JPH03996B2

JPH03996B2 -

Info

Publication number: JPH03996B2
Application number: JP59165400A
Authority: JP
Inventors: Yoshiji Shinmen; Sumio Asami; Norihide Amano; Teruo Amachi; Hajime Yoshizumi; Hidekazu Kosugi
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1984-08-07
Filing date: 1984-08-07
Publication date: 1991-01-09
Also published as: EP0171074A3; EP0171074A2; CA1261289A; JPS6143987A; ATE69265T1; DE3584593D1; US4737460A; EP0171074B1

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は微生物によるペルオキシダーゼの製造
法、更に触しくは新菌属のアルスロマイセスに属
する微生物によつて生産され、４−アミノアンチ
ピリン（以下「４−AA」と略す）−フエノール
系、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（以下「MBTH」と略す）−ジエチルアニリ
ン（以下「DEA」と略す）系、及び２，2′−ア
ジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−
スルホン酸（以下「ABTS」と略す）を水素供
与体として発色する新規なペルオキシダーゼの製
造法に関する。（従来技術）ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で
種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診
断用試薬として、グルコース、コレステロール、
リン脂質及び尿酸の定量に種々のオキシダーゼと
共に使用されており、又、酵素免疫試験法におけ
る標識酵素としても使用されているが、その供給
源としては、西洋ワサビ、大根等の植物が用いら
れているにすぎない。しかしながら、これらの植
物由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かづつ
異なるアイソザイムが含まれるため、診断試薬に
用いる純粋な酵素を得るには、アイソザイムを分
離する必要があり、非常に手間を要するという問
題がある。微生物起源のペルオキシダーゼも各種知られて
おり、例えば細菌及び糸状菌の生産するチトクロ
ームC₃ペルオキシダーゼやNADHペルオキシダ
ーゼなどがあるが、これらは通常の西洋ワサビ及
び大根のそれぞれに由来するような非特異的なペ
ルオキシダーゼではなく、その特異性の面で、臨
床診断用試薬に用いるには不適である。又、近年
０−ジアニシジンを水素供与体とするペルオキシ
ダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属する微
生物から生産されたが、０−ジアニシジンは発癌
性作用を有するため、その臨床診断薬への使用は
回避される傾向にあり、やはり上記診断試薬とし
ての使用には適していない。（発明が解決しようとする課題）本発明者らは、従来の西洋ワサビ或いは大根に
由来するペルオキシダーゼと同様に、臨床診断用
試薬及び酵素免疫試験法における標識酵素などと
して使用し得るペルオキシダーゼを増殖の速い微
生物から得るために、自然界より多くの微生物を
分離し、４−AA−フエノール系、MBTH−
DEA系及びABTS等の発色剤により呈色するペ
ルオキシダーゼの生産性を検討した。その結果、
ペルオキシダーゼ高生産能を有する新菌属に属す
る微生物菌株を見出し、本発明を完成した。（発明の構成）上記菌株の菌学的性質は次の通りである。 (1) 各培地における生育状態培養条件：室温（25〜28℃）、散光下バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地５日後のコロニーの直径24〜27mm。気中菌糸
は短かく密。コロニーは白色、コロニー裏側は
白色ないし黄味をおびた白色。菌糸は隔壁を持
ち分岐する。隔壁のところでややくびれること
がある。表面は平滑。無色。幅２〜5μm。分生
子の形成が認められる。又、厚膜胞子に類似し
た細胞が観察された。この細胞は菌糸先端、菌
糸の節間又は菌糸側面に形成され、球形又は楕
円形。直径５〜9μm、又は10〜15×６〜10μm。
