JPH0395199A - グリオーマ由来増殖因子の精製及び特徴 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 これは１９８９年５月２４日付で出願された同時係属出
願第３５６．４７７号の一部継続出願である。

内皮細胞マイトジェンは血管生長（血管形成）及び管修
復のようなインビボ血管組織ｖ１復を促進し（障害内皮
細胞の置換による）、かつ移植用血管製造のため適切な
基質上において内皮細胞増殖を促進する上で有用である
。グリオーマ由来増殖因子　ｆＧＤＧＦ）処理により合
成ポリマー管をヒトを含めた宿主動物からの非トロンボ
ゲン性血管内皮細胞で覆い、これによって合成管移植片
に伴う多くの、あるいはすべての凝固問題を回避できる
。

ＧＤＧＦによる内皮細胞刺激は、ホストの血管内皮細胞
を管状支持体上に増殖させ、これをヒトを含めた同一ホ
スト動物に戻し移植をすることによるインビト口管産生
にとって有用であり、それによって移植片の免疫拒絶が
回避され、更に患者に移植するのに良好な血管がしばし
ば供給不足になることも回避できる。管状支持体は宿主
動物に移植されるに先立ち、インビトロでＧＤＧＦで被
屠される、あるいはＧＤＧＦで被覆され、内皮細胞を接
種された後移植される。移植後内皮細胞は人工表面上に
移動し及び／又はそこで増殖して、インビボで人工血管
を形成する。前記のようにＧＤＧＦはインビボにおける
血管増殖及び修復の刺激又は促進のためにも用いられ、
それによって十分な酸素及び／又は他の血液運搬成分が
不足した組織への血液流入量が増加する．　ＧＤＧＦは
血管内皮細胞の特異的刺激によって血管形成及び増殖を
高めつることから、そのタンパク質は組織修復を促進す
る上で有用である． したがって、新規グリオーマ由来増殖因子ＩＧＤＧＦ）
を提供することが本発明の目的である．ちう１つの目的
は、ＧＤＧＦを実質上純粋にまで精製する方法を提供す
ることである．他の目的は、血管増殖の誘導、血管修復
及び人工血管の製造用に内皮細胞を刺激するためＧＤＧ
Ｆを提供することである。

グリオーマ由来増殖因子は、噛乳動物グリオーマ細胞を
維持するために用いられた培地から精製される。本タン
パク質は哨乳動物内皮細胞の分裂誘発を促進し、血管形
成及び修復の促進にとって有用である。この独特な増殖
因子は組織修復の促進に関しても有用である。

本発明は内皮細胞の分裂誘発促進性を示す独特なグリオ
ーマ由来増殖因子　（ＧＤＧＦ）に関する。グリオーマ
は、脳、脊髄、下垂体後葉腺及び網膜を含めた中枢神経
系の間質組織を形成する様々なタイプの細胞のうち１つ
から派生する新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）として本明細
書では定義される。、従って、本発明の範囲はあらゆる
噛乳動物グリオーマ組織又は細胞系を含めた細胞から単
離かつ精製される独特な増殖因子も包含している。細胞
系としては格別限定されず、Ｃ６、ｈｓ６８３及びＧＳ
−９Ｌのようなグリオーマ由来細胞系．　Ａ−１７２及
びＴ９８Ｇのようなグリ才プラストーマ：　ＩＭＲ−３
２及びＳＫ−Ｎ−　ＭＣのようなニューロブラストーマ
：Ｈ４のようなニューログリオーマ；　ＸＢ−２のよう
なテトローマ．　Ｕ−８７ＭＧ及びＵ−３７３ＭＧのよ
うなアストロサイトーマ：胎児性がん腫及び非トランス
フォームグリア又はアストロサイト細胞系があるが、Ｇ
Ｓ−９Ｌが好ましい。

ＧＨ３及びＨｓｌ９９のような下垂体前葉腫瘍細胞系も
用いてよい。本発明のＧＤＧＦはラット細胞から単離さ
れたものとして記載されているが、同一の又は実質上同
様の増殖因子がヒト細胞を含めた他の哨乳動物細胞から
単離される。

グリオーマ由来増殖因子は、様々な微異質形として存在
し、これは様々な前記細胞の１種以上から単離される。

本発明では以後微異質形とは、ＤＮＡの単一遺伝子ユニ
ットから産生されｍＲＮＡレベルで又は翻訳後構造的に
修正されたべブチドであるところの単一遺伝子産物のこ
とを言うものとする。ペブチド及びタンパク質は本明細
書で相互変換的に用いられる。微異質形はすべて同等の
分裂誘発活性を有している。“生物活性”及び“生物学
的に活性”をは互換的に用いられ、下記のような血管内
皮細胞を含めた標的細胞においてＤＮＡ合成を促進して
結果的に細胞増殖させつるＧＤＧＦの能力として本明細
書では定義される。修飾はインビボ又は単離及び精製プ
ロツセスのいずれかで起きる。インビボ修飾は、格別限
定されないが、タンパク質分解、グリコシル化、ホスホ
リル化、アセチル化又はＮ末端における脱アミド化に起
因している．タンパク質分解としては、１以上の末端ア
ミノ酸が逐次酵素的に開裂されて原遺伝子産物よりもア
ミノ酸数が少ない微異質形を生じるエキソタンパク質分
解がある。またタンパク質分解としては、アミノ酸配列
の特定部位でベプチドを開裂するエンドブロテアーゼの
作用に起因したエンドタンパク質分解修飾もある．同様
の修飾は精製プロセスで起きることがあり、その場合に
も微異質形を生じる．精製中に起きる最ちありふれた修
飾はタンパク質分解であるが、これは通常プロテアーゼ
阻害剤の使用で最小に抑制される．ほとんどの条件下に
おいて、１種以上の微異質形が天然ＧＤＧＦの精製後に
存在している．天然ＧＤＧＦとはＧＤＧＦを産土する細
胞から単離かつ精製されたＧＤＧＦのことを言う． ラット細胞系ＧＳ−９１のようなグリオーマ細胞を、約
１７５０一の組織培養フラスコ中、約ｌＯ％新生子牛血
清（ＮＣＳ）添加ダルベツコ改良イーグル培地＋ＤＭＥ
Ｍｌ中でコンフルエントになるまで増殖させる・細胞が
コンフルエントに達したとき培地を除去し、細胞層を無
Ｃａ．　Ｍｇリン酸緩衝液（ＰＢＳＩで洗浄し、約０．
１％トリブシン及び約０．０４％ＥＤＴＡの溶液による
処理でフラスコから取出される。約１×１０”の細胞を
遠心によりペレットにし、約５％ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ約
１５００ｍｌニ再懸濁し、表面積６０００Ｃ一のｌＯレ
ベルセルファクトリー（ＮＵＮＣ）中に移す。細胞を約
５％ＣＯ２雰囲気下約３７℃で約４８〜約９６時間、好
ましくは７２時間インキユベートした後培地を除去し，
セルファクトリーをＰＢＳで３回洗浄する。新鮮培地は
、約２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ．約５ｕｇ／ｌｌｌインシュ
リン、約ｌＯμｇ／ｍｌ　トランスフエリンを含有しか
つ約１．０ｍｇ／＋ｗｌ牛血清アルブミンを含有した又
は含有しないハムーＦｌ２　ｆＨａｍ’ｓ−Ｆ１２１　
／　ＤＭＥＭの約１＝２混合物約１５００ｍｌである．
この培地は約２４時間後新鮮培地と交換され、その後は
４８時間毎に回収される．回収された馴養培地は細胞砕
片を除去するためワットマン＃ｌ濾紙で濾過され，−２
０℃で貯蔵される。

ＧＳＪＬ馴養培地は解凍し、Ｉ　Ｍ　ＨＣＩ　ｔ’ｐＨ
６．０に調整する。最初の精製ステップはＣＭセファデ
ックス（Ｃ）Ｊ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　．ファルマシア
・モノＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ　Ｓｌ、ゼタ
クロムＳＰ　（ＺｅｔａｃｈｒｏｍＳＰ）及びポリアス
パラギン酸ＷＣＸ　　［ネストクルーブｆＮｅｓｔ　Ｇ
ｒｏｕｐ）］のような、様々なマトリックスの様々な陽
イオン交換剤を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
からなるが、ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシ
ア）が好ましい。ＧＤＧＦ含有培地は馴養培地約２０β
につき約１ｇのＣ＋ＪセファデックスＣ−５０と混合し
，約２４時間にわたり４℃で低速にて撹拌する．樹脂を
沈降させ、過剰の液体を除去する。樹脂スラリーをカラ
ムに充填し、残りの培地を除去する。未結合タンパク質
は０．１５Ｍ　ＮａＣ１含有ｐｌｉ６．０の０．０５Ｍ
リン酸ナトリウムでカラムから洗い出される．　ＧＤＧ
Ｆは約０．６１Ｊ　ＮａＣ１含有ｐＨ６．　０の約０．
０５リン酸ナトリウムで溶出される。

