JPH0411892A - ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 - Google Patents
ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法Info
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- JPH0411892A JPH0411892A JP17985190A JP17985190A JPH0411892A JP H0411892 A JPH0411892 A JP H0411892A JP 17985190 A JP17985190 A JP 17985190A JP 17985190 A JP17985190 A JP 17985190A JP H0411892 A JPH0411892 A JP H0411892A
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- streptokinase
- amino acid
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- gene
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列をコ
ードする塩基配列を含む新規な化学合成遺伝子、その対
応プラスミド組換え体、対応形質転換体及びその培養に
よるストレプトキナーゼの製造法並びに改変されたアミ
ノ酸−次配列を有する新規なストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質、該蛋白質をフードする塩基配列を含む化学合成
遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド組換え体、該組換え
体で形質転換された形質転換体及び該形質転換体の培養
によるストレプトキナーゼ誘導体蛋白質の製造法に関す
る。
ードする塩基配列を含む新規な化学合成遺伝子、その対
応プラスミド組換え体、対応形質転換体及びその培養に
よるストレプトキナーゼの製造法並びに改変されたアミ
ノ酸−次配列を有する新規なストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質、該蛋白質をフードする塩基配列を含む化学合成
遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド組換え体、該組換え
体で形質転換された形質転換体及び該形質転換体の培養
によるストレプトキナーゼ誘導体蛋白質の製造法に関す
る。
従来の技術
ストレプトキナーゼは、溶血性連鎖球菌により生産、分
泌される血栓溶解作用を有する分子量的４７０００の蛋
白質である。該蛋白質のアミノ酸−次配列は後記式（１
）に示され、その産生菌であるストレプトコッカス エ
キシミリス［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓ
ｉｍｉｌｉｓ Ｈ４６Ａ（Ｇｒｏｕｐ Ｃ） ］のＤＮ
Ａより、その全塩基配列も決定されている。
泌される血栓溶解作用を有する分子量的４７０００の蛋
白質である。該蛋白質のアミノ酸−次配列は後記式（１
）に示され、その産生菌であるストレプトコッカス エ
キシミリス［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓ
ｉｍｉｌｉｓ Ｈ４６Ａ（Ｇｒｏｕｐ Ｃ） ］のＤＮ
Ａより、その全塩基配列も決定されている。
上記ストレプトキナーゼは、また欧米諸国において既に
血栓溶解剤として臨床使用されており、例えば肺栓塞、
急性心筋梗塞患者等の治療等に広く用いられ、効果も充
分に証明されている。
血栓溶解剤として臨床使用されており、例えば肺栓塞、
急性心筋梗塞患者等の治療等に広く用いられ、効果も充
分に証明されている。
しかしながら、上記起源細菌の培養によってストレプト
キナーゼを製造する場合、培養液中にはストレプトキナ
ーゼ以外の幾つかの細胞外分泌物が含まれ、之等の多く
はヒトに対して毒性を有するかその可能性があり、上記
培養液から臨床応用のためのストレプトキナーゼを調製
するには、細心の注意を払って多段階の精製操作を行な
う必要がある。また上記起源細胞の培養により得られる
ストレプトキナーゼは、その抗原性に起因する各種のシ
ョック症状の発症等が報告されており、該抗原性の低減
技術乃至抗原性の低下された新しいストレプトキナーゼ
誘導体の開発が当業界で要望されている。更にストレプ
トキナーゼはその臨床使用に際しての血中での安定性の
向上や特異的に血栓を溶解する特性の改善等も望まれて
いる。
キナーゼを製造する場合、培養液中にはストレプトキナ
ーゼ以外の幾つかの細胞外分泌物が含まれ、之等の多く
はヒトに対して毒性を有するかその可能性があり、上記
培養液から臨床応用のためのストレプトキナーゼを調製
するには、細心の注意を払って多段階の精製操作を行な
う必要がある。また上記起源細胞の培養により得られる
ストレプトキナーゼは、その抗原性に起因する各種のシ
ョック症状の発症等が報告されており、該抗原性の低減
技術乃至抗原性の低下された新しいストレプトキナーゼ
誘導体の開発が当業界で要望されている。更にストレプ
トキナーゼはその臨床使用に際しての血中での安定性の
向上や特異的に血栓を溶解する特性の改善等も望まれて
いる。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、ストレプトキナーゼを容易に、高純度
で且つ大量に製造することのできる、遺伝子組換え技術
を利用した製造法、殊に該方法のための大腸菌での生産
を容易なものとするヌクレオチドコドンを採用したスト
レプトキナーゼの化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した
対応プラスミド組換え体（ストレプトキナーゼ発現ベク
ター）、該早換え体により形質転換された宿主細胞（形
質転換体）及びその培養製造技術を提供することにある
。
で且つ大量に製造することのできる、遺伝子組換え技術
を利用した製造法、殊に該方法のための大腸菌での生産
を容易なものとするヌクレオチドコドンを採用したスト
レプトキナーゼの化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した
対応プラスミド組換え体（ストレプトキナーゼ発現ベク
ター）、該早換え体により形質転換された宿主細胞（形
質転換体）及びその培養製造技術を提供することにある
。
また本発明の目的は、ストレプトキナーゼ本来の活性、
殊に血栓溶解活性を有しており、しがもストレプトキナ
ーゼ特異抗体との結合性並びにこれを投与した場合の特
異抗体の産生（抗原性）が共に低下された新しいストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質を提供することにある。
殊に血栓溶解活性を有しており、しがもストレプトキナ
ーゼ特異抗体との結合性並びにこれを投与した場合の特
異抗体の産生（抗原性）が共に低下された新しいストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質を提供することにある。
本発明の他の目的は、血中での安定性が向上され、血栓
溶解特性のより向上された上記誘導体蛋白質を提供する
ことにある。
溶解特性のより向上された上記誘導体蛋白質を提供する
ことにある。
更に本発明は、上記新しいストレプトキナーゼ誘導体蛋
白質を容易に高純度で且つ大量に製造可能とする遺伝子
組換え技術を利用した該蛋白質の製造法、殊に該方法の
ための大腸菌での生産を容易なものとするヌクレオチド
コドンを採用した化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した
対応プラスミド組換え体（発現ベクター）、数組換え体
により形質転換された宿主細胞（形質転換体）及びその
培養による上記蛋白質の製造技術を提供することをも目
的とする。
白質を容易に高純度で且つ大量に製造可能とする遺伝子
組換え技術を利用した該蛋白質の製造法、殊に該方法の
ための大腸菌での生産を容易なものとするヌクレオチド
コドンを採用した化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した
対応プラスミド組換え体（発現ベクター）、数組換え体
により形質転換された宿主細胞（形質転換体）及びその
培養による上記蛋白質の製造技術を提供することをも目
的とする。
課題を解決するための手段
本発明によれば、下記式（１）のアミノ酸−次配列を有
する天然型ストレプトキナーゼをコードする化学合成遺
伝子、該遺伝子を挿入した対応プラスミド組換え体（天
然型ストレプトキナーゼ発現ベクター）、数組換え体に
より形質転換された対応形質転換体、及び該形質転換体
の培養による天然型ストレプトキナーゼの製造法が提供
される。
する天然型ストレプトキナーゼをコードする化学合成遺
伝子、該遺伝子を挿入した対応プラスミド組換え体（天
然型ストレプトキナーゼ発現ベクター）、数組換え体に
より形質転換された対応形質転換体、及び該形質転換体
の培養による天然型ストレプトキナーゼの製造法が提供
される。
式（１）：
％式％
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒ−５
ｅｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉ １
ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ
−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−５ｅｒ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉ １ｅ−Ｉ
