JPH04108378A - ヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体Info
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- JPH04108378A JPH04108378A JP2227504A JP22750490A JPH04108378A JP H04108378 A JPH04108378 A JP H04108378A JP 2227504 A JP2227504 A JP 2227504A JP 22750490 A JP22750490 A JP 22750490A JP H04108378 A JPH04108378 A JP H04108378A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトパーフォリンタンパク質と特異的に反応
するモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマに関する。
するモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体
を産生ずるハイブリドーマに関する。
パーフォリンはキラー細胞の細胞質顆粒に含まれている
物質で、キラー細胞が標的細胞を破壊する際にキラー細
胞から放出されるタンパク質である。このパーフォリン
は標的細胞膜に結合し、カル／ウムイオンの存在下て“
°たる仮゛°のように重合して、標的細胞の膜に孔をあ
ける。その結果、標的細胞に水と塩分か流入して細胞か
死滅することになる。従って、このパーフォリンの細胞
に対する孔形成能を増強することかできれば、癌やエイ
ズをはじめとする種々の疾磨の治療に役立てられる可能
性かある。またアメーバ赤痢菌や、ある種の寄生虫真菌
類および細菌は、パーフォリンに似たタンパク質を生産
し、同しように細胞に孔をあけるので、このタンパク質
の合成あるいは作用を阻害する手段を見い出すことかで
きれば、このタンパク質による病気を効率よく治療する
ことか期待される。この期待を実現すへく、種々のキラ
ー細胞からパーフォリン分子の抽出、精製かなされてい
る（ヤング等Ｃｅ１Ｌ４４ ８４９−８５９ １９８６
゜オフムラ等、 Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１８゜２９−３３ １９８８）。また特開平２−２
３５０号には、キラー細胞より単離したパーフォリン遺
伝子、該遺伝子を組み込んた発現ベクター、該発現ベク
ターを導入した形質転換細胞及び該細胞を培養して得ら
れる組換えパーフォリンの調製法か記載されている。
物質で、キラー細胞が標的細胞を破壊する際にキラー細
胞から放出されるタンパク質である。このパーフォリン
は標的細胞膜に結合し、カル／ウムイオンの存在下て“
°たる仮゛°のように重合して、標的細胞の膜に孔をあ
ける。その結果、標的細胞に水と塩分か流入して細胞か
死滅することになる。従って、このパーフォリンの細胞
に対する孔形成能を増強することかできれば、癌やエイ
ズをはじめとする種々の疾磨の治療に役立てられる可能
性かある。またアメーバ赤痢菌や、ある種の寄生虫真菌
類および細菌は、パーフォリンに似たタンパク質を生産
し、同しように細胞に孔をあけるので、このタンパク質
の合成あるいは作用を阻害する手段を見い出すことかで
きれば、このタンパク質による病気を効率よく治療する
ことか期待される。この期待を実現すへく、種々のキラ
ー細胞からパーフォリン分子の抽出、精製かなされてい
る（ヤング等Ｃｅ１Ｌ４４ ８４９−８５９ １９８６
゜オフムラ等、 Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１８゜２９−３３ １９８８）。また特開平２−２
３５０号には、キラー細胞より単離したパーフォリン遺
伝子、該遺伝子を組み込んた発現ベクター、該発現ベク
ターを導入した形質転換細胞及び該細胞を培養して得ら
れる組換えパーフォリンの調製法か記載されている。
パーフォリン及びその類縁の物質による病気の治療はも
とより、パーフォリンの生物学的、免疫学的意義を知る
うえからも、パーフォリンに対する抗体の取得か期待さ
れており、マウスパーフォリンに対するウサキの抗血清
を用いて一部検討か試みられている（ヤング等Ｊ、Ｅｘ
ｐ、Ｍｅｄ、 １６９２１５９−７１．１９８９）。
とより、パーフォリンの生物学的、免疫学的意義を知る
うえからも、パーフォリンに対する抗体の取得か期待さ
れており、マウスパーフォリンに対するウサキの抗血清
を用いて一部検討か試みられている（ヤング等Ｊ、Ｅｘ
ｐ、Ｍｅｄ、 １６９２１５９−７１．１９８９）。
しかし、パーフォリンはキラー細胞の顆粒にのみ存在す
ることから、パーフォリンの精製には高度の技術か要求
されること、精製過程か複雑であること、および安定性
が低いことなとの理由で、ヒトパーフォリンは現在まで
精製することに成功していない。遺伝子レヘルては、ヒ
トパーフォリン遺伝子は、特開平２−２３５０号記載の
マウスパーフォリン遺伝子を基に単離されており、その
遺伝子配列、アミノ酸配列かわかっている（ジンカイ等
、Ｉ ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０．４５２−４
５７゜１９８９）。またボタツク等も別に遺伝子の取得
に成功している（Ｎａｔｕｒｅ ３３５，４４４−４５
Ｌ１９８８）。しかしながら、この遺伝子を発現させる
ことに基く純粋なヒトパーフォリンの安定な取得には未
だ誰も成功していない。
ることから、パーフォリンの精製には高度の技術か要求
されること、精製過程か複雑であること、および安定性
が低いことなとの理由で、ヒトパーフォリンは現在まで
精製することに成功していない。遺伝子レヘルては、ヒ
トパーフォリン遺伝子は、特開平２−２３５０号記載の
マウスパーフォリン遺伝子を基に単離されており、その
遺伝子配列、アミノ酸配列かわかっている（ジンカイ等
、Ｉ ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０．４５２−４
５７゜１９８９）。またボタツク等も別に遺伝子の取得
に成功している（Ｎａｔｕｒｅ ３３５，４４４−４５
Ｌ１９８８）。しかしながら、この遺伝子を発現させる
ことに基く純粋なヒトパーフォリンの安定な取得には未
だ誰も成功していない。
これらの理由から、種々の疾患の治療及びその解明に有
用と考えられる、パーフォリンに対する抗体の取得は期
待されてはいるものの、いまた取得されるにいたってい
ない。
用と考えられる、パーフォリンに対する抗体の取得は期
待されてはいるものの、いまた取得されるにいたってい
ない。
このような状況下、本発明者等は、上記課題に対し、種
々検討した結果、ヒトパーフォリンをコートする遺伝子
において、ヒトパーフォリンに特異的な配列であると考
えられる、添付の図面の第１図のアミ７Ｍ 配列中、２
９７〜４６３位のアミノ酸配列をコードする塩基配列の
Ｎ末端に、第２図Ｂに記載の３５塩基を加えた融合バー
フォリン部分タンパク質をコードする遺伝子をベクター
に組み込み、大腸菌にて発現させた後、精製したそノ融
合バーフォリン部分タンパク質をマウスに免疫すること
により融合バーフォリン部分タンパク質に反応する抗体