約２週間後のコロニーには菌核の形成が認めら
れる。菌核は多数形成され、茶〜濃茶色。球形
又は楕円形。直径75〜100μm、又は100〜175×
75〜110μm。麦芽エキス寒天培地５日後のコロニーの直径７〜12mm。気中菌糸
は短かく密。コロニーは白色、コロニー裏側も
白色。菌糸は隔壁を持ち分岐する。隔壁のとこ
ろでややくびれることがある。表面は平滑。幅
２〜5μm。分生子の形成は認められず、厚膜胞
子に類似した細胞のみが観察される。この細胞
は菌糸先端、菌糸の節間又は菌糸側面に形成さ
れ、球形又は楕円形。直径８〜13μm、又は10
〜20×５〜12μm。 YpSs培地５日後のコロニーは直径52〜60mm。コロニー
は白色、コロニー裏側も白色。気中菌糸は密。
但し、コロニー中心部は気中菌糸が非常に少な
い。菌糸は隔壁を持ち分岐する。隔壁のところ
で、ややくびれることがある。表面は平滑。無
色。幅２〜5μm。分生子の形成が認められる。 (2) 検鏡観察各培地の検鏡標本とスライド培養によつて、分
生子形成様式、分生子柄、分生子などを観察し
た。分生子柄は栄養菌糸と区別困難である。分生子
形成様式は分節型である。分生子形成にあたつ
て、菌糸先端の基部がまず切断される。切断され
た菌糸は更にその中央部ないし、中央部よりやや
上部で分節して分生子となる。同時に、菌糸切断
面直下の菌糸側面から菌糸が伸長し、同様にして
分生子が形成される。この過程がくりかえされて
分生子が形成される。このため、菌糸の先端に分
生子が球状に集合することがある。また、菌糸切
断面直下の菌糸側面から伸長した菌糸がそのまま
伸長を続けることもある。分生子は短円筒形。先
端部は丸みをおびる。無色。表面は平滑。3.8〜
6.0×1.5〜2.5μm。 (3) 生理的性質本菌株の生育可能PHは４〜10、生育好適PHは６
〜９、増殖温度は10〜45℃、増殖好適温度は30〜
40℃である。以上の菌学的性質のうち、分生子形成様式が分
節型であることに注目し、本菌株と一致する属
を、J.W.Carmichael，W.B.Kendrick，I.L.
Conners及びL.Sigler著、Genera of
HyphomycetesとW.B.Kendrick及びJ.W.
Carmichael著、Hyphomycetes in“The Fungi”
Vol.Ａ，（Ainsworth，et al.，ed）において検
策したところ、本菌株に形態的特徴が一致する属
は見出せなかつた。そこで本菌株はヒポマイセー
テス（Hyphomycetes）中の一新属とするのが妥
当であると認めた。そこで新属アルスロマイセス
（Arthromyces）属を創設し、本菌株をアルスロ
マイセスラモスス（A.ramosus）と命名した。ここで、アルスロマイセス属は次のとおり定義
される：不完全菌亜門（Deuteromycotina）、不完全糸
状菌綱（Hyphomycetes）に所属する。菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する。分生子柄
は栄養菌糸との区別が困難、分生子形成様式は分
節型、分生子は菌糸の先端基部がまず切断され、
切断された菌糸が更に分節して形成される。同時
に菌糸切断直下の菌糸側面から菌糸が伸長して同
様の過程で分生子が形成される。分生子は短円筒
形。無色。基準種：Arthromyces ramosus N.Amano，
sp.nov. これらの菌株はいずれも土壞より分離したもの
である。又、アルスロマイセスラモススは微工
研菌寄託受理番号第7754号（FERM Ｐ−7754）
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。なお、本種の正基準標本（Holotype）
は、サントリー株式会社応用微生物研究所菌類標
本庫に保管されている。本発明に使用される菌株を培養するためには、
その菌株の胞子、菌糸あるいは予め培養して得ら
れた前培養液を液体培地あるいは固形培地に接種
し培養する。液体培地の場合に、炭素源としては
グルコース、フラクトース、キシロース、サツカ
ロース、マルトース、可溶性澱粉、糖密、グリセ
ロール、マンニトール等の一般的に使用されるも
のがいずれも使用できる。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミ
ノ酸、コーンスチープリカー等の天然窒素源の他
に、尿素等の有機窒素源ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を用いるこ
とができる。この他必要に応じリン酸塩、硫酸マ
グネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無基塩及びビタ