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａ ｌａ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉ １ｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ また本発明によれば、ストレプトキナーゼ活性を有し、
天然型ストレプトキナーゼの上式（１）で示されるアミ
ノ酸配列（天然型ストレプトキナーゼ）のＣ末端側３７
３位以降を欠失すると共に、更に該配列中に少なくとも
１個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入がなされるこ
とのある改変されたアミノ酸−次配列を有するストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質が提供される。
ｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒ−５
ｅｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉ １
ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ
−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−５ｅｒ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ
−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｐｂｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉ １ｅ−Ｉ
１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａ ｌａ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉ １ｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ また本発明によれば、ストレプトキナーゼ活性を有し、
天然型ストレプトキナーゼの上式（１）で示されるアミ
ノ酸配列（天然型ストレプトキナーゼ）のＣ末端側３７
３位以降を欠失すると共に、更に該配列中に少なくとも
１個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入がなされるこ
とのある改変されたアミノ酸−次配列を有するストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質が提供される。
上記式（１）及び以下の本明細書におけるアミノ酸配列
及び各アミノ酸残基の略号による表示並びに塩基配列及
び核酸塩基、その他の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもの
とし、その例を次に挙げる。
及び各アミノ酸残基の略号による表示並びに塩基配列及
び核酸塩基、その他の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもの
とし、その例を次に挙げる。
Ａｌａ・・・アラニン Ａｒｇ・・・アルギニンＡ
ｓｎ・・・アスパラギン Ａｓｐ・・・アスパラギン酸
Ｃｙｓ・・・システィン Ｇｌｎ・・・グルタミンＧ
ｌｕ・・・グルタミン酸 Ｇｌｙ・・・グリシンＨｉｓ
・・・ヒスチジン Ｉｌｅ・・・イソロイシンＬｅｕ
・・・ロイシン Ｌｙｓ・・・リジンＮｅｔ・・・
メチオニン Ｐｈｅ・・・フェニルアラニンＰｒｏ・
・・プロリン Ｓｅｔ・・・セリンＴｈｒ・・・ス
レオニン Ｔｒｐ・・・トリプトファンＴｙｒ・・・
チロシン Ｖａｌ・・・バリンＡ・・・・・・アデ
ニン Ｔ・・・・・・チミンＧ・・・・・・グアニ
ン Ｃ・・・・・・シトシン但し、アミノ酸配列に
おける各アミノ酸残基の位置は、欠落及び挿入がある場
合でも全て上記式（１）のアミノ酸配列に従って表示す
るものとする。
ｓｎ・・・アスパラギン Ａｓｐ・・・アスパラギン酸
Ｃｙｓ・・・システィン Ｇｌｎ・・・グルタミンＧ
ｌｕ・・・グルタミン酸 Ｇｌｙ・・・グリシンＨｉｓ
・・・ヒスチジン Ｉｌｅ・・・イソロイシンＬｅｕ
・・・ロイシン Ｌｙｓ・・・リジンＮｅｔ・・・
メチオニン Ｐｈｅ・・・フェニルアラニンＰｒｏ・
・・プロリン Ｓｅｔ・・・セリンＴｈｒ・・・ス
レオニン Ｔｒｐ・・・トリプトファンＴｙｒ・・・
チロシン Ｖａｌ・・・バリンＡ・・・・・・アデ
ニン Ｔ・・・・・・チミンＧ・・・・・・グアニ
ン Ｃ・・・・・・シトシン但し、アミノ酸配列に
おける各アミノ酸残基の位置は、欠落及び挿入がある場
合でも全て上記式（１）のアミノ酸配列に従って表示す
るものとする。
本発明に係わる改変されたアミノ酸−次配列を有するス
トレプトキナーゼ誘導体蛋白質の好ましい例を挙げると
次の通りである。
トレプトキナーゼ誘導体蛋白質の好ましい例を挙げると
次の通りである。
（１）天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸配列（上式
（１）で示される）のＣ末端側３７３位以降が欠失され
たポリペプチド。
（１）で示される）のＣ末端側３７３位以降が欠失され
たポリペプチド。
（２）天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸配列のＣ末
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも４
５位Ａｒｇから６８位Ｇｕｙが欠失されたポリペプチド
。
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも４
５位Ａｒｇから６８位Ｇｕｙが欠失されたポリペプチド
。
（３）天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸配列のＣ末
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも１
１８位Ｐｈｅが欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換さ
れたポリペプチド。
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも１
１８位Ｐｈｅが欠失もしくは他のアミノ酸残基に置換さ
れたポリペプチド。
（４）天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸配列のＣ末
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも２
５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓが欠失もしくは他のア
ミノ酸残基に置換されたポリペプチド。
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも２
５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓが欠失もしくは他のア
ミノ酸残基に置換されたポリペプチド。
（５）天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸配列のＣ末
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも２
５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓのそれぞれの後に他の
アミノ酸残基が挿入されたポリペプチド。
端側３７３位以降を欠失すると共に、更に少なくとも２
５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓのそれぞれの後に他の
アミノ酸残基が挿入されたポリペプチド。
上記改変アミノ酸配列において、置換及び挿入を行ない
得る他のアミノ酸残基は、ストレプトキナーゼの蛋白質
を構成するものであればいずれでもよく、人体蛋白質構
成α−アミノ酸から選ばれるのがよい。その具体例とし
ては例えばＰｒｏ、Ｇｉｎ 、 Ｔｈｒ 、 Ｓｅｒ
、 Ｈｉｓ等を例示できる。ヨリ詳しくは上記２５６位
の置換を行なうためのアミノ酸残基としてはＧｉｎ 、
Ｔｈｒ Ｈｌｓ等を、また２５７位の置換のための
アミノ酸残基としてはＰｒｏ 、 Ｇｉｎ 、 Ｓｅｒ
、 Ｈｉｓを、２５６位及び２５７位の後に挿入され
るアミノ酸残基としてはＰｒｏをそれぞれ好適なものと
して例示できる。
得る他のアミノ酸残基は、ストレプトキナーゼの蛋白質
を構成するものであればいずれでもよく、人体蛋白質構
成α−アミノ酸から選ばれるのがよい。その具体例とし
ては例えばＰｒｏ、Ｇｉｎ 、 Ｔｈｒ 、 Ｓｅｒ
、 Ｈｉｓ等を例示できる。ヨリ詳しくは上記２５６位
の置換を行なうためのアミノ酸残基としてはＧｉｎ 、
Ｔｈｒ Ｈｌｓ等を、また２５７位の置換のための
アミノ酸残基としてはＰｒｏ 、 Ｇｉｎ 、 Ｓｅｒ
、 Ｈｉｓを、２５６位及び２５７位の後に挿入され
るアミノ酸残基としてはＰｒｏをそれぞれ好適なものと
して例示できる。
更に本発明によれば、上記改変されたアミノ酸−次配列
を有するストレプトキナーゼ誘導体蛋白質をコードする
塩基配列を含む化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した対
応プラスミド組換え体（ストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質発現ベクター）、数組換え体により形質転換された形
質転換体並びにその培養によるストレプトキナーゼ誘導
体蛋白質の製造方法が提供される。
を有するストレプトキナーゼ誘導体蛋白質をコードする
塩基配列を含む化学合成遺伝子、該遺伝子を挿入した対
