JPH04110661A - 核酸の免疫学的測定方法 - Google Patents
核酸の免疫学的測定方法Info
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- JPH04110661A JPH04110661A JP22676990A JP22676990A JPH04110661A JP H04110661 A JPH04110661 A JP H04110661A JP 22676990 A JP22676990 A JP 22676990A JP 22676990 A JP22676990 A JP 22676990A JP H04110661 A JPH04110661 A JP H04110661A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、特定の塩基配列を結合した核酸を、この特定
の塩基配列を特異的に認識するモノクローナル抗体によ
り固相に固定化し、二本鎖核酸を構造特異的に認識する
モノクローナル抗体を利用することを特徴とする、試料
中の核酸の免疫学的測定方法に関するものである。
の塩基配列を特異的に認識するモノクローナル抗体によ
り固相に固定化し、二本鎖核酸を構造特異的に認識する
モノクローナル抗体を利用することを特徴とする、試料
中の核酸の免疫学的測定方法に関するものである。
核酸の塩基配列を同定することは、現在非常に注目され
ている診断方法である。感染症の診断、ヒト遺伝子疾患
の診断、癌診断などで応用されることが期待されている
。例えば感染症では、サルモネラ、赤痢などの細菌、肝
炎やエイズなどのウィルス、マイコプラズマ、寄生虫、
クラミジアなどの微生物による感染症の診断に応用でき
る。また遺伝子診断では、遺伝子欠陥か病気の原因にな
っているもので、例えば染色体性遺伝病として、ダウン
症候群、ターナ−症候群など、メンデル型遺伝病として
、フェニルケトン尿症、血友病など、多因子型遺伝病と
しては、本態性高血圧、糖尿病などの臨床診断に期待さ
れる。さらに癌においては、正常なりＮＡ配列が変異し
たり、活性化された結果束じた癌遺伝子を同定して診断
する。この様に適切なりＮＡプローブさえ用いれば、病
因と関連している遺伝子、あるいはその一部を特異的に
同定し臨床診断することが期待される。
ている診断方法である。感染症の診断、ヒト遺伝子疾患
の診断、癌診断などで応用されることが期待されている
。例えば感染症では、サルモネラ、赤痢などの細菌、肝
炎やエイズなどのウィルス、マイコプラズマ、寄生虫、
クラミジアなどの微生物による感染症の診断に応用でき
る。また遺伝子診断では、遺伝子欠陥か病気の原因にな
っているもので、例えば染色体性遺伝病として、ダウン
症候群、ターナ−症候群など、メンデル型遺伝病として
、フェニルケトン尿症、血友病など、多因子型遺伝病と
しては、本態性高血圧、糖尿病などの臨床診断に期待さ
れる。さらに癌においては、正常なりＮＡ配列が変異し
たり、活性化された結果束じた癌遺伝子を同定して診断
する。この様に適切なりＮＡプローブさえ用いれば、病
因と関連している遺伝子、あるいはその一部を特異的に
同定し臨床診断することが期待される。
［従来の技術］
ＤＮＡの測定方法としては、核酸ハイブリダイゼーショ
ン法による４つのアッセイ方法が一般的である。つまり
、ドツトハイブリダイゼーション法（Ｐ、 ５ｔａｌｈ
ａｎｄｓｋｅ、 ｔｌ、 Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、 Ｊ
、 Ｃｌ１ｎ。
ン法による４つのアッセイ方法が一般的である。つまり
、ドツトハイブリダイゼーション法（Ｐ、 ５ｔａｌｈ
ａｎｄｓｋｅ、 ｔｌ、 Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、 Ｊ
、 Ｃｌ１ｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉ ｔｏ、、１５．７４４−７４７（１９
８２））、：］］Ｏ：−ハイブリダイセーション法Ｍ、
Ｊ、 Ｈａａｓ、 ｅｔ ａｌ、、ＰｃｒｓＣｏｍｌ
ｌｕｎ、、 （１９８７））、ｊｎ ５ｕｔｅ ｉｚ
イブリダイゼーション法（Ｃ，Ｊ、 Ｂｕｒｒｅｌｌ、
Ｅ、 Ｊ、 Ｃｏｗａｎｓ、 Ａ、 Ｉ＋Ｊｉｌｂｅ
ｒｔ、 Ｊ、 Ｒ，Ｌａｋｅ、 Ｂ、 Ｐ、
Ｍａｒｍｉｏｎ Ｈｅｐａｔ。
８２））、：］］Ｏ：−ハイブリダイセーション法Ｍ、
Ｊ、 Ｈａａｓ、 ｅｔ ａｌ、、ＰｃｒｓＣｏｍｌ
ｌｕｎ、、 （１９８７））、ｊｎ ５ｕｔｅ ｉｚ
イブリダイゼーション法（Ｃ，Ｊ、 Ｂｕｒｒｅｌｌ、
Ｅ、 Ｊ、 Ｃｏｗａｎｓ、 Ａ、 Ｉ＋Ｊｉｌｂｅ
ｒｔ、 Ｊ、 Ｒ，Ｌａｋｅ、 Ｂ、 Ｐ、
Ｍａｒｍｉｏｎ Ｈｅｐａｔ。
２、８５Ｓ−９１，Ｓ（１，９８２））である。さらに
サントイッチハイプリダイセーション法（Ｍ、 Ｖｉｒ
ｔａｎｅｎ、 Ｍ。
サントイッチハイプリダイセーション法（Ｍ、 Ｖｉｒ
ｔａｎｅｎ、 Ｍ。
Ｌａａｋｓｏｎｅｎ、 Ｈ，Ｓ ｄｅｒｌｕｎｄ、 Ａ
、 Ｐａ１ｖａ、 Ｐ、Ｈａｌｏｎｅｎ、 Ｌ Ｒ
