JPH04118614A - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は暗視野測光方式の共焦点走査型顕微鏡に関し、
特に詳細には、光点の走査機構が改良された暗視野測光
方式の共焦点走査型顕微鏡に関するものである。

（従来の技術） 従来より、照明光を微小な光点に収束させ、この光点を
試料上において２次元的に走査させ、その際該試料を透
過した光あるいはそこで反射した光、さらには試料から
発せられた蛍光を光検出器で検出して、試料の拡大像を
担持する電気信号を得るようにした光学式走査型顕微鏡
が公知となっている。

なかでも、照明光を光源から発生させた上で試料上にお
いて光点に結像させる一方、この試料からの光束を再度
点像に結像させてそれを光検出器で検出するように構成
した共焦点走査型顕微鏡は、試料面上にピンホールを配
する必要が無く、実現容易となっている。なお特開昭６
２−２１７２１１ｉ号公報には、この共焦点走査型顕微
鏡の一例が示されている。

また、このような共焦点走査型顕微鏡において、解像度
を超えた微小物体像を識別可能とするために、暗視野測
光方式の適用も考えられている。この暗視野測光方式の
共焦点走査型顕微鏡は基本的に、 照明光を発する光源と、 試料が載置される試料台と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
る送光光学系と、 上記試料を透過した直接光を遮断するビームトラップを
含み、この試料で散乱した光を集光して点像に結像させ
る受光光学系と、 この点像を検出する光検出器と、 上記光点を試料上において２次元的に走査させる走査機
構とから構成されるものである。

（発明が解決しようとする課題） 従来の共焦点走査型顕微鏡においては、上記走査機構と
して、 ■試料台を２次元的に移動させる機構、あるいは■照明
光ビームを光偏向器によって２次元的に偏向させる機構
が用いられていた。

しかし■の機構を採用した場合には、高速走査を行なう
と試料が飛んでしまうという問題が生じていた。顕微鏡
で観察される試料としては生物試料も多く、この生物試
料を観察する際に高速走査ができないと、生物試料の微
妙な動きを捕えることが不可能となる。また、このよう
な生物試料に限らなくても、はぼリアルタイムで試料像
を撮像したいという要求は広く存在するものであり、高
速走査が不可能であれば、当然、このような要求に応え
ることができない。

一方、■の機構によれば十分高速の走査が可能であるが
、この機構においては、ガルバノメータミラーやＡＯＤ
　（音響光学光偏向器）等の高価な光偏向器が必要であ
るという難点が有る。またこの■の機構においては、照
明光ビームを光偏向器で振るようにしているから、送光
光学系の対物レンズにはこの光ビームが刻々異なる角度
で入射することになり、それによる収差を補正するため
に対物レンズの設計か困難になるという問題も認められ
ている。特にＡＯＤを使用した場合には、対物レンズ以
外にもＡＯＤから射出した光束に非点収差が生ずるため
特殊な補正レンズが必要となり、光学系をより複雑なも
のとしている。

そこで本発明は、高速走査が可能で、その一方、構成が
簡単で安価に形成することができる、暗視野測光方式の
共焦点走査型顕微鏡を提供することを目的とするもので
ある。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明による暗
視野測光方式の共焦点走査型顕微鏡は、先に述べたよう
な試料台と、光源と、送光光学系と、ビームトラップを
含む受光光学系と、光検出器と、光点の２次元走査機構
とを備えた共焦点走査型顕微鏡において、 上記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移動
台と、 この移動台を、上記光点が試料上を一方向に主走査する
ように往復移動させる主走査手段と、上記移動台と試料
台とを、上記主走査の方向とほぼ直交する方向に、該主
走査の速度よりも低い速度で相対移動させて、上記光点
を試料上において副走査させる副走査手段とによって走
査機構を構成したことを特徴とするものである。

なお上述の副走査手段は、移動台を移動させるものであ
ってもよいし、それとは反対に、試料台を移動させるも
のであってもよい。副走査速度は比較的低速とすること
ができるから、上記のように試料台を移動させても、試
料が飛んでしまうことを防止可能である。

上記の構成においては、光点走査のために照明光ビーム
が振られることがないから、光学系の設計は光軸上の光
線のみを考えて行なえばよいことになり、該光学系の設
計は非常に容易となる。

