JPH04108379A - 新規スーパーオキサイドディスムターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔従来の技術〕 ＳＯＤは生体に有害なスーパーオキサイド（活性酸素分
子）を分解消去する酵素であり、全ての臓器、細胞内画
分（細胞質及びミトコンドリア）に存在する。しかし、
細胞膜及び組繊細胞外空間ではこのような防御機構は極
めて不十分であり、そのためこれらの局所で、時として
生体に極めて危険な酸化的病態が発生する。従来より、
これらの酸化的組織損傷病態を改善する目的でＳＯＤの
静脈内投与や局所投与が試みられてきているが、何れも
その生体内不安定性や短い半減期（数分）の故に、その
防御作用を十分発現しうるには至っていない。

最近、ＳＯＤも血中半減期を延長させるためにＳＯＤの
様々な化学修飾が行われている。例えば、ポリエチレン
グリコール（特開昭６１−２４９３８８　）、高分子デ
キストラン（Ｗ、Ｆ、Ｐｅｔｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ａｃｉ、ＵＳＡ、　７７、１１５
９　（１９８０））　、イヌリン（特開昭５８−３２８
２６）などによるＳＯＤの修飾が行われている。しかし
、これらの修飾ＳＯＤは下記に示すように様々な欠点を
有し、問題点を十分解決するには至っていない。

また、血中のアルブミンを主体とする血清蛋白質と複合
体を作らせる目的でスチレンマレイン酸ブチルエステル
誘導体（ＳＭＡ）を酵素のりジン残基に酸アミド結合に
より結合させたＳＯＤ誘導体（ＳＭＡ−ＳＯＤ）も考案
されている（井上正康ら、蛋白質核酸酵素、３３，２８
８９　、（１９８８）　）。しかしながら二のような非
天然の化学修飾したＳＯＤを血中に投与することは、予
期せぬ副作用をもたらす恐れがある。

〔発明が解決しようとする課題］ 前述のように、有害なスーパーオキサイドラジカルの除
去にＳＯＤは有効であるが、投与俊速やかに排泄されて
しまうので薬効はあまり期待できない。

一方、様々な化学修飾法による修飾ＳＯＤは、血中では
安定ではあるが、酸化的組織障害の起こる組織や細胞に
特異的に指向できないので、スーパーオキサイドを有効
に除去できない。さらに、修飾ＳＯＤは生体には全くあ
るいは僅かにしか存在しない修飾試薬により修飾されて
いるので、修飾ＳＯＤの投与により、副作用の生じる可
能性がある。また、これらの修飾ＳＯＤを得るためには
、ＳＯＤを精製してから化学修飾し、さらに精製すると
いう複雑な操作が必要であった。

本発明者らはこれらを解決するため、以前に、ヘパリン
結合性部位を本来有しないスーパーオキサイドディスム
ターゼにヘパリン結合部位が付加された新規なスーパー
オキサイドディスムターゼを開発した（特願平１−５２
１４１号）。これは生体内に存在する物質からなり、副
作用の可能性が極めて少なく、しかも微量で損傷の起こ
っている組織を特異的に保護することができる。しかし
ながら、プロテアーゼに対してより高い耐性を有し、持
続性を有するスーパーオキサイドディスムターゼが望ま
れている。

従って、本発明はプロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン結
合性部位が付加された新規なスーパーオキサイドディス
ムターゼを提供する。

［課題を解決するための手段］ 生体内に多く存在するヘパリン結合性ペプチドの共通点
は塩基性アミノ酸のクラスターを持つことである（Ｅ、
Ｒａｕｖａｌａ、　ＥＭＢＯＪ、旦、　２９３３−２９
４１．１９８９；及びＳ、５ｏｅｄａ　ら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　９９９２９−３
５．１９８９）。しかしながら、プロテアーゼのなかに
は例えばトリプシンのようにポリペプチド鎖中のアルギ
ニン、リジン残基のカルボキシル基側を特異的に切断す
るものが多く存在する。しかし、塩基性アミノ酸残基の
隣がプロリンである時、そのペプチドはプロテアーゼに
よる消化を受けにくい。