を産生ずる細胞を取得し、これを用いてハイブリトーマ
を調製し、得られたハイブリトーマか産生ずる抗体かヒ
トパーフォリンと反応することを確認し、本発明を完成
するに至った。
々検討した結果、ヒトパーフォリンをコートする遺伝子
において、ヒトパーフォリンに特異的な配列であると考
えられる、添付の図面の第１図のアミ７Ｍ 配列中、２
９７〜４６３位のアミノ酸配列をコードする塩基配列の
Ｎ末端に、第２図Ｂに記載の３５塩基を加えた融合バー
フォリン部分タンパク質をコードする遺伝子をベクター
に組み込み、大腸菌にて発現させた後、精製したそノ融
合バーフォリン部分タンパク質をマウスに免疫すること
により融合バーフォリン部分タンパク質に反応する抗体
を産生ずる細胞を取得し、これを用いてハイブリトーマ
を調製し、得られたハイブリトーマか産生ずる抗体かヒ
トパーフォリンと反応することを確認し、本発明を完成
するに至った。
本発明により製造されるモノクローナル抗体は、サブク
ラスかＩ ｇ Ｇ ２ ｂであり、Ｌ鎖はにタイプに属
する。
ラスかＩ ｇ Ｇ ２ ｂであり、Ｌ鎖はにタイプに属
する。
従って本発明は、添付の第１図に記載のヒトパーフォリ
ン遺伝子の２９７番目から４６３番目までのアミノ酸を
コートする遺伝子を、第２図Ｂに記載の３５塩基対を含
んでいる第２図Ａに記載の発現ベクターｐＥ Ｔ ３
Ｃに組み込み、得られたベクターで大腸菌を形質転換し
、該形質転換大腸菌に生産させた融合ヒトバーフォリン
部分タンパク質を誓歯類動物に免疫感作し、該鰯歯類動
物の牌細胞またはリンパ節細胞とマウスミエローマとの
融合によって形成されたハイブリトーマであって、ヒト
パーフォリンタンパク質と特異的に反応し得るモノクロ
ーナル抗体産生能を有するハイブリドーマを提供するも
のである。
ン遺伝子の２９７番目から４６３番目までのアミノ酸を
コートする遺伝子を、第２図Ｂに記載の３５塩基対を含
んでいる第２図Ａに記載の発現ベクターｐＥ Ｔ ３
Ｃに組み込み、得られたベクターで大腸菌を形質転換し
、該形質転換大腸菌に生産させた融合ヒトバーフォリン
部分タンパク質を誓歯類動物に免疫感作し、該鰯歯類動
物の牌細胞またはリンパ節細胞とマウスミエローマとの
融合によって形成されたハイブリトーマであって、ヒト
パーフォリンタンパク質と特異的に反応し得るモノクロ
ーナル抗体産生能を有するハイブリドーマを提供するも
のである。
更に本発明は、上記ハイブリトーマにより産生される、
ヒトパーフォリンタンパク質と特異的に反応し得るモノ
クローナル抗体であって、サブクラスかＩｇＧ２ｂであ
り、Ｌ鎖がにタイプに属するモノクローナル抗体を提供
するものである。
ヒトパーフォリンタンパク質と特異的に反応し得るモノ
クローナル抗体であって、サブクラスかＩｇＧ２ｂであ
り、Ｌ鎖がにタイプに属するモノクローナル抗体を提供
するものである。
本発明に係るモノクローナル抗体および該モノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリトーマは、以下のようにして
製造することかできる。すなわち、）ヒトパーフォリン
タンパクをコートスル遺伝子から、パーフォリン特異的
でかつパーフォリンの生理活性に重要な部分と考えられ
る一部の遺伝子を発現ヘクターに挿入したものを大腸菌
に導入し、ヒトパーフォリンの部分タンパクを大腸菌に
大量に生産させ、 ）ｉ）で得たヒトパーフォリン部分タンパク質を抽出、
精製し、これを抗原として、誓歯類動物に免疫感作し、 １１１）該諺歯類動物のリンパ節細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞とを融合させて、ヒトパーフォリンの部分タン
パク質に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リトーマを選択し、 ｉｖ ） ｉｉｉ ）で得たハイブリトーマを適当な条
件下で培養し、モノクローナル抗体を回収し、このモノ
クローナル抗体を用いて、ヒトパーフォリン遺伝子を発
現している細胞との免疫組織染色を行うことにより、最
終的にヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体
を産生ずるノ・イブリトーマを選択し、 Ｖ）工程ｉ〜）で得たハイブリドーマを培養することに
より該モノクローナル抗体を回収する。
ル抗体を産生ずるハイブリトーマは、以下のようにして
製造することかできる。すなわち、）ヒトパーフォリン
タンパクをコートスル遺伝子から、パーフォリン特異的
でかつパーフォリンの生理活性に重要な部分と考えられ
る一部の遺伝子を発現ヘクターに挿入したものを大腸菌
に導入し、ヒトパーフォリンの部分タンパクを大腸菌に
大量に生産させ、 ）ｉ）で得たヒトパーフォリン部分タンパク質を抽出、
精製し、これを抗原として、誓歯類動物に免疫感作し、 １１１）該諺歯類動物のリンパ節細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞とを融合させて、ヒトパーフォリンの部分タン
パク質に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リトーマを選択し、 ｉｖ ） ｉｉｉ ）で得たハイブリトーマを適当な条
件下で培養し、モノクローナル抗体を回収し、このモノ
クローナル抗体を用いて、ヒトパーフォリン遺伝子を発
現している細胞との免疫組織染色を行うことにより、最
終的にヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体
を産生ずるノ・イブリトーマを選択し、 Ｖ）工程ｉ〜）で得たハイブリドーマを培養することに
より該モノクローナル抗体を回収する。
この様にして得られる本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトバーフォリン分子と特異的に反応することから、種
々の用途かある。すなわち、バーフォリン分子はキラー
細胞か特異的に発現しているタンパク質であるため、キ
ラー細胞の同定か可能になる。この同定か実現すれば実
に多くの利用範囲か生じる。すなわち、各種疾患におけ
るキラー細胞の働きを各患部免疫組織染色により同定す
ることができる。そうすることにより、これまで原因か
わからなかった疾患の解明か可能になる。
ヒトバーフォリン分子と特異的に反応することから、種
々の用途かある。すなわち、バーフォリン分子はキラー
細胞か特異的に発現しているタンパク質であるため、キ
ラー細胞の同定か可能になる。この同定か実現すれば実
に多くの利用範囲か生じる。すなわち、各種疾患におけ
るキラー細胞の働きを各患部免疫組織染色により同定す
ることができる。そうすることにより、これまで原因か
わからなかった疾患の解明か可能になる。
また、移植における拒絶反応は、キラーＴ細胞か移植さ
れた組織を破壊することによって生しる。
れた組織を破壊することによって生しる。
この拒絶反応において、パーフォソン免疫ｉｆｆ織染色
を、本モノクローナル抗体を用いることにより可能とす
れば、拒絶反応のメカニズムを知るうえても重要な知見
か得られることはまちかいない。
を、本モノクローナル抗体を用いることにより可能とす
れば、拒絶反応のメカニズムを知るうえても重要な知見
か得られることはまちかいない。
さらに拒絶反応の主反応かパーフォリンによるものであ