応プラスミド組換え体（ストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質発現ベクター）、数組換え体により形質転換された形
質転換体並びにその培養によるストレプトキナーゼ誘導
体蛋白質の製造方法が提供される。
以下、本発明の天然型ストレプトキナーゼの製造技術及
び本発明ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質とその製造技
術につき、これらに利用される化学合成遺伝子、発現ベ
クター及び形質転換体を順次詳述する。
び本発明ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質とその製造技
術につき、これらに利用される化学合成遺伝子、発現ベ
クター及び形質転換体を順次詳述する。
本発明の天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列
をコードする化学合成遺伝子の塩基配列は、前記式（１
）のアミノ酸−次配列に基づき種々設定でき、その際に
は下記基準の採用が好ましい。
をコードする化学合成遺伝子の塩基配列は、前記式（１
）のアミノ酸−次配列に基づき種々設定でき、その際に
は下記基準の採用が好ましい。
１） 宿主細胞、例えば大腸菌での使用頻度の高いトリ
ヌクレオチドコドンを選択する。
ヌクレオチドコドンを選択する。
２）設定される塩基配列内及びその両端に特定の制限酵
素認識部位を持たせ、任意にその部位を操作して、他の
遺伝子等の塩基配列との連結やプラスミドベクターへの
挿入等を容易なものとする。
素認識部位を持たせ、任意にその部位を操作して、他の
遺伝子等の塩基配列との連結やプラスミドベクターへの
挿入等を容易なものとする。
３）化学合成した遺伝子（ＤＮＡ断片）を集合、連結さ
せる際に、目的とする連結状態とは異なる連結が起こら
ないか、又は最小限となるようにする。
せる際に、目的とする連結状態とは異なる連結が起こら
ないか、又は最小限となるようにする。
４）設計される塩基配列中に、例えば転写終結信号等の
不都合な配列が生じないようにする。
不都合な配列が生じないようにする。
５）引き続く遺伝子の改変を容易なものとするため適当
な位置に制限酵素認識部位を設ける。
な位置に制限酵素認識部位を設ける。
上記に従い設計された天然型ストレプトキナーゼの化学
合成遺伝子（塩基配列）の好ましい一興体例を、対応ア
ミノ酸配列と共に次式（２）に示す。
合成遺伝子（塩基配列）の好ましい一興体例を、対応ア
ミノ酸配列と共に次式（２）に示す。
式（２）：
％式％
ＡＡＡ ＣＣＧ ＴＴＣＧＣＴ ＡＣＴ ＧＡＣＴＣＴ
ＧＧＣＧＣＴ ＡＴＧＴＴＴ ＧＧＣＡＡＧ ＣＧＡ
ＴＧＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＣＣＧ ＣＧＡ ＴＡＣＬ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＡ
Ａ ＣＴＣＧＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＡＴ
ＣＴＧ ＣＴＧＡＧＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣＴＴＣＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣＧＡＣ
５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＴ
ＣＣＡＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＴＣ５ＣＴ Ａ
ＡＣＴＴＴ ＣＧＴ ＴＡＧ ＧＴＣＣＴＴ ＧＴＣ
ＧＡＣＴＡＧ ＣＧＡ ＴＴＧＬｙｓ−Ａｌａ−１１
ｅ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−ＧＴＡ ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＡＣＧＡＣＧ
ＡＣＴＡＣＴＴＴ ＧＡＧ ＧＴＡＣＡＴ ＧＴＡ Ａ
ＧＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＴ
ＣＣＡＴＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＡＴＣＧＡＣ
ＴＴＣＧＣＴ ＡＧＣＧＡＣＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＣＡ
ＣＣＴＡＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＣＴＧ
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天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列をコード
する互いに相補的な二本鎖ＤＮＡ配列として示されるが
、これを構成する各−本鎖ＤＮＡ配列もまた本発明に包
含される。
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Ａ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＴＡＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＴＧＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＣＡ
ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＴＧ
ＧＡＣＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＣＧＣＴＡ
Ｔ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＣＣＣＴ ＡＴＣＣ
ＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣＧＣＧ ＡＴＡ ＴＧＡ
ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＡＧ ＧＧＣ
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ｈｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−ＣＣ
Ｇ ＡＡＣＧＡＴ ＡＡＡ ３“ＧＧＣＴＴＧ
ＣＴＡ ＴＴＴ ５’Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ 上記式（２）で表わされる塩基配列は、前記式（１）の
天然型ストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列をコード
する互いに相補的な二本鎖ＤＮＡ配列として示されるが
、これを構成する各−本鎖ＤＮＡ配列もまた本発明に包
含される。
また、上式（２）の塩基配列は、宿主細胞としての大腸
菌の利用を考慮し、大腸菌による使用頻度の高いコドン
を優先的に選択、組合せ設計されているが、本発明遺伝
子はこれに限定はされない。
菌の利用を考慮し、大腸菌による使用頻度の高いコドン
を優先的に選択、組合せ設計されているが、本発明遺伝
子はこれに限定はされない。
更に本発明にｆｌＪ用される宿主細胞は後述するように
大腸菌に限定されず、従って利用する宿主細胞に応じて
、該細胞による使用頻度の高いコドンの選択、組合せも
可能である。即ち、所望の遺伝子における塩基配列は、
これが上式（２）に示す塩基配列と同じ遺伝情報を有す
る限り、即ちストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列を
コードする塩基配列を含み、遺伝子組換え技術により該
ストレプトキナーゼを発現、製造できる限り、いかなる
化学合成遺伝子であってもよ（、上式（２）の塩基配列
を基礎として、その塩基配列の変更、削除、付加等の改
変乃至修飾等が可能である。２等塩基配列の改変乃至修
飾には、例えば上式（２）の塩基配列によりコードされ
るアミノ酸−次配列と同一のアミノ酸−次配列をコード
する遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｏｎ ）の採用
や、得られる塩基配列を実際に適当なベクター等に挿入
して目的蛋白を微生物で発現させるために必要なプロモ
ーター等の各種調節因子との連結を行なうための、各種
制限酵素認識部位の付与等が包含でれる。即ち、本発明
の遺伝子はこれを利用して遺伝子工学的手法により目的
の発現ベクターを構築するに当って、プロモーター、シ
ャイン・ダルガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎ
ｏ配列、ＳＤ配列）等のリポソーム結合部位、蛋白合成
の開始コドン、終結コドン等の各種調節因子を適宜連結
させる必要があるが、之等各塩基配列の切断、結合等の
操作は、いずれも制限酵素の利用により行なわれるため
、所望遺伝子には、その前後に適当な制限酵素認識部位
を付加する必要がある。かかる適当な制限酵素認識部位
の付加された遺伝子の一例を次式（３）に示す。
大腸菌に限定されず、従って利用する宿主細胞に応じて
、該細胞による使用頻度の高いコドンの選択、組合せも
可能である。即ち、所望の遺伝子における塩基配列は、
これが上式（２）に示す塩基配列と同じ遺伝情報を有す
る限り、即ちストレプトキナーゼのアミノ酸−次配列を
コードする塩基配列を含み、遺伝子組換え技術により該
ストレプトキナーゼを発現、製造できる限り、いかなる
化学合成遺伝子であってもよ（、上式（２）の塩基配列
を基礎として、その塩基配列の変更、削除、付加等の改
変乃至修飾等が可能である。２等塩基配列の改変乃至修
飾には、例えば上式（２）の塩基配列によりコードされ
るアミノ酸−次配列と同一のアミノ酸−次配列をコード
する遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｏｎ ）の採用
や、得られる塩基配列を実際に適当なベクター等に挿入
して目的蛋白を微生物で発現させるために必要なプロモ
ーター等の各種調節因子との連結を行なうための、各種
制限酵素認識部位の付与等が包含でれる。即ち、本発明
の遺伝子はこれを利用して遺伝子工学的手法により目的
の発現ベクターを構築するに当って、プロモーター、シ
ャイン・ダルガルノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎ
ｏ配列、ＳＤ配列）等のリポソーム結合部位、蛋白合成
の開始コドン、終結コドン等の各種調節因子を適宜連結
させる必要があるが、之等各塩基配列の切断、結合等の
操作は、いずれも制限酵素の利用により行なわれるため
、所望遺伝子には、その前後に適当な制限酵素認識部位
を付加する必要がある。かかる適当な制限酵素認識部位
の付加された遺伝子の一例を次式（３）に示す。
これは前記式（２）の塩基配列の前後に該塩基配列でコ
ードされる目的蛋白の発現に必要なプロモーター等の各
種調節因子との連結のための特定の制限酵素認識部位を
付加したものであり、引続く発現ベクターの構築に好適
である。数式（３）の塩基配列中に存在する制限酵素認
識部位を引き続く式（４）に示す。勿論この式（４）に
示した制限酵素認識部位は一例であり、本発明遺伝子中
に存在させるべきそれは、構築される発現ベクターの種
類に応じて適宜変更、選択できる。
ードされる目的蛋白の発現に必要なプロモーター等の各
種調節因子との連結のための特定の制限酵素認識部位を
付加したものであり、引続く発現ベクターの構築に好適
である。数式（３）の塩基配列中に存在する制限酵素認
識部位を引き続く式（４）に示す。勿論この式（４）に
示した制限酵素認識部位は一例であり、本発明遺伝子中
に存在させるべきそれは、構築される発現ベクターの種
類に応じて適宜変更、選択できる。
式（３）：
％式％
ＧＡＣＣＧＴ ＡＡＣＧＧＣＡＡＡ ＧＴＡ ＴＡＣＴ
ＴＣＧＣＴ ＧＡＣＣＴＧ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＣＧ
ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＴＧＣ
ＡＴ ＣＣＧ ＧＧＣＴＡＣＡＣＴ ＡＴＣＴＡＣＧＡ
Ａ ＣＧＣＧＡＣＧＴＡ ＧＧＣＣＣＧ ＡＴＧ ＴＧ
Ａ ＴＡＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＣＴＧＡＡＡ
ＧＡＣＧＧＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＴＴ
ＣＣＧ ＡＣＴ ＣＡＡＴＴＴ ＣＴＧ Ｃ
ＣＡ ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＧＡＡ ＧＧＣ
ＴＧＡ ＧＴＴＴＣＴ ＴＣＣＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣ
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Ｇ ＴＡＧＣＣＧ ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＴ
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ＣＧ ＧＴＡＴＴＣＣＧＴ ＡＣＣＡＴＴ ＣＴＧ
ＣＣＧ ＡＴＧ ＧＡＣＣＡＧ ＧＡＡＡＡＧ ＧＣＡ
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ＣＴＴＧＴＡ ＣＧＣＧＴＴ ＣＧＣＣＣＧ ＴＡＣ
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Ｇ ＴＧＡＧＡＣＣＴＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＡＣＴＡＧ ＣＣＡ ＧＡＣＧＡＴ ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧ
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ＴＴ ＣＣＡＧＡＣＡＣＴ ＡＡＡ ＣＴＧ
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ＡＣＣＣＧ ＴＴＣＧＡＴ ＣＧＴ ＴＣＴＣＴＣＴＴ
ＣＧＧＣＡＴＡ ＣＴＧ ＧＧＣＡＡＧ ＣＴＡ ＧＣ
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Ｇ ＴＴＴ ＡＴＧ ＣＡＡＧＣＴ ＣＡＧ ＧＣ
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ＡＧ ＴＣＴＣＴＧ ＣＡＧ ＣＴＡ ＴＧＧ Ｔ
ＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧ
ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＣＣＣＴＣＧＴ
ＣＧＡＣＧＡＣＴＧＧ ＧＣＴ ＴＣＣＧＡＡ ＣＧＴ ＡＡＴＣＧＡ ＡＧＧ
ＣＴＴ ＧＣＡ ＴＴＡＣＣＧ ＡＡＣＧＡＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＡ ＴＡＧ ３’ＧＧＣＴＴＧ
ＣＴＡ ＴＴＴ Ａ’ｒＴ ＡＴＣＡＧＣＴ
５’ＣＴＧ ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＡＴ ＣＴＧ
ＴＡＣＧＡＣＣＣＧ ＣＧＴＧＡＣＣＴＧ ＡＡＧ Ｇ
ＣＧ ＣＴＡ ＧＡＣＡＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣＣＣＡ式
（４）： ％式％ ’ＭｌｕＩ 本発明の改変されたアミノ酸−次配列を有するストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質をコードする化学合成遺伝子は
、上述した天然型ストレプトキナーゼをコードする遺伝
子を基礎として、そのアミノ酸−次配列の改変に従い、
該改変に対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列
（コドン）を採用して設計できる。該ＤＮＡ配列の特定
部分の改変操作は、当業界において知られている各種方
法に従い実施でき、この操作には適当な制限酵素による
特定領域の切断除去や、別途合成した改変部分を含む化
学合成オリゴヌクレオチドによる特定領域の置き換え（
修復）等が包含される。
ＴＣＧＣＴ ＧＡＣＣＴＧ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＣＧ
ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＴＧＣ
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（４）： ％式％ ’ＭｌｕＩ 本発明の改変されたアミノ酸−次配列を有するストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質をコードする化学合成遺伝子は
、上述した天然型ストレプトキナーゼをコードする遺伝
子を基礎として、そのアミノ酸−次配列の改変に従い、
該改変に対応するアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列
（コドン）を採用して設計できる。該ＤＮＡ配列の特定
部分の改変操作は、当業界において知られている各種方
法に従い実施でき、この操作には適当な制限酵素による
特定領域の切断除去や、別途合成した改変部分を含む化
学合成オリゴヌクレオチドによる特定領域の置き換え（
修復）等が包含される。
本発明の化学合成遺伝子は、その設計された塩基配列に
従い、何本かのオリゴヌクレオチド断片に分けてそれぞ
れを化学合成した後、之等を連結させて製造されるのが
望ましい。各オリゴヌクレオチド断片の合成は、市販の
ＤＮＡ合成機等を利用して通常の方法に従い容易に化学
合成できる。
従い、何本かのオリゴヌクレオチド断片に分けてそれぞ
れを化学合成した後、之等を連結させて製造されるのが
望ましい。各オリゴヌクレオチド断片の合成は、市販の
ＤＮＡ合成機等を利用して通常の方法に従い容易に化学
合成できる。
該方法としては、例えば固相リン酸トリエステル法［Ｎ
ａｔｕｒｅ、 ３１０．１０５ （１９８４） ） 、
固相フォスフｔ７ミダイド法［Ｓ、 Ｌ、 Ｂｅａｕｃ
ａｇｅ ａｎｄ Ｍ、 Ｈ。
ａｔｕｒｅ、 ３１０．１０５ （１９８４） ） 、
固相フォスフｔ７ミダイド法［Ｓ、 Ｌ、 Ｂｅａｕｃ
ａｇｅ ａｎｄ Ｍ、 Ｈ。
Ｃａｒｕｔｈｅｙｓ、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ 、 ２２．１８５９（１９８１）］等を例
示できる。また合成されたオリゴヌクレオチド断片の単
離、精製は、例えば高速液体クロマトグラフィー等の常
法に従うことができ、精製された各塩基配列の確認は、
例えばマキサム−ギルバート法［Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａ
ｍ ａｎｄ Ｗ、 Ｇ１１ｂｅｒｔ。
ｔｔｅｒｓ 、 ２２．１８５９（１９８１）］等を例
示できる。また合成されたオリゴヌクレオチド断片の単
離、精製は、例えば高速液体クロマトグラフィー等の常
法に従うことができ、精製された各塩基配列の確認は、
例えばマキサム−ギルバート法［Ａ、 Ｍ、 Ｍａｘａ
ｍ ａｎｄ Ｗ、 Ｇ１１ｂｅｒｔ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、ＵＳ
Ａ、 ７４．５６０ （１９７７） −Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍ ａｎｄ Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、、 ６５．４９９ Ａｃａ