ＣＭセファデックスＣ−５０カラムから回収された活性
分画は、ＧＤＧＦをさらに精製するためレクチンアフィ
ニティクロマトグラフィーによって更に分画される。Ｇ
ＤＧＦと結合するレクチンとしては格別限定されず，コ
ンカナバリンＡ及びレンズマメアグルチニンのようなマ
ンノース残基と特異的に結合するレクチン、小麦胚芽ア
グルチニンのようなＮ−アセチルグルコサミンと結合す
るレクチン、ガラクトース又はガラクトサミンと結合す
るレクチン並びにシアル酸と結合するレクチンがあるが
、コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）が好ましい．約５
ｍｌ充填容量のＣａｎ　Ａアガロース〔ベクターラボラ
トリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
　］を含有する１．５ｃｍ径カラムを約１　ｒｓｕ　Ｃ
ａＣｌｚ、約１　ｍｕ　ＭｎＣ１ａ及び約０．６Ｍ　Ｎ
ａＣ１含有約ｐＨ６．０の約０．０５Ｍ酢酸ナトリウム
で洗浄かつ平衡化する．未結合タンパク質は平衡化緩衝
液でカラムから洗い出される。ＧＤＧＦは約０．５Ｍα
−メチルマンノシド含有平衡化緩衝液で溶出される。

Ｃｏｎ　Ａカラムから回収されたＧＤＧＦ活性分画は約
ｐＨ６．０の約０．　０５＃Ａリン酸ナトリウムで約ｌ
：２に希釈する。サンプルは同一リン酸緩衝液で平衡化
されたポリアスパラギン酸ＷＣｘ陽イオン交換高性能液
体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣＩカラムに約０．５ｍ
ｌ／ｗｉｎの速度で供給される。カラムは同一緩衝液中
約０．７５１Ｊ　ＮａＣｌの約０〜１００％直線勾配で
溶出させる。流速は約０．　７５ｍｌ／ｍｉｎに保たれ
、６０秒間毎に分画回収する。グリオーマ由来増殖因子
は約２５〜３０分間後に溶出する分画中に存在している
。

ポリスアスパラギン酸ＷＣＸカラムから溶出されたＧＤ
ＧＦ活性含有分画は予め溶媒Ａ０．１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡＩ　で平衡化された４．５　Ｘ５０ｍｍバイ
ダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにかけ
られる。カラムは０〜１００％Ｂ［Ｂ＝３３％Ａ＋６７
％アセトニトリル（ｖ／ｖｌ　］の直線勾配で６０分間
にわたり溶出される．流速は０．７５ｍｌ／ｗｉｎに保
たれ、毎分毎に分画回収する。均一ＧＤＧＦはこれらの
条件下で２９分と３２分間の間にＣ４カラムから溶出す
る。増殖因子はカラム溶出液７５０μβに対し約ＩＭヘ
ベス緩衝液（約ｐＨ７．　５５１約１５０ｕＩ２中に溶
出された。

タンパク質の純度はレムリｆＬａｅｍｍｌ　ｉ）　，　
Ｎａｔｕｒｅ、第２２７巻、第６８０−６８４頁、ｌ９
７０年の方法を用いてｌ２．５％架橋ゲルを用いたデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）により検定される。銀染色ゲルによ
れば、ＧＤＧＦは非還元条件下で見掛けの分子量約４８
．　０００〜約４４，　０００ドルトンの１以上のバン
ドからなることを示している。微異質形のＧＤＧＦ含有
サンプルを還元条件下で分離する場合、ＧＤＧＦは分子
量約２１．０００ドルトンの単一バンドとして移動する
． グリオーマ由来増殖因子は電気泳動後に非還元性のドデ
シル硫酸ナトリウムボリアクリルアミドゲルから抽出す
ることもできる．電気泳動は当業界で公知の条件下で行
われる。ＧＤＧＦは緩衝液でゲルから溶出され、そのタ
ンパク質はセントリコンー１０　ｆｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
−１０）遠心マイクロコンセントレータ又は相当物で′
ａ縮される． 生物活性は噛乳動物血管内皮細胞を用いた分裂誘発アッ
セイにより測定される。ヒト膝血管内皮（ＨＩＶＥ）細
胞を約２０％熱不活化牛胎児血清ｉＦＣＳＩ約１　５ｍ
Ｍヘペス緩衝液（約ｐ１７．　５５）含有培地１９９（
１１９９）約５００μβ中約２０００細胞／ＣＩ１２の
密度となるようゼラチン被覆培養皿にまいた。ＧＤＧＦ
のサンプルはＭｌ９９＋ＦＣＳで連続希釈し，培養開始
時にウエルに加えた．細胞は５％Ｃ０２下３７℃で７２
時間インキユベートした６インキュベート後培地を除去
し、細胞は約ｐＨ７．４のＰＢＳ約２５０ＬＬｆ２で洗
浄し、約ｏ．ｉ％トリブシン／約０．０４％ＥＤＴＡ約
２００μβで処理してはく離させる。次いで細胞を血球
計数器で計測する．最大分裂誘発応答を示すＧＤＧＦ濃
度の１７２は約１　ｎｇ／ｍｌである。

牛大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）はＧＤＧＦ処理後チミジ
ン取込み量を評価するために用いられる。ＢＡＥＣはｌ
Ｏ％ＮＣＳ含有ＤＭＥＭ約５００ｕｊ２中約２０００細
胞／ウエルの密度でまいて、３７℃で１２時間インキュ
ベ−１〜する．培地を除去し、ＤＭＥＭ＋　１％ＦＣＳ
と交換して、細胞を４８時間インキユベートする。ＧＤ
ＧＦのサンプルをｌ％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで連続希釈し
、４８時間の最後に加える。更に１２時間のインキュベ
ート後、培地１ｍｌにつき〔メチル・３Ｈｌチミジン１
．６ｇ　Ｃｉ　（２０Ｃｉ／ｖｗｏｌｌ及び未標識チミ
ジン２．４５ｕ　ｇをロＭＥＭ２０μ℃でウェルに加え
る。細胞は３６時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し
、炭酸ナトリウム２ｇ及びＮａＯＨ　０．４ｇ／ｌｏｏ
ｍｌ　＋７）溶液２５ｏｕＩ２で溶解する。細胞ＤＮＡ
中への放射ｌＩ標識取込み量はシンチレーションカウン
トにより測定される。

４８キロドルトンｆｋＤａｌ　．　４６ｋＤａ及び４４
ｋＤａの未変性タイマーＧＤＧＦサンプル並びに還元が
つカルボキシメチル化されたモノマーｆ２１ｋＤａｌサ
ンプルは常時沸１１！６ＮＨ（：ｌ中約２４時間かけて
加水分解し、それらのアミノ酸組成はウォーターズ・ビ
コ・タグ（■ａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ　Ｔａｇｌ　システ
ムを用いて調べられる。アミノ酸組成は第２表に示され
ている。

精製ＧＤＧＦのサンプルは、約０、ｌ％ＥＤＴＡ．約６
Ｍ塩酸グアニジン及び約２０−ジチオスレイトール含有
約ｐ！｛９．５の約０．１Ｍｌ−リス中約５０℃で約２
時間かけて還元される．還元タンパク質は約０．１％Ｅ
ＤＴＡ及び約６−塩酸グアニジン含有約ｐＨ７．　８の
約０．７Ｍトリス中の未標識ヨード酢酸約９．２μＭ及
び１　４Ｃ−ヨード酢酸２．８μＭを添加してカルボキ
シメチル化される。タンパク質は室温で約ｌ時間かけて
カルボキシメチル化される．タンパク質は前記のように
逆相ＨＰＬＣで単離される。還元されかつカルボキシメ
チル化されたモノマーのサンプルは、当業界で周知の操
作によりリジン及びアルギニン残基のＣ末端側でポリペ
ブチドを開裂するトリブシンブロテアーゼ又はリジンの
Ｃ末端側でポリベブチドを開裂するＬｙｓＣのいずれか
で処理する。ポリベブチドは逆相！｛ＰＬＣ　（ＲＰ−
ＨＰＬＣＩ　により単離される。単離されたベプチドの
アミノ酸配列は、機械メーカーの指示どおりＡＢＩガス
相配列決定機にＡＢＴ　１２０Ａオンラインフェニルチ
オヒダントイアナライザーを接続しエドマン分解を用い
決定する。