ると判明すれば、パーフォリンに反応する本モノクロー
ナル抗体を移植的に投与することで、拒絶反応をおさえ
ることができ、移植か高確率で成功する可能性が高い。
ると判明すれば、パーフォリンに反応する本モノクロー
ナル抗体を移植的に投与することで、拒絶反応をおさえ
ることができ、移植か高確率で成功する可能性が高い。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。
実施例Ｉ
Ｃ−１）ヒトバーフォリン部分タンパク質をコードする
遺伝子を挿入した発現ベクター及び大腸菌形質転換菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＣ−３，１ｙｓｓ）の調製第１図に示すヒト
パーフォリン遺伝子において、２９７１目のアミノ酸か
ら４６３番目のアミノ酸をフードするｃＤＮＡを制限酵
素にて切り呂した。
遺伝子を挿入した発現ベクター及び大腸菌形質転換菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＣ−３，１ｙｓｓ）の調製第１図に示すヒト
パーフォリン遺伝子において、２９７１目のアミノ酸か
ら４６３番目のアミノ酸をフードするｃＤＮＡを制限酵
素にて切り呂した。
制限酵素５ａｕ３Ａは塩基配列ＧＡＴＣを認識して１非
仝８Ｈのように切断する。この酵素を用いると、ヒトパ
ーフォリン遺伝子はアミノ酸配列でいえば２９７番目の
アミノ酸の１個前の塩基から４６３番目のアミノ酸の１
個後の塩基までを切り出すことかできた。具体的には、
ヒトパーフォリン遺伝子を組み込んたＢ Ｉｕｅｓｃｒ
ｉｐｔヘクター（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ製）（１μｇ
／μＱ） １ ｔｔ（ｌに制限酵素５ａｕ３Ａ（１０Ｕ
／ｍ（）１ ｔｔＱと制限酵素用Ｈ緩衝液（宝酒造）１
μＱと蒸留水６μＱを加えて、３７°Ｃにて一夜反応さ
せることにより、分解した。
仝８Ｈのように切断する。この酵素を用いると、ヒトパ
ーフォリン遺伝子はアミノ酸配列でいえば２９７番目の
アミノ酸の１個前の塩基から４６３番目のアミノ酸の１
個後の塩基までを切り出すことかできた。具体的には、
ヒトパーフォリン遺伝子を組み込んたＢ Ｉｕｅｓｃｒ
ｉｐｔヘクター（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ製）（１μｇ
／μＱ） １ ｔｔ（ｌに制限酵素５ａｕ３Ａ（１０Ｕ
／ｍ（）１ ｔｔＱと制限酵素用Ｈ緩衝液（宝酒造）１
μＱと蒸留水６μＱを加えて、３７°Ｃにて一夜反応さ
せることにより、分解した。
これを、１％のＬＭＰアガロースケル（ＢＲＬ製）を用
いて、ＴＡＥ緩衝液のもと、３ｏ分電気泳動した。エチ
ジウムブロマイドにてＤＮＡを染色した後、ＵＶモニタ
ー下で約５００ｂｐの塩基からなるヒトパーフォリン遺
伝子の５ａｕ３Ａ分解画分をカッターで切り出した。重
さの２．５倍量のＴＡＢに懸濁し、６５℃にてゲルを溶
かした。これを６５°Ｃにあたためた水飽和フェノール
で抽出した。このフェノール抽出を３回行った後、クロ
ロホルム抽出を２回行った。さらに１／１０量の３Ｍ凡
ａＯＡｃ緩衝液、２５倍量のエタノール、及びｌμＣの
ＭＧ（２０ｍｇ／ｉのを加え、−８０°Ｃにて３０分放
置することにより、Ｄ Ｎ Ａを沈澱させた。１５００
０ ｒｐｍて５分間遠心することによりＤＮＡを沈澱さ
せ、ＴＥ緩衝液２０μＱに再度溶解した。
いて、ＴＡＥ緩衝液のもと、３ｏ分電気泳動した。エチ
ジウムブロマイドにてＤＮＡを染色した後、ＵＶモニタ
ー下で約５００ｂｐの塩基からなるヒトパーフォリン遺
伝子の５ａｕ３Ａ分解画分をカッターで切り出した。重
さの２．５倍量のＴＡＢに懸濁し、６５℃にてゲルを溶
かした。これを６５°Ｃにあたためた水飽和フェノール
で抽出した。このフェノール抽出を３回行った後、クロ
ロホルム抽出を２回行った。さらに１／１０量の３Ｍ凡
ａＯＡｃ緩衝液、２５倍量のエタノール、及びｌμＣの
ＭＧ（２０ｍｇ／ｉのを加え、−８０°Ｃにて３０分放
置することにより、Ｄ Ｎ Ａを沈澱させた。１５００
０ ｒｐｍて５分間遠心することによりＤＮＡを沈澱さ
せ、ＴＥ緩衝液２０μＱに再度溶解した。
このヒトパーフォリン５ａｕ３Ａ部分遺伝子を発現ヘク
ターｐＥＴ３Ｃ（ローセンバーブ、ＢＮＬＮホラトリー
）に組みこんた。ｐＥ Ｔ ３ Ｃは第２図Ａに示すよ
うな、タンパク質のコート開始領域を示す特徴を持つヘ
クターで、詳しくは、ローセンバーブ等のＧｅｎｅ、５
６，１２５−１３５．１９８７に記載されている。ｐＥ
Ｔ ３ Ｃはタンパク質の開始のアミノ酸から１２番
目のところに制限酵素ＢａｍＨＩて切り出される部分が
ある。ＢａｍＨＩにより切り出された部分の塩基配列は
ＧＡＴＣであり、５ａｕ３Ａにて切り出されたヒトバー
フォリン遺伝子の両端に相補性かある。そこて、ｐＥＴ
３Ｃ１μ９に、制限酵素ＢａｍＨ１１μＱと制限酵素に
緩衝液（宝酒造）１μＱと蒸留水６μａ加えて３７°Ｃ
にて一夜反応させ、線状化（環状を一本鎖にすること）
した。
ターｐＥＴ３Ｃ（ローセンバーブ、ＢＮＬＮホラトリー
）に組みこんた。ｐＥ Ｔ ３ Ｃは第２図Ａに示すよ
うな、タンパク質のコート開始領域を示す特徴を持つヘ
クターで、詳しくは、ローセンバーブ等のＧｅｎｅ、５
６，１２５−１３５．１９８７に記載されている。ｐＥ
Ｔ ３ Ｃはタンパク質の開始のアミノ酸から１２番
目のところに制限酵素ＢａｍＨＩて切り出される部分が
ある。ＢａｍＨＩにより切り出された部分の塩基配列は
ＧＡＴＣであり、５ａｕ３Ａにて切り出されたヒトバー
フォリン遺伝子の両端に相補性かある。そこて、ｐＥＴ
３Ｃ１μ９に、制限酵素ＢａｍＨ１１μＱと制限酵素に
緩衝液（宝酒造）１μＱと蒸留水６μａ加えて３７°Ｃ
にて一夜反応させ、線状化（環状を一本鎖にすること）
した。
次に、エタノールを３０μＱ添加し、−８０’Ｃにて２
時間放置し、ｐＥ Ｔ ３ Ｃベクターを１５，０００
ｒｐｍ、１５分の遠心により回収した。蒸留水２μＣ
に溶解後、アルカリホスファターセ（Ｃａｌｆｉｎｔｅ
ｓｔｉｎｅ宝酒造）０．１ μｇ（１０１，／μのにト
リス緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｌ ｐＨ
８，３，１０ｍＭ ＺｎＣｇ２．１０ ｍＭ ＭｇＣｃ
ｔ） １ ｕσに蒸留水７μＱを加え、３７℃にて３０
分反応させた。
時間放置し、ｐＥ Ｔ ３ Ｃベクターを１５，０００
ｒｐｍ、１５分の遠心により回収した。蒸留水２μＣ
に溶解後、アルカリホスファターセ（Ｃａｌｆｉｎｔｅ
ｓｔｉｎｅ宝酒造）０．１ μｇ（１０１，／μのにト
リス緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｌ ｐＨ
８，３，１０ｍＭ ＺｎＣｇ２．１０ ｍＭ ＭｇＣｃ
ｔ） １ ｕσに蒸留水７μＱを加え、３７℃にて３０
分反応させた。
その後、ブロテイナーゼＫ（ペーリンガーマンノ＼イム
製） １ ｔｔ Ｑ（１０ｔｔ＋９／＋Ｑ）を加え、さ
らに３７°Ｃで３０分反応させた。その後、水飽和フェ
ノールでの抽出を行い、さらにエタノール沈殿を行った
。
製） １ ｔｔ Ｑ（１０ｔｔ＋９／＋Ｑ）を加え、さ
らに３７°Ｃで３０分反応させた。その後、水飽和フェ
ノールでの抽出を行い、さらにエタノール沈殿を行った
。
最終的に脱リン酸化した一本鎖ｐＥ ７３ Ｃベクター