ｄ、 Ｐｒｅｓｓ （１９８０））等により行なうこと
ができる。
Ａ、 ７４．５６０ （１９７７） −Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍ ａｎｄ Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、、 ６５．４９９ Ａｃａ
ｄ、 Ｐｒｅｓｓ （１９８０））等により行なうこと
ができる。
かくして得られる化学合成オリゴヌクレオチドの５′末
端の水酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化後、アニーリングし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結させて複数個のブロックを作製し、之等を同様に
して連結させてサブユニットを構築し、該サブユニット
を連結させることにより目的とする本発明遺伝子を構築
できる。
端の水酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化後、アニーリングし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結させて複数個のブロックを作製し、之等を同様に
して連結させてサブユニットを構築し、該サブユニット
を連結させることにより目的とする本発明遺伝子を構築
できる。
尚、上記サブユニット及び所望遺伝子は之等を一旦適当
なベクター、例えばｐＢＲ３２２等に組み込むことによ
り保存、増幅等を行なうことができ、引き続く操作の前
に該ベクターより切り出して用いるのが望ましい。上記
各操作の具体例は後記実施例に示す通りである。
なベクター、例えばｐＢＲ３２２等に組み込むことによ
り保存、増幅等を行なうことができ、引き続く操作の前
に該ベクターより切り出して用いるのが望ましい。上記
各操作の具体例は後記実施例に示す通りである。
上記プラスミドベクターの構築に際しては、遺伝子組換
え技術における通常の操作、方法等を採用できる。これ
には各種制限酵素、Ｓ１ヌクレアーゼ等によるＤＮＡの
切断処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いたＤＮＡの連結
処理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法等によるＤＮＡの単離、精製、フェノー
ル抽出法によるＤＮＡの回収、精製等が包含される。ま
たプラスミドベクターが宿主細胞中に存在することの確
認は、アルカリ−８ＤＳ抽出法（Ｈ，Ｃ。
え技術における通常の操作、方法等を採用できる。これ
には各種制限酵素、Ｓ１ヌクレアーゼ等によるＤＮＡの
切断処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いたＤＮＡの連結
処理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法等によるＤＮＡの単離、精製、フェノー
ル抽出法によるＤＮＡの回収、精製等が包含される。ま
たプラスミドベクターが宿主細胞中に存在することの確
認は、アルカリ−８ＤＳ抽出法（Ｈ，Ｃ。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｊ、 Ｄｏｌｙ、 Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７゜１５１３ （
１９７９））等に従い、プラスミドＤＮＡを分取後、種
々の制限酵素で処理し、２等制限酵素認識部位の存在の
有無乃至生成りＮＡ断片の長さを検討することにより行
ない得る。更に、例えば遺伝子の塩基配列を直接ジデオ
キシ法（Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ１．、 ＵＳＡ、
７４゜５４６３ （１９７７））等で解析する方法によ
ることによっても上記確認が可能である。
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７゜１５１３ （
１９７９））等に従い、プラスミドＤＮＡを分取後、種
々の制限酵素で処理し、２等制限酵素認識部位の存在の
有無乃至生成りＮＡ断片の長さを検討することにより行
ない得る。更に、例えば遺伝子の塩基配列を直接ジデオ
キシ法（Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ１．、 ＵＳＡ、
７４゜５４６３ （１９７７））等で解析する方法によ
ることによっても上記確認が可能である。
尚、本発明遺伝子を組み込んだプラスミド組換え体構築
のために利用される起源ベクターとしては、ｐＢＲ３２
２及びこれに由来する各種プラスミドベクターが好適で
あるが、之等に限定されず従来公知の種々のもの、例え
ばバクテリオファージ及び動植物ウィルスを含む各種ウ
ィルスベクター、各種プラスミド、コスミド等も利用で
きる。
のために利用される起源ベクターとしては、ｐＢＲ３２
２及びこれに由来する各種プラスミドベクターが好適で
あるが、之等に限定されず従来公知の種々のもの、例え
ばバクテリオファージ及び動植物ウィルスを含む各種ウ
ィルスベクター、各種プラスミド、コスミド等も利用で
きる。
本発明遺伝子を保有するベクターは、これを導入して得
られた形質転換体が目的のストレプトキナーゼ又はその
誘導体蛋白質を発現するために、本発明遺伝子の他に、
その発現に必要な各種の調節因子、例えばプロモーター
、転写終結信号、ポリＡ鎖付加信号（真核細胞を宿主細
胞とする場合）等の転写のための因子やりボゾーム結合
部位等の翻訳のための因子等を有する必要がある。かか
る調節因子は宿主細胞に応じてそれぞれよく知られてお
り、例えばプロモーターとしては、大腸菌においてはせ
Ｌプロモーター、ハ（プロモーターｔａｃプロモーター
、ＵＬプロモーター、卸Ｌプロモーター等、枯草菌にお
いては５ＰＯＩプロモーター５ＰＯ２プロモーター、！
プロモーター等、酵母その他の真核細胞においてはＰＨ
０５プロモーターＰＧＫプロモーター、罫赳由来プロモ
ーター等を例示できる。之等の調節因子は、本発明ベク
ターの構築に当り之等を含むプラスミドを選択して起源
ベクターとすることにより、又は之等を含むプラスミド
から常法に従い単離するかもしくは化学合成した後、適
当なベクターに組込むことにより、それぞれ本発明ベク
ターに存在させ得、かくして所望の発現ベクターを収得
できる。
られた形質転換体が目的のストレプトキナーゼ又はその
誘導体蛋白質を発現するために、本発明遺伝子の他に、
その発現に必要な各種の調節因子、例えばプロモーター
、転写終結信号、ポリＡ鎖付加信号（真核細胞を宿主細
胞とする場合）等の転写のための因子やりボゾーム結合
部位等の翻訳のための因子等を有する必要がある。かか
る調節因子は宿主細胞に応じてそれぞれよく知られてお
り、例えばプロモーターとしては、大腸菌においてはせ
Ｌプロモーター、ハ（プロモーターｔａｃプロモーター
、ＵＬプロモーター、卸Ｌプロモーター等、枯草菌にお
いては５ＰＯＩプロモーター５ＰＯ２プロモーター、！
プロモーター等、酵母その他の真核細胞においてはＰＨ
０５プロモーターＰＧＫプロモーター、罫赳由来プロモ
ーター等を例示できる。之等の調節因子は、本発明ベク
ターの構築に当り之等を含むプラスミドを選択して起源
ベクターとすることにより、又は之等を含むプラスミド
から常法に従い単離するかもしくは化学合成した後、適
当なベクターに組込むことにより、それぞれ本発明ベク
ターに存在させ得、かくして所望の発現ベクターを収得
できる。
得られるストレプトキナーゼ又はその誘導体蛋白質の発
現ベクター（組換本体）は、本発明遺伝子の上流にプロ
モーター及びリボゾーム結合部位を、また下流に転写終
結信号を各々連結されてなるストレプトキナーゼ（天然
型又は誘導体）蛋白質の発現情報を保有しており、適当
な宿主細胞内に導入して該細胞を形質転換させることに
より、該細胞に目的とするストレプトキナーゼ又はその
誘導体蛋白質の発現（生産、蓄積）を行なわせ得る。
現ベクター（組換本体）は、本発明遺伝子の上流にプロ
モーター及びリボゾーム結合部位を、また下流に転写終
結信号を各々連結されてなるストレプトキナーゼ（天然
型又は誘導体）蛋白質の発現情報を保有しており、適当
な宿主細胞内に導入して該細胞を形質転換させることに
より、該細胞に目的とするストレプトキナーゼ又はその
誘導体蛋白質の発現（生産、蓄積）を行なわせ得る。
特に大腸菌を宿主細胞とする場合、上記発現系ベクター
には目的とする蛋白質を菌体内に直接発現させる系及び
ペリプラズム層に分泌発現させる系の両者が包含される
。上記分泌発現系では、本発明の化学合成遺伝子の上流
にシグナルペプチドをコードする遺伝子を連結させたベ
クターを構築する必要がおる。以下、この分泌発現系に
つき詳述する。
には目的とする蛋白質を菌体内に直接発現させる系及び
ペリプラズム層に分泌発現させる系の両者が包含される
。上記分泌発現系では、本発明の化学合成遺伝子の上流
にシグナルペプチドをコードする遺伝子を連結させたベ
クターを構築する必要がおる。以下、この分泌発現系に
つき詳述する。
ここでシグナルペプチドとは、各種の分泌性蛋白質のア
ミノ末端に存在する士数個乃至数十個の疎水性に富んだ
アミノ酸配列であり、これは上記蛋白質を細胞の細胞質
内から膜外に導き出す作用を奏し、またそれ自体はシグ
ナルペプチダーゼにより目的の分泌性蛋白質と切離され
るものである。
ミノ末端に存在する士数個乃至数十個の疎水性に富んだ
アミノ酸配列であり、これは上記蛋白質を細胞の細胞質
内から膜外に導き出す作用を奏し、またそれ自体はシグ
ナルペプチダーゼにより目的の分泌性蛋白質と切離され
るものである。
遺伝子組換え法におけるかかるシグナルペプチドの利用
及びそれによる利点は知られており、例えば特開昭６１
−１４９０８９号公報等に詳述されている。
及びそれによる利点は知られており、例えば特開昭６１
