JPH04112800A - マイクロカプセル固定化酵素を用いた尿素定量分析方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液・食品・土壌等に含まれる尿素の定量方
法及びその装置に係り、操作が容易で応答性の優れた尿
素定量分析方法及びその装置に関する。

［従来の技術］ 尿素の定置分析として広く行われている方法は、尿素に
ウレアーゼを作用させてアンモニアを生成させ、これを
グルタミン酸デドロゲナーゼ及びニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを用い、比色法により定量する方法で
ある。この方法は、酵素を使い捨てにするために経済的
ではなく、体液のような着色試料はそのまま使うことが
できないという欠点があった。

酵素を繰り返し使用する方法として、酵素を膜に固定化
し、この酵素膜でイオン選択性電極やガス電°極を被覆
して使用する方法が検討されたが、酵素膜を電極で覆う
ため、膜を通しての透過・拡散に時間を要し、応答速度
が遅くセンサーとして使用するには不十分であった。ま
た、酵素膜の取り付は方が感度に影響したり、膜の付は
替えの手間などの不便さがあった。この問題を改善する
ために、ＰＶＣを母材とするイオン選択性電極に直接酵
素を化学結合で固定化する方法が考案された。

この方法により、応答速度は改善されたが、体液等に含
まれる蛋白質が膜表面の酵素に付着すること、或は、蛋
白質分解酵素による酵素の分解などのために、センサー
としての性能を長期間安定に維持することは難しかった
。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、従来法では酵素の活性を長期間安定に維持し
たまま、繰り返し使用することが困難であったこと、セ
ンサーとして固定化酵素を用いる場合に応答時間が長い
こと、また固定化酵素の取り付は操作が煩雑なことなど
の課題を解決することを目的としたものである。

口課題を解決するための手段］ 酵素をマイクロカプセル中に固定化することは、従来か
ら知られており、バイオリアクター等に応用されている
。しかしながら、マイクロカプセル固定化酵素をセンサ
ーへ応用した例はこれまでに全くない。本発明では、界
面重合法　により合成したマイクロカプセルの膜厚が、
数ｎ嘗程度と非常に薄く半透過性であることか呟　基質
・反応生成物の透過が非常にはやいこと、酵素を安定化
剤とともに固定化できること、および酵素が半透過性の
高分子膜で覆われているため、蛋白質の付着や蛋白質分
解酵素による分解反応を受けることがなく、酵素活性を
長期間安定に維持できる可能性があることに看目し、セ
ンサーへの応用を検討した。本発明は、被測定試料をマ
イクロカプセル中に固定化した酵素を充填したカラム内
へ供給し、被測定試料中の尿素を酵素反応により分解し
、その時生成するアンモニウムイオンを測定することに
よって尿素の定量を行なう方法である。さらに、本発明
方法は、マイクロカプセル中に固定化した酵素を充填す
るカラムと、被測定試料を前記カラムへ供給する供給手
段と、被測定試料中の尿素が前記酵素により分解され、
その時生成されるアンモニウムイオンを測定する電極と
、該電極の電位変化を検出する電位計とからなる尿素定
量分析装置を用いることによって行なうことができる。

［作用］ 被測定試料（尿素水溶液）は、サンプル注入バルブから
経路内に一定量供給され、固定化酵素カラム内で酵素反
応を受け、反応生成物であるアンモニウムイオンが電極
で感知される。この時の電位変化を電位計で検出するこ
とにより尿素濃度の測定を行う。

［実施例］ マイクロカプセル固定化酵素は、特公昭５１１６５１３
号公報記載の方法によって作成した。

また、酵素反応により生成したアンモニウムイオンを測
定するための電極７は、アンモニウムイオン電極７ａと
Ａｇ／ＡｇＣ１電極７ｂからなる。

アンモニウムイオン電極７ａを第１図のように作成し、
アンモニウム感応膜４の作成法としては、抗性物質ノナ
クチン・アジピン酸ジオクチル・ポリ塩化ビニルをテト
ラヒドロフランに溶解し、これをシャーレに注ぎ、１〜
２日室温で静置する。

溶媒が蒸発した後に生成した膜を切抜き、中空のポリ塩
化ビニル管２の先端にはりつけ電極とした。

本発明における尿素定量分析装置の構成を第２図に示す
。

被測定試料を固定化酵素カラム６へ供給するための供給
手段は、緩衝液タンク８と定量ポンプ９とサンプル注入
バルブ５からなる。緩衝液としては、Ｑ’−０５Ｍトリ
ス塩緩衝液またはＬＩＭリノ酸緩衝液が好ましい。一定
温度に保たれた緩衝液は定置ポンプ９により一定流量で
送液され、サンプル注入バルブ　５、固定化酵素カラム
６（アクリル製、内径３−■、長さ３ｏｗｓ）、電極７
を通過した後、装置外へ排出される。被測定試料の供給
は、サンプル注入バルブ５を切り替えることによって行
われる。