を得た。
を得た。
次に、５ａｕ３Ａで分解したヒトパーフォリン部分遺伝
子（１μ９／μの１μＱと一本鎖の脱リン酸化ＢａｍＨ
Ｉ切断ｐＥＴ３Ｃ（１ｔｔ９／１ｔＱ）１ ｔｔ（ｌに
５×リ力−セ緩衝液ｌμｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ（３５
Ｕ／μｇ）１μｇに蒸留水５μＱを加え、室温にて１時
間反応させることにより、ヒトパーフォリン５ａｕ３Ａ
分解部分遺伝子をｐＥ７３Ｃに挿入した。
子（１μ９／μの１μＱと一本鎖の脱リン酸化ＢａｍＨ
Ｉ切断ｐＥＴ３Ｃ（１ｔｔ９／１ｔＱ）１ ｔｔ（ｌに
５×リ力−セ緩衝液ｌμｇとＴ４ＤＮＡリガーゼ（３５
Ｕ／μｇ）１μｇに蒸留水５μＱを加え、室温にて１時
間反応させることにより、ヒトパーフォリン５ａｕ３Ａ
分解部分遺伝子をｐＥ７３Ｃに挿入した。
次にこのヒトパーフォリン部分遺伝子を挿入した発現ヘ
クター（ＰＦＰ−ｐＥＴ３Ｃ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＣ
−３，１ｙｓｓ）に組みこみ、ＢＬ２１を形質転換した
。コンピテントになったＢＬ２１を用いた。コンピテン
ト細胞の調製は常法に従った（Ｍａｎｉａｔｉｓ らＭ
ｏ１ｅｃｕｌｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ２ ｎｄ ｅｄ
ｉｔｉＯｎ参照）。このコンピテントＢＬ２１ １ＸＩ
Ｏ’個にＰＰＰ−ＰＥＴ３Ｃ（１０μ９＞ １００μＣ
加え、水浴下で３０分放置した。その後３７°Ｃで５分
インキュベーションを行い、ＬＢ培地（トリプトン１０
ｇ／ρ、酵母エキス５９／１２、ＮａＣｌ２１０９／（
１’）１ｉＣ加え、さらに３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。３０００ ｒｐｍで１分間遠心分離すること
によりＢＬ２１を回収し、再度ＬＢ培地１００１１（２
を加えた。これを、アンビンリンを加えたＬＢ寒天のプ
レートにまき、ふえてくるＢＬ２１を数個選択した。こ
れらＢＬ２１形質転換体について、２ｙｔ（ｌのＬＢ培
地て培養し、その後アルカリ法にてプラスミドＤＮＡを
調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、ＭＯｌｅｃｕｌｏｒ
ＣＩｏｎｉｎｇ参照）。ＢａｍＨＩ分解後、１％アガ
ロースゲル電気泳動によりヒトパ−フォリン部分遺伝子
か挿入されたＢＬ２１形質転換体を選択した。
クター（ＰＦＰ−ｐＥＴ３Ｃ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＣ
−３，１ｙｓｓ）に組みこみ、ＢＬ２１を形質転換した
。コンピテントになったＢＬ２１を用いた。コンピテン
ト細胞の調製は常法に従った（Ｍａｎｉａｔｉｓ らＭ
ｏ１ｅｃｕｌｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ２ ｎｄ ｅｄ
ｉｔｉＯｎ参照）。このコンピテントＢＬ２１ １ＸＩ
Ｏ’個にＰＰＰ−ＰＥＴ３Ｃ（１０μ９＞ １００μＣ
加え、水浴下で３０分放置した。その後３７°Ｃで５分
インキュベーションを行い、ＬＢ培地（トリプトン１０
ｇ／ρ、酵母エキス５９／１２、ＮａＣｌ２１０９／（
１’）１ｉＣ加え、さらに３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。３０００ ｒｐｍで１分間遠心分離すること
によりＢＬ２１を回収し、再度ＬＢ培地１００１１（２
を加えた。これを、アンビンリンを加えたＬＢ寒天のプ
レートにまき、ふえてくるＢＬ２１を数個選択した。こ
れらＢＬ２１形質転換体について、２ｙｔ（ｌのＬＢ培
地て培養し、その後アルカリ法にてプラスミドＤＮＡを
調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、ＭＯｌｅｃｕｌｏｒ
ＣＩｏｎｉｎｇ参照）。ＢａｍＨＩ分解後、１％アガ
ロースゲル電気泳動によりヒトパ−フォリン部分遺伝子
か挿入されたＢＬ２１形質転換体を選択した。
（２）ヒトパーフォリン部分タンパク質の調製このヒト
バーフォリンタンパク質をコードする遺伝子を発現ヘク
ターに組みこんた大腸菌ＢＬ２１形質転換体を２．５Ｒ
ρのＬＢ培地（アンピシリン１５０μ９／村含）に植え
、３７°Ｃて一夜培養した。
バーフォリンタンパク質をコードする遺伝子を発現ヘク
ターに組みこんた大腸菌ＢＬ２１形質転換体を２．５Ｒ
ρのＬＢ培地（アンピシリン１５０μ９／村含）に植え
、３７°Ｃて一夜培養した。
その後、２５０ｊＩＱのＬＢ培地（アンピシリン１５０
μ９／ｚＱ’）にこれを植えつぎ、ＯＤ、、、＝ ０．
６になるまで２〜２．５時間培養した。Ｉ ＰＴＧを最
終的に０．４ｍＭ加え、さらに３時間培養した。６００
０ ｒｐｍ、５分の遠心分離により大腸菌を回収した。
μ９／ｚＱ’）にこれを植えつぎ、ＯＤ、、、＝ ０．
６になるまで２〜２．５時間培養した。Ｉ ＰＴＧを最
終的に０．４ｍＭ加え、さらに３時間培養した。６００
０ ｒｐｍ、５分の遠心分離により大腸菌を回収した。
上清液を除去した。大腸菌のペレ・ノドに５ｙＱ（Ｄ緩
衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣＱ ｐＨ８，２ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭＤ １ｍＭ ＰＭＳＦ、５％グリセ
ロール）を加え、よく撹拌した。
衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣＱ ｐＨ８，２ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭＤ １ｍＭ ＰＭＳＦ、５％グリセ
ロール）を加え、よく撹拌した。
これに最終濃度か０ 、２ ｍｙ／ｍ（ｌになるように
リゾチーム（ングマ社製）を加え、Ｏ′Ｃにて３０分静
置した。超音波（ＳＯＮＦＩＥＲＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵ
ＰＴＯＲ２００，ＢＲＡＮＳＯＮ製）により細胞を破壊
した（１５５×１０）。
リゾチーム（ングマ社製）を加え、Ｏ′Ｃにて３０分静
置した。超音波（ＳＯＮＦＩＥＲＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵ
ＰＴＯＲ２００，ＢＲＡＮＳＯＮ製）により細胞を破壊
した（１５５×１０）。
さらに、トリトンＸ−１００を最終濃度か０゜５％にな
るように加え、０℃にて２０分静置した。
るように加え、０℃にて２０分静置した。
その後、１０，０００ｇ、４５分、４℃にて遠心分離し
、融合ヒトパーフォリン部分タンパク質の粗抽出液を回
収した。この融合ヒトパーフォリン部分タンパク質の粗
抽出液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動法を
用いて分離した後、１９８にクルトンの融合ヒトパーフ
ォリン部分タンパク質を回収した。
、融合ヒトパーフォリン部分タンパク質の粗抽出液を回
収した。この融合ヒトパーフォリン部分タンパク質の粗
抽出液を５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動法を