アミノ酸配列は第３表で示されている。

還元されかつカルボキシメチル化されたＧＤＧＦは乾燥
後、約６Ｍ塩酸グアニジン及びｖ１０．１％ＥＤＴＡ含
有約ｐＨ７．８の約０．７Ｍ｝−リスに溶解する。■８
プロテアーゼを約ｐＨ８．０の炭酸水素アンモニウム緩
衝液に加え、混合物を約３７℃で約４８時間インキユベ
ートする。プロテアーゼは主にグルタミン酸残基のカル
ボキシル末端側を開裂する。得られたボノペブチドは前
記のようにＣ　．　．ＲＦ−１｛ＰＬＣで分離される。

ＧＤＧＦの還元及びカルボキシメチル化後、タンパク質
は６ＮＨＣｌで約ｐｉｉｓ．ａに調整され、メチオニン
スルホキシドのメチオニン残基への還元のためジチオス
レイトールを最終濃度２Ｍとなるよう加える。約３９℃
で約２０時間の還元後、タンパク質はＣ　．Ｈ　Ｐ　Ｌ
　Ｃ−で再精製される。生成物は乾燥後、暗所アルゴン
雰囲気下、約２０℃で約２４時間約７０％ｔＶ／Ｖｌギ
酸中４０ｍＭ臭化シアン２００μβで処理することによ
り、メチオニン残基のカルボキシル末端側で切断される
。切断生成物はＣ　．　．ＲＰ−｝ＩＰＬｃで分離され
る，アミノ酸配列は第ｌ図で示されている．完全鎖長１
９０アミノ酸残基タンパク質翻訳産物及びそのｃＤＮＡ
コード配列は第１図で示されている。成熟アミノ末端は
典型的疎水性分泌リーダー配列のすぐ後の残基２７であ
る。単一のＮ−グリコシル化可能部位はＡＳｎ＋ｏｏで
ある。アミノ末端，トリプシン（Ｔｌ　．　Ｌｙｓ−Ｃ
（Ｌ）．ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ
ｖ８ブロテアーゼ（ｖ８）及び臭化シアンｉｃＢ）開裂
のＨ　Ｐ　Ｌ　（：逆相精製産物が含まれる還元かつカ
ルボキシメチル化した成熟サブユニット１６４残基のほ
とんど｛１４３アミノ酸残基）は合計５ｍｇのタンパク
質を用いて直接微量配列決定［アブライド・バイオシス
テムズ４７０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ　４７０Ａｌ　］により調べられた。アミノ酸配列決
定で同定されたすべての残基は、右向きの矢印で示され
ており、残基２７におけるカツユに続く配列の直下にあ
るものはそれがサブユニット全体のアミン末端解析によ
るものであることを示し，ポリベブチド切断産物を示す
双方向矢印のある矢印はそれがそのポリベブチド切断産
物から同定された残基であることを示す．示された１対
のポリペブチドＶ１３Ａ及びＶ１８Ｂは混合物として配
列決定され，したがってｃＤＮＡから推察されるアミノ
酸配列の確認にとどまる。図参照． 完全鎖長コード領域は３組の部分的に重複するｃＤＮＡ
クローンから決定された．ポリベブチドＬ４２のアミノ
酸配列Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｉ
ｎ　　（残基４２−　４７１及びポリベブチドＴ３８の
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　　（残基１
６４−１６１１１に基づく縮重オリゴヌクレオチドプラ
イマーがサイキら、サイエンスｉｓｃｉｅｎｃｅ）　，
第２３０巻、第１３５０−１３５４頁，　１９８５年の
操作に従いＧＤＧＦに関するｃＤＮＡの中心領域をＰＣ
Ｒ増幅させるために用いられた．４２０ｂｐで移動する
単一バンドがゲル精製され、Ｓａｌ　Ｉで切断され、ｐ
ＧＥＭ３Ｚｆ　（＋ｌに結合され、配列決定された．得
られたヌクレオチド配列（ｐ４２３８）は，フローマン
ｆＦｒｏｈｍａｎｊら、プロシーディング・才ブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンスｔｌｓＡＩＰｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄ
ｅｍｙ　ｏｆ　ＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ、第８５巻、第８
９９８−９００２頁、１９８８年で記載されたプロトコ
ールに従い反方向！ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）及び正方向（
ｓｅｎｓｅ）ブライマーをデザインしてｃＤＮＡの５′
及び３′末端を増幅させるために用いられた。これらの
５′及び３′クローンは各々ｐ５−１５及びｐＷ−　３
と呼ばれる．各組のクローンに関して決定されたブライ
マーを除く完全ＤＮＡ配列の領域はヌクレ才チド配列上
に双方向矢印で示されている． グリオーマ由来増殖因子に関するヌクレオチド配列は，
グリオーマ由来増殖因子に関する配列内の適切なアミノ
酸をコードする、遺伝コードの縮重で示されるようなす
べてのコドンを包含すると解釈されることを意図してい
る．更にグリオーマ由来増殖因子に関するヌクレオチド
配列及びアミノ酸配列は、グリオーマ由来増殖因子に類
似した生物活性を示すタンパク質となるところの、端部
切除遺伝子又はタンパク質を包含すると考えられる。

ＧＤＧＦ遺伝子の発現は、いくつかの異なるプロモータ
ー発現系及びいくつかの異なる細胞内において行われる
。発現ベクターとは、適切な宿主において組換えロＮＡ
配列又は遺伝子のクローン化コピーが転写されそのａ＋
ＲＮＡが翻訳されるのに必要とされるＤＮＡ配列として
本明細書では定義される。

このようなベクターは細菌、藍藻植物、酵母細胞、昆虫
細胞、植物細胞及び動物細胞のような様々な宿主で遺伝
子を発現させるために用いることができる． 血管内皮細胞の分裂を促進しつるＧＤＧＦの能力により
このペブチドのすべての微異質形が薬剤として有用であ
る．本発明で用いられるタンパク質は前記のようなすべ
ての微異質形を包含すると考えられる。本タンパク質は
治療の必要な患者への新規タンパク質の投与によってヒ
トを含めた捕乳動物の創傷を治療するために用いること
ができる。

血管内皮細胞の刺激に関する新親方法は，栄養培地中に
おいて所望の血管内皮細胞のサンプルを約１　＝　ｌＯ
ｎｇ／＋１の濃度の哨乳動物，好ましくはヒト又はラッ
トのＧＤＧＦにより処理することを含む。

血管内皮細胞．増殖がインビトロで行われる場合、ＤＭ
ＥＭのような栄養培地又はその改良培地及び約０〜２容
量％のような低濃度の子牛又は牛血清の存在を要する。

抗生物質のような保存剤も含有されていてよく、これら
は当業界で周知である６本発明の新規増殖因子は血管内
皮細胞による人工血管の被覆にとって有用である。患者
の血管内皮細胞は末梢血管又は毛細血管含有組織の小切
片の摘出によって得られ、所望の細胞は増殖に必要なＧ
ＤＧＦ及びその他の補充成分の存在下で培養増殖される
．合成ポリマー血管を覆うのに十分な量まで培養された
内皮細胞は管の内表面上に移され、しかる後患者に移植
される。あるいは管状支持体を患者への移植前にインビ
トロでＧＤＧＦによりコーティングしてもよい。移植後
、内皮細胞は人工表面上に移動してそこで増殖する，移
植前に人工管をフィブリン、コラーゲン、フィブロネク
チン又はラミニンのようなタンパク質により共有又は非
共有結合的にコーティングすることにより人工表面への
細胞の付着性を高めることができる６次いで細胞被覆人
工管は患者に外科移植されるが、その場合に患者自身の
細胞で覆われていれば免疫的に適合しつるであろう。非
トロンボゲン性内皮細胞被覆することにより人工管の表
面上における凝固形成頻度を減少させ、ひいては管閉塞
区は他の箇所の塞栓の傾向を減少させる。

