JPH0394679A - 固定化菌体及びその製造方法 - Google Patents
固定化菌体及びその製造方法Info
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- JPH0394679A JPH0394679A JP23145389A JP23145389A JPH0394679A JP H0394679 A JPH0394679 A JP H0394679A JP 23145389 A JP23145389 A JP 23145389A JP 23145389 A JP23145389 A JP 23145389A JP H0394679 A JPH0394679 A JP H0394679A
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- JP
- Japan
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- cell
- microorganismic
- bacterial cells
- water
- immobilized
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、水一有機溶媒からなる二液相系で水難溶性基
質に微生物を作用させて反応生成物を採取する際の微生
物を担体に固定化した固定化菌体及びその製造方法に関
する。
質に微生物を作用させて反応生成物を採取する際の微生
物を担体に固定化した固定化菌体及びその製造方法に関
する。
炭化水素等の水難溶性基質に微生物を作用させ、反応生
成物を採取する方法が種々行われている。この種の反応
は、反応効率を高めるために、往々にして、前記基質と
異なる有機溶剤を添加した、いわゆる水一有機溶媒から
なる二液相系からなる溶媒中で行われることがある（特
公昭６３−１３６７８号、同６３−１４９５１号公報参
照）。
成物を採取する方法が種々行われている。この種の反応
は、反応効率を高めるために、往々にして、前記基質と
異なる有機溶剤を添加した、いわゆる水一有機溶媒から
なる二液相系からなる溶媒中で行われることがある（特
公昭６３−１３６７８号、同６３−１４９５１号公報参
照）。
一方、最近生戊物と菌体との分離を容易にするために、
微生物を固定化した、いわゆる固定化菌体が種々提案さ
れている。この固定化法として、菌体を包み込むような
状態で高分子ゲルに固定化する包括法がある。この方法
は、菌体の漏出が少なく、菌体と担体との化学結合がな
いので菌体の活性低下が少ない等の利点があるため、広
く採用されている。この包括固定化法で使用される担体
としては、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キトサン
、ゼラチン、アルブミン等の天然高分子、アクリルアミ
ド、光架橋性樹脂、ポリウレタン、ポリビニルアルコー
ル、エポキシ樹脂、シリコーンゴム等の合成高分子が知
られている。
微生物を固定化した、いわゆる固定化菌体が種々提案さ
れている。この固定化法として、菌体を包み込むような
状態で高分子ゲルに固定化する包括法がある。この方法
は、菌体の漏出が少なく、菌体と担体との化学結合がな
いので菌体の活性低下が少ない等の利点があるため、広
く採用されている。この包括固定化法で使用される担体
としては、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キトサン
、ゼラチン、アルブミン等の天然高分子、アクリルアミ
ド、光架橋性樹脂、ポリウレタン、ポリビニルアルコー
ル、エポキシ樹脂、シリコーンゴム等の合成高分子が知
られている。
しかしながら、かかる担体を用いる方法は、水一有機溶
媒の二液相系で水難溶性基質を反応させる場合、担体の
素材が親水性の場合は、基質の透過性が悪く、また疎水
性の場合は、無機栄養成分の透過性が悪く、反応活性を
十分に高く保つことができず、反応収率が悪いという問
題があった。
媒の二液相系で水難溶性基質を反応させる場合、担体の
素材が親水性の場合は、基質の透過性が悪く、また疎水
性の場合は、無機栄養成分の透過性が悪く、反応活性を