ミン等も微量栄養源として使用できる。これらの
培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば
特に制限はない。実用上一般に、炭素源は0.1〜
10重量％、好ましくは１〜５重量％、窒素源は
0.01〜５重量％、好ましくは0.1〜２重量％の濃
度とするのがよい。又、培養温度は10〜45℃、好
ましくは30〜40℃とし、培地のPHは４〜10、好ま
しくは６〜９として、通気撹拌培養、振盪培養も
しくは静置培養を行なう。培養は通常３〜14日間
で行なわれる。固形培地で培養する場合は、50〜100重量％の
水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用い、
10〜45℃、好ましくは30〜40℃下に３〜14日間で
行なわれる。この場合に必要に応じて培地中に窒
素源、無機塩類、微量栄養源を加えることができ
る。大量培養のためには液体培地を使用すること
が好ましい。このように培養して培養物中にペルオキシダー
ゼが生成蓄積する。ここで培養物とは、液体培養
においては培養後の菌体及び培養上澄液又は培養
液を意味し、固体培養においては菌体及び菌体
の生育した培地を意味する。液体培地を使用した
場合には培養液中からペルオキシダーゼの採取は
次のごとく行なう。培養終了後、培養液より遠心分離及び過など
の固液分離手段により菌体及び不溶物を除いて粗
酵素液を得る。さらに菌体中に含まれるペルオキ
シダーゼは磨砕もしくは超音波処理等の手段によ
つて菌体を破壊して酵素を抽出することにより粗
酵素液を得る。又、菌体を含む培養液をそのまま
超音波処理することにより菌体を破壊したのち不
溶物を除去して粗酵素液を得ることも可能であ
る。又、固形培地を使用した場合には菌体を含む固
形培地に水を加え、そのまま又は例えば超音波処
理等により菌体を破壊したのち、不溶物を除去し
て粗酵素液を得る。このようにして得られた粗酵素液から例えば有
機溶媒分別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法
及びカラムクロマトグラフイー等通常の酵素精製
方法を単独にあるいは組合せて用いることにより
精製されたペルオキシダーゼを得ることができ
る。本発明のペルオキシダーゼ活性の測定は、水素
供与体として例えば４−AA−フエノール系を使
用して次のように行なう。即ち、0.1Mリン酸バ
ツフアー（PH7.0）１mlに、0.1％フエノール溶液
1.3ml、0.2％４−AA溶液0.25ml及び0.02％過酸化
水素溶液0.2mlを加え、37℃に予熱後、これに酵
素液0.25mlを加えて10分間反応させる。反応後20
％アジ化ナトリウム溶液0.2mlを加え、500nmの
吸光度を測定して反応値とする。別にコントロー
ルとして過酸化水素溶液の代わりに水0.2mlを加
えて反応を行ない、同様の操作によつて吸光度を
測定しコントロール値とする。ペルオキシダーゼ
力価の単位Ｕ（ユニツト）は１分間に1μモルの過
酸化水素を消費する酵素量として表わされ、酵素
液又は培養液のペルオキシダーゼ力価（Ｕ／ml）
は0.198×ΔO.D.₅₀₀×（酵素液又は培養液の希釈
率）で求められる。なお、上式においてΔO.D.₅₀₀
は反応値からコントロール値を引いた値を示す。次に本発明で得られるペルオキシダーゼの性質
を示す。 (1) 作用特異性；本酵素は過酸化水素の存在下で種々の化合物の
酸化を触媒する。その作用機構は次式に示す通り
である。 H₂O₂＋AH₂ペルオキシターゼ ―――――――――→ 2H₂O＋Ａ〔但し式中AH₂は水素供与体を、又、Ａは酸
化された水素供与体を示す〕 (2) 水素供与体に対する特異性；本酵素の種々の水素供与体に対する特異性を第
１表に示す。但し、この表は本発明のペルオキシ
ダーゼが酸化を触媒する水素供与体の範囲を限定
するためのものではない。

【表】 ABTS：２，2′−アジノビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム
塩 (3) 至適PH； PH3.5〜5.5の範囲は0.1M酢酸バツフアー、PH
5.5〜8.0の範囲は0.1Mリン酸バツフアー、PH7.5
〜9.0の範囲は0.1Mトリス−塩酸バツフアー、PH
8.5〜9.0の範囲は0.1Mグリシン−水酸化ナトリウ
ムバツフアーを使用して、活性測定と同様の配合
比率で検討した。その結果を第１図に示す。 (4) 至適作用温度； 10〜80℃における酵素活性を測定した結果を第
２図に示す。 (5) PH安定性； PH3.5〜5.0の範囲は0.1M酢酸バツフアー、PH
6.0〜8.0の範囲は0.1Mリン酸バツフアー、PH8.0