この新規タンパク質は人工管の製造にとっても有用であ
る。患者の血管内皮細胞及び平滑筋細胞を別々に採取し
、かつ培養する。内皮細胞は前記のようにＧＤＧＦの存
在下で培養する．平滑筋は当業界で周知の操作により培
養増殖される。生体適合性ポリマー（タンパク質被覆さ
れたもしくはされていない合成ポリマー又は外科縫合糸
のような非免疫原性バイオポリマー物質）の管状メッシ
ュマトリックスを用い外側においては平滑筋細胞内表面
においては血管内皮細胞の培養増殖を支持する。内皮細
胞が内表面でコンフルエントな単層を形成しかつ多層の
平滑筋細胞が外部を覆うと直ちに、管は患者に移植され
る。

新規ベブチドは組織修復又は増殖の誘導のためにも用い
ることができる。純粋なＧＤＧＦを用い血管増殖及び／
又は修復を誘導することにより組織の増殖を誘導かつ促
進させることができる。ベブチドは組織修復のためには
局所的に、血管修復のためには血管内で用いることがで
きる。血管新生及び表面創傷の治癒に関する適用の場合
、処方剤は約１　０ｎｇ〜約Ｉ　Ｂ／ｃｍ”／日の割合
で直接適用される。血管修復の場合、ＧＤＧＦハ約１０
ｇ〜約１００ｕｇ／ｋｇ体重７日の割合で血管内投与さ
れる．内部血管増殖の場合、処方剤は血管新生されるべ
き領域中に移植された徐放性ポリマー物質又は徐放性ボ
ンブから直接放出される。放出速度はいずれの場合にも
約１　００ｎｇ〜約１０υμｇ／日／Ｃ一である。

非局所適用の場合、ＧＤＧＦは標準的医薬実務に従い医
薬組成物として医薬的に認容される担体又は希釈剤，例
えばリン酸緩衝剤、塩水、リン酸緩衝液、リンゲル液等
と共に投与される。局所適用の場合には、様々な医薬処
方剤が本発明の活性化合物の投与にとって有用である。

このような処方剤としては格別限定されず以下のような
ものがある二親水性ワセリン又はポリエチレングリコー
ル軟膏のような軟膏；キサンタンガムのようなガムを含
有したペースト：アルコール性又は水性溶液のような溶
液：水酸化アルミニウム又はアルギン酸ナトリウムゲル
のようなゲル：ヒト又は動物アルブミンのようなアルブ
ミン：ヒト又は動物コラーゲンのようなコラーゲン．ア
ルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース及び
アルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えばメチル
セルロース，ヒドロキシェチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロース，ヒドロキシプロビルメチルセルロー
ス及びヒドロキシプ口ビルセルロースのようなセルロー
ス：ブルロニック■（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７で
例示されるプルロニツク■ボリオールのようなポリオキ
サマー：テトロニック１５０８（ｊｅｔｒｏｎｉｃ　１
５０８）のようなテトロニツク：アルギン酸ナトリウム
のようなアルギン酸塩．下記実施例は本発明を説明する
ものであり、本発明をそれらに限定するものではない。

実施例Ｉ ＧＳ−９Ｌ細　を馴　した　地の ＧＳ−９Ｌ細胞を１７５０一の組織培養フラスコ内でダ
ルベツコ改良イーグル培地／ＩＱ％新生子牛血清ｆＩ）
ＭＥＭ／ＮＣＳｌ中でコンフルエントになるまで増殖さ
せた。集密時に培地をフラスコからデカントし、フラス
コを無カルシウム及びマグネシウムＪン酸緩衝液ｆＰＢ
ｓｌで洗浄し、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡの溶液で１
回処理して遊離させた．細胞（　Ｌ　Ｘ　ＩＱ’ｌを遠
心でベレット化し、ＤＭＥ／５％ＮＣＳｔｓＯＤｍｌに
再懸濁し、１０レベル（表面積６０００ｃｍ”）セ？フ
ァクトリー（ＮＵＮＣＩ中に移した。５％ＣＯ■雰囲気
下３７℃で７２時間のインキュベート後培地をデカント
し，セルファクトリーをＰＢＳで３回洗浄した。細胞に
２　５ｍＭへベス、５μｇ／ｍｌインシュリン、ｌＯμ
ｇ／ｍｌ　トランスフエリン及び１．ロ一ｇ／＋１牛血
清アルブミン含有ハムーＦ１２／ＤＭＥＭのｌ：２混合
物ｌ５００ｌｌｌを再補給した．この培地を２４時間後
新鮮Ｆ−１２／ＤＭＥＭと交換し、その後は４８時間毎
に回収した．馴養培地はワットマン＃１紙で濾過して細
胞砕片を除去し，−２０℃で凍結貯蔵した。

実施例２ 実施例ｌのＧＳ−９Ｌ　９１養培地を解凍し、Ｉ　Ｍ　
ＨＣＩでＩ）Ｈ６．０にした．　ＣＭセファデックスＣ
−５０陽イオン交換樹脂１ｇをｌ　Ｎ　ＨＣＩでｐＨ６
．０に調整したＰＢＳで予め平衡化し馴養培地２０Ｉ２
に加えた。混合物を４℃で２４時間にわたり低速で撹拌
した。次いで樹脂を沈降させ、培地を吸引した。残った
樹脂スラノーを３．３ｃｍ径カラムに充填し、残った培
地は流下させた．未結合タンパク質はＯ．ｌ５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１含有ｐ｝Ｉ６．ロの０．０５Ｍリン酸ナトリウムで
カラムから洗い出した。その後グリオーマ由来増殖因子
を０．　６ＭＮａＣ　ｌ含有ｐＨ６．０の０．　０５Ｍ
　リン酸ナトリウム洗浄でカラムから溶出させた。

実施例３ コンカナバリンＡアフィニテ　クロマトグラフィー 充填体１１５ｍｌのＣｏｎＡアガロース（ベクターラボ
ラトリーズ）含有１．５ｃｍ径カラムをｌ　ｍＭ　Ｃａ
Ｃｌｇ、１　ｍＭ　ＭｎＣｌｚ及びロ．６Ｍ　ＮａＣ１
含有ｐＨ６．　０の０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄か
つ平衡化した。実施例２のＧＤＧＦ活性のあるＣＭセフ
ァデックスＣ−５０溶出物をカラムにのせ、未結合タン
パク質を平衡化緩衝液洗浄でカラムから除去した．　Ｇ
ＤＧＦ活性は０．５Ｍα−メチルマンノシド含有平衡化
緩衝液洗浄でカラムから溶出した。

実施例４ ポリアスパラギン酸ｗＣｘ　　イオンー　クロマトグラ
フィ− ４．　５　Ｘ　２５０ｍｍポリアスパラギン酸ＷＣＸ陽
イオン交換ＨＰＬＣカラム（ネストグループ）をｐｕｓ
．ｏの０．０５Ｍリン酸ナトリウムで平衡化した。Ｃｏ
ｎＡアガロースから溶出された実施例３のＧＤＧＦ活性
分を０．５１ｌｌ／ｍｔｎでポリアスパラギン酸カラム
にのせた。次いでカラムを０〜１００％Ｂ緩衝液の直線
勾配で３０分間溶出させた（Ａ＝平衡化緩衝液及びＢ　
＝　０．７５Ｍ　Ｎａｉｌ含有のＡ），流速を０．７５
ｗｌ／ｗｉｎに保ち、分画を毎分毎に採取した。ＧＤＧ
Ｆ活性は２５分と３０分間の間に溶出した分画中に存在
していた。

実施例５ ＨＰＬＣクロマトグラフィー ポリアスパラギン酸カラムから溶出された実施例４のＧ
ＤＧＦ活性含有分画を０．１％トリフル才口酢酸ｔＴＦ
Ａ）溶液で予め洗浄された４．５　Ｘ５０ｍｍバイダッ
クＣ４逆相ＨＰＬＣカラムにのせた．カラムを０〜ｌ０
０％Ｂの直綿勾配で６０分間で溶出させた（Ａ＝０．１
％丁ＦＡ及びＢ＝３３％Ａ、６７％アセトニトリル）。