そこで、ヘパリン結合能を持ち、がっ、プロテアーゼ抵
抗能を持つペプチドとして、次の一般式：％式％） （式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙは相互に独立に
アルギニン又はリジンであり、Ｐｒｏはプロリンであり
、そしてｎは１〜１０の整数である）で表わされるペプ
チドを使用する。ｎは好ましくは５以下であり、例えば
２又は３である。

本発明においては任意のスーパーオキサイドディスムタ
ーゼを使用することができ、動物（例えばヒト、ウシ）
、植物、微生物等の生物体中に存在するいずれのＳＯＤ
も使用できる。

ＳＯＤとヘパリン結合性ペプチドの結合様式としては、
ペプチドのＮ−末端アミノ酸のアミン基とＳＯＤのＣ−
末端のカルボキシル基をアミド結合により結合せしめる
方法、ペプチドのＣ−末端アミノ酸のカルボキシル基と
ＳＯＤのＮ−末端アミノ酸のアミノ基とをペプチド結合
により結合させる方法等がある。この様な結合様式にお
いては、ＳＯＤ分子とヘパリン結合性ペプチドとが一本
のポリペプチドを構成しているため、これをコードする
遺伝子を用いて製造することができる。

本発明のヘパリン結合性ペプチドはプロテアーゼ耐性で
あるため、このペプチドを有するＳＯＤを容易に収率よ
く精製することができる。また、このＳＯＤは予想通り
ＳＯＤ活性を有し、且っヘパリン結合性を有する。この
ことは、実施例３において本発明のペプチドがヘパリン
セファロースカラムにより吸着されることからも明らか
である。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
。この実施例においては、ヘパリン結合性ペプチドの一
例として： Ａ　ｌａ　−Ａｒｇ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　
−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ｐｒ。

を用い、ＳＯＤとしてヒト赤血球型ＳＯＤを用いる。そ
して前記ペプチＦがこのＳＯＤに結合したヘパリン結合
性ＳＯＤをｒ　）ＩＢ−５００−４Ｊと称する。

［実施例］ 遺」１倚口よ　）ＩＢ−５００−４ｉ　　云　の構築プ
ロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン結合性ペプチドとして
、Ａｒｇ−Ａｒｇ　−Ｐｒｏの繰り返し配列を持つペプ
チドをコードする塩基配列を合成した。すなわち、 Ａ３４３：５　ＧＡＴＣＧＣＣＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧ
ＣＣＣＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＡＧ３’ Ａ３４４：５”ＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴ
ＧＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣ３” を合成した。池原らの方法（Ｍ、Ｉｋｅｈａｒａ　ｅｔ
　ａｌ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８１．５
９５６．１９８４）に従い、これら４種の合成りＮＡを
リン酸化した後、アニーリングし、ｐＢＲｓＯＤｌ　（
特願平１−５２１４１参照）（なおこのプラスミドの構
築方法は本明細書の参考例に記載する）のＢａｍＨｒと
５ａｌＩで消化した約４．５　ｋｂのＤＮＡ断片とライ
ゲーションし、得られたプラスミド−をρＢＲＨＢＳＯ
Ｄ４　とした。ρＢＲ）ＩＢＳＯＤ４　は、Ｓ。

Ｄとヘパリン結合性ペプチドの結合した遺伝子がＥｃｏ
ＲＩと５ａｌｔで切り出される構造になっている（第１
図）。

ｐＢＲＨＢｓＯＤ４のＨＢ−ＳＯＤ−４をコードする部
分の塩基配列およびそれのコードするアミノ酸配列を第
２図に示した。

以上のようにして、プロテアーゼ抵抗能を持つヘパリン
結合性ペプチドを有するＨＢ−５ＯＤ−４の遺伝子を構
築した。

実施ｌ　　ＨＢ−ＳＯＤ−４の　　での実施例１で構築
したＨＢ−ＳＯＤ−４遺伝子を酵母の発現プラスミドに
連結した。酵母の発現プラスミドとして、ｐＹＩ（ＣＣ
ＩＯＩ　Ｃ特開平１−３７２９１参照。なお、ｐＹＨｃ
ｃｌｏｌで形質転換された酵母がと胚加用１匹照ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　ＳＡＭＯ７５０と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に昭和６２年（１９８７）　７
月１６日付けで微工研菌寄第９４７５号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−９４７５）　として、更に平成２年（１９９０）　２
月２３日付けで国際寄託に移管され微工研条寄第２７６
７号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７６７）として寄託されてい
る）を用いた。