（実　施　例） 以下、図面に示す実施例に基づいて本発明の詳細な説明
する。

第１図は、本発明の第１実施例による透過型共焦点走査
型顕微鏡を示すものであり、また第２および３図は、そ
れに用いられた走査機構を詳しく示している。第１図に
示されるように、ＲＧＢレーザ１０からは、赤色光、緑
色光および青色光からなる照明光１１が射出される。こ
の照明光１１はビームコンプレッサ１２でビーム径が縮
小され、屈折率分布型レンズ１３で集光されてシングル
モード光ファイバー１４内に入射せしめられる。

この光ファイバー１４の一端は移動台１５に固定されて
おり、該光フアイバー１４内を伝搬した照明光１１はこ
の一端から出射する。この際光ファイバー１４の一端は
、点光源状に照明光１１を発することになる。移動台１
５には、コリメーターレンズ１６および対物レンズ１７
からなる送光光学系１８と、対物レンズ１９、集光レン
ズ２０およびそれらの間に配されたビームトラップ５か
らなる受光光学系２１とが、互いに光軸を一致させて固
定されている。また両光学系１８．２１の間には、移動
台１５と別体とされた試料台２２が配されている。なお
受光光学系２１のＮＡ（開口数）は、送光光学系１８の
それよりも大とされている。

上記の照明光１１はコリメーターレンズ１６によって平
行光とされ、次に対物レンズ１７によって集光されて、
試料台２２に載置された試料２３上で微小な光点Ｐに結
像する。試料２３を透過した透過光１１’の光束は、受
光光学系２１に中心直接光として入射し、ビームトラッ
プ５によって遮断される。一方試料２３で生じた散乱光
１１＝は、対物レンズ１９および集光レンズ２０によっ
て集光されて、シングルモード光ファイバー２４の一端
から該光フアイバー２４内に入射せしめられる。この光
ファイバー２４の上記一端は移動台１５に固定されてお
り、またその他端には屈折率分布型レンズ２５が接続さ
れている。

光フアイバー２４内を伝搬した散乱光１１−はその他端
から出射し、上記屈折率分布型レンズ２５によって平行
光とされる。

この散乱光１１”はダイクロイックミラー２６に入射し
、その青色光１１Ｂのみがそこで反射し、該青色光１１
Ｂは第１光検出器２７によって検出される。

ダイクロイックミラー２６を透過した散乱光１１”は別
のダイクロイックミラー２８に入射し、その緑色光１１
Ｇのみがそこで反射する。この緑色光１１Ｇは、第２光
検出器２９によって検出される。そして上記ダイクロイ
ックミラー２８を透過した散乱光１１”（すなわち赤色
光１１Ｒ）はミラー３０において反射して、第３光検出
器３１によって検出される。

なお上記光検出器２７．２９．３１としては例えばフォ
トダイオード等が用いられ、それらからは各々、試料２
３の拡大像の青色成分、緑色成分、赤色成分を担持する
信号ＳＢ、ＳＧ、ＳＲが出力される。

上述した通りこの共焦点走査型顕微鏡においては、暗視
野測光方式が適用されているから、上記信号ＳＢ、ＳＧ
、ＳＲにより、解像度を超えた微小物体像を識別可能な
カラー顕微鏡像を再生することができる。

次に、照明光１１の光点Ｐの２次元走査について、第２
．３図を参照して説明する。第２図と第３図はそれぞれ
、移動台１５の周辺部分を、第１図の上方側、右方側か
ら見た状態を示している。この移動台１５は架台３２に
、積層ピエゾ素子３３を介して保持されている。積層ピ
エゾ素子３３はピエゾ素子駆動回路３４から駆動電力を
受けて、移動台１５を矢印Ｘ方向に高速で往復移動させ
る。この往復移動の振動数は、例えば１０ｋＨｚとされ
る。その場合、主走査幅を１００μｍとすると、主走査
速度は、１０ＸＩＯ３Ｘ１００　ＸｌＯ４Ｘ２−２ｍ／
ｓとなる。なお、光ファイバー１４．２４は可撓性を有
するので、それぞれ照明光１１．散乱光１１’を伝搬さ
せつつ、移動台１５の振動を許容する。