測定終了後のマイクロカプセル固定化酵素は、カラム内
において緩衝液中で保存される。また、測定に際しＮａ
”やに゛のような妨害イオンの影響を防ぐために、固定
化酵素カラム６の前に、陽イオン交換樹脂カラムを設置
してもよい。さらに、尿あるいは血液中の定置において
は、サンプル中に存在スるアンモニウムイオンが正の誤
差要因となることがら、この誤差を防ぐために、第３図
に示すように固定化酵素カラム６の前に電極７を設置し
、共存するアンモニウムイオンを定量し、補正を行なう
ことにとり精度よく尿素を定量することができる。

例１ 本発明尿素測定装置の測定条件として、０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液流量３　ｍ　ｌ　／　ｓｉｎ、　　マイク
ロカプセル固定化酵素充填量はウレアーゼとして約２．
３ｍｇ１１１２０ユニツト）、サンプル注入量５００μ
１１測定温度２５℃という条件で行った。このようにし
て尿素水溶液を測定した時の電位変化を第４図に示す。

また、尿素濃度とピーク電位の関係の一例を第５図に示
す。この結果、１０−’Ｍ　（約６ＰＰ園）から１０−
　Ｍ　（約６０００ＰＰｍ）の広い範囲でネルンストの
式が成立し、この濃度範囲が測定可能であった。

９０％応答時間は、１０秒以内であり早い応答を示した
。測定精度を調べるため、１０−３Ｍの尿素水溶液を１
０点連続して測定した結果、変動率は約２％と良好であ
った。また、低濃度（５Ｘ　１０−’Ｍ　）と高濃度（
１０〜２Ｍ）の尿素水溶液を交互に測定した結果、第６
図に示すように、再現性よく測定することができた。

例２ マイクロカプセル化ウレアーゼはＯ，ＩＭりん酸緩ｌ１
ｉｆｆｌ中約５℃で、また、アンモニウムイオン電極は
感応膜部分を純水中に浸し室温（１０〜２０’Ｃ）で保
存し両者の経時変化が、尿素センサーの性能に及ぼす影
響を調査した結果、三ケ月後においても、尿素濃度ｌＯ
−′〜１０−’Ｍの範囲でネルンストの式が成立した。

直線の回帰式は、日々若干変動するものの、傾きは常に
５０ｉｖ／ｄｅｃａｄｅを維持しており、センサーとし
ての性能を十分に満足していた。測定日ごとに直線の回
帰式を補正することにより、精度よく測定することが可
能であった。

［発明の効果コ 本発明によれば、酵素がヘモクロビンなどの安定化剤と
ともに固定化されていること、半透過性の高分子膜で保
護されているため蛋白質等の付着や蛋白質分解酵素によ
る酵素の分解がないこと、および酵素の漏出がないこと
により、長期間安定に尿素を測定することができる。ま
た、マイクロカプセルの膜厚が数１１と非常に薄く半透
過性であるため、尿素測定時の応答時間は１０秒程度と
速い。

更に、マイクロカプセル固定化酵素の交換は、カラムに
新しいマイクロカプセル固定化酵素を詰め替えるだけで
あり、容易に行なうことができるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アンモニウムイオン電極の［１’図、箪２図
及び第３図は尿素定量分析装置の構成図、箪４図は尿素
水溶液測定時の電位変化を示すグラフ、第５図は尿素水
溶液濃度とピーク電位の関係を示すグラフ、第６図は尿
素水溶液の濃度測定の再現性を示すグラフである。 ｌ・・・Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極、２・・・ポリ塩化ビ
ニル管、３　＝０．１ＭＮＩ（ａＣＩ　ａ　ｑ、　　４
−７７モニウム感応膜、５川サンプル注入バルブ、６・
・・固定化酵素カラム、７　・・・電極ｓ　　７ａ・・
・アンモニウムイオン電極、７ｂ・・・Ａ　ｇ　／　Ａ
　ｇ　Ｃ１電極、８・・緩衝液タンク、９・−・定量ポ
ンプ、１ｏ・電位計、　１１・記１１ｇ＋、１２・・・
パーソナルコンピューター　　１３・・・恒温槽 特許出願人　日本たばこ産業株式会社 第１図 第３図 第２図 胃 測定順序 第６図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）マイクロカプセル中に固定化した酵素を充填した
   カラム内へ被測定試料を供給し、被測定試料中の尿素が
   該酵素により分解され、その時生成されたアンモニウム
   イオンを測定することを特徴とする尿素定量分析方法。
2. （２）前記酵素がウレアーゼである請求項（１）に記載
   の尿素定量分析方法。
3. （３）マイクロカプセル中に固定化した酵素を充填する
   カラムと、被測定試料を前記カラムへ供給する供給手段
   と、被測定試料中の尿素を該酵素によって分解し、その
   時生成するアンモニウムイオンを測定する電極と、該電
   極の電位変化を検出する電位計とからなる尿素定量分析
   装置。