用いて分離した後、１９８にクルトンの融合ヒトパーフ
ォリン部分タンパク質を回収した。
（３）モノクローナル抗体の作製
Ａ、免疫感作
上記実施例１−（２）で得た融合ヒトパーフォリン部分
タンパク質（５０μ９）を完全フロインドアジュバント
と１：１の比で混合して乳濁化させ、これをＢａ１ｂ／
ｃマウス（チャールズリハー）の肉跳に注射した。次い
て６日目、９日目に融合ヒトパーフォリン部分タンパク
質５０μ９を同一マウスの肉２ｍに注射することにより
免疫を感作した。
タンパク質（５０μ９）を完全フロインドアジュバント
と１：１の比で混合して乳濁化させ、これをＢａ１ｂ／
ｃマウス（チャールズリハー）の肉跳に注射した。次い
て６日目、９日目に融合ヒトパーフォリン部分タンパク
質５０μ９を同一マウスの肉２ｍに注射することにより
免疫を感作した。
Ｂ 融合
最終免疫３日後に上記マウス２匹からリンパ節を取り出
した。両足のそけい部から取り出したリンパ節を、細断
後、メノンユでろ過し、ＲＰ〜１１１６４０培地に浮遊
させ、リンパ節細胞を８×１０’個得た。このリンパ節
細胞とマウス由来の８−アサグアニン耐性株（ヒポキサ
ンチングアニンホスホリホ／ルトランスフェラーセ欠損
株）ＰＡｌ、１．３Ｘ１０７と約６＝１の割合で混合し
、遠心した（１５００ｒｐｍ５分）。得られた沈澱に５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）／
、ＲＰＭ１１６４０溶液３ｙｉＱを３７°Ｃ１温水中で
撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭ１１
６４０液１５ｘｆｆを撹拌しなから６分間を要して加え
、細胞融合を行った。融合後、大量のＲＰＭ１１６４０
を加え、遠心（１５００ｒｐｍ、 ５分）して上清を除
去した。次いでヒボキサンチン（ｌＯＯμＭ）、アミノ
プテリン（０，４μＭ）、チミジン（１０μＭ）を含む
１５％Ｎｕ−血清−ＲＰＭ１１６４０培地（ＨＡＴ培地
）にてリンパ節細胞かｌＸ１０＠／ｊＩＱになるように
調製した。
した。両足のそけい部から取り出したリンパ節を、細断
後、メノンユでろ過し、ＲＰ〜１１１６４０培地に浮遊
させ、リンパ節細胞を８×１０’個得た。このリンパ節
細胞とマウス由来の８−アサグアニン耐性株（ヒポキサ
ンチングアニンホスホリホ／ルトランスフェラーセ欠損
株）ＰＡｌ、１．３Ｘ１０７と約６＝１の割合で混合し
、遠心した（１５００ｒｐｍ５分）。得られた沈澱に５
０％ポリエチレングリコール４０００（メルク社製）／
、ＲＰＭ１１６４０溶液３ｙｉＱを３７°Ｃ１温水中で
撹拌しながら１分間を要して加えた。これにＲＰＭ１１
６４０液１５ｘｆｆを撹拌しなから６分間を要して加え
、細胞融合を行った。融合後、大量のＲＰＭ１１６４０
を加え、遠心（１５００ｒｐｍ、 ５分）して上清を除
去した。次いでヒボキサンチン（ｌＯＯμＭ）、アミノ
プテリン（０，４μＭ）、チミジン（１０μＭ）を含む
１５％Ｎｕ−血清−ＲＰＭ１１６４０培地（ＨＡＴ培地
）にてリンパ節細胞かｌＸ１０＠／ｊＩＱになるように
調製した。
Ｃ，ハイブリドーマの選択
上記Ｂで調製した細胞浮遊液を９６ウ工ルマイクロプレ
ート５枚に２００μρずつ分注し、３７°Ｃ１炭酸ガス
５％下にあるｃｏ、インキュベーターで細胞を培養した
。６日後にはハイブリトーマのみがコロニーを形成して
増殖していることが確認できた。
ート５枚に２００μρずつ分注し、３７°Ｃ１炭酸ガス
５％下にあるｃｏ、インキュベーターで細胞を培養した
。６日後にはハイブリトーマのみがコロニーを形成して
増殖していることが確認できた。
Ｄ、抗体の検出
ハイブリドーマが十分に増殖していることが確認された
ので、その培養上清を行い、以下に示す酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）にて抗体の検出を行った。融合ヒトパー
フォリン部分タンパク質を発現・生産している大腸菌の
細胞溶解液（粗抽出液）５．３２ｍ１Ｆ／ｉ１２および
融合ヒトパーフォリン部分タンパク質を発現生産してい
ない大腸菌の細胞溶解液（粗抽出液２ 、１ ｏ／ｘ１
２）ソれぞれ５０μ（ｌずつ別々のアッセイ用プレート
（ダイナチック イムロン２）に分注し、この抗原を固
定した。（４°Ｃ／−夜）。次いて、抗原液を除去し、
ブロッキング液（フロックエース：大日本製薬社製）を
加えてブロッキングした。これら２種のアッセイプレー
トにハイブリトーマの培養上清５０μＱを分注し、室温
にて１時間反応させた。０．０５％Ｔ ｗｅｅｎ ２０
を含んだＰＢＳでプレートを洗浄した後、ベルオ牛シタ
ーセ（西洋ワサビ、ＨＲＰ）で標識した抗マウスＩｇ抗
体のＦ （ａｂ）’ ｔフラグメント（アマジャム製）
を１０００倍希釈した液５０μＣを加え、結合させた（
室温１時間）。その後もう１度ＰＢＳで洗浄した後、０
−フ二二レンジアミン（０，４Ｒ９／ｍａ＞、過酸化水
素水０．０１２％を含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ
５，０）１００μＱをプレートに加え、発色反応によっ
て抗体を検出した。その際、融合ヒトパーフォリン部分
タンパク質を含む大腸菌溶解液に反応し、含まない大腸
菌溶解液に反応しない抗体を産生じているウェルを選択
した。
ので、その培養上清を行い、以下に示す酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）にて抗体の検出を行った。融合ヒトパー
フォリン部分タンパク質を発現・生産している大腸菌の
細胞溶解液（粗抽出液）５．３２ｍ１Ｆ／ｉ１２および
融合ヒトパーフォリン部分タンパク質を発現生産してい
ない大腸菌の細胞溶解液（粗抽出液２ 、１ ｏ／ｘ１
２）ソれぞれ５０μ（ｌずつ別々のアッセイ用プレート
（ダイナチック イムロン２）に分注し、この抗原を固
定した。（４°Ｃ／−夜）。次いて、抗原液を除去し、
ブロッキング液（フロックエース：大日本製薬社製）を
加えてブロッキングした。これら２種のアッセイプレー
トにハイブリトーマの培養上清５０μＱを分注し、室温
にて１時間反応させた。０．０５％Ｔ ｗｅｅｎ ２０
を含んだＰＢＳでプレートを洗浄した後、ベルオ牛シタ
ーセ（西洋ワサビ、ＨＲＰ）で標識した抗マウスＩｇ抗
体のＦ （ａｂ）’ ｔフラグメント（アマジャム製）
を１０００倍希釈した液５０μＣを加え、結合させた（
室温１時間）。その後もう１度ＰＢＳで洗浄した後、０
−フ二二レンジアミン（０，４Ｒ９／ｍａ＞、過酸化水
素水０．０１２％を含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ
５，０）１００μＱをプレートに加え、発色反応によっ
て抗体を検出した。その際、融合ヒトパーフォリン部分
タンパク質を含む大腸菌溶解液に反応し、含まない大腸
菌溶解液に反応しない抗体を産生じているウェルを選択
した。
Ｅ、クローニング
上記（Ｄ）で選択したウェルて増殖しているハイブリト
ーマを限界希釈法でクローニングした。
ーマを限界希釈法でクローニングした。
希釈後の細胞濃度か０５個／ウェルとなるように１５％
Ｎｕ−血清−ＲＰＭ１１６４０培地て希釈し、９６ウエ
ルマイクロフレートに２００μａずつ分注した。３７°
Ｃ１５％Ｃ○２存在下で培養を行った。コロニーかある
程度の大きさになってから、上記ヒトパーフォリン部分