流速を０．　７５ｍｌ／ＩｔＩｉｎに保ち、分画を毎分
毎に回収した。均一ＧＤＧＦはこれらの条件下で０４カ
ラムか６２９分と３２分の間に勾配中に溶出した。増殖
因子は分裂誘発活性を保つため、カラム溶出液７５０μ
βをｐＨ７．５５のＩＭヘペス緩衝液１５０μβ中に溶
出させた．銀染色ゲルをおこなったタンパク質のＳＯＳ
−ＰＡＧＥ分析では、ＧＤＧＦが非還元条件下で見掛け
分子量４８，　０００、４６，０００及び４４．　００
０ドルトンの３バンドからなることを示した。見掛け分
子量は既知分子量の較正用タンパク質標準品から計算さ
れた。すべての操作は当業界で周知である。還元条件下
においてはＧＤＧＦは分子量２１．０００のタンパク質
の単一バンドとして出現する。

実施例６ 廷聚透又ヱユ土ヱ ヒトａ血管内皮細胞を２０％熱不活化牛胎児血清（ＦＣ
ＳＩ及びｌ　５ａＭヘベス緩衝液含有培地１９９　５０
０μ℃中２０００細胞／ウェルの密度でゼラチンコーテ
ィングした４８ウェル組織培養皿に入れた．分析を行う
実施例１〜５のＧＤＧＦサンプルはＭｌ９９／牛胎児血
清で段階希釈し、培養開始時にウエルに加えた。培養プ
レートを５％ＣＯ，中３７℃で７２時間インキュベート
した。インキュベート後培地を細胞から除去し、しかる
後ＰＢＳ２５０μβで洗浄し、細胞をトリプシンｆＯ．
１％　）　／ＥＤＴＡ（０．０４％）　２００　ｕ　ｆ
２　’ｔ’遊離させた．次いで細胞を血球計数器でカウ
ントした。

牛大動脈内皮細胞をＤＭＥＭ　／１０％ＮＣＳ５００μ
２中２０００細胞／ウェルの密度で４８ウエルプレート
に入れ、３７℃で１２時間インキユベートした。培地を
プレートから除去し、ＤＭＥＭ／１％熱不活化ＦＣＳと
交換し、細胞を再度４８時間インキユベートした。分析
される実施例１〜５のＧＤＧＦサンプルをＤＭＥＭ　／
ｌ％ＦＣＳで連続希釈し、この４８時間の最後にプレー
トに加えた。更に１２時間のインキュベート後、培地Ｉ
ｎ＋１につき〔メチルー”Ｈｌチミジン１．６ｕＣｉ　
（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌｌ及び未標識チミジン２．４５．
　ｇを添加したＤＭＥＭ２０μβをウエルに加えた。プ
レートを再度３６時間インキユベートし、培地を除去し
、細胞層をＰＢＳで洗浄し、細胞をｌｏＯ＋ｎｌ当り炭
酸ナトリウム２ｇ及びＮａＯＨ　Ｏ．４ｇを含む溶液ｚ
ｓｏｕｇで溶解させた。次いでＤＮＡ中への敢射′ＭＡ
標識取込み量をシンチレーションカウントにより測定し
た。

ＨＯＭＥ細胞で半最大分裂誘発応答をを示すＧＤＧＦｉ
ｌｌｌ度は約１ｎｇ／ｍｌであった．ポジティブコント
ロールである酸性フィブロブラスト増殖因子に対する応
答性を促進するため、これらのアッセイにおいて１０〜
１００μｇ／ｍｌのレベルで必要とされるグリコサミノ
グリカンヘパリンはＧＤＧＦによるこれら細胞の分裂誘
発促進性を高めない。

ラインマイヤー（Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ）ら，バイオ／テ
ックｆＢｉｏ／Ｔｅｃｈ）　．第５巻、第９６０−９６
５頁、１９８７年に記載されたＢＡＬＢ／Ｃ　３Ｔ３フ
ィブロブラストによる分裂誘発アッセイを用いたところ
、ＧＤＧＦは３Ｔ３細胞において分裂誘発応答を促進で
きなかった．前記の生化学的操作及び分析技術を用いた
段階的精製を第１表に要約する． 第１表 クリ才−マ由来増殖因の精製 馴養培地　　　２．　５ｘｌＯ” ＣＭセフ７ｆツクス Ｃ−５０ Ｃａｎ　　Ａ ｆリアλバラギン酸ＷＣＸ Ｃ．　　ｌ｛ＰＬＣ ｌ６ １．２ １．　１ｘｌＯ−” １．ロｘｌＯ−’ １馴養培地５Ｉ２に基づく ２０．　０００ ｌ １２，　０００ ４，　０００ １．　５００ ｔ．ｏｏｏ ７．５ｘｌＯ” ３．　３ｘｌＯ” １．　４ｘｌＯ’ １．Ｏｘｌ０６ １７，　５００ １２５．　０００ 実施例７ アミノ　　フ゛　び　夕Ｉ 未変性ダイマーＧＤＧＦのサンプル及び還元かつカルボ
キシメチル化されたモノマーのサンプル双方を加水分解
し、それらのアミノ酸組成をウォーターズ・ビコ・タグ
・システムで調べた。未変性ダイマーＧＤＧＦのサンプ
ル及び還元かつカルボキシメチル化されたモノマーのサ
ンプル（アミノ酸配列決定のため下記プロトコールを用
いてＧＤＧＦの還元及びカルポキシメチル化を行って得
られる）の双方は１％フェノール［ビアースｆＰｉｅｒ
ｃｅｌ　］含有常時沸騰ＨＣｌ中１１０℃で２４時間加
水分解した。次いで加水分解産物をフェニルイソチオシ
アネートでフエニルチオカルバミルアミノ酸ｆＰＴｃ）
とした。ＰＴＣアミノ酸をウォーターズ・ビコ・タグア
ミノ酸分析ＨＰＬＣカラムによる逆相クロマトグラフィ
ーで分離し、それらの２５４ｎｍにおける吸光度を既知
量の標準ＰＴＣアミノ酸の場合と比較して定量した。正
確なプロトコールはｌ９８６年２月のウ才−ターズ・ビ
コ・タグアミノ酸分析システムマニュアルＮｏ．８８１
４０に詳細に記載されている。アミノ酸組−成はＧＤＧ
Ｆダイマー形からオリゴ糖鎖をひいた分子量３５．　０
００ドルトンを基本にしている。

ＧＤＧＦ中に存在する才リゴ糖の量は、エンドグリコシ
ダーゼＨ酵素によるオリゴ糖除去の前後の還元ＳＯＳ−
ＰＡＧＥにおけるＧＤＧＦの分子量を比較することによ
り調べた．純粋ＧＤＧＨ２５ｎｇをｐＨ６．０の０．０
５ｍクエン酸ナトリウム，０．旧％ＳＤＳ及び０．　Ｈ
ｅβ−メルカプトエタノール中３７℃で６時間エンドグ
リコシダーゼＨ　２０ｍＵ／ｍｌで処理した．次いで生
成物を１２，５％ＳＯＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動を行い
、銀染色して、タンパク質分子量評価におけるオリゴ糖
側珀の影響を確認するため、才リゴ糖除去に基づく相対
的移動度の変化を調べた。結果は、下記表で示されてい
る。