十分に高く保つことができず、反応収率が悪いという問
題があった。
本発明者は、上記問題を解決すべく、鋭意研究を進めた
結果、疎水性のポリマーであるシリコーンボリマーと親
水性のゲルであるアルキン酸ゲルの複合マトリックス中
に菌体を包括することにより、反応活性を高くできるこ
とがわかった。本発明は、かかる知見に基づいてなされ
たもので、本発明の目的は水一有機溶媒の二液相系で水
難溶性基質を反応させる場合でも、反応活性を十分に高
く保ち、反応効率を極めて高くできる固定化菌体及びそ
の製造方法を提供することにある。
結果、疎水性のポリマーであるシリコーンボリマーと親
水性のゲルであるアルキン酸ゲルの複合マトリックス中
に菌体を包括することにより、反応活性を高くできるこ
とがわかった。本発明は、かかる知見に基づいてなされ
たもので、本発明の目的は水一有機溶媒の二液相系で水
難溶性基質を反応させる場合でも、反応活性を十分に高
く保ち、反応効率を極めて高くできる固定化菌体及びそ
の製造方法を提供することにある。
本発明の固定化菌体は、シリコーンボリマーとアルギン
酸ゲルとの複合マトリックス中に菌体を分散保持させた
ことからなるもので、特に好ましくは、前記アルギン酸
ゲルに反応培地を含ませてなるものである。また、本発
明の固定化菌体の製造方法としては、菌体を、シリコー
ンブレボリマーとアルギン酸イオンとを含有する溶液に
加えた後、アルギン酸ゲル化剤と接触させるとともに、
当該シリコーンプレポリマーを重合させることからなる
ものである。
酸ゲルとの複合マトリックス中に菌体を分散保持させた
ことからなるもので、特に好ましくは、前記アルギン酸
ゲルに反応培地を含ませてなるものである。また、本発
明の固定化菌体の製造方法としては、菌体を、シリコー
ンブレボリマーとアルギン酸イオンとを含有する溶液に
加えた後、アルギン酸ゲル化剤と接触させるとともに、
当該シリコーンプレポリマーを重合させることからなる
ものである。
本発明は、例えば、ノルマルパラフィンやオレフィン等
の炭化水素を、キャンデイダ属、ノカルディア属、ロド
コッカス属、コリネバクテリウム属、アルスロバクター
属、マイコバクテリウム属、シュードモナス属等の微生
物を用い、パラフィン、オレフイン、ハロゲン化パラフ
ィン、アルキルベンゼン等の水不溶性の有機溶媒と水と
の混合溶媒中で、酸化してカルボン酸やエボキサイドを
生成させる、水一有機溶媒の二液相系での水難溶性基質
の菌体による反応に適用される。また、ノカルディア属
、アスペルギルス属等の微生物菌体による各種のステロ
イド類の変換反応等にも適用できる。
の炭化水素を、キャンデイダ属、ノカルディア属、ロド
コッカス属、コリネバクテリウム属、アルスロバクター
属、マイコバクテリウム属、シュードモナス属等の微生
物を用い、パラフィン、オレフイン、ハロゲン化パラフ
ィン、アルキルベンゼン等の水不溶性の有機溶媒と水と
の混合溶媒中で、酸化してカルボン酸やエボキサイドを
生成させる、水一有機溶媒の二液相系での水難溶性基質
の菌体による反応に適用される。また、ノカルディア属
、アスペルギルス属等の微生物菌体による各種のステロ
イド類の変換反応等にも適用できる。
シリコーンポリマーは、ジメチルシロキサンを構成単位
とするものであるが、本発明の適用に当たっては、特に
、制限はないが、スベイヤ−（Ｓｐｅｉｅｒ）触媒によ
るジメチルシロキサンプレポリマーのヒドロシリル化反
応による重合硬化を利用するものが、室温の比較的温和
な条件で、副反応なく進行するため、特に、好適である
。
とするものであるが、本発明の適用に当たっては、特に
、制限はないが、スベイヤ−（Ｓｐｅｉｅｒ）触媒によ
るジメチルシロキサンプレポリマーのヒドロシリル化反
応による重合硬化を利用するものが、室温の比較的温和
な条件で、副反応なく進行するため、特に、好適である
。
このボリマーは、市販品を用いると簡便で良い。
一方、アルギン酸は、アルギン酸のナトリウム、カリウ
ム、アンモニウム塩を用いることができる。これは、塩
化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸アルミニウム、塩
化アルミニウム、塩化バリウム、塩化ストロンチウム等