タンパク質に対する抗体か産生されているかとうかをも
う一度（Ｄ）の酵素免疫測定法で調べた。ヒトパーフォ
リン部分タンパク質に強く反応したウェルのハイブリト
ーマを、上述と同様にしてもう一度限界希釈法でクロー
ニングした。
Ｎｕ−血清−ＲＰＭ１１６４０培地て希釈し、９６ウエ
ルマイクロフレートに２００μａずつ分注した。３７°
Ｃ１５％Ｃ○２存在下で培養を行った。コロニーかある
程度の大きさになってから、上記ヒトパーフォリン部分
タンパク質に対する抗体か産生されているかとうかをも
う一度（Ｄ）の酵素免疫測定法で調べた。ヒトパーフォ
リン部分タンパク質に強く反応したウェルのハイブリト
ーマを、上述と同様にしてもう一度限界希釈法でクロー
ニングした。
Ｆ、ヒトバーフォリンタンパク質との反応性次に、上で
得られたハイブリドーマが産生ずる抗体かヒトパーフォ
リンタンパク質と反応するかとうかについて、免疫組織
染色法にて測定した。
得られたハイブリドーマが産生ずる抗体かヒトパーフォ
リンタンパク質と反応するかとうかについて、免疫組織
染色法にて測定した。
■ヒト末梢血リンパ球＊１及びＩ Ｌ−２て活性化した
ヒトＬＡＫ細胞＊２をサイトスピン２（シャントン社製
）を用いてスライドグラスに固定した。
ヒトＬＡＫ細胞＊２をサイトスピン２（シャントン社製
）を用いてスライドグラスに固定した。
注＊ｌヒト末梢血リンパ球は健常人ヒト末梢血からＢ
ｏｙｕｍ、 Ｓ ｃａｎｄ、 Ｊ 、 ＣＩｉｎ、 Ｌ
ａｂ のＬｎｒｅｓｔ２１（Ｓｕｐｐｌ、９７）；
７７．１９６８の技術に従い、セパレートＬ（ムトー化
学）比重遠心分離法により単離した。
ｏｙｕｍ、 Ｓ ｃａｎｄ、 Ｊ 、 ＣＩｉｎ、 Ｌ
ａｂ のＬｎｒｅｓｔ２１（Ｓｕｐｐｌ、９７）；
７７．１９６８の技術に従い、セパレートＬ（ムトー化
学）比重遠心分離法により単離した。
注＊２ＬＡＫ細胞は＊１て単離したヒト末梢血リンパ球
ヒトＩＬ−２（ジオツキ）１００ＯＵ／ｚＱ含む１０％
ＦＣ３−ＲＰＭＩ １６４０培地で４日間培養したもの
を用いた。
ヒトＩＬ−２（ジオツキ）１００ＯＵ／ｚＱ含む１０％
ＦＣ３−ＲＰＭＩ １６４０培地で４日間培養したもの
を用いた。
■上記固定したプレートを一２０℃で冷却したアセトン
溶液に３分間入れて、固定し、さらに４％バラホルムア
ルデヒド／ＰＢＳ溶Ｍに１分間入れ、固定を完了した。
溶液に３分間入れて、固定し、さらに４％バラホルムア
ルデヒド／ＰＢＳ溶Ｍに１分間入れ、固定を完了した。
０５０ｍＭ）リス−ＨＣρｐ８７．６に５分間浸し、２
回洗浄した。
回洗浄した。
■蒸留水に溶かした０、５％過ヨード酸溶液に１０分間
浸し、変性させた。
浸し、変性させた。
■再度５０ｍＭ）リス−ＨＣｆｆｐＨ７，６にて洗浄し
た（５分Ｘ２）。
た（５分Ｘ２）。
■０３％過酸化水素水／メタノールに９漬し、細胞内に
存在するベルオキシターセを不活化した。
存在するベルオキシターセを不活化した。
■トリスーＨＣ（にて洗＃（２回）。
■ウサキ血清を１％ＢＳＡ牛血清アルブミンＰＢＳにて
５０倍に希釈したものを５０μａずつ固定化した細胞に
分注し、ブロッキングを行った（室温３０分）。
５０倍に希釈したものを５０μａずつ固定化した細胞に
分注し、ブロッキングを行った（室温３０分）。
■上記（Ｅ）にて取得したハイブリドーマの培養上清を
１００μｇ加え、室温にて１時間反応した。
１００μｇ加え、室温にて１時間反応した。
［相］トリス−ＨＣ＋２にて洗浄（３回）。
■ビオチン標識した抗マウスＩｇＧ（Ｈ十Ｌ）（ベクタ
ー製）を１００倍に希釈したものを細胞に５０μＱ加え
、室温で１時間反応した。
ー製）を１００倍に希釈したものを細胞に５０μＱ加え
、室温で１時間反応した。
■トリスーＨＣＣ処理（３回）。
［相］ベクタスティンのＡＢＣキットエリート（ベクタ
ー社製）を用いて酵素（ペルオキシダーゼ）を結合させ
たく室温３０分）。
ー社製）を用いて酵素（ペルオキシダーゼ）を結合させ
たく室温３０分）。
■トリスーＨＣＣ処理（３回）。
■ジアミノベンジジン（ドータイト社製）２０ｕ、３０
％過酸化水素水ｌＯμｇ含む５０ｍＭ ト’ＪスＨＣ
Ｑ ｐＨ７，６溶０．１００ μにｉＬ、発色反応させ
た。
％過酸化水素水ｌＯμｇ含む５０ｍＭ ト’ＪスＨＣ
Ｑ ｐＨ７，６溶０．１００ μにｉＬ、発色反応させ
た。
こうして、（Ｅ）で選択したハイブリドーマの中でヒト
末梢血リンパ球およびＬＡＫ細胞の一部の細胞の細胞内
顆粒に存在するバーフォリンを選択的に染色することの
できる抗体を産生じているハイブリドーマ２種を選択し
た。この様にして得た２種のハイブリドーマ（ハイブリ
ドーマＭＰＦＰ１およびＭＰＦＰ−２）は同一種と考え
られる。
末梢血リンパ球およびＬＡＫ細胞の一部の細胞の細胞内
顆粒に存在するバーフォリンを選択的に染色することの
できる抗体を産生じているハイブリドーマ２種を選択し
た。この様にして得た２種のハイブリドーマ（ハイブリ
ドーマＭＰＦＰ１およびＭＰＦＰ−２）は同一種と考え
られる。
尚、ハイブリドーマＭＰＦＰ−１は、工業技術院微生物
工業技術研究所に受託番号：微工研菌寄第１１６６９号
で寄託されている（受託日：平成２年８月２０日）。
工業技術研究所に受託番号：微工研菌寄第１１６６９号
で寄託されている（受託日：平成２年８月２０日）。
この様にして得られたハイブリドーマそれぞれＩ Ｘ
１０’個をＧＩＴ培地（和光純薬製）ＩＯＣ）ｙＱにて
３日間培養した。その後、１５００ｒｐｍ、 ５分遠心
分離することにより、培養上澄液を回収した。この培養
上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ｍａｂｔｒａｐ
Ｇファルマシア製）にて精製し、抗体を得た。
１０’個をＧＩＴ培地（和光純薬製）ＩＯＣ）ｙＱにて
３日間培養した。その後、１５００ｒｐｍ、 ５分遠心
分離することにより、培養上澄液を回収した。この培養
上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ｍａｂｔｒａｐ
Ｇファルマシア製）にて精製し、抗体を得た。
この抗体５μ９について、１０％の５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドケルにて電気泳動を行った。ソノ後、クマンー
ブリリアントブルーによりタンパク質を染色し、得られ
た抗体を分析した。その結果、２つのハイブリトーマと
もに、分子量約５万からなる抗体のＨ鎖および分子量約
２５万の抗体のし鎖からなるＩｇＧであることを確認し
た。第３図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳
動の結果て、Ａは分子量マーカー（９０Ｋ、６７Ｋ、４
３Ｋ、３０に、２０Ｋ）、Ｂ、ＣＪ＜、取得シタハイブ
リドーマＭＰＦＰ−１および２かそれぞれ産生ずる抗体
である。
ルアミドケルにて電気泳動を行った。ソノ後、クマンー
ブリリアントブルーによりタンパク質を染色し、得られ
た抗体を分析した。その結果、２つのハイブリトーマと
もに、分子量約５万からなる抗体のＨ鎖および分子量約
２５万の抗体のし鎖からなるＩｇＧであることを確認し
た。第３図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳
動の結果て、Ａは分子量マーカー（９０Ｋ、６７Ｋ、４
３Ｋ、３０に、２０Ｋ）、Ｂ、ＣＪ＜、取得シタハイブ