第　　２　　表 タイマーＧＤＧＦのアミノ酸組成 ＡｓＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ロ
Ｇ　ｌ　ｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４　
４Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４Ｇ
ｔｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｔｏＨｉｓ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１０Ａｒｇ　　　
　　　　　　　　　　　　　２４Ｔｈｒ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１８Ａｌａ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１２Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　２８Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　
　　８Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　１６
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８Ｍｅ
ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　８Ｃｙｓ　　
　　　　　　　　　　　　　２８Ｉ　ｌｅ　　　　　　
　　　　　　　　　　　１２Ｌｅｕ　　　　　　　　　
　　　　　　　　１４Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　
　　　　ｉｌｌトリブトファンは測定されなかった。シ
スチンは還元かつカルボキシメチル化されたモノマー中
への１４ｃ−ヨード酢酸の取込みレベルから評価された
． 未変性タイマーＧＤＧＦサンプル４ｇ．ｇをｐＨ９．５
のｏ．ｉｕトリス中５０℃で２時間かけて０．１％ＥＤ
ＴＡ．　６讐塩酸グアニジン及び２　０ｍＭジチ才スレ
イトールで還元した．還元されたタンパク質は０．１％
ＥＤＴＡ及び６Ｍ塩酸グアニジン含有ｐＨ７．　８の０
．　７Ｍ　Ｉ−リス中未標識ヨード酢酸９．２ムＡＭ及
び１４Ｃ−ヨード酢酸２，３μＭの添加によってカルボ
キシメチル化した。タンパク質は室温で１時間かけてカ
ルボキシメチル化した。次いでタンパク質を前記のよう
に、Ｃ．ＲＰ−　ＨＰＬＣで再単離した。還元かつカル
ボキシメチル化されたモノマーのサンプルをトリブシン
プロテアーゼ又はＬｙｓＣのいずれかで処理した。トリ
プシンの場合には、還元かつカルボキシメチル化された
ＧＤＧＦをｐＨ８．３のｏ．　ｉｈＡ炭酸水素アンモニ
ウム中３７℃で６時間ＧＤＧＦに対してｌ　：　１００
重量比のトシルフェニルクロロケトンートリブシンで処
理した．得られたべブチド断片を４．　５ｍｍ　Ｘ　２
５ｃｍＣ　＋　ａ逆相カラムによるクロマトグラフィー
で分離した。

ベブチドは０〜１００％Ｂの直線勾配で３時間で溶出さ
せた．（Ａ＝０．１％ＴＦＡ及びＢ＝６７％アセトニト
リル含有０．ｌ％ＴＦＡ）．　ＬｙｓＣの開裂の場合に
もすべての条件は同一であるが、但し用いられた緩衝液
はｐＨ８．５　＋７）０．１Ｍト’）　ステアッテ、Ｇ
ＤＧＦ対ＬｙｓＣの比率を４０：ｌに保ち、ＧＤＧＦ及
びＬｙｓＣ混合物を１４時間インキユベートした。次い
で単離されたべブチドのアミノ酸配列をＡＢＴ　１２０
Ａオンラインフエニルチオヒダントインアナライザー（
アプライド゜バイ才システム社）を接続したＡＢＩガス
相配列決定機においてエドマン分解を用い決定した６ベ
ブチド配列は下記表で示されている． 第　　３　　表 Ｔ２２ Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ｉｓ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓ’ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ａｒｇ−Ａｒ（（−Ｌｙｓ Ｔ２７ Ｘｘｘ”−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−ＬｙｓＨｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−ＡｓｐＴ４０ Ｐｈｅ−ＩＪｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−
ＡｒｇＬｙｓ　　Ｃ Ｌｌ６ Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−　Ｌｙｓ　−　Ｐｒｏ−Ｇ　
ｌ　ｕ−Ａｓｎ−１１ｉ　ｓ−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌｕ　−　
Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
ＬｙｓＬ２０ Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｇ　１　ｎ　−　Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｕ−　Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｃ
ｙｓ　−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇＬ２３ Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙ，ｓ−Ｌｙｓ１未同定アミ
ノ酸残基を示す 単離されたベプチドのアミノ酸配列はＧＤＧＦに特有な
性質を示している。

ＧＤＧＦを前記精製プロトコールの最終段階で逆相Ｃ４
ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより均一タンパク質を溶
出させるために用いられた水性トリフルオロ酢酸ｆＴＦ
Ａｌ　／アセトニトリル混合物中において４℃で貯蔵し
た。精製タンパク質の一部（１〜２μｇ）を酸洗浄され
たｌＯＸ７５ｍｍガラスチューブ内で減圧下蒸発乾固さ
せ、アルゴン雰囲気下６Ｍｔ！ｉ酸グアニジン、０．１
％ＥＤＴＡ及び２０ｎ＋Ｍジチオスレイトール〔カルビ
オケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ウルトロールグレー
ド（Ｕｌｔｒｏｌ　ｇｒａｄｅｌｌ含有ｐＨ９．５の０
．　１Ｍ　トノス緩衝液１００μβ中５０℃で２時間還
元した。次いで還元タンパク質を酸性ｐＨの０．７Ｍト
リス１００ｕｇ及Ｕヨ−｝’　［２−”ｃ　］酢ａ５０
＋ｕｃｉ　［１７．９ｍＣｉ／ｍ＊ｏｌ、アマーシャム
（Ａｍｅｒｓｈａｗｌ　］を添加して２０℃で１時間か
けてカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化終了
後、混合物を０．１％ＴＦＡで予め平衡化された４．６
ｍｎ＋　Ｘ　５．ＯｃｍバイダックＣ４カラム上に直接
のせた。還元かつカルボキシメチル化されたタンパク質
を０．】％ＴＦＡ中０〜６７％ｈ／Ｖ）アセトニトリル
の３０分間直線勾配による流速０．　７５ｍＬ／ｍｉｎ
の溶出で再精製し、この溶出液中４℃で貯蔵した。

還元かつカルボキシメチル化されたＧＤＧＦｆ７２５ｎ
ｇｌ　を酸洗浄ｌＯ×７５１ＩＩＩＩｌガラスチューブ
中で〆圧蒸留により乾燥させた。ＴＰＣＫ処理牛膵臓ト
リブシン［３ロｎｇ、ワージントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ）　］をｐＨ８．３の０．１Ｍ炭酸水素アンモニ
ウム２ロ０μｅに加えた．基質タンパク質を３７℃で６
時間消化し、得られたポリペブチドを０．１％ＴＦＡで
平衡化された４．６ｎｉｍ　Ｘ　２５ｃｏ＋バイダック
Ｃｌａ逆相ＨＰＬＣカラム上にのせた．アルギニン及び
リジン残基のカルボキシル基側におけるタンパク質分解
で得られたポリベブチドは２０℃において０．１％ＴＦ
Ａ中０〜６７％アセトニトリルの２時間直線勾配による
流速０．　７５ｍｌ／ｍｉｎの溶出で分別した．個々の
ピークは０．　７５ｍｌ／ｒｎｉｎであって，この溶出
液中４℃で貯蔵した．還元かつカルボキシメチル化され
たＧＤＧＦ　（９２５ｎｇ）を酸洗浄１０Ｘ７５ｎ＋ｍ
ガラスチューブ中減圧蒸留により乾燥させた。リジン残
基のカルボキシル基側を開裂する酵素ＬｙｓＣブロチア
ーゼ［　５０ｎｇ、べ一リンガー・マンハイムｆＢｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　］１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ含有ｐＨ８．　５の０．　Ｈｅ　トリス５０με
に加えた。基質タンパク質を３７℃で８時間かけて切断
し，得られたポリベブチドを前記のようにＣｌａカラム
で逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分離した． 還元かつカルボキシメチル化されたＧＤＧＦ（１．１μ
ｇ）を乾燥し．６Ｍ塩酸グアニジン、０．１％ＥＤＴＡ
含有ｐＨ７．　８の０．　７Ｍ　トリス５μβに溶解し
た，　Ｖ８ブロテアーゼ［６５ｎｇ、マイルス・ラボ（
ＭｉｌｅｓＬａｂｓｌ　］を０．１％ＥＤＴＡ含有ｐＨ
８．０の０．　１Ｍ炭酸水素アンモニウム６５μ氾に加
え、混合物を３７℃で４８時間インキユベートした。こ
れらの切断条件下、このプロテアーゼはグルタミン酸残
基のカルボキシル末端側を主に開裂する。得られたポリ
ベブチドを前記のようにＣ．カラムで逆相ＨＰＬＣクロ
マトグラフィーにより分離した． ＧＤＧＦ　ｆ１．　ａ　ｕ　ｇ）の還元及びカルボキシ
メチル化後、タンパク質溶液を６ＮＨＣｌでｐＨ６．　
８に調整し、ジチオスレイトールをメチオニンスルホキ
シドのメチ才ニン残基への還元のため最終濃度２Ｍとな
るよう加えた。３９℃で２０時間の還元後、タンパク質
を前記のようにＣ．ＨＰＬＣ逆相カラムで再精製した。

生成物を１０Ｘ７５ｍｍガラスチューブ中で乾燥し，暗
所中アルゴン雰囲気下２０℃で２４時間かけて７０％（
Ｖ／Ｖ）ギ酸中４０ｍｋｌ臭化シアン２００ｕＩ２によ
りメチオニン残基のカルボキシル末端側を開裂させた。