ａｎｋｉ：Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、 ３８１−３８９
（１９８３））が開発されている。
、 Ｐａ１ｖａ、 Ｐ、Ｈａｌｏｎｅｎ、 Ｌ Ｒ
ａｎｋｉ：Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、 ３８１−３８９
（１９８３））が開発されている。
ドツトハイブリダイゼーション法について説明すると、
まず試料中の核酸を抽出してアルカリ処理（０，５Ｎ
Ｎａ０Ｈ） Ｌ一重鎖叶Ａとする。この一重鎖ＤＮＡ
ヲニトロセルロースフィルターの上に固定し、それに放
射性標識したハイブリダイゼーションプローブを加えて
ハイブリダイズする。遊離のハイブリダイゼーションプ
ローブを除去し、放射性標識物質を検出する方法である
。
まず試料中の核酸を抽出してアルカリ処理（０，５Ｎ
Ｎａ０Ｈ） Ｌ一重鎖叶Ａとする。この一重鎖ＤＮＡ
ヲニトロセルロースフィルターの上に固定し、それに放
射性標識したハイブリダイゼーションプローブを加えて
ハイブリダイズする。遊離のハイブリダイゼーションプ
ローブを除去し、放射性標識物質を検出する方法である
。
非放射性ハイブリダイゼーションプローブを使用するも
のとしては、核酸をハプテンで標識し、それを免疫学的
に検出する方法（ｊ、 Ｅ、 Ｌａｎｄｅｇｅｎｔｅｔ
ａｌ、、 Ｅｘｐ、 Ｃｅ１１． Ｒｅｓ、、 １．
５３．６１−７２ （１９８４）Ｐ、 Ｔｃｈｅｎ、
ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８１、３４６０Ｊ４７０ （１９８
４）） ビオチン標識したＤＮＡプローブを試料中
のＤＮＡとハイブリダイズさせ、次にストレプトアビジ
ン、アルカリフォスファターゼ、ＮＢＴ色素により発色
させる方法（高橋豊三奥田研爾、ＢＩＯＩＮＤＬＩｓＴ
ＲＹ、 ２．９２８−９３５．１０１３−１０１５ （
１９８５））、オーストラリアのＢＲＥＳＡ（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｅｎｔｅｒｐ
ｒｉｓｅｓ ５ｏｕｔｈＡｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ、
Ｌｔｄ、）により開発されたＰｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ
法、Ｏｒｇｅｎｉｃｓ社が開発した抗体を利用するＣｈ
ｅｍｉｐｒｏｂｅ法、和光純薬玉業■が開発したラベザ
イムーベルオキシダーゼを標的ＤＮＡに標識して検出す
る方法が市販されている。
のとしては、核酸をハプテンで標識し、それを免疫学的
に検出する方法（ｊ、 Ｅ、 Ｌａｎｄｅｇｅｎｔｅｔ
ａｌ、、 Ｅｘｐ、 Ｃｅ１１． Ｒｅｓ、、 １．
５３．６１−７２ （１９８４）Ｐ、 Ｔｃｈｅｎ、
ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８１、３４６０Ｊ４７０ （１９８
４）） ビオチン標識したＤＮＡプローブを試料中
のＤＮＡとハイブリダイズさせ、次にストレプトアビジ
ン、アルカリフォスファターゼ、ＮＢＴ色素により発色
させる方法（高橋豊三奥田研爾、ＢＩＯＩＮＤＬＩｓＴ
ＲＹ、 ２．９２８−９３５．１０１３−１０１５ （
１９８５））、オーストラリアのＢＲＥＳＡ（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｅｎｔｅｒｐ
ｒｉｓｅｓ ５ｏｕｔｈＡｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ、
Ｌｔｄ、）により開発されたＰｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ
法、Ｏｒｇｅｎｉｃｓ社が開発した抗体を利用するＣｈ
ｅｍｉｐｒｏｂｅ法、和光純薬玉業■が開発したラベザ
イムーベルオキシダーゼを標的ＤＮＡに標識して検出す
る方法が市販されている。
特許では特開昭６０−７２８２８号が重要である。
［発明が解決しようとする課題］
従来知られた放射性標識したハイブリダイゼーションプ
ローブを用いる方法は、極めて簡便に、多検体を検出す
ることには優れている。しかしなから、放射性物質で標
識していることから経済的に高価になり、人体に対する
安全性あるいは廃棄処理の安全性の問題、適切な放射性
物質使用設備の設置、放射性物質の半減期の問題などを
考慮しなければならない。非放射性標識したハイブリダ
イゼーシヨンプローブを用いる方法においては、感度か
低いし、フィルターを用いるので洗浄方法に工夫か必要
である。
ローブを用いる方法は、極めて簡便に、多検体を検出す
ることには優れている。しかしなから、放射性物質で標
識していることから経済的に高価になり、人体に対する
安全性あるいは廃棄処理の安全性の問題、適切な放射性
物質使用設備の設置、放射性物質の半減期の問題などを
考慮しなければならない。非放射性標識したハイブリダ
イゼーシヨンプローブを用いる方法においては、感度か
低いし、フィルターを用いるので洗浄方法に工夫か必要
である。
「課題を解決するための手段コ
本発明者らは、従来技術の課題を解決した、操作が簡便