リドーマＭＰＦＰ−１および２かそれぞれ産生ずる抗体
である。
（Ｇ）抗体のサブクラスの決定
抗マウス抗体［抗Ｉ ｇＧ Ｉ＋ Ｉ ｇＧ ２−９Ｉ
ｇＧ ２ ｂＩ ｇｃ ３＋ Ｉ ｇＭ、 Ｉ ｇＭ
］及び抗マウスＬ鎖抗体［抗Ｋ。
ｇＧ ２ ｂＩ ｇｃ ３＋ Ｉ ｇＭ、 Ｉ ｇＭ
］及び抗マウスＬ鎖抗体［抗Ｋ。
λコ（ＭＡＢ−アイソタイプキット Ｐ ｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ社製）とハイブリドーマの培養上清中の抗ヒトパ
ーフォリンモノクローナル抗体とを反応させる酵素免疫
測定法によって、得られた２種のハイブリトーマが産生
ずる抗体のサブクラスを決定した。その結果、いずれも
抗ＩｇＧ２ｂを入れた場所及び抗に鎖抗体を入れた場所
のみ発色か認められ、ＩｇＧ２ｂ、ＫＰＭのし鎖を持つ
モノクローナル抗体を産生ずる株であることかわかった
。
ｇｅｎ社製）とハイブリドーマの培養上清中の抗ヒトパ
ーフォリンモノクローナル抗体とを反応させる酵素免疫
測定法によって、得られた２種のハイブリトーマが産生
ずる抗体のサブクラスを決定した。その結果、いずれも
抗ＩｇＧ２ｂを入れた場所及び抗に鎖抗体を入れた場所
のみ発色か認められ、ＩｇＧ２ｂ、ＫＰＭのし鎖を持つ
モノクローナル抗体を産生ずる株であることかわかった
。
第１図はヒトバーフォリンをコードする塩基配列および
対応するアミノ酸配列を示す模式図、第２図Ａは発現ヘ
クターｐＥ Ｔ ３ Ｃの模式図、第２図Ｂは第２図Ａ
のクローニンク部位と記載した部位の上流側の３”末端
に存在する３５塩基対を示す模式図、第３図は本発明に
係るモノクローナル抗体の電気泳動の結果を示す模式図
であり、Ａはマーカー、ＢはハイブリトーマＭＰＦＰ−
１の産生ずる抗体、ＣはＭＰＦＰ−２の産生ずる抗体を
示す。 特許出願人 住友電気工業株式会社 代理 人弁理士青白葆 はか１名 第１図−１ ＣＴＧ ＧＧＣＡＴＣＣＴＴ ＣＴＣＣＴＧ Ｃ
ＴＧ ＣＴＧ ＣＣＣＣＴＧ ＣＣＣＣＴＣＣＣＴ
ＧＣＣ６３Ｌｓｕ Ｇｌｙ ｌｌｅ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ ＬＩＩｕ Ｌｓｕ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｌａｕ ’Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ＠ Ｇｌｙ １・ Ｈ＋ｉ Ｇｌｙ Ｓ＠ｒ ｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ第１図−２ ＴＴＣＣＡＣＣＡＡ ＡＣＣ丁ＡＣＣＧＧ ＧＡＧ
ＣＧＣＣＡＴ ＴＣＧ ＧＡＡ ＧＴＧ Ｇ
ＴＴ ＧＧＣＧＧＣＣＡＴ ＣＡＣＰｈａＨ１ｓＧ
ｌｆＩＴｈｒｒｙｒ＾ｒｇＧＬｕＡｒｇＨｉｓＳ＠ｒＧ
ｌｕＶａｌＶａｌＧｌｙＧｌｙ）ｌｉｓ＋−１ｉｓＣＣ
ＣＧＡＧ ＣＡＧ ＴＡＣＴＣＡ ＧＣＣＴＧＧ
ＣＴＡ ＡＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＣＣＣＧＧ
ＣＡＧＣＣＣＴ ＧＧＣＣＴＧρｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ ＴｒＤＶａｔ ＾ｚｎ’ｓ
ｅｒ匡Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｅρｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
コｌ０ ＴＴＣＴＴＴ ＧＧＴ ＧＧＣＣＡＧ ＧＡＧ
ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＣＧ ＡＧＣＡＣＣＧＴＧ
ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＴ ＡＡＣＡＡＣρｈｅ
Ｐｈｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＧｌｆＩ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖ
ａｌ 丁ｒｅ Ａｇｏ Ａｓｎ Ａｓｎ ＾
Ｓ０ＣＴＧ ＧＣＣＡＣＡ ＧＧＧ ＧＧＧ Ｃ
ＣＣＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴ
ＧＧ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣＴＣＴ ＧＧＣ
Ｌａｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＾「区 Ｌ＠ｕＧｌｎ Ｖａｌ
Ｔｅａ Ａｇｏ Ｇｌｎ ＾ｓｐ Ｓｅｔ
Ｇｌｙ６Ｇ ＾＾Ｇ ＴＣＴ ＧＧＴ ＴＣＣＣＡＴ ＧＡ
Ｇ ＧＴＧ ＡＧＡ ＴＧＣＡＡＣＣＴＧ ＡＡ
Ｔ ＣＡＴ ＧＧＣＣＡＣＣＴＡ ＡＡ＾Ｌｙｓ
ＳｅｒＧｌｙＳｓｒＨｉｓＧｌｕＶａｌ＾ｒＫＣｙｓＡ
ｓｎＬ＊ｕＡｓｎｌ−１ｉｓＧｌｙ＋−１喝５ＬｅｕＬ
ｙｓＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧ ＧＡＣＴＡＴ Ｇ
ＴＣＣＣＣＣＡＡ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＴＧ Ｇ
ＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＧ＾Ｇｌ、
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ＡＳ９ 丁ｙｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ ＧＩｎＭｅｔ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
ａ１７ Ａｓｎ Ａｒｇ ５ｅｒ ６１７ ＾
１１ ■−２０５３Ｏ 第２図Ａ 第３図 マーカー 第２図Ｂ １：１ａｍ ＨＩ フイト
対応するアミノ酸配列を示す模式図、第２図Ａは発現ヘ
クターｐＥ Ｔ ３ Ｃの模式図、第２図Ｂは第２図Ａ
のクローニンク部位と記載した部位の上流側の３”末端
に存在する３５塩基対を示す模式図、第３図は本発明に
係るモノクローナル抗体の電気泳動の結果を示す模式図
であり、Ａはマーカー、ＢはハイブリトーマＭＰＦＰ−
１の産生ずる抗体、ＣはＭＰＦＰ−２の産生ずる抗体を
示す。 特許出願人 住友電気工業株式会社 代理 人弁理士青白葆 はか１名 第１図−１ ＣＴＧ ＧＧＣＡＴＣＣＴＴ ＣＴＣＣＴＧ Ｃ
ＴＧ ＣＴＧ ＣＣＣＣＴＧ ＣＣＣＣＴＣＣＣＴ
ＧＣＣ６３Ｌｓｕ Ｇｌｙ ｌｌｅ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ ＬＩＩｕ Ｌｓｕ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｌａｕ ’Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ＠ Ｇｌｙ １・ Ｈ＋ｉ Ｇｌｙ Ｓ＠ｒ ｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ第１図−２ ＴＴＣＣＡＣＣＡＡ ＡＣＣ丁ＡＣＣＧＧ ＧＡＧ
ＣＧＣＣＡＴ ＴＣＧ ＧＡＡ ＧＴＧ Ｇ