の水溶液からなるゲル化剤と接触させることによりゲル
化する。
ム、アンモニウム塩を用いることができる。これは、塩
化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸アルミニウム、塩
化アルミニウム、塩化バリウム、塩化ストロンチウム等
の水溶液からなるゲル化剤と接触させることによりゲル
化する。
尚、このアルギン酸ゲルには、反応培地を含ませること
が好ましい。この場合、アルギン酸ソーダを反応培地水
溶液に添加して、用いると良い。尚、この反応培地の量
は、当該固定化菌体中に１〜２０重量％とすることが好
ましい。
が好ましい。この場合、アルギン酸ソーダを反応培地水
溶液に添加して、用いると良い。尚、この反応培地の量
は、当該固定化菌体中に１〜２０重量％とすることが好
ましい。
このシリコーンポリマーとアルギン酸ゲルのマトリック
スは、シリコーン１００％からアルギン酸１００％まで
の全範囲で、任意の割合のマトリックスが得られるが、
シリコーンとアルギン酸との比を３＝７〜７：３の範囲
とすることが好ましい。アルギン酸の割合を３以下とす
ると、固定化菌体の親水性が乏しくなり、また、アルギ
ン酸が７以上となると、逆に疎水性に乏しくなるため、
あまり好ましくない。
スは、シリコーン１００％からアルギン酸１００％まで
の全範囲で、任意の割合のマトリックスが得られるが、
シリコーンとアルギン酸との比を３＝７〜７：３の範囲
とすることが好ましい。アルギン酸の割合を３以下とす
ると、固定化菌体の親水性が乏しくなり、また、アルギ
ン酸が７以上となると、逆に疎水性に乏しくなるため、
あまり好ましくない。
このようなマトリックス中に固定化する菌体は、ｌ〜２
０重量％とすることが好ましい６１重量％以下であれば
、反応効率が悪く、また、２０重量％以上とすると基質
および生威物の拡散律速もしくは生成物阻害等の弊害が
でるため好ましくない。
０重量％とすることが好ましい６１重量％以下であれば
、反応効率が悪く、また、２０重量％以上とすると基質
および生威物の拡散律速もしくは生成物阻害等の弊害が
でるため好ましくない。
本発明の固定化菌体は、遠心分離などにより濃縮した菌
体のペーストを、シリコーンプレポリマーと０．５〜３
重量％濃度のアルギン酸塩を含む水溶液（当該水溶液と
して、反応培地水溶液を用いると好ましい）の混合物中
に加え、十分に撹拌することにより、菌体を良く分散さ
せ、この混合液を、ゲル化剤中に注射器等を用いて滴状
で押し出すことにより、アルギン酸をゲル化させるとと
もに、シリコーンプレポリマーを重合硬化させて、ビー
ズ状の標品として得ることができる。尚，この際、必要
に応じて、前記シリコーンプレポリマーの重合触媒を添
加して、当該ボリマーの硬化時間を短縮しても良い。さ
らに、このマトリックスは、シート状に成形しても良い
ことは云うまでもない。
体のペーストを、シリコーンプレポリマーと０．５〜３
重量％濃度のアルギン酸塩を含む水溶液（当該水溶液と
して、反応培地水溶液を用いると好ましい）の混合物中
に加え、十分に撹拌することにより、菌体を良く分散さ
せ、この混合液を、ゲル化剤中に注射器等を用いて滴状
で押し出すことにより、アルギン酸をゲル化させるとと
もに、シリコーンプレポリマーを重合硬化させて、ビー
ズ状の標品として得ることができる。尚，この際、必要
に応じて、前記シリコーンプレポリマーの重合触媒を添
加して、当該ボリマーの硬化時間を短縮しても良い。さ
らに、このマトリックスは、シート状に成形しても良い
ことは云うまでもない。
このようにして得られる固定化菌体は、バイオリアクタ
ー中に充填され、当該リアクターに基質と反応培地であ
る水一有機溶媒混合液もしくは、基質を含む有機溶媒単
一液及び空気が供給されて、反応が行われる。
ー中に充填され、当該リアクターに基質と反応培地であ
る水一有機溶媒混合液もしくは、基質を含む有機溶媒単
一液及び空気が供給されて、反応が行われる。
［実施例］
星生立斑星
保存培地上のノカルディアコラリーナＢ−２７６（微工
研菌寄第４０９４号）の菌体一白金耳を、グルコース１
％、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２を２．５