一方試料台２２は、２次元移動ステージ３５に固定され
ている。この２次元移動ステージ３５は、モータ駆動回
路３６から駆動電流を受けるパルスモータ３７により、
マイクロメータ３８を介して矢印Ｙ方向に往復移動され
る。それにより試料台２２は移動台１５に対して相対移
動され、前記光点Ｐが試料２３上を、前記主走査方向Ｘ
と直交するＹ方向に副走査する。なおこの副走査の所要
時間は例えば１／２０秒とされ、その場合、副走査幅を
１００μｍとすると、副走査速度は、 ２０Ｘ１００　ＸＩＯ’　−０，００２ｍ／　ｓ＝２ｍ
ｍ／ｓ と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。この程度の
副走査速度であれば、試料台２２を移動させても、試料
２３が飛んでしまうことを防止できる。

以上のようにして光点Ｐが試料２３上を２次元的に走査
することにより、該試料２３の２次元像を担持する時系
列の信号ＳＢ、ＳＧ、ＳＲが得られる。

これらの信号ＳＢ、ＳＧ、ＳＲは、例えば所定周期毎に
積分する等により、画素分割された信号とされる。

また本実施例においては２次元移動ステージ３５が、モ
ータ駆動回路３９から駆動電流を受けるパルスモータ４
０により、主、副走査方向ＸＳＹと直交する矢印Ｚ方向
（すなわち光学系１８．２１の光軸方向）に移動される
。こうして２次元移動ステージ３５を２方向に所定距離
移動させる毎に前記光点Ｐの２次元走査を行なえば、合
焦点面の情報のみが光検出器２７．２９．３１によって
検出される。そこで、これらの光検出器２７．２９．３
１の出力ＳＢ、５ＧＳＲをフレームメモリに取り込むこ
とにより、試料２３を２方向に移動させた範囲内で、全
ての面に焦点が合った画像を担う信号を得ることが可能
となる。

なおピエゾ素子駆動回路３４およびモータ駆動回路３６
．３９には、制御回路４１から同期信号が入力され、そ
れにより、光点Ｐの主、副走査および試料台２２のＺ方
向移動の同期が取られる。

以上説明した実施例においては、種々の変更が可能であ
る。例えばビームコンプレッサ１２でビーム径が縮小さ
れた照明光１１は、屈折率分布型レンズ１３で集光され
てシングルモード光ファイバー１４内に入射せしめられ
るが、この屈折率分布型レンズ１３の代わりに顕微鏡対
物レンズ等を用いてもよく、またシングルモード光ファ
イバー１４は、マルチモードのものにピンホール等をつ
けたものでもよい。

また、受光光学系２Ｉ側の集光素子である屈折率分布型
レンズ２５は、顕微鏡対物レンズ等であってもよい。そ
して、２次元移動ステージ３５に固定された試料台２２
をＹ方向に往復移動（副走査）させるための駆動源であ
るパルスモータ３７は、エンコーダ付きのＤＣモータで
もよく、またこのように試料台２２を移動させることに
よって光点Ｐの副走査を行なう代わりに、移動台１５を
移動させることによって光点Ｐの副走査を行なうように
してもよい。さらに移動台１５の移動は積層ピエゾ素子
３３を利用して行なう他、例えばボイスコイルや音叉、
あるいは超音波による固体の固有振動を利用した走査方
式等を用いて行なうことも可能である。

次に第４図を参照して、本発明の別の実施例によるモノ
クロ透過型の共焦点走査型顕微鏡について説明する。こ
の実施例においては、送光光学系および受光光学系と共
に、光源および光検出器もまた移動台に一体的に保持さ
れており、これにより光学系がさらに簡素化されたコン
パクトな共焦点走査型顕微鏡が実現されている。なお第
４図において、第１図ないし第３図と共通部分には同じ
番号を付し、それらについての詳細な説明は省略する（
以下、同様）。

この実施例では、照明光１１を発する光源としてレーザ
ダイオード５１が用いられており、このレーザダイオー
ド５Ｉは移動台１５に一体的に保持されている。このレ
ーザダイオード５１から発せられた照明光１１は、同じ
く移動台１５に一体的に保持された送光光学系１８に直
接入射し、これにより前記実施例と同様に試料２３上に
微小な光点Ｐとして結像せしめられる。

試料２３を透過して受光光学系２Ｉに中心直接光として
入射した透過光１１’　は、ビームトラップ５によって
遮断される。一方、試料２３で生じた散乱光１１°は、
移動台１５に一体的に保持された受光光学系２１により
集光され、アパーチャピンホール５３を通過した後、同
様に移動台１５に一体的に保持された光検出器５２に直
接入射して、そこで結像する。