でかつ安全に低コストに、加えて感度よく日常的に核酸
を免疫学的に診断する方法について鋭意検討したところ
、核酸に構造特異的なモノクローナル抗体を用いること
によってこれらの課題を解決できることを見出だし、本
発明を完成された。すなわち本発明は、 ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ７特定の塩基配列を５°末端または３゛末端に結合さ
せた一重鎖核酸プローブ Ｃ３一重鎖に処理された試料中の核酸 ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法および ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ、特定の塩基配列に結合した、一重鎖に処理された試
料中の核酸 仁一重鎖核酸プローブ ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法を提供するものであり、以下
詳細に説明する。
でかつ安全に低コストに、加えて感度よく日常的に核酸
を免疫学的に診断する方法について鋭意検討したところ
、核酸に構造特異的なモノクローナル抗体を用いること
によってこれらの課題を解決できることを見出だし、本
発明を完成された。すなわち本発明は、 ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ７特定の塩基配列を５°末端または３゛末端に結合さ
せた一重鎖核酸プローブ Ｃ３一重鎖に処理された試料中の核酸 ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法および ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ、特定の塩基配列に結合した、一重鎖に処理された試
料中の核酸 仁一重鎖核酸プローブ ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法を提供するものであり、以下
詳細に説明する。
まず、第一の発明について説明する。
本発明でいう特定の塩基配列とは、同じ塩基が連続して
結合した配列をいい、通常、１０個以上連続して結合し
ていることが好ましい。例えば、ポリｄＴ ポリｄＡ
、ポリｄＣ，ポリｄＧなどが用いられる。
結合した配列をいい、通常、１０個以上連続して結合し
ていることが好ましい。例えば、ポリｄＴ ポリｄＡ
、ポリｄＣ，ポリｄＧなどが用いられる。
これは、抗体に認識されるのに必要だからである。
この特定の塩基配列を一重鎖核酸プローブの５末端また
は３′末端に結合させる。結合は、５゛末端または３゛
末端のどちらでもよく、その方法は何等限定されること
はなく、公知の方法を用いればよい。
は３′末端に結合させる。結合は、５゛末端または３゛
末端のどちらでもよく、その方法は何等限定されること
はなく、公知の方法を用いればよい。
本発明で用いられる核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのどちら
でもよい。
でもよい。
特定の塩基配列を認識するモノクローナル抗体（１）お
よび二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２）は、Ｑ、 Ｋｏｈｌｅｒ、 ＣＭｉｌｓｔｅ
ｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５．１
９７５）に従って調製すればよい。また、市販のものを
用いることもできる。
よび二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２）は、Ｑ、 Ｋｏｈｌｅｒ、 ＣＭｉｌｓｔｅ
ｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６．４９５．１
９７５）に従って調製すればよい。また、市販のものを
用いることもできる。
モノクローナル抗体（１〉を同相に固定化するには、通
常知られた物理的または化学的方法などを用いればよい
。さらには、例えば前記したモノクローナル抗体（１）
のＰｃ領域を特異的に認識する抗体を固相に物理的また
は化学的に固定化し、その後、該抗体を介してモノクロ
ーナル抗体（１）を固定化してもよい。
常知られた物理的または化学的方法などを用いればよい
。さらには、例えば前記したモノクローナル抗体（１）
のＰｃ領域を特異的に認識する抗体を固相に物理的また
は化学的に固定化し、その後、該抗体を介してモノクロ
ーナル抗体（１）を固定化してもよい。
固相としては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子、
ラテックス、アガロース、セルロース、ポリメタアクリ
レートなどが使用される。
リ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子、
ラテックス、アガロース、セルロース、ポリメタアクリ
レートなどが使用される。
またモノクローナル抗体（２）を標識化することにより