〜9.0は0.1Mトリス−塩酸バツフアー、PH9.0〜
12.0は0.1Mグリシン−水酸化ナトリウムバツフ
アーを使用し、これらのバツフアー溶液0.9mlに
酵素液0.1mlを加えた後、30℃に16時間放置した。
この処理酵素液を0.02Mリン酸バツフアー（PH
7.0）で10倍に希釈した後、活性を測定した。そ
の結果を第３図に示す。 (6) 温度安定性； 0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）1.9mlに酵素
液0.1mlを加えて調製した酵素液を20〜90℃の
種々の温度に30分間保ち、処理後、直ちに氷水で
10分間冷却し、残存酵素活性を測定した。その結
果を第４図に示す。 (7) 分子量； SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法により分
子量を測定した。その結果、本発明によるペルオ
キシダーゼは分子量約36000であることがわかつ
た。 (8) 等電点； PH３〜10のキヤリアーアンホライト（フアルマ
シア社）を用い、40時間900V通電して等電点分
画を行なつた。その結果、本発明によるペルオキ
シダーゼの等電点はPH3.4であつた。上記述べた
ことから、本ペルオキシダーゼは、新規であり、
かつ、アイソザイムを含まないという特徴を有す
る。またアイソザイムを含まないことにより、酵素
免疫試験法における標識酵素として特に有用であ
る。すなわち、Avrameas〔Immunochemistry，
６，43（1969）〕が、西洋ワサビ由来ペルオキシダ
ーゼで行つた方法に準じてアイソザイムを分離す
ることなくグルタルアルデヒドで抗原あるいは抗
体に標識して、抗原あるいは抗体の検出、あるい
は定量に用いることができる。次に本発明の実施例を示す。（実施例１）グルコース１％、ポリペプトン0.5％、酵母エ
キス0.3％及び麦芽エキス0.3％を含む培地（PH
6.0）10mlを径24mmの試験管に入れ、120℃で15分
間殺菌した。アルスロマイセスラモススの１白金
耳を接種し、振盪培養機（300rpm）により30℃
で８日間振盪培養した。培養液を過し、液の
ペルオキシダーゼ力価を測定した結果、10.7U／
mlであつた。（実施例２）グルコース１％、ポリペプトン0.5％及び酵母
エキス0.3％を含む培地（PH6.0）５を15ジヤ
ーフアーメンターに仕込み、120℃で40分間殺菌
後、アルスロマイセスラモススの前培養液200
mlを接種した。30℃、通気量0.5V.V.M.で５日間
通気撹拌培養を行なつた。培養液を過し、液
のペルオキシダーゼ力価を測定した結果、
3.6U／mlであつた。（実施例３）実施例１と同じ組成の培地３を500ml溶坂口
フラスコ30本に100mlずつ分注し、120℃で20分間
殺菌した。アルスロマイセスラモススの前培養
液10mlを各々に接種し、レシプロシエーカー
（110rpm）により28℃で８日間振盪培養した。培
養液を過し、培養過液1915mlを得た。この
液のペルオキシダーゼ力価を測定した結果、
7.0U／mlであつた。この液に硫酸アンモニウ
ムを加え硫酸アンモニウム75％飽和で沈殿した画
分を集め、0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）66
mlに溶解した。この溶液をセロフアンチユーブを
透析膜として同一バツフアーに対して透析し、硫
酸アンモニウムを除いた。透析した酵素液を、予
め0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）で平衡化し
たDEAE−セルロースのカラムに通し、吸着画分
を塩化ナトリウムでグラジエント溶出させ、溶出
液の分画中で活性の高い画分106mlを集めた。硫
酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム75％飽
和で沈殿する画分を集め、0.1M塩化ナトリウム
を含む0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）３mlに
溶解し、セロフアンチユーブを透析膜として透析
した。この透析した酵素液を、予め0.1M塩化ナ
トリウムを含む0.02Mリン酸バツフアー（PH7.0）
で平衡化したウルトラゲル ACA 44のカラム
（LKB製）に通し、分画した溶出液を得た。溶出
液の分画中で活性の高い画分17mlを集め、硫酸ア
ンモニウムを加え、硫酸アンモニウム75％飽和で
沈殿する画分を集める。このペルオキシダーゼ塩
析物の培養液からの活性収率は57％、比活性は
37.6U／mgであつた。（発明の効果）本発明のペルオキシダーゼは、アイソザイムが