−１４９０８９号公報等に詳述されている。
本発明に利用されるシグナルペプチドは、上記公報等に
記載のものと同一であってもよく、また之等とは異なっ
ていてもよい。その具体例としては例えば大腸菌β−ラ
クタマーゼ（ｂｌａユ）、アルカリ性フォスファターゼ
（曲旦」−）、大腸菌外膜蛋白質（叶と鼾、諭Ｐ」−１
ｍ−等）等のシグナルペプチドを例示できる。
記載のものと同一であってもよく、また之等とは異なっ
ていてもよい。その具体例としては例えば大腸菌β−ラ
クタマーゼ（ｂｌａユ）、アルカリ性フォスファターゼ
（曲旦」−）、大腸菌外膜蛋白質（叶と鼾、諭Ｐ」−１
ｍ−等）等のシグナルペプチドを例示できる。
２等シグナルペプチドをコードする塩基配列は化学合成
することもでき、天然のそれを利用することもできる。
することもでき、天然のそれを利用することもできる。
上記シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むベク
ターの具体例としては、例えば後記実施例に示すｐＫＴ
Ｎを例示できる。
ターの具体例としては、例えば後記実施例に示すｐＫＴ
Ｎを例示できる。
ｐＫＴＮは、大腸菌肛シグナルペプチドをコードする塩
基配列を含むベクター、より詳しくはｔａｃ−プロモー
ター、ＳＤ配列及びｂｌａｌミニシグナルペプチドード
する塩基配列が同一方向に並んだ遺伝情報を有する。該
ｐＫＴＮを保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、「Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−１０３゜ｐＫＴＮ
−２−２Ｊなる表示で、微工研条寄第１３９８号（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１３９８）として寄託されている。
基配列を含むベクター、より詳しくはｔａｃ−プロモー
ター、ＳＤ配列及びｂｌａｌミニシグナルペプチドード
する塩基配列が同一方向に並んだ遺伝情報を有する。該
ｐＫＴＮを保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、「Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−１０３゜ｐＫＴＮ
−２−２Ｊなる表示で、微工研条寄第１３９８号（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１３９８）として寄託されている。
上記分泌発現系の好適な一例としては、上記ｐＫＴＮを
用いて構築されたプラスミドｐｓＫＸＴを例示でき、そ
の構築の詳細は後記実施例に示す通りである。該分泌発
現ベクターｐＳＫＸＴは、殊に■Ｌシグナルペプチドを
コードする塩基配列の後にストレプトキナーゼ遺伝子の
第１位アミノ酸をコードする第１コドンが直結された塩
基配列、即ち上記シグナルペプチドとストレプトキナー
ゼとの融合蛋白をコードする塩基配列を有しており、そ
の読みとりフレームがずれるおそれもな（、ｔａｃプロ
モーターの働きによりシグナルペプチドとストレプトキ
ナーゼとの融合蛋白を大腸菌菌体内に発現させ、内膜を
通過してペリプラズム層に目的蛋白質のみを分泌、蓄積
させ得る。
用いて構築されたプラスミドｐｓＫＸＴを例示でき、そ
の構築の詳細は後記実施例に示す通りである。該分泌発
現ベクターｐＳＫＸＴは、殊に■Ｌシグナルペプチドを
コードする塩基配列の後にストレプトキナーゼ遺伝子の
第１位アミノ酸をコードする第１コドンが直結された塩
基配列、即ち上記シグナルペプチドとストレプトキナー
ゼとの融合蛋白をコードする塩基配列を有しており、そ
の読みとりフレームがずれるおそれもな（、ｔａｃプロ
モーターの働きによりシグナルペプチドとストレプトキ
ナーゼとの融合蛋白を大腸菌菌体内に発現させ、内膜を
通過してペリプラズム層に目的蛋白質のみを分泌、蓄積
させ得る。
このプラスミドｐｓＫＸＴを保有する大腸菌ＪＭ１０９
株は、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−
１０９゜ｐＳＫＸＴ Ｊなる表示で微工研に寄託されて
おり、その寄託番号は微工研条寄第２４６４号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２４６４）である。
株は、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−
１０９゜ｐＳＫＸＴ Ｊなる表示で微工研に寄託されて
おり、その寄託番号は微工研条寄第２４６４号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２４６４）である。
上記の如くして得られる所望の発現ベクターは、これを
適当な宿主細胞に導入（形質転換）させることにより、
該宿主細胞に本発明のストレプトキナーゼ又はその誘導
体蛋白質の産生能を付与できる。ここで用いられる宿主
細胞としては、特に限定はなく、公知の各種のもの、例
えば大腸菌等のダラム陰性細菌、枯草菌等のグラム陽性
細菌、放線菌、酵母、動植物細胞等のいずれでもよいが
、特に大腸菌が好ましく、その中でもに１２株由来（７
）Ｈ８１０１株（Ｈ，Ｗ、 Ｂｏｙｅｒ ａｎｄ Ｄ、
Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、、 ４１．４５９ （１９６９） ）
及びＪＭ１０９株（Ｊ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ
、、 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９．３
０９ （１９８１） ）は好ましい。
適当な宿主細胞に導入（形質転換）させることにより、
該宿主細胞に本発明のストレプトキナーゼ又はその誘導
体蛋白質の産生能を付与できる。ここで用いられる宿主
細胞としては、特に限定はなく、公知の各種のもの、例
えば大腸菌等のダラム陰性細菌、枯草菌等のグラム陽性
細菌、放線菌、酵母、動植物細胞等のいずれでもよいが
、特に大腸菌が好ましく、その中でもに１２株由来（７
）Ｈ８１０１株（Ｈ，Ｗ、 Ｂｏｙｅｒ ａｎｄ Ｄ、
Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、、 ４１．４５９ （１９６９） ）
及びＪＭ１０９株（Ｊ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ
、、 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９．３
０９ （１９８１） ）は好ましい。
上記宿主細胞への本発明ベクターの導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法、
例えば宿主細胞を低温で塩化ガルシウムを含む水溶液中
で処理し、該溶液中にベクターを添加する方法［Ｅ、
Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓ。
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法、
例えば宿主細胞を低温で塩化ガルシウムを含む水溶液中
で処理し、該溶液中にベクターを添加する方法［Ｅ、
Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓ。
Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １１９
．１０７２（１９７４） ）等を例示できる。
．１０７２（１９７４） ）等を例示できる。
本発明は上記に従い形質転換された宿主細胞（本発明天
然型ストレプトキナーゼ又はその誘導体蛋白質の発現ベ
クターを導入された形質転換体）をも提供するものであ
る。
然型ストレプトキナーゼ又はその誘導体蛋白質の発現ベ
クターを導入された形質転換体）をも提供するものであ
る。
本発明の上記形質転換体は、通常の細胞培養用培地を用
いて培養できる。上記培養に利用できる培地としては、
例えばＬ″″ｂｒｏｔｈ″ｂｒｏｔｈ培地９培地等の各
種のものを例示でき木。また之等の培地には、更に通常
知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加することもで
きる。
いて培養できる。上記培養に利用できる培地としては、
例えばＬ″″ｂｒｏｔｈ″ｂｒｏｔｈ培地９培地等の各
種のものを例示でき木。また之等の培地には、更に通常
知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加することもで
きる。
培養は、宿主細胞の生育に適したｐＨ，温度、通気、攪
拌等の条件を採用した各種の方法により実施できる。例
えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜８の範囲、特にｐＨ
７が適当であり、約２０〜４３℃の温度で、通気攪拌条
件で培養するのが望ましく、培養のスケールには特に限
定はない。更に目的とする蛋白質の発現量を高めるため
、また目的蛋白質の分泌を促進乃至抑制する目的等に応
じて、上記培地組成や培養条件等は適宜変更することも
できる。
拌等の条件を採用した各種の方法により実施できる。例
えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜８の範囲、特にｐＨ
７が適当であり、約２０〜４３℃の温度で、通気攪拌条
件で培養するのが望ましく、培養のスケールには特に限
定はない。更に目的とする蛋白質の発現量を高めるため
、また目的蛋白質の分泌を促進乃至抑制する目的等に応
じて、上記培地組成や培養条件等は適宜変更することも
できる。
上記培養により、例えば本発明のストレプトキナーゼ又
はその誘導体蛋白質分泌発現ベクターで形質転換された
大腸菌では、ペリプラズム層に目的の蛋白質が分泌蓄積
され、これは常法に従い分離、回収、精製できる。之等