、最終的に生成した免疫反応生成物の検出を簡便に行う
ことができる。この標識化の方法とその検出方法も何等
限定されるものではなく、公知の方法により標識化およ
び検出することができる標識としては、例えば、 ３）
（、１２５！、 ＋３１■などの放射性物質を用いる
こともできるが、安全性、管理の容易さなどの点から、
例えばフルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネー
ト、テトラローダミンイソチオシアネートなどの蛍光物
質が常法によりモノクローナル抗体（２）に標識される
。さらに好ましくは、通常のエンザイムイムノアソセイ
で使用されるような酵素、例えばペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどがよ
い。
、最終的に生成した免疫反応生成物の検出を簡便に行う
ことができる。この標識化の方法とその検出方法も何等
限定されるものではなく、公知の方法により標識化およ
び検出することができる標識としては、例えば、 ３）
（、１２５！、 ＋３１■などの放射性物質を用いる
こともできるが、安全性、管理の容易さなどの点から、
例えばフルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネー
ト、テトラローダミンイソチオシアネートなどの蛍光物
質が常法によりモノクローナル抗体（２）に標識される
。さらに好ましくは、通常のエンザイムイムノアソセイ
で使用されるような酵素、例えばペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどがよ
い。
標識されていないモノクローナル抗体（２）を用いた場
合には、モノクローナル抗体（２）のＦｃ領域を特異的
に認識する、前記したような標識物質で標識された抗体
を使用して、同相上に標識物質を有する免疫反応複合体
を形成させる。この複合体は詳しくは、 固相・・・モノクローナル抗体（１）−特定の塩基配列
を結合させた一重鎖の核酸−試料中の核酸−モノクロー
ナル抗体（２）・・・標識物質と表される。ここで、・
・・は前記したようにモノクローナル抗体（１）または
（２）とは異なる、ポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体を介してもよい結合である。ただし、本発明
で同一のサブクラスに属するモノクローナル抗体（１）
および（２）を使用する場合には制限が生じる。すなわ
ち、同一のサブクラスに属するモノクローナ＋−・フ１
４体は、そのＦｃ領域が同一であることから、例えばモ
ノクローナル抗体（２）のＦｃ領域を認識するように調
製された、標識された抗体が誤ってモノクローナル抗体
（１〉のＰｃ領域を認識し、複合体同相・・・モノクロ
ーナル抗体（１）・・・標識物質を形成する可能性があ
るからである。従って本発明では、抗体の調製などの操
作を簡便にするためにも固相に物理的或いは化学的に結
合したモノクローナル抗体（１）および標識物質と化学
的に結合しモノクローナル抗体（２）の２種のモノクロ
ーナル抗体を使用することが好ましい。一重鎖核酸の特
定の塩基配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（
１）、二重鎖核酸を特異的に認識するモノクローナル抗
体（２）以外の標識された抗体を用いる場合には、サブ
クラスの異なるモノクローナル抗体（１）、モノクロー
ナル抗体（２）を使用したり、或いは標識物質と直接（
他の抗体を介さずに）結合したモノクローナル抗体（２
）を使用することが好ましい。
合には、モノクローナル抗体（２）のＦｃ領域を特異的
に認識する、前記したような標識物質で標識された抗体
を使用して、同相上に標識物質を有する免疫反応複合体
を形成させる。この複合体は詳しくは、 固相・・・モノクローナル抗体（１）−特定の塩基配列
を結合させた一重鎖の核酸−試料中の核酸−モノクロー
ナル抗体（２）・・・標識物質と表される。ここで、・
・・は前記したようにモノクローナル抗体（１）または
（２）とは異なる、ポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体を介してもよい結合である。ただし、本発明
で同一のサブクラスに属するモノクローナル抗体（１）
および（２）を使用する場合には制限が生じる。すなわ
ち、同一のサブクラスに属するモノクローナ＋−・フ１
４体は、そのＦｃ領域が同一であることから、例えばモ
ノクローナル抗体（２）のＦｃ領域を認識するように調
製された、標識された抗体が誤ってモノクローナル抗体
（１〉のＰｃ領域を認識し、複合体同相・・・モノクロ
ーナル抗体（１）・・・標識物質を形成する可能性があ
るからである。従って本発明では、抗体の調製などの操
作を簡便にするためにも固相に物理的或いは化学的に結
合したモノクローナル抗体（１）および標識物質と化学
的に結合しモノクローナル抗体（２）の２種のモノクロ
ーナル抗体を使用することが好ましい。一重鎖核酸の特
定の塩基配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（