開裂生成物を前記のようにＣｌｌｌカラムで逆相ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフィーにより分離した。

実施例８ Ｐ４２３８のＰＣＲ　　　一、クローニング　び配列決
一ＬｙｓＣ断片４２及びトリプシン断片３８間のＧＤＧ
Ｆのべブチド配列についてコードするｃＤＮＡを増幅さ
せるため、２種の縮重オリゴヌクレオチドを合成した．
これらの才リゴヌクレオチドは以下のとおりであった： ４２．２　　５゜ＴＴＴＧ丁ＣＧＡＣ丁Ｔ［ＴＣ］ＡＴ
ＧＧＡ［ＴＣ］ＧＴ［Ｎ］ＴＡＦ丁Ｃ］ＣＡ３’ Ｔ：ｌ８３　　Ｂ　　５゜ ＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡ　［ＡＧ］　ＴＣ
　［Ｎ］ＧＴ　［ＡＧ］ＴＴ　［ＴＣ］ＴＴ［ＡＧ］Ｃ
Ａ３ Ｎ＝ＡＣＧＴ インビトロゲン（｛ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ファースト
・トラック（Ｆａｓｔ　ＴｒａｃｋｌＲＮＡ単離キット
及びそのプロトコールによってＧＳ　９Ｌ細胞からＲＮ
Ａを単離した。最初のｃＤＮＡ鎖合成は下記のように行
われた：ＧＳ−９Ｌ　ＲＮＡＩμｇをアダプターブライ
マーＴＡ］７５゜ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ
ＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　３゜１μｇと
容１１０ｕｇで７０℃５分間反応させ室濡に冷却してア
ニーリングさせた。この反応液に以下を加えた： 水３．０μ｛ １０Ｘ緩衝液ｆｐＨ８．　３ノ５００ｍＭ　トリスＨＣ
Ｉ，　７５０１１１Ｍ　ＫＣＩ，１００ｍＭ　ＭｇＣＬ
ａ、５ｍＭスペルミシン）２．５ｕｆｆｌＯロｍＭ　　
ＤＴＴ　　２．５　　μ　℃各ｌＯ−のｄＡＴＰ，　ｄ
ＧＴＰ．　ｄＣＴＰ，　ｄＴＴＰ　２．　５　μ２１５
単位ＲＮアーゼ　０．６μ２ ４　０ｍＭビロリン酸ナトリウム２．５μβ１５単離逆
転写酵素１．５μ２ 反応液を４２℃で１時間インキユベートし、しかる後１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ｐ｝１７．５の１［１ｍＭトリス
ＨＣＩでｌｍｌに希釈した． ＰＣＢ反応 一次反応液１００　ｕ℃ パーキン・エルマー・セタス・ジーンアンブ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐｌ　
　キットの１０Ｘ緩衝液ｔｏｕ　ｇ 各ストック１．２５ｍｌＪのｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　
ｄＧ１’Ｐ及びｄＴＴＰｌ６μ２ 第一のｃＤＮＡ鎖２μβ ５０ｐＭ　Ｌ４２．２　　２μβ ５０ｐＭ　Ｔ３８３゜Ｂ　２ｕｌ２ ２．５単位アンプリタック（Ａｍｐｌｉｔａｑｌ　ＤＮ
Ａポリメラーゼ０．５μβ 水６７．５μ２ 反応条件４０サイクルの９４℃１分間：５０℃２分３０
秒：７２℃２分間 調製用スケール二次反応 １０Ｘ緩衝液ｔｏａｕｇ 各ストック１．２５−のｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ１６ｕＩ２ 一次ＰＣＲ反応液１０Ｌ１℃ ５００ｐＭ　Ｌ４２．２　２０μβ ５ロＯｐＭ　　Ｔ３８３’Ｂ　　２０　　ｕ　　２２５
単位アンプリタツクＤＮＡポリメラーゼ５μβ 水６８５μｅ 反応条件３０サイクルの９４℃１分間：５５℃２分間：
７２℃２分間 ＰＲＣ生成物をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｌ　
３０スビンカラムで濃縮し、１％アガロースゲルで精製
し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ　Ｉで切断した。次
いでＳａｌ　Ｉ断片をＳａｌ　Ｉ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ　
ｔ＋）に結合した．結合混合物を用いて大腸菌ＸＬ−１
ｂｌｕｅを形質転換させた．ブラスミドＤＮＡを白色形
質転換株から単離し，ジデオキシ鎖終結法で配列決定し
た。

実施例９ ■−３のＰＣＲ　　−　クローニング　びｐ４２３８ク
ローンから得られた配列に基づき、２種の特異的ＰＣＢ
ブライマ一二 オリゴ３０７５゜ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＧ
ＧＡＧＡＡＡＧＣ　３゜及びオリゴ２８９　５’ＴＴＴ
ＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴ（：ＡＣＴＧＴＧＡＧＣ　３
゜を合成した．これらのブライマーをオリゴＡ１７　５
゜ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ　３’と共に用
いて、フローマンら，プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８５巻
、第８９９８−９００２頁．　１９８８年で記載された
３゜ＲＡＣＥ技術に従いＧＤＧＦのＣＯＯＨ未端側につ
いてコードするｃＤＮＡを増幅させた． ＰＣＲ反応 一次反応液１００μβ バーキン・エルマー・セタス・ジーンアンブキットのｉ
０Ｘ緩衝液ｌＯμｅ １．２５ｍｕのｄＡＴＰ．　ｄＣＴＰ．ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰの各ストック１８ｕβ 第一のＧＳ９Ｌ　ｃＤＮＡ鎖ｏ．３ｓｕ　ｇ５０ｐＭ　
２８９　　２　ｕ　Ｊ２ ２．５単位アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ０．５　
μ℃ 水６７．１５　ｕβ 反応条件ＩＯサイクルの９４℃１分間：５８℃２分間・
７２℃２分間、しかる後５０ｐＭ　Ａ１７を加え、次い
でｌサイクルの９４℃１分間：５８℃２分間：７２℃４
０分間、しかる後４０サイクルの９４℃１分間：５８℃
２分間：７２℃２分間。

調製用スケール二次反応 ｔＯＸ緩衝液６０μ℃ １．２５−のｄＡＴＰ．ｄＣＴＰ．　ｄＧＴＰ及びｄＴ
ＴＰの各ストック１０８μ４ 一次ＰＣＲ反応液２４μβ ３ロＯｐＭ　　３０７　　１２ｕ　　１２３ｏｏｐｌＪ
　Ａ１７　１２μβ １５単位アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ３ＬＡβ 水３８１ｕｆｆ 反応条件３０サイクルの９４℃１分間：５８℃２分間Ｐ
ＣＲ生成物は１％アガロースゲルで精製し、制限エンド
ヌクレアーゼＳａｌ　Ｉで切断した。次いでＳａ１Ｉ断
片をＳａｌ　Ｉ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ　（＋）に結合させ
た。結合混合物を用いて大腸菌ＸＩ、−１ｂｌｕｅを形
質転換させた．ブラスミドＤＮＡを白色形質転換株から
単離し、ジヲ１オキシ鎖終結法で配列決定した。

実施例１０ ５−１５のＰＣＲ　　−、クローニング　び　列決定ｐ
Ｐ４２３８クローンの配列に基づき，２種の特異的ＰＣ
Ｒブライマー：オリゴｌ１３５゜ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ
ＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧ　３’及びオリ
ゴ７４５゜ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡ
ＡＧＡＴＧＴＣＣ　３゜を合成した．これらのブライマ
ーをオリゴＡ１７　５゜ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡ
ＴＣＧ　３’と共に用いて，前掲のフローマンらにより
記載された５“ＲＡＣＴ技術に従いＧＤＧＦのアミノ末
端側についてコードするｃＤＮＡを増幅させた．　ＧＳ
−９Ｌ　ＲＮＡから特異的にＧＤＧＦ　ｃＤＮＡをブラ
イマー化するためオリゴ１５１を合成した．才リゴ１５
１は５゜ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣ　３゜
である。