ｐＢＲＨＢｓＯＤ４をＥｃｏＲＩと５ａｌｔで消化して
得られる約４８０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＹＩ（ＣＣＩＯ
ＩをＥｃｏＲＩと５ａｌＩで消化して得られる約８ｋｂ
のＤＮＡ断片とライゲーションし、得られたプラスミド
をｐＹｓＯ６０００とした。このプラスミドを大腸菌Ｄ
ＨＩを用いて、増幅し、酵母Ｇ−１３１５株（Ｍａｔ　
ａ、　ｔｒｐｌ）０１．Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉｅｔ　ａｌ
、、　Ｊ、Ｊｐｎ、Ｓｏｃ、５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、３
４．１４８　（１９８７））を形質転換した。なお、こ
の場合の酵母株としては（ｔｒｐ　１　）株であればい
ずれも使用することができる。形質転換の方法は、伊藤
らの方法によった（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、１５３．１６３　（１９８３））。

トリプトファンの合成能の回復した形質転換株を得た。

以下、この形質転換株をＧ−１３１５（ｐＹｓＯ６００
０）とする（第３図）。

以上に述べた酵母ベクターはＨＢ−５ｏｎ−４生産のた
めの一例であり、酵母のプロモーターとしてホスホグリ
セロキナーゼまたは抑制型酸性ホスファターゼなどの遺
伝子のプロモーターを使用することもできる。

得られた形質転換体Ｇ−１３１５（ｐＹｓ０６０００）
及びＧ−１３１５を２ｄのハークホルダー培地（Ｐ、Ｒ
，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ。

八ｍ、Ｊ、Ｂｏｔ、、　３０．２０６．　（１９４３）
）にて、３０℃で２晩振とう培養した。１．５ｄを集菌
後、ヤッフェらの方法（Ｍ、Ｐ、Ｙａｆｆｅ　ｅｔ　ａ
ｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ
、。

８１、４８１９　（１９８４））で酵母菌体から蛋白質
を得て、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。

電気泳動後、コマジ−ブリリアントブルーＲ２５０によ
る蛋白染色〔方法はたとえば、今堀ら、続生化学実験講
座タンパク質の化学、東京化学同人（１９８７）　）を
行った結果、どの形質転換株にもプラスミドをもたない
Ｇ４３１５にはない明瞭な蛋白質のバンドがみられ、こ
のバンドは菌体蛋白質の約５％に相当する。この分子量
は約１９．０００テ、ＨＢ−５ＯＤ−４（Ｄ予想される
分子量とほぼ一致した。また、ウェスタンプロティング
を行い、抗ＳＯＤ抗体を用いて、酵素抗体法〔例えば、
今堀ら、続生化学実験講座タンパク賞の化学、東京化学
同人（１９８７）　）によりその抗体と反応するものを
検出したところ、１本のバンドが見られ、これは蛋白染
色のＨＢ−ＳＯＤ−４と考えられるハンドの位置と一致
したので、ＨＢ−５ＯＤ−４が組換え酵母で生産されて
いるとした。

裏施拠ｌ　川づ並」■精製 スラント上のＧ−１３１５（ρＹＳＯ６０００）を１白
金耳、５威のパークホルダー培地に植菌し、３０°Ｃで
４０時間振とう培養した。これを１リツトルのエルレン
マイヤーフラスコにいれた４００ｄのハークホルダー培
地に植菌し、同様に培養した。次にこの培養液を３０リ
ツトルの０．１ｍＭの硫酸銅と０．１ｍＭの硫酸亜鉛を
含むパークホルダー培地でジャーファーメンタ−にて４
４時間培養した。遠心分離により集菌し、約１．３ｋｇ
の菌体を得た。