１）、二重鎖核酸を特異的に認識するモノクローナル抗
体（２）以外の標識された抗体を用いる場合には、サブ
クラスの異なるモノクローナル抗体（１）、モノクロー
ナル抗体（２）を使用したり、或いは標識物質と直接（
他の抗体を介さずに）結合したモノクローナル抗体（２
）を使用することが好ましい。
ハイブリダイゼーションおよび免疫反応については、モ
ノクローナル抗体（１）、核酸プローブ、試料中の核酸
およびモノクローナル抗体（２）の接触順序にはとくに
限定はない。順次接触させて、途中、必要に応じて未反
応体を除去してもよいし、−度に接触させ、反応を行わ
せてもよい。いずれの場合も、最後に標識されたモノク
ローナル抗体（２）のうち、遊離の（間接的に固相に結
合されていない）標識されたモノクローナル抗体（２）
の除去には、例えば通常のイムノアッセイで使用される
Ｂ／Ｐ分離などの洗浄法を行えばよい。
ノクローナル抗体（１）、核酸プローブ、試料中の核酸
およびモノクローナル抗体（２）の接触順序にはとくに
限定はない。順次接触させて、途中、必要に応じて未反
応体を除去してもよいし、−度に接触させ、反応を行わ
せてもよい。いずれの場合も、最後に標識されたモノク
ローナル抗体（２）のうち、遊離の（間接的に固相に結
合されていない）標識されたモノクローナル抗体（２）
の除去には、例えば通常のイムノアッセイで使用される
Ｂ／Ｐ分離などの洗浄法を行えばよい。
前記した試料中の核酸とは、天然に存在するウィルス、
細菌などの微生物、動植物などに由来する一本鎖もしく
は二本鎖核酸であるが限定されるものではない。二重鎖
の場合は、一重鎖に融解した後、反応を行う。
細菌などの微生物、動植物などに由来する一本鎖もしく
は二本鎖核酸であるが限定されるものではない。二重鎖
の場合は、一重鎖に融解した後、反応を行う。
第二の発明についても、基本的には、第一の発明と同様
である。たたし、一重鎖核酸プローブと、特定の塩基配
列を一重鎖に処理された試料中の核酸に結合したものと
を用いて免疫学的測定を行えばよい。
である。たたし、一重鎖核酸プローブと、特定の塩基配
列を一重鎖に処理された試料中の核酸に結合したものと
を用いて免疫学的測定を行えばよい。
［発明の効果］
本発明によれば、簡便な操作により核酸のａｔす定か可
能である。さらに、本発明ではモノクローナル抗体の固
定化および標識物質のモノクローナル抗体への結合を前
もって行っておくことで、さらに操作を簡便にし、要す
る時間を短縮することが可能である。この事は、短時間
に多数の検体（試料）を測定するという臨床的な要望を
解決するものである。
能である。さらに、本発明ではモノクローナル抗体の固
定化および標識物質のモノクローナル抗体への結合を前
もって行っておくことで、さらに操作を簡便にし、要す
る時間を短縮することが可能である。この事は、短時間
に多数の検体（試料）を測定するという臨床的な要望を
解決するものである。
また、本発明では、特定の塩基配列を認識するモノクロ
ーナル抗体および二重鎖核酸を構造特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を用いるため、モノクローナル抗体の
結合が核酸ハイブリダイゼーションの障害になることが
ない。
ーナル抗体および二重鎖核酸を構造特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を用いるため、モノクローナル抗体の
結合が核酸ハイブリダイゼーションの障害になることが
ない。
［実施例］
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではな
い。
が、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではな
い。
（１）抗ポリｄＴモノクローナル抗体の固定化未処理マ
イクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレート
、インターメッド社製）の各ウェルに０．ＩＮ炭酸緩衝
液（ｐｌ＋９．６）に溶解した１０μｇ／ｍ１の抗ポリ
ｄＴ （ｐｄＴ ）モノクローナル抗体（ｃｈｅｍｉｃ
ｏｎ肚製）の溶液１００ ｔｔ ｌを加えて、室温で２
時間インキニベートした。次に、各ウェルがら炭酸緩衝
液を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５９６Ｍ
ａＣ１含有０，０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２、以下
ＰＢＳと略す）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清ア
ルブミン（以下ＢＳＡと略す）を溶解したＰＢＳ溶液３
００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロッキング処理
した。
イクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレート
、インターメッド社製）の各ウェルに０．ＩＮ炭酸緩衝
液（ｐｌ＋９．６）に溶解した１０μｇ／ｍ１の抗ポリ