ＲＮＡをインビトロゲン製ファースト・トラックＲＮＡ
単離キットとその所定のプロトコールでＧＳ９Ｌ細胞か
ら単離した。最初のｃＤＮＡ鎖合成は下記のように行わ
れた。： ＧＳ−９Ｌ　ＲＮＡ　ｌ　ｕ　ｇを容量ｓｇｇ中７０℃
１？５分間インキユベートししかる後室湛に冷却するこ
とによりオリゴ１５１１ｕｇとアニーリングさせた．こ
の反応液に以下を加えた： １０Ｘ　緩衝液ｆｐＨ８．３ｃ７）５００＋＋Ｍ　ト’
Ｊ　スＨＣ１，７５０ｍＭＫＣＩ．　　１００ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩ２、５ｍ＆ｌスベルミジンｌ１．５ｕｊ２１０ｓ
ｏＭ　ＤＴＴ　２．５ｇ　Ａ 各１０＋ｓ−のｄＡＴＰ．　ｄＧＴＰ．　ｄＣＴＰ．　
ｄＴＴＰ２．　５　ｕ　９２５単位ＲＮアーゼ０．６　
μ氾 ４０ｍＭビロリン酸ナトリウム２．５μＣ２０単位希釈
逆転写酵素９．５μｅ 反応液は４２℃で１時間インキユベートした．過剰の才
リゴ１５１をセントリコンｌ００スビンカラムで除去し
、ｃＤＮＡの５゜末端にｄＡＴＰ及びターミナルトラン
スフェラーゼの添加により尾部形成した．尾部形成され
たｃＤＮＡをｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ｐＨ７．５の１０
ｍｌＪトリスＨＣＩで最終容量１５０μ℃に希釈した。

ＰＣＲ反応 一次反応液５０μβ バーキン・エルマー・セタス・ジーンアンブキットのＩ
ＯＸ緩衝液５μβ 各ストック１．２５ｍＭのｄＡＴＰ．　ｄＣＴＰ．　ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ８μβ オリゴ１５１でプライマー化されかつ尾部形成された第
一のＧＳ９Ｌ　ｃＤＮＡ鎖５ｕＱ２５ｐ４１オリゴｌｌ
：ｌ　　ｉｕＩ２２５ｐＭ　Ａ１７　　Ｊ　ｕ　ｎ １０ｐＭ　ＴＡ１７　１　ｕ　１２ １．２２５単位アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ０．
２５ｕ℃ 水２８．　７５μａ 反応条件ｌサイクルの９４゜Ｃｌ分間：５０℃２分間：
７２℃４０分間、しかる後４０サイクルの９４℃ｌ分間
：５０℃１分３０秒間：７２℃２分間 調製用スケール二次反応 １０Ｘ　＃！！衝液６０４ｔｆｌ 各ストック１．　２５＋＋＋Ｍ（７）　ｄＡＴＰ．　ｄ
ｃＴＰ．ｄＧＴＰ及びｄ’ｒＴＰ９６ｕｌ２ 一次ＰＣＲ反応液６μｅ ３００ｐＭオリゴ７４　１２　ｕ　Ｉ２３０ＤｐＭ　Ａ
１７　　１２ｕ１２ １５単位アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ３μ氾 水４１１μＣ 反応条件３ロサイクルの９４℃１分間：５５℃２分間：
７２℃２分間 ＰＣＢ生成物をセントリコン【００スビンカラムで濃縮
し、制限エンドヌクレアーゼＳａｌｌで切断した。次い
でＳａｌＩ断片をＳａｌ　Ｉ切断ｐＧＥＭ３Ｚｆ　Ｄｌ
に結合させた。結合混合物を用いて大腸１ｉ１ＸＬ−　
１ブルーを形質転換させた．ブラスミドロＮＡを白色形
質転換株から単離し、ジデオキシ鎖終結法で配列決定し
た。塩基配列は第１図で示されている。

【図面の簡単な説明】

図は完全鎖長１９０アミノ酸残基タンパク質翻訳産物及
びそのｃＤＮＡコード配列について示している． Ｇ面の浄書（内容に変更なし） ｘＪｏｇｔ 手続補正書 平戊２年８月２ｇ日 （１）別紙の通り、明細書１通を提出致します。 （２）別紙の通り、正式図面１通を提出致します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質上純粋で生物学的に活性なグリオーマ由来増殖
   因子。 ２．増殖因子が哺乳動物グリオーマ細胞から得られる、
   請求項１記載のグリオーマ由来増殖因子。 ３．その因子がＧＳ−９Ｌ細胞から単離される、請求項
   １記載のグリオーマ由来増殖因子。 ４．その増殖因子がヒトグリオーマ細胞から得られる、
   請求項１記載のグリオーマ由来増殖因子。 ５．その因子が哺乳動物血管内皮細胞に対して分裂誘発
   性である、請求項１記載のグリオーマ由来増殖因子。 ６．その因子が分子量約４８，０００、４６，０００及
   び４４，０００ドルトンの少なくとも３種の微異質形と
   して存在する、請求項１記載のグリオーマ由来増殖因子
   。 ７．その因子が各モノマー単位が約２１，０００ドルト
   ンの分子量を有するホモグイマーとして存在する、請求
   項７記載のグリオーマ由来増殖因子。 ８．ａ．馴養（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地の単離；
   ｂ．ｐＨ６．０のカルボキシメチルセファデックスＣ−
   ５０交換樹脂吸着による陽イオン交換クロマトグラフィ
   ー、ついで０．６Ｍ ＮａＣｌ含有ｐＨ６．０の０．０５Ｍリン酸ナトリウム
   による溶出； ｃ．ｐＨ６．０のコンカナバリンＡアガロース樹脂吸着
   によるレクチンアフィニティク ロマトグラフィー、ついで１ｍＭＣａＣｌ＿２、１ｍＭ
   ＭｎＣｌ＿２、０．１５ＭＮａＣｌ及び０．５Ｍα−メ
   チルマンノシド含有ｐＨ６．０の０．０５Ｍ酢酸ナトリ
   ウムによる溶出； ｄ．ポリアスパラギン酸ＷＣＸ（ネスト）吸着による陽
   イオン交換高性能液体クロマ トグラフィー、ついで約０〜約１００％ ０．７５ＭＮａＣｌによる溶出；及び ｅ．バイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ＿４シリカベースＨＰ
   ＬＣカラムによるグリオーマ由来増殖因子の逆相高性能
   液体クロマトグラフィー 精製；の一連のステップからなる実質上 純粋形のグリオーマ由来増殖因子の単離 方法。 ９．ＧＳ−９Ｌ細胞培養液からの単離に関する、請求項
   ８記載の方法。 １０．薬学的担体及び組織修復に有効量の請求項１に記
   載された精製グリオーマ由来増殖因子を含むことを特徴
   とする組織修復用医薬組成物。 １１．治療の必要な患者に有効組織修復量の請求項１に
   記載されたグリオーマ由来増殖因子を投与することを特
   徴とする組織修復促進方 法。 １２．栄養培地中において所望の内皮細胞のサンプルを
   約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でグリオーマ由来増
   殖因子で処理することを特徴とする血管内皮細胞の増殖
   促進方法。 １３．血管外植片からの細胞を、宿主に移植するための
   合成ポリマー管の表面上で増殖させ る、請求項１２記載の方法。 １４．宿主に移植するため、血管外植片からの内皮細胞
   を生体適合性管状メッシュ支持体の内表面上で増殖させ
   、平滑筋細胞を管状メッ シュ支持体の外表面上で増殖させる、請求項１２記載の
   方法。 １５．合成ポリマー管をグリオーマ由来増殖因子で処理
   して、かかる血管移植の必要なヒトに移植し、移植後に
   内皮細胞が人工表面上に移動して増殖することを特徴と
   する合成血管の製造方法。 １６．治療の必要な患者に有効増殖促進量のグリオーマ
   由来増殖因子を投与し、それによって血管修復、血管新
   生又はその双方が促進されることを特徴とする、インビ
   ボにおける血管内皮細胞の増殖促進方法。 １７．生物学的に活性なグリオーマ由来増殖因子をコー
   ドする精製及び単離ＤＮＡ配列。 １８．配列が組換えＤＮＡである、請求項１７記載のＤ
   ＮＡ配列。 １９．少なくとも図示されたようなヌクレオチド配列を
   含み及び生物学的に活性なグリオーマ由来増殖因子をコ
   ードするサブユニットならどれでも含むことを特徴とす
   る、生物学的に活性なグリオーマ由来増殖因子をコード
   する精製及び単離ＤＮＡ配列。 ２０．少なくとも図示されたようなアミノ酸配列及びそ
   の微異質又は端部切除形であることを特徴とする組換え
   グリオーマ由来増殖因子。