菌体をｌ■Ｈ硫酸銅、１ｍＭ硫酸亜鉛、１０ｍＭβメル
カプトエタノール、１ｎ＋Ｍ（バラ−アミジフェニル）
メタンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＰＭＳＦ）　
ヲ含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８，８，２
リツトルに懸濁し、ダイノミルにて菌体を破砕した。破
砕菌体を遠心分離し、遠心上清を７０度で１０分間熱処
理を行った後、遠心分離し、その上清を回収した。この
画分に５０％硫酸アンモニウムを加えてよく溶解した後
遠心分離し、その上清を５０％硫酸アンモニウムを含む
２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０で平衡化したプ
チルトーヨーパール６５０（）−ソー社）カラム（５Ｘ
２０ｃｍ）に吸着させた。５０％硫酸アンモニウムを含
む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、５００
！Ｉｄｌでカラムを洗浄した後、３０％硫酸アンモニウ
ムを含む２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液で溶出し、ＳＯＤ
活性画分（活性測定は、チトクロームＣ法（Ｊ、Ｍ、Ｍ
ｃＣｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、
、　２４４．６０４９（１９６９））ニよった）を集め
た。この画分を５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５（ファルマシア
社）カラム（１５Ｘ９０ｃｍ）で脱塩した後、１０＋ｗ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）　、３０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１と同じ電気伝導度にＮａＣ１を加えて合わせた。

これを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）　、
３０ｍＭ　ＮａＣ１で平衡化したＤＥＡＥセファロース
ＣＬ６Ｂ　（ファルマシア社）を充填したカラム（５Ｘ
１０Ｃ１１１）にかけて非吸着画分を回収した。この画
分をＩＭの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を適当量
加えてｐＨを７゜０に下げた後、１０ｍＭ燐酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＳＰセファロースＣ
−２５（ファルマシア社）　を充ｌしたカラム（５Ｘ１
０ｃ１＋＋）にかけて非吸着画分を回収した。これを１
Ｏｎ＋Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＦ１７．０）で平衡化
したヘパリンセファロースＣＬ６Ｂ　（ファルマシア社
）を充填したカラム（５Ｘ１０Ｃ１１）に吸着させた。

５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７、０）５０（ｌｄで洗浄した後５００＊Ｍ　ＮａＣ１
，１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出し
た。活性画分を回収し、９０％硫安で塩析して沈澱した
蛋白を少量の水に溶かし、生理食塩水に透析した。この
活性画分を前述のようにＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動し、蛋白染色したところ、単一なバンドが観察
されたので、以上の精製により純粋なＨＢ−５００−４
を得たとした。なお、１（Ｂ−５ＯＤ−４７７）精製は
４℃で行った。

１１■玉　…」並」■止血Ｉ ＨＢ−５ＯＤ−４のプロテアーゼ抵抗性を調べた。Ｇ−
１３１５（ｐＹｓＯ６０００）　、　Ｇ−１３１５（ｐ
ＹＨＢｓ２）　（ｐＹＨＢＳ２は、ヘパリン結合性部位
を本来有しないスーパーオキサイドディムターゼにヘパ
リン結合部位が付加された新規なスーパーオキサイドデ
ィスムターゼをコードする遺伝子を含有するプラスミド
である。特願平１−５２１４１号参照］、及びＧ−１３
１５（ｐＹｓＯ２００）（ｐＹｓ０２００はｐＹＨＢＳ
２の）１Ｂ−５ＯＤ−２遺伝子の代わりにヘパリン結合
性部位を有しないヒトのスーパーオキサイドディスミュ
ターゼ遺伝子の入ったプラスミドである〕を１白金耳、
１０ｍのパークホルダー培地に植菌し、３０°Ｃで４０
時間振とう培養した。そのうちの１．５　ｄは集菌後、
ヤッフエらの方法（Ｍ。

Ｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ、　Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔ、、　
３０．２０６．　（１９４３））で酵母菌体からタンパ
ク質を得た。残りの８．５　ｄは集菌後、菌体にＩ　Ｍ
　ＮａＣ１を０．５　ｄ加えて懸濁しさらに、クロロホ
ルムを０．５　ＩＭ１加えて室温で１晩振とうした。そ
して遠心を行い、上清を回収した。

これらの蛋白をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行った。その結果を第４図に示した。ヤッフエらの方
法で調製した場合、細胞内のプロテアーゼは作用しない
ので、三種類のどのＳＯＤも分解せず低分子化していな
いが、クロロホルム抽出を行うと酵母のプロテアーゼが
作用するため、プロテアーゼの消化を受は易いＨＢ−Ｓ
ＯＤ−２は分解して低分子化した蛋白がみられる。しが
し、ＳＯＤや１（Ｂ−５ＯＤ−４では、低分子化した蛋
白はみられず、ＨＢ−５ＯＤ−４がＨＢ−５ＯＤ−２に
比べてプロテアーゼに対して抵抗性であると考えられる
。

次に、精製したＨＢ−ＳＯＤ−４のアミノ酸分析を行っ
た。結果を次の第１表に示す。分析値はＤＮＡの塩基配
列から予想される値とよい一致を示した。

また、ＨＢ−５ＯＤ−４の吸収スペクトルは組み換えヒ
）ＳＯＤと一致したので、銅及び亜鉛を含む活性のある
蛋白であると考えられる。

第１表 アミノ酸分析 ヒト胎盤から、グアニジウムチオシアネートを用いて常
法に従い、全ＲＮＡを得た。第１７ゴｄＴセルロースカ
ラムクロマトグラフイーを用いて全ＲＮＡからポリアデ
ニル化ＲＮＡをｍＲＮＡ画分として分取した。このＲＮ
Ａ画分を用いて、ガブラーらの方法（Ｇｕｂｌｅｒ、　
Ｕ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ＋　２５＋　２６３（１
９８３）に従い作製されたｃＤＮＡ合成キ・ント（アマ
ジャム社）を用いて２本１ｊ　Ｄ　Ｎ　Ａを作製した。

この２本鎖ＤＮＡにターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（ファルマシア社）によりデオキシ
ＣＴＰホモポリマーを付加した。これと、ｐＢＲ３２２
のＰｓｔ、１部位にデオキシＧＴＰのホモポリマーを付
加したベクター（ファルマシア社）とをアニーリングし
て、大腸菌０８１を形質転換し、約４０万クローンのｃ
ＤＮＡライブラリーを作製した。

（２）彫Ｉ膚Ｊ■１欠１択 始めにヒト５ＯＤｃＤＮＡ検出用のプローブとして下記
の配列をもつＤＮＡ　Ａ０３９を合成した。その配列は
５’　ＧＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧ
ＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴＧ３’である。

この配列は既に知られているヒトｓｏＤのｃＤＮＡの塩
基配列［Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｙ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０．５４６５　（１９
８３）　）に含まれる配列である。合成はアプライドバ
イオシステムズ社の３８１Ａ　ＤＮＡ合成装置を用いて
行った。このプローブ゛を（Ｔ〜３２Ｐ）八ＴＰ（アマ
ジャム社）とＴ４−ポリヌクレオチジルキナーゼを用い
て標識し、ＳＯＤ遺伝子の検出用プローブとして用いた
。コロニハイプリダイゼーションの手法により、このプ
ローブとハイブリダイズする大腸菌形質転換体を上記ｃ
ＤＮＡライブラリーから得た。この形質転換体を通常の
方法で培養して増殖させ、菌体よりプラスミドＤＮＡを
抽出した。このプラスミドはＰｓｔＩで切り出されるヒ
ト由来の６００ｂｐのｃＤＮＡを含んでいた。このプラ
スミドをｐｓＯｌｏとした。この挿入部分の塩基配列を
Ｍ１３ファージを鋳型とするジデオキシ法〔たとえば、
高温ら、続生化学実験講座、遺伝子研究法■　東京化学
同人（１９８６）　）により決定した。決定した塩基配
列は前述の既に報告された塩基配列と一致したが、アミ
ノ末端の３アミノ酸残基をコードする遺伝子が欠失して
いた。