の操作は、例えば浸透圧ショック法により調製したペリ
プラズム層につき、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー等を単独で又は適宜組合せて実施できる。
はその誘導体蛋白質分泌発現ベクターで形質転換された
大腸菌では、ペリプラズム層に目的の蛋白質が分泌蓄積
され、これは常法に従い分離、回収、精製できる。之等
の操作は、例えば浸透圧ショック法により調製したペリ
プラズム層につき、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー等を単独で又は適宜組合せて実施できる。
特にペリプラズム層乃至培養上澄に分泌されるものは上
記分離、精製が比較的容易な利点がある。
記分離、精製が比較的容易な利点がある。
かくして、本発明によれば遺伝子組換え技術により、ス
トレプトキナーゼ及びその誘導体蛋白質を製造できる。
トレプトキナーゼ及びその誘導体蛋白質を製造できる。
得られる蛋白質の確認は、例えば高速液体クロマトグラ
フィーにより単一ピークになること、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法で単一バンドになること等を指標とし
て容易に行ない得る。更に目的の高純度精製ストレプト
キナーゼ又はその誘導体蛋白質の同定は、通常のポリペ
プチド乃至蛋白質の構造解析手段と同様の手段例えば５
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量分析、等電点電気泳動によ
る等電点測定、アミノ酸分析機によるアミノ酸組成の測
定、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列の解
析等により行ない得る。
フィーにより単一ピークになること、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法で単一バンドになること等を指標とし
て容易に行ない得る。更に目的の高純度精製ストレプト
キナーゼ又はその誘導体蛋白質の同定は、通常のポリペ
プチド乃至蛋白質の構造解析手段と同様の手段例えば５
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量分析、等電点電気泳動によ
る等電点測定、アミノ酸分析機によるアミノ酸組成の測
定、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列の解
析等により行ない得る。
尚、本発明の改変されたアミノ酸−欠配列を有するスト
レプトキナーゼ誘導体蛋白質は、より有利には、まず上
記した方法に従い得られる天然型ストレプトキナーゼ発
現ベクターを、適当な制限酵素で切断して特定領域を除
去した後、目的とする塩基配列を有する化学合成オリゴ
ヌクレオチド断片を用いて遺伝子の修復を行ない、これ
を再度同様にして適当なベクターに組み込んで改変され
た所望の誘導体蛋白質発現ベクターを構築し、これを宿
主細胞に導入し、該細胞を培養することにより製造でき
る。この方法によれば前記式（１）の天然型ストレプト
キナーゼの任意の位置のアミノ酸残基を欠失及び置換で
き、また任意の位置にアミノ酸残基を挿入できる。之等
各操作は既に説明した通りであり、また後記実施例に詳
述される方法に従うことができる。
レプトキナーゼ誘導体蛋白質は、より有利には、まず上
記した方法に従い得られる天然型ストレプトキナーゼ発
現ベクターを、適当な制限酵素で切断して特定領域を除
去した後、目的とする塩基配列を有する化学合成オリゴ
ヌクレオチド断片を用いて遺伝子の修復を行ない、これ
を再度同様にして適当なベクターに組み込んで改変され
た所望の誘導体蛋白質発現ベクターを構築し、これを宿
主細胞に導入し、該細胞を培養することにより製造でき
る。この方法によれば前記式（１）の天然型ストレプト
キナーゼの任意の位置のアミノ酸残基を欠失及び置換で
き、また任意の位置にアミノ酸残基を挿入できる。之等
各操作は既に説明した通りであり、また後記実施例に詳
述される方法に従うことができる。
かくして、遺伝子組換え技術により、容易に高純度でし
かも大量に天然型ストレプトキナーゼ及びその誘導体蛋
白質を製造できる。殊に本発明により得られるストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質は、天然型ストレプトキナーゼ
と対比して、抗原性が低下されており、血中での安定性
が向上されており、また血栓溶解活性の選択性、特異性
（血栓選択性）も優れている。従って、これは天然型ス
トレプトキナーゼが利用されている各種医薬用途により
有効に利用できる。
かも大量に天然型ストレプトキナーゼ及びその誘導体蛋
白質を製造できる。殊に本発明により得られるストレプ
トキナーゼ誘導体蛋白質は、天然型ストレプトキナーゼ
と対比して、抗原性が低下されており、血中での安定性
が向上されており、また血栓溶解活性の選択性、特異性
（血栓選択性）も優れている。従って、これは天然型ス
トレプトキナーゼが利用されている各種医薬用途により
有効に利用できる。
実 施 例
以下、本発明を更に詳しく説明するため天然型ストレプ
トキーナーゼ発現例を実施例１〜４として挙げ、次いで
本発明ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質の製造例を実施
例５〜１２として挙げる。
トキーナーゼ発現例を実施例１〜４として挙げ、次いで
本発明ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質の製造例を実施
例５〜１２として挙げる。
尚、各例において用いられる各方法及び操作は特に明記
しない限り以下の通り行なわれたものとする。
しない限り以下の通り行なわれたものとする。
１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作
使用した制限酵素は宝酒造株式会社製、東洋紡績株式会
社製及び株式会社ニッポンジーン製のものであり、反応
液としては各社が指定する組成のものを用いた。反応温
度は３７℃とし、温浴中で３時間静置して反応させた。
社製及び株式会社ニッポンジーン製のものであり、反応
液としては各社が指定する組成のものを用いた。反応温
度は３７℃とし、温浴中で３時間静置して反応させた。
制限酵素の標準的使用量はＤＮＡＩμｇに対して１ユニ
ツトであり、最終反応液量は１００μｌとなるようにし
た。また反応容器としては滅菌済み１．５ｘｌ容エツペ
ンドルフチユーブを用いた。
ツトであり、最終反応液量は１００μｌとなるようにし
た。また反応容器としては滅菌済み１．５ｘｌ容エツペ
ンドルフチユーブを用いた。
２、フェノール抽出法
酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液にその液量の
半量となるＴＥ緩衝液飽和フェノール［１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｈ８，０）緩衝液
をフェノールに飽和させたちのコを加えて充分振盪攪拌
し、次いで遠心分離（１２０ｏｏ回転／分、５分子ｓｊ
）してＤＮＡ（７）含まれる水層を採取し、更に同量の
エーテルを加えて同様に振盪攪拌後、遠心分離して水層
を採取した。この操作を２〜３回繰返した。採取された
水層に０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，８）と２．５倍容量の冷エタノールを加え振盪攪拌
し、−８０℃で３０分間以上放置後、遠心分離（１２０
００回転／分、５分間）することによりＤＮＡを沈澱さ
せて回収した。
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液にその液量の
半量となるＴＥ緩衝液飽和フェノール［１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｈ８，０）緩衝液
をフェノールに飽和させたちのコを加えて充分振盪攪拌
し、次いで遠心分離（１２０ｏｏ回転／分、５分子ｓｊ
）してＤＮＡ（７）含まれる水層を採取し、更に同量の
エーテルを加えて同様に振盪攪拌後、遠心分離して水層
を採取した。この操作を２〜３回繰返した。採取された
水層に０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，８）と２．５倍容量の冷エタノールを加え振盪攪拌
し、−８０℃で３０分間以上放置後、遠心分離（１２０
００回転／分、５分間）することによりＤＮＡを沈澱さ
せて回収した。
３、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合操作
６７ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６） 、６．７ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭ
ＡＴＰを含む水溶液にＤＮＡを溶かしＤＮＡ１μｇに対
して１ユニツトとなる量のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
株式会社製）を加え、１２℃で５時間以上又は４℃で一
晩反応させることによりＤＮＡを結合させた。最終反応
液量は１００μｌとした。反応終了後、前記フェノール
抽出法にてＤＮＡを回収した。
マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭ
ＡＴＰを含む水溶液にＤＮＡを溶かしＤＮＡ１μｇに対
して１ユニツトとなる量のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
株式会社製）を加え、１２℃で５時間以上又は４℃で一
晩反応させることによりＤＮＡを結合させた。最終反応
液量は１００μｌとした。反応終了後、前記フェノール
抽出法にてＤＮＡを回収した。
４、形質転換法
宿主細胞として大腸菌ＨＢ−１０１株又はＪＭ−１０９