この実施例においても、光点Ｐの２次元走査は前記実施
例と同様に行なわれ、光検出器５２の出力がフレームメ
モリに取り込まれることにより、試料２３の２方向移動
範囲内で、全ての面に焦点が合った画像を担う信号が得
られる。

なお、上記第４図の実施例のように照明光源と光検出器
とを移動台１５に固定する場合でも、３色の光源と、各
色数乱光を検出する光検出器とを設けることにより、カ
ラー画像を撮像可能となる。

また前記第１図の実施例のように、照明光源あるいは光
検出器と移動台１５との間に光ファイバーを介在させる
場合でも、モノクロ画像を得るように構成可能であるこ
とは言うまでも無い。

次に、第５図を参照して本発明の第３実施例について説
明する。この第３実施例の共焦点走査型顕微鏡も、第１
図の装置と同様にカラー透過型のものであるが、第１図
の装置と比べると、光ファイバー１４．２４の代わりに
それぞれ偏波面保存光ファイバー７０．７１が用いられ
、また送光光学系１８および受光光学系２１内に各々λ
／４板７２．７３が配され、そして偏波面保存光ファイ
バー７０に入射する前の照明光１１偏波面保存光ファイ
バー７１から出射した散乱光１１”がそれぞれλ／２板
７４．７５に通される点が異なっている。

上記偏波面保存光ファイバー７０としては、第６図に断
面形状を示すように、クラッド７０ａ内にコア７０ｂが
配され、このコア７０ｂの両側に応力付与部７０Ｃ％　
７０Ｃが形成されてなる、いわゆるＰＡＮＤＡ型のもの
が用いられている。そして直線偏光した照明光１１は、
λ／２板７４を適宜回転させることにより、偏波面の向
きが応力付与部７０ｃ、７Ｑ（の並び方向（矢印Ｖ方向
）、あるいはそれに直交する方向（矢印Ｕ方向）と揃う
状態にして、該光フアイバー７０内に入射せしめられる
。なおもう−方の偏波面保存光ファイバー７１も、上記
偏波面保存光ファイバー７０と同様のものである。

偏波面保存光ファイバー７０を伝搬した後、送光光学系
１８のコリメーターレンズ１６によって平行光とされた
照明光１１は、λ／４板７２を通過して円偏光とされ、
次に対物レンズ１７によって集光されて、試料台２２に
載置された試料２３上で（表面あるいはその内部で）微
小な光点Ｐに結像する。

この場合も、試料２３を透過した透過光１１’　の光束
は、ビームトラップ５によって遮断される。−方試料２
３で生じた散乱光１１°は、受光光学系２１の対物レン
ズ１９によって平行光とされた後、λ／４板７３により
円偏光から直線偏光に変換され、次に集光レンズ２０に
よって集光されて、偏波面保存光ファイバー７１の一端
から該光フアイバー７１内に入射する。

偏波面保存光ファイバー７１から出射した散乱光１１°
は、λ／２板７５を適宜回転させることにより、ダイク
ロイックミラー２６．２ｇにＰ偏光あるいはＳ偏光の状
態で入射せしめられる。

上記の構成においては、照明光１１、散乱光１１″を伝
搬させる光ファイバーとして、偏波面保存光ファイバー
７０．７１を用いているので、それらの光１１、１１″
のゆらぎが抑えられるようになる。したがって、この散
乱光１１”を検出した出力ＳＢ、ＳＧ、ＳＲに基づいて
再生される顕微鏡像は、ムラの無い高画質のものとなり
うる。

また上記の構成において、照明光１１は円偏光状態で送
光光学系１８から出射してそのまま受光光学系２１に入
射するから、移動台１５部分の組立てに際して、両光学
系１１ｉ、　２１間で偏波面を合わせる調整は不要であ
る。したがって、両光学系１８．２１の組立ては各々別
個に行なっておき、これら両光学系１１１１、２１を光
軸合せのみで組み合わせることができるから、移動台１
５部分の組立ては容易になされうる。

ナオ、λ／４板７２および７３を設ければ、上述の通り
の効果が得られるので好ましいが、これらのλ／４板７
２および７３を省いても構わない。その場合は、光学系
の組立てに際して偏波面保存光ファイバー７０と７１と
を、応力付与部の並び方向が互いに合致するように、あ
るいは９０＠ずれるように位置合わせ（軸周り方向の回
転位置合わせ）すればよい。