（３）　ＨＢ−５ＯＤ’云の 欠失しているアミノ末端の遺伝子と開始コドン、及び発
現へシラーへのつなぎ込みのためのＥｃｏＲ１部位の作
製のため、以下の実験を行った。

合成りＮＡ　ＡＯ７１、すなわち５”ＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧ
ＴＧＣ３’　を前述のようにアプライド°゛ハイオシス
テムズ社のＤＮＡ合成装置３８１Ａにより作製した。こ
の合成りＮＡをプライマーに、ｐｓＯｌｏのＰｓｔＩで
切り出される６００ｂｐのＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９
にクローニングして得た組換え１本鎖ＤＮＡを鋳型にし
て、シラーらの方法（Ｍ、Ｊ。

Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅｓ、＋　１０．６４８７（１９８２））により部位特
異的突然変異を生じさせた。この突然変異体の挿入部分
の塩基配列を決定したところ、目的の通り、欠失してい
たアミノ末端の３残基のアミノ酸をコードする遺伝子と
開始コドンとＥｃｏＲ１部位が生じていたので、完全長
のＳＯＤ　ｃＤＮＡが得られたことがわかった。この突
然変異の生した組換えＭ１３１本鎖ＤＮＡを調製し、Ｐ
ｓｔｌで切り出される６００ｂＰのＤＮＡ断片をｐＵＣ
９のＰｓｔ１部位にサブクローニングした。得られた組
換え体の内、ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで切り出される６０
０ｂｐのＤＮＡ断片を持つプラスミドをρ５０１００と
した。ｐｓＯｌｏｏからＥｃｏＲＩと５ａｕ３Ａ１で切
り出される４５０ｂｐのＤＮＡ断片をρＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。こ
のプラスミドをｐＢＲ５ＯＤ１　とした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＤ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ５
ＯＤ１とヘパリン結合性ペプチドをコードする合成オリ
ゴヌクレオチドとから、ヘパリン結合性ペプチドがＣ−
末端に付加されたＳＯＤをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドｐＢＲ１（ＢＳＯＤ４の構築を示す。 第２図は、本発明の、ヘパリン結合性ペプチドが付加さ
れたＳ　ＯＤ　（ＨＢ−ＳＯＤ−４）のアミノ酸配列及
びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す。 第３図は、酵母発現用プラスミドｐＹＨｃｃ１０１と、
ＨＢ−５ＯＤ−４をコードする遺伝子を含有するプラス
ミドｐＢＲＨＢｓＯＤ４とからのＨＢ−ＳＯＤ−４用の
酵母発現プラスミドｐＹｓＯ６０００の構築を示す。 第４図は、（Ａ）本発明のヘパリン結合性ＳＯＤ　（Ｈ
Ｂ−ＳＯＤ−４）、（Ｂ）未修飾のＳＯＤ、及び（Ｃ）
ヘパリン結合部位として分泌性ＳＯＤヘパリン結合性ペ
プチドが付加されているＳ　ＯＤ　（ＨＢ−５ＯＤ−２
）を酵母にて発現させた場合の分解を比較したものであ
り、図中（１）はクロロホルム抽出により回収した場合
（酵母のプロテアーゼの作用を受ける）、レーン（２）
ヤッフェの方法により抽出した場合（酵母プロテアーゼ
の作用を受けない）、レーン（Ｓ）分子量標準、及びレ
ーンＨ（形質転換されない宿主）のＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動図である。 ＳＢ　　　　Ｃ Ｈ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙはそれぞれ独立
   にアルギニン又はリジンであり、Ｐｒｏはプロリンであ
   り、そしてｎは１〜１０の整数である）を有するヘパリ
   ン結合部位が付加されているスーパーオキサイドディス
   ムターゼ。