％含む寒天培地上に植菌し、２４時間培養した。
研菌寄第４０９４号）の菌体一白金耳を、グルコース１
％、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２を２．５
％含む寒天培地上に植菌し、２４時間培養した。
次いで、増殖した全菌体を１００ｍｌのＮＢＧ培地（水
道水ｌＱ当たり、グルコース１ ０ｇ， Ｎｕ乞ｒｉｅ
ｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２ ２ ５ｇ）に加え、温度
３０℃、１ ４ ０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎの振盪条件
下に、１７時間培養した。さらに、この培地から１０ｍ
ｌを抜き出し、新しいＮＢＧ培地１００ｍｌに加え、同
条件下４８時間振盪培養した。続いて、菌体を遠心分離
により集菌した後、リン酸緩衝液（ＰＨ８）及び反応培
地（精製水ＩＣ当り、Ｋ，ＨＰ０， １．７４ｇ；Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ，０ １．５ｇ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ，Ｏ
Ｏ．０ ５ｇ；ｐＨ８）で洗浄した。
道水ｌＱ当たり、グルコース１ ０ｇ， Ｎｕ乞ｒｉｅ
ｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２ ２ ５ｇ）に加え、温度
３０℃、１ ４ ０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎの振盪条件
下に、１７時間培養した。さらに、この培地から１０ｍ
ｌを抜き出し、新しいＮＢＧ培地１００ｍｌに加え、同
条件下４８時間振盪培養した。続いて、菌体を遠心分離
により集菌した後、リン酸緩衝液（ＰＨ８）及び反応培
地（精製水ＩＣ当り、Ｋ，ＨＰ０， １．７４ｇ；Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ，０ １．５ｇ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ，Ｏ
Ｏ．０ ５ｇ；ｐＨ８）で洗浄した。
舅』１亙幌』Ｌ匿
上記菌体懸濁液から遠心分離により水分を除去して菌体
ペーストを調製し、この１．７ｍｌ（菌体質量０ ．
３ ｇ−ＤＣＷ）を、市販のジメチルシロキサンの二液
性プレポリマー（トーレ・シリコーン（株）製，ＣＹ５
２−１１１，初期粘度１ ５ ０ ０ｃ，ｐ，ｓ）Ａ液
及びＢ液各４ｇ、計８ｇと、上記と同じ組或の反応培地
を含む２．５重量％濃度のアルギン酸ナトリウム水溶液
１０ｍｌとの混合液に加え、十分にかき混ぜた後、４０
℃に保温した０．１モル濃度の塩化カルシウムを含む反
応培地水溶液２ ０ ０ｍｌ中に注射器により滴状で押
出し、一晩撹拌下に放置することにより、シリコーンポ
リマー約５０％及びアルギン酸ゲル約５０％の複合マト
リクス中に包括された、粒径２〜５ｍｍのビーズ状の固
定化菌体約２０ｍｌを得た。
ペーストを調製し、この１．７ｍｌ（菌体質量０ ．
３ ｇ−ＤＣＷ）を、市販のジメチルシロキサンの二液
性プレポリマー（トーレ・シリコーン（株）製，ＣＹ５
２−１１１，初期粘度１ ５ ０ ０ｃ，ｐ，ｓ）Ａ液
及びＢ液各４ｇ、計８ｇと、上記と同じ組或の反応培地
を含む２．５重量％濃度のアルギン酸ナトリウム水溶液
１０ｍｌとの混合液に加え、十分にかき混ぜた後、４０
℃に保温した０．１モル濃度の塩化カルシウムを含む反
応培地水溶液２ ０ ０ｍｌ中に注射器により滴状で押
出し、一晩撹拌下に放置することにより、シリコーンポ
リマー約５０％及びアルギン酸ゲル約５０％の複合マト
リクス中に包括された、粒径２〜５ｍｍのビーズ状の固
定化菌体約２０ｍｌを得た。
さらに、同様の手順によって，シリコーンボリマー１０
０％からアルギン酸ゲルｌＯＯ％までの両者の混合割合
を種々変えたものについても、各々、上記と同量の菌体
を包括した固定化標品約２０ｍｌを得た。
０％からアルギン酸ゲルｌＯＯ％までの両者の混合割合
を種々変えたものについても、各々、上記と同量の菌体