ｄＴ （ｐｄＴ ）モノクローナル抗体（ｃｈｅｍｉｃ
ｏｎ肚製）の溶液１００ ｔｔ ｌを加えて、室温で２
時間インキニベートした。次に、各ウェルがら炭酸緩衝
液を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５９６Ｍ
ａＣ１含有０，０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２、以下
ＰＢＳと略す）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清ア
ルブミン（以下ＢＳＡと略す）を溶解したＰＢＳ溶液３
００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロッキング処理
した。
なお、このモノクローナル抗体を固定化したプレートは
、測定まで４℃条件下で保存した。
、測定まで４℃条件下で保存した。
（２）試料中の核酸の測定
（１）のようにして作製したプレートを室温にもどし、
０．０４％ツイーン（ｔｖｅｅｎ ）−２０を含んだリ
ン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）で洗浄
した後、１０μｇ／ｌの末端にｐｄＴ （シグマ社製
、Ｔが１０個結合したもの）をリガーゼによって結合さ
せたプローブ核酸を各ウェルに１００μｌ加え３７℃て
１．５時間インキュベートした。
０．０４％ツイーン（ｔｖｅｅｎ ）−２０を含んだリ
ン酸緩衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）で洗浄
した後、１０μｇ／ｌの末端にｐｄＴ （シグマ社製
、Ｔが１０個結合したもの）をリガーゼによって結合さ
せたプローブ核酸を各ウェルに１００μｌ加え３７℃て
１．５時間インキュベートした。
（３）−末鎖核酸の調製
既知量の二本鎖核酸を含むＯ，１８Ｍ ＮａＣ１溶液を
５分間沸騰させた。この後すぐに水冷し、−末鎖核酸溶
液を得た。
５分間沸騰させた。この後すぐに水冷し、−末鎖核酸溶
液を得た。
り４）ハイブリダイゼーション
（３）で得られた一本鎖核酸溶液をハイブリダイゼーシ
ョン溶液（終ａ度５ＸＳＳＣ，ｌｘデンハルト溶液、５
％デキストラン硫酸、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５） ）に溶解し各ウェルに１００μｍずっ加え、６５
℃で一晩インキユベートした。次にＰＢＳ−Ｔで３回洗
浄した。
ョン溶液（終ａ度５ＸＳＳＣ，ｌｘデンハルト溶液、５
％デキストラン硫酸、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５） ）に溶解し各ウェルに１００μｍずっ加え、６５
℃で一晩インキユベートした。次にＰＢＳ−Ｔで３回洗
浄した。
（５〉試料中の一本鎖核酸の測定
次にマウス抗二本鎖核酸モノクローナル抗体をＰＢＳ−
Ｔ 溶液で希釈し、各ウェルに１００μｍずっ添加した
。３７℃で１，５時間インキュベートした後、溶液を除
去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。次にＰＢＳ−Ｔ溶
液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗免疫グロブリン抗
体（タボ社製）をＩＯ［１μｍずっ各ウェルに加え、３
７℃で１．５時間インキュベートした後、溶液を除去し
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。
Ｔ 溶液で希釈し、各ウェルに１００μｍずっ添加した
。３７℃で１，５時間インキュベートした後、溶液を除
去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。次にＰＢＳ−Ｔ溶
液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗免疫グロブリン抗
体（タボ社製）をＩＯ［１μｍずっ各ウェルに加え、３
７℃で１．５時間インキュベートした後、溶液を除去し
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。
各ウェルに０２口３９６２，２−アジノジ−（３−エチ
ルベンズシアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）およびＤ 、 ０１ ％過酸化水素（Ｈ２０□）を
含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｌ−１４，１）か
らなる基質溶液を各ウェルに１００μｍ添加し、室温で
１０分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を
１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロ
タイタープレートを各ウェルについて、波長４１５ｎｍ
。
ルベンズシアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）およびＤ 、 ０１ ％過酸化水素（Ｈ２０□）を