ＴＴ ＧＧＣＧＧＣＣＡＴ ＣＡＣＰｈａＨ１ｓＧ
ｌｆＩＴｈｒｒｙｒ＾ｒｇＧＬｕＡｒｇＨｉｓＳ＠ｒＧ
ｌｕＶａｌＶａｌＧｌｙＧｌｙ）ｌｉｓ＋−１ｉｓＣＣ
ＣＧＡＧ ＣＡＧ ＴＡＣＴＣＡ ＧＣＣＴＧＧ
ＣＴＡ ＡＡＣＴＣＧ ＣＴＧ ＣＣＣＧＧ
ＣＡＧＣＣＣＴ ＧＧＣＣＴＧρｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ ＴｒＤＶａｔ ＾ｚｎ’ｓ
ｅｒ匡Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｅρｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
コｌ０ ＴＴＣＴＴＴ ＧＧＴ ＧＧＣＣＡＧ ＧＡＧ
ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＣＧ ＡＧＣＡＣＣＧＴＧ
ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＴ ＡＡＣＡＡＣρｈｅ
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Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖ
ａｌ 丁ｒｅ Ａｇｏ Ａｓｎ Ａｓｎ ＾
Ｓ０ＣＴＧ ＧＣＣＡＣＡ ＧＧＧ ＧＧＧ Ｃ
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Ｌａｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＾「区 Ｌ＠ｕＧｌｎ Ｖａｌ
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Ｇ ＧＴＧ ＡＧＡ ＴＧＣＡＡＣＣＴＧ ＡＡ
Ｔ ＣＡＴ ＧＧＣＣＡＣＣＴＡ ＡＡ＾Ｌｙｓ
ＳｅｒＧｌｙＳｓｒＨｉｓＧｌｕＶａｌ＾ｒＫＣｙｓＡ
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ｙｓＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧ ＧＡＣＴＡＴ Ｇ
ＴＣＣＣＣＣＡＡ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＴＧ Ｇ
ＧＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＧ＾Ｇｌ、
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Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
ａ１７ Ａｓｎ Ａｒｇ ５ｅｒ ６１７ ＾
１１ ■−２０５３Ｏ 第２図Ａ 第３図 マーカー 第２図Ｂ １：１ａｍ ＨＩ フイト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトパーフォリンタンパク質の２９７番目から４６
３番目までのアミノ酸をコードする塩基配列を、以下の
配列式。 【遺伝子配列があります】 で示される３５塩基を持つ発現ベクターｐＥＴ３ＣのＢ
ａｍＨＩサイトに組み込み、得られたベクターで大腸菌
を形質転換し、該形質転換体に生産させた融合ヒトパー
フォリン部分タンパク質を齧歯類動物に免疫感作し、該
齧歯類動物の脾細胞またはリンパ節細胞とマウスミエロ
ーマ細胞とを融合させることによって形成されるハイブ
リドーマであって、ヒトパーフォリンタンパク質と特異
的に反応し得るモノクローナル抗体産生能を有するハイ
ブリドーマ。 ２、マウスミエローマ細胞がＰＡＩミエローマ細胞であ
り、リンパ節細胞がＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものであ
る請求項１に記載のハイブリドーマ。 ３、請求項１に記載のハイブリドーマにより産生される
ヒトパーフォリンタンパク質と特異的に反応するモノク
ローナル抗体であって、サブクラスがＩｇＧ２＿ｂであ
り、Ｌ鎖がκタイプに属するモノクローナル抗体。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2227504A JPH04108378A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | ヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体 |
| CA002049883A CA2049883A1 (en) | 1990-08-28 | 1991-08-26 | Monoclonal antibody specifically reactive with human perforin |
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| AT91114433T ATE136929T1 (de) | 1990-08-28 | 1991-08-28 | Monoklonaler antikörper, der spezifisch mit dem humanen perforin reagiert |
| DE69118780T DE69118780T2 (de) | 1990-08-28 | 1991-08-28 | Monoklonaler Antikörper, der spezifisch mit dem humanen Perforin reagiert |
| EP91114433A EP0473128B1 (en) | 1990-08-28 | 1991-08-28 | Monoclonal antibody specifically reactive with human perforin |
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|---|---|---|---|
| JP2227504A JPH04108378A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | ヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04108378A true JPH04108378A (ja) | 1992-04-09 |
Family
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Family Applications (1)
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| JP2227504A Pending JPH04108378A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | ヒトパーフォリンと反応するモノクローナル抗体 |
Country Status (6)
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Also Published As
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