存在しないので、臨床診断用試薬及び酵素免疫試
験法における標識酵素として、従来の西洋ワサビ
等のものより優れている。そのうえ、本発明のペ
ルオキシダーゼは、微生物により生産されるか
ら、安定かつ大量に供給することができる点でも
優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応PHと本発明ペルオキシダーゼの相
対活性との関係を示すグラフであり、第２図は反
応温度と相対活性との関係を示すグラフであり、
第３図はPH安定性を示すグラフであり、第４図は
温度安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の定義：不完全菌亜門（Deuteromycotina）、不完全糸
状菌綱（Hyphomycetes）に所属する；菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する；分生子柄
は栄養菌糸との区別が困難、分生子形成様式は分
節型、分生子は菌糸の先端基部がまず切断され、
切断された菌糸が更に分節して形成される；同時
に菌糸切断面直下の菌糸側面から菌糸が伸長して
同様の過程で分生子が形成される；分生子は短円
筒形、無色；基準種：Arthromyces ramosus N.Amano，
sp.nov.；で規定されるアルスロマイセス（Arthromyces）
属に属するペルオキシダーゼ産生能を有する微生
物から得られ、下記の特性：酵素作用：過酸化水素による有機物質の酸化
を触媒する能力を持つ；ヒドロキノンおよびジエチルアニリンの酸化
を触媒する能力よりも、ｐ−アニシジン、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸およびｐ−アミノ安息香酸
の酸化を触媒する能力が大きく、そしてフエノ
ール、ピロガロール、ｏ−ジアニシジンおよび
２，2′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩
（ABTS）の酸化を触媒する能力は更に大き
い；至適PHが５〜７である；至適温度が30〜45℃である； PH５〜10で安定である； 50℃以下の温度で安定である； SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法での分
子量が約36000である；等電点分画法（アンホライン使用）による等
電点がPH約3.4である；アイソザイムを含まない；を有するペルオキシダーゼ。２アルスロマイセス属に属する微生物が、アル
スロマイセスラモスス（Arthromyces
ramosus）（微工研菌寄託受理番号第7754号；
FERM Ｐ−7754）である特許請求の範囲第１項
記載のペルオキシダーゼ。３下記の定義：不完全菌亜門（Deuteromycotina）、不完全糸
状菌綱（Hyphomycetes）に所属する；菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する；分生子柄
は栄養菌糸との区別が困難、分生子形成様式は分
節型、分生子は菌糸の先端基部がまず切断され、
切断された菌糸が更に分節して形成される；同時
に菌糸切断面直下の菌糸側面から菌糸が伸長して
同様の過程で分生子が形成される；分生子は短円
筒形、無色；基準種：Arthromyces ramosus N.Amano，
sp.nov.；で規定されるアルスロマイセス（Arthromyces）
属に属するペルオキシダーゼ産生能を有する微生
物を培養し、下記の特性：酵素作用：過酸化水素による有機物質の酸化
を触媒する能力を持つ；ヒドロキノンおよびジエチルアニリンの酸化
を触媒する能力よりも、ｐ−アニシジン、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸およびｐ−アミノ安息香酸
の酸化を触媒する能力が大きく、そしてフエノ
ール、ピロガロール、ｏ−ジアニシジンおよび
２，2′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩
（ABTS）の酸化を触媒する能力は更に大き
い；至適PHが５〜７である；至適温度が30〜45℃である； PH５〜10で安定である； 50℃以下の温度で安定である； SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法での分
子量が約36000である；等電点分画法（アンホライン使用）による等
電点がPH約3.4である；アイソザイムを含まない；で規定されるペルオキシダーゼを培養物中に生成
蓄積させ、これを採取することを特徴とするペル
オキシダーゼの製造法。