含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｌ−１４，１）か
らなる基質溶液を各ウェルに１００μｍ添加し、室温で
１０分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を
１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロ
タイタープレートを各ウェルについて、波長４１５ｎｍ
。
対象波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイター
プレートリーダー（東ソー沖製、ＭＰ］？−Ａ４、商品
名）で測定した結果を表に示す。表からも明らかなよう
に、試料中の核酸は０，１〜１１００ｎ／ｍ Ｉの範囲
て定量できることが確認された。
プレートリーダー（東ソー沖製、ＭＰ］？−Ａ４、商品
名）で測定した結果を表に示す。表からも明らかなよう
に、試料中の核酸は０，１〜１１００ｎ／ｍ Ｉの範囲
て定量できることが確認された。
Claims (2)
- （１） ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ、特定の塩基配列を５′末端または３′末端に結合さ
せた一重鎖核酸プローブ ｃ、一重鎖に処理された試料中の核酸 ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法。 - （２） ａ、特定の塩基配列を認識する固定化モノクローナル抗
体（１） ｂ、特定の塩基配列に結合した、一重鎖に処理された試
料中の核酸 ｃ、一重鎖核酸プローブ ｄ、二重鎖核酸を構造特異的に認識するモノクローナル
抗体（２） を接触させ、遊離の核酸、抗体、核酸プローブを除去し
た後、生じた免疫反応生成物を定量することを特徴とす
る核酸の免疫学的測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22676990A JPH04110661A (ja) | 1990-08-30 | 1990-08-30 | 核酸の免疫学的測定方法 |
| EP91114548A EP0473158A1 (en) | 1990-08-30 | 1991-08-29 | Method for the immunoassay of a nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22676990A JPH04110661A (ja) | 1990-08-30 | 1990-08-30 | 核酸の免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04110661A true JPH04110661A (ja) | 1992-04-13 |
Family
ID=16850326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22676990A Pending JPH04110661A (ja) | 1990-08-30 | 1990-08-30 | 核酸の免疫学的測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0473158A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04110661A (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4623627A (en) * | 1983-08-19 | 1986-11-18 | Cetus Corporation | Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same |
| CA1253777A (en) * | 1984-06-01 | 1989-05-09 | Robert J. Carrico | Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes |
| ATE65092T1 (de) * | 1985-05-31 | 1991-07-15 | Amoco Corp | Verstaerkung von hybridisierungssignalen durch verwendung von komplementarischen dns-straengen. |
-
1990
- 1990-08-30 JP JP22676990A patent/JPH04110661A/ja active Pending
-
1991
- 1991-08-29 EP EP91114548A patent/EP0473158A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0473158A1 (en) | 1992-03-04 |
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