換えＰＬＤＡＩＩＩを作製した。（この
プラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株はＦ
ＥＲＭ　Ｐ−１１２１２として寄託されている。）ＰＬ
ＤＡＩＩＩ中のプローブと親和性のある部分について塩
基配列を決定した。塩基配列決定はＤＩＥＡＺ八シーク
へンスニ１−ツＬ　（ｆｆ１社製）　ヲ用い、その指示
に従った。決定した塩基配列を第３図に示す。第３図の
中で各サブユニットのコーディングｗ４域と推測される
部分をアミノ酸に翻訳しである。また２０３〜２０８の
ＣＣＴ八八へへ２６１〜２６５のＴＡＴＡ八配列へ真核
生物のプロモーター配列であり、１６０１〜１６０６の
ＡＡＴＡＡＡはポリアゾニレ−ジョンシグナルである。

また４５６〜５１２がβＮ末端プローブに相当する部位
であり、６５８〜７１４がαＮ末端プローブに相当する
部位である。また１１５３〜１１９４に他のリパーゼと
相同性のあるアミノ酸配列をコードする部分がある。

実施例３ （１）ｍＲＮＡの３周整 凍結した菌体を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて破砕し
、Ｉｇの菌体に対し５■のＤＴＴを添加、さらにＩｇの
菌体に対し２．６ｍｌの０．２ＭＮａＢｏｒａｔｅ（ｐ
ｌ＋９．０）、　１　％ＳＤＳ　　、　　３０ｍＭ　　
ＩＥＧＴＡ　　、　１０ｍＭ　　Ｖａｎａｄｙｌ−ｒｉ
ｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（これをＸＴＢと言う、９０
〜９５°Ｃ）を加え、ポリトロンをかけた。Ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅｋを０．５■／　ｒＭになるように加え、４
０°Ｃで２時間放置した。

１　ｍｆｌのＸＴＢに対し８０ｐｅの２ＭＫＣｌを加え
、氷上１時間放置した。　１２００Ｏｒｐｍで２０分、
４°Ｃで遠心し、沈澱を２ＭＬｉＣｌで２回洗浄した。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）に約２　ｍｇ　／　
ｍｌとなるように溶解し、酢酸カリウム（２００ｍＭ）
を加えた後エタノール沈澱した。沈澱を２成の１１□Ｏ
に溶かし、６５℃、１分加熱した。２　ｒｔｒＲの１．
５Ｍ　ＮａＣｌ　、２　ｍｆｌの２０ｍ１’ｌ　Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ７，６）を加え、セルロースカラムを通し、非
吸着画分をオリゴｄＴセルローースカラムに吸着させた
。この時カラムの平衡化には０．４ＭＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）（これを旧ｎｄｉｎｇ　Ｂ
と言う）を用いた。３０ｍｆｌのＢｉｎｄｉｎＢで洗浄
して、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）でＰｏ１ｙＡ
　ＲＮ　Ａを溶出した。０．５Ｍとなるように５　ＭＮ
ａＣＩを加え、再度０１ｉｇｏ　ｄＴセルロースカラム
に吸着させ、２０ｍＲのＢｉｎｄｉｎｇ　Ｂで洗浄し、
さらにｌＯｍＲの０．４ＭＮａＣｌ。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）で洗った。１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）で溶出し、Ｐｏ１ｙＡ　ＲＮ
　Ａを得た。

（２）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの作製アマジャム
社製のｃＤＮＡ合威システムプラスを用いｃＤＮＡ合威
を台底た。方法はキットの指示に従った。作製されたｃ
ＤＮＡを材料にしてアマジャム社製ｃＤＮＡクローニン
グシステムλｇｔ１０ｖｅｒ、　　２．０を用いてライ
ブラリーの作製を行っ５ た。方法はキットの指示に従った。

（３）スクリーニング、塩基配列決定 作製されたｃＤＮＡライブラリーをもとに実施例２の（
３）　（４）　（５）の方法に従ってｃ　ＤＮＡりロー
ンを多数得た。（６）の方法に従い塩基配列の決定を行
った。ｃＤＮＡインサートを含むＰＯＣｌ２をｐｌ、ｃ
ＤＮＡ６−１−２と言い、このプラスミドを含むＥ、ｃ
ｏｌｉ　ＪＭ１０９はＦＩｌ＋ＲＭ　Ｐ−１１２１３と
して寄託されている。決定した塩基配列を第４図に示す
。第４図でα、β各すブユニットコーディング領域と考
えられる部分をアミノ酸に翻訳しである。１１８〜１７
４部位がβのＮ末端プローブに相当し、３２０〜３７６
部位がαのＮ末端プローブに相当する。なお、ゲノム遺
伝子配列とは１塩基（４５８−Ｇ）を除いて同一であっ
た。

（ゲノムでは４５８−Ａ）。

これによりゲノムではα配列中４７Ｌｙｓとなっている
がｃＤＮＡでは４７ＧＩｕとなっている。なお、β配列
中アミノ酸配列にして１〜２８はβのシグナル配列と考
えられ、α配列中、アミノ酸配列にして１〜２０がαの
シグナル配列、２１〜５１がプロ配列６ であると考えられる。

〔発明の効果〕

本発明により遺伝子工学的手段でリパーゼを容易に高純
度で大量生産することができる。また、蛋白質工学的手
法を用いることにより、より高活性な、あるいは、より
安定性の高い新規リパーゼを作ることも可能になる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を表
す図である。 第２図は合成ＤＮＡプローブ設計を表す図である。ＤＮ
Ａ配列はアンチセンス配列になっている。 第３図はゲノム遺伝子配列である。２つのサブユニット
のコーディング領域を推測してアごノ酸に翻訳しである
。 下線部分のアミノ酸配列はタンパク質側より構造決定し
たＮ末端アミノ酸配列を示す。なお、１〜３００の間に
は１部決定されていない配列を含む。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ末端アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 からなるリパーゼ活性を有する蛋白質
2. （２）Ｎ末端アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 からなるリパーゼ活性を有する蛋白質
3. （３）Ｎ末端アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 及び 【遺伝子配列があります。】 からなるリパーゼ活性を有する蛋白質
4. （４）糸状菌が生産する請求項（１）（２）又は（３）
   に記載の蛋白質
5. （５）リパーゼをコードする遺伝子
6. （６）シグナル配列、及びプロ構造を含む請求項（５）
   に記載の遺伝子
7. （７）以下に示すＣＣＴＡＡＴ、及びＴＡＴＡＡ配列に
   示されるプロモーター領域を含む請求項（５）に記載の
   遺伝子【遺伝子配列があります。】
8. （８）アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 からなるポリペプチドをコードする遺伝子
9. （９）アミノ酸配列が 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 からなるポリペプチドをコードする遺伝子
10. （１０）糸状菌由来の請求項（５）（６）（７）（８）
    又は（９）に記載の遺伝子