同様に、λ／２板７４あるいは７５を省くこともできる
。そうする場合は、偏波面保存光ファイバー７０あるい
は７１を上記のように軸周り方向に回転させることによ
り、各々の保存する偏波面の向きを、照明光１１あるい
はダイクロイックミラー２６．２Ｂに対して調整すれば
よい。

次に、第７図を参照して本発明の第４実施例について説
明する。本実施例の共焦点走査型顕微鏡は、第５図図示
の第３実施例装置と比べると、基本釣に、送光光学系１
８のコリメーターレンズ１６と対物レンズ１７との間に
、円板状のビームトラップ３が配され、そしてビームト
ラップ５に代えて環状のビームトラップ４が用いられて
いる点が異なっている。

この装置においては、上述のビームトラップ３により照
明光１１が輪帯照明光とされる。したがって、試料２３
を透過した透過光（直接光）１１゛　　も輪帯光となり
、この透過光１１°は上記環状のビームトラップ４によ
って遮断される。そして試料２Ｂで生じた散乱光１１”
は対物レンズ１９の広い中央部分に入射し、最終的に光
検出器２７．２９．３１によって検出される。

なお第７図図示のように、受光側の偏波面保存光ファイ
バー７１の光入射端前方には、集光レンズ２０による集
光スポット径と等しい径の開口を有するアパーチャピン
ホール２を配置するのが望ましい。

また、以上説明したような輪帯照明光を利用する構成は
、第１図あるいは第４図図示の基本構成を有する共焦点
走査型顕微鏡においても、同様に適用可能である。

（発明の効果） 以上詳細に説明した通り、本発明の共焦点走査型顕微鏡
においては、送光光学系と受光光学系とを一体的に移動
台に保持させ、この移動台を往復移動させて光点の主走
査を行なうように構成したから、試料台を高速で移動さ
せる必要がなく、よって試料が飛んでしまうことを防止
可能で、また、高速走査も可能となる。

そして本発明の共焦点走査型顕微鏡においては、照明光
ビームが振られることがないから、光学系の設計が容易
となり、またガルバノメータミラーやＡＯＤ等の高価な
光偏向器が不要で簡単な構造となっているから、本装置
は従来の共焦点走査型顕微鏡に比べて安価に形成可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の第１実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、 第２図と第３図はそれぞれ、上記共焦点走査型顕微鏡の
要部を示す平面図と側面図、 第４図は、本発明の第２実施例による共焦点走査ｙＪ！
顕微鏡を示す概略正面図、 第５図は、本発明の第３実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、 第６図は、上記第３実施例の共焦点走査型顕微鏡に用い
られた偏波面保存光ファイバーの断面図、第７図は、本
発明の第４実施例による共焦点走査型顕微鏡を示す概略
正面図である。 ３．４．５・・・ビームトラップ ｌＯ・・・ＲＧＢレーザ　　　１１・・・照明光１１°
・・・透過光　　　　　１１’・・・散乱光１４．２４
・・・光ファイバー　１５・・・移動金工６・・・コリ
メーターレンズ　１７．１９・・・対物レンズ１８・・
・送光光学系　　　　２０・・・集光レンズ２１・・・
受光光学系　　　　２２・・・試料台２３・・・試料 ２Ｂ、２８・・・ダイクロイックミラー２７．２９．８
１．５２・・・光検出器３０・・・ミラー　　　　　　
３２・・・架台３３・・・積層ピエゾ素子　　３４・・
・ピエゾ素子駆動回路３５・・・２次元移動ステージ ３Ｂ、３９・・・モータ駆動回路　３７．４０・・・パ
ルスモータ３８・・・マイクロメータ　　　４１・・・
制御回路５１・・・レーザダイオード ５３・・・アパーチャピンホール ７０．７１・・・偏波面保存光ファイバー７２．７３・
・・λ／４板　　　７４．７５・・・λ／２板第 図 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料が載置される試料台と、 照明光を発する光源と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
   る送光光学系と、 前記試料を透過した直接光を遮断するビームトラップを
   含み、この試料で散乱した光を集光して点像に結像させ
   る受光光学系と、 この点像を検出する光検出器と、 前記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移動
   台と、 この移動台を、前記光点が前記試料上を一方向に主走査
   するように往復移動させる主走査手段と、前記移動台と
   試料台とを、前記主走査の方向とほぼ直交する方向に、
   該主走査の速度よりも低い速度で相対移動させて、前記
   光点を前記試料上において副走査させる副走査手段とか
   らなる共焦点走査型顕微鏡。