を包括した固定化標品約２０ｍｌを得た。
反一息
上記方法で得られた固定化菌体を２０ｍｌ、１−オクテ
ン４ｍｌおよびｎ−ヘキサデカン４０ｍｌを、それぞれ
坂口フラスコに入れ、３０℃で、１４０ ｓｔｒｏｋｅ
ｓ／ｍｉｎの往復振盪培養機で培養し、所定時間ごとに
サンプリングを行い、１，２−エポキシオクタンの濃度
を、ガスクロマトグラフィーにより分析した。この結果
を、次表に示した。
ン４ｍｌおよびｎ−ヘキサデカン４０ｍｌを、それぞれ
坂口フラスコに入れ、３０℃で、１４０ ｓｔｒｏｋｅ
ｓ／ｍｉｎの往復振盪培養機で培養し、所定時間ごとに
サンプリングを行い、１，２−エポキシオクタンの濃度
を、ガスクロマトグラフィーにより分析した。この結果
を、次表に示した。
表
［発明の効果］
以上のように本発明は、シリコーンボリマーとアルギン
酸ゲルとの複合マトリックス中に菌体を分散保持させる
ので、水一有機溶媒の二液相系で水難溶性基質を反応さ
せる場合でも、反応活性を十分に高く保ち、反応効率を
極めて高くできるという格別の効果を有するものである
。
酸ゲルとの複合マトリックス中に菌体を分散保持させる
ので、水一有機溶媒の二液相系で水難溶性基質を反応さ
せる場合でも、反応活性を十分に高く保ち、反応効率を
極めて高くできるという格別の効果を有するものである
。
Claims (3)
- （１）水−有機溶媒の二液相系で水難溶性基質に作用さ
せる固定化菌体において、シリコーンポリマーとアルギ
ン酸ゲルとの複合マトリックス中に菌体を分散保持させ
たことを特徴とする固定化菌体 - （２）請求項（１）のアルギン酸ゲルに反応培地を含ま
せたことを特徴とする固定化菌体。 - （３）菌体を、シリコーンプレポリマーとアルギン酸イ
オンとを含有する溶液に加えた後、アルギン酸ゲル化剤
と接触させるとともに、当該シリコーンプレポリマーを
重合させることを特徴とする固定化菌体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23145389A JP2717449B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 固定化菌体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23145389A JP2717449B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 固定化菌体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0394679A true JPH0394679A (ja) | 1991-04-19 |
| JP2717449B2 JP2717449B2 (ja) | 1998-02-18 |
Family
ID=16923755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23145389A Expired - Lifetime JP2717449B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 固定化菌体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2717449B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011676A1 (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
-
1989
- 1989-09-08 JP JP23145389A patent/JP2717449B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011676A1 (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2717449B2 (ja) | 1998-02-18 |
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