株を用いた。
株を用いた。
宿主細胞株をＬ−ｂｒｏｔｈ培地（１％バクトドリプト
ン、０．５％バクトイ−ストエキストラクト、０．５％
塩化ナトリウム）で３７℃下、６００ｎｆｌｌの吸光度
が０．２５になるまで振盪培養して増殖させた。この培
養液１０ｘｌを遠心分離（７０００回転／分、５分間）
して菌体を回収し水冷した。
ン、０．５％バクトイ−ストエキストラクト、０．５％
塩化ナトリウム）で３７℃下、６００ｎｆｌｌの吸光度
が０．２５になるまで振盪培養して増殖させた。この培
養液１０ｘｌを遠心分離（７０００回転／分、５分間）
して菌体を回収し水冷した。
これに０．１Ｍ塩化マグネシウム５ ｘｌを添加し懸濁
させて洗浄し、続いて遠心分離（７０００回転／分、１
分間）により菌体を回収し、更に水冷した０、１Ｍ塩化
カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マグネシウム混合溶液５
ｘｉを添加し懸濁させた。これを水中で３０分以上放
置後遠心分離（７０００回転／分、１分間）して菌体を
回収し、再度同溶液０．５ｘｌに懸濁させた。この懸濁
液０．２ｚ／にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
ＤＮＡの反応組成液２０μｌを加え、３０分間氷冷した
。
させて洗浄し、続いて遠心分離（７０００回転／分、１
分間）により菌体を回収し、更に水冷した０、１Ｍ塩化
カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マグネシウム混合溶液５
ｘｉを添加し懸濁させた。これを水中で３０分以上放
置後遠心分離（７０００回転／分、１分間）して菌体を
回収し、再度同溶液０．５ｘｌに懸濁させた。この懸濁
液０．２ｚ／にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
ＤＮＡの反応組成液２０μｌを加え、３０分間氷冷した
。
次イで、４２．５℃の温浴で３０秒間加温し、Ｌ−ｂｒ
ｏｔｈ培地１．ＯｚＡ’を加え、これを３７℃の温浴中
で１時間静置した。
ｏｔｈ培地１．ＯｚＡ’を加え、これを３７℃の温浴中
で１時間静置した。
かくして得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性を指
標として選択した。即ち、１．５％寒天を含むＬ−ｂｒ
ｏｔｈ培地にアンピシリン５０μｇ ／ ｘｉを添加し
て調製した平板培地に、上記で得た反応組成液各０．２
ｘｌｌずつをひろげ、これを３７℃で一晩静置培養し、
生育するコロニーを分離した。
標として選択した。即ち、１．５％寒天を含むＬ−ｂｒ
ｏｔｈ培地にアンピシリン５０μｇ ／ ｘｉを添加し
て調製した平板培地に、上記で得た反応組成液各０．２
ｘｌｌずつをひろげ、これを３７℃で一晩静置培養し、
生育するコロニーを分離した。
５、プラスミドの単離、精製
プラスミドを保有する菌株をアンピシリン５０ｔｔｇ／
ｘｉを添加したＬ−ｂｒｏｔｈ培地４００ｘｌで、３７
℃で１２〜１６時間振盪培養した。これを遠心分離（６
０００回転／分、１０分間）して菌体を集め、これに溶
液Ｉ ［５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
、２５ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８，０）及び２■／ ｘ
ｉリゾチーム、滅菌後便用］の１．４ｘｌを加えて懸濁
させ、水中に３０分間放置した。更に溶液ＩＩ ［０，
２Ｎ水酸化ナトリウム及び１％ソジウムドデシル硫酸］
の２８ｘｌ！を加えて攪拌し、水中で５分間放置後、溶
液ｍ ［３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８） 、滅菌後
便用］の２１１１を加えて水中で６０分以上放置後、遠
心分離（８０００回転／分、１０分間）して沈渣を得た
。
ｘｉを添加したＬ−ｂｒｏｔｈ培地４００ｘｌで、３７
℃で１２〜１６時間振盪培養した。これを遠心分離（６
０００回転／分、１０分間）して菌体を集め、これに溶
液Ｉ ［５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
、２５ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８，０）及び２■／ ｘ
ｉリゾチーム、滅菌後便用］の１．４ｘｌを加えて懸濁
させ、水中に３０分間放置した。更に溶液ＩＩ ［０，
２Ｎ水酸化ナトリウム及び１％ソジウムドデシル硫酸］
の２８ｘｌ！を加えて攪拌し、水中で５分間放置後、溶
液ｍ ［３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８） 、滅菌後
便用］の２１１１を加えて水中で６０分以上放置後、遠
心分離（８０００回転／分、１０分間）して沈渣を得た
。
これに溶液ＩＶ［０，１Ｍ酢酸ナトリウム及び０．０５
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）］の１１１１を加えて溶解
させ、更に２．５倍容量の冷エタノールを加え、−８０
℃で３０分間放置した。もう−度遠心分離（１２０００
回転／分、１５分間）して沈渣を集めた。
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）］の１１１１を加えて溶解
させ、更に２．５倍容量の冷エタノールを加え、−８０
℃で３０分間放置した。もう−度遠心分離（１２０００
回転／分、１５分間）して沈渣を集めた。
次いで得られた沈渣にＴＥ緩衝液［１０ｍＭ）リス塩酸
（ｐＨ７，５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液コ４ｘｌ
加えて溶解させ、これに塩化セシウム４．６２ｇを加え
て攪拌溶解させ、更にエチジウムブロマイド５■／ ｘ
ｉ液０．４２ｘｌ！を加えた。得られた溶液を遠心分離
（３０００回転／分、１０分間）して浮遊物を除き、溶
液を超遠心分離（５００００回転／分、１５時間）した
。この超遠心分離の終了後、紫外線照射により蛍光を発
するプラスミドＤＮＡ部分を採取した。これを５Ｍ塩化
ナトリウム溶液で飽和したイソプロパツールで５〜６回
抽出してエチジウムブロマイドを除去した。最後にバイ
オゲｋ Ａ５ Ｑ （ＢｉＯｇｅｌ Ａ−５０、バイオ
・ラッド社製）カラムクロマトグラフィー（２，５ａｎ
Ｘ１５〜２Ｏａｎカラムサイズ、溶出溶媒＝ＴＥ緩衝液
＋０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液、ＵＶ２５４ｎＨにより
検出）により塩化セシウム及び混入しているＲＮＡ等を
除去し、前記フェノール抽出法によりプラスミドＤＮＡ
を回収した。
（ｐＨ７，５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液コ４ｘｌ
加えて溶解させ、これに塩化セシウム４．６２ｇを加え
て攪拌溶解させ、更にエチジウムブロマイド５■／ ｘ
ｉ液０．４２ｘｌ！を加えた。得られた溶液を遠心分離
（３０００回転／分、１０分間）して浮遊物を除き、溶
液を超遠心分離（５００００回転／分、１５時間）した
。この超遠心分離の終了後、紫外線照射により蛍光を発
するプラスミドＤＮＡ部分を採取した。これを５Ｍ塩化
ナトリウム溶液で飽和したイソプロパツールで５〜６回
抽出してエチジウムブロマイドを除去した。最後にバイ
オゲｋ Ａ５ Ｑ （ＢｉＯｇｅｌ Ａ−５０、バイオ
・ラッド社製）カラムクロマトグラフィー（２，５ａｎ
Ｘ１５〜２Ｏａｎカラムサイズ、溶出溶媒＝ＴＥ緩衝液
＋０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液、ＵＶ２５４ｎＨにより
検出）により塩化セシウム及び混入しているＲＮＡ等を
除去し、前記フェノール抽出法によりプラスミドＤＮＡ
を回収した。
得られた精製プラスミドＤＮＡ量は、ＯＤ ２６０ｎｍ
測定による０Ｄ２６ｏ＝０，０２２を１μｇｌｘｉＤＮ
Ａ量と換算して算出した。
測定による０Ｄ２６ｏ＝０，０２２を１μｇｌｘｉＤＮ
Ａ量と換算して算出した。
６、オリゴヌクレオチドの合成
りＮＡの化学合成はアプライド バイオケミカルズ社製
モデル３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｄｅｌ ３８１Ａ ｔｙｐｅ
ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて行なった
〔固相β−シアノエチルホスフォアミダイド法、０．２
μＭカラム使用〕。その操作は同社のマニュアルに従っ
た。合成機により得られるオリゴヌクレオチドには３′
末端側にカラム担体樹脂が、各活性基には保護基が、５
′末端側にはジメトキシルトリチル基がそれぞれ付加さ
れたままであるので、之等を除去する必要があり、この
操作も同マニュアルに従った。
モデル３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｄｅｌ ３８１Ａ ｔｙｐｅ
ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて行なった
〔固相β−シアノエチルホスフォアミダイド法、０．２
μＭカラム使用〕。その操作は同社のマニュアルに従っ
た。合成機により得られるオリゴヌクレオチドには３′
末端側にカラム担体樹脂が、各活性基には保護基が、５
′末端側にはジメトキシルトリチル基がそれぞれ付加さ
れたままであるので、之等を除去する必要があり、この
操作も同マニュアルに従った。
次に副反応物、遊離した保護基、脱保護基剤等を、目的
とするオリゴヌクレオチドから効率よく除くために高速
液体クロマトグラフィーを用いて単一ピークとなるまで
分取、精製を行なった。ここで用いたカラムは、ＹＭＣ
Ａ−ＰＡＣＫ ＡＭ−３０３００５（山村化学研究所社
製、４ 、 ６ Ｘ ２５０ ｍｍ、 Ｗａｔｅｒｓｔ
ｙｐｅ ）であり、溶出溶媒としては５％→４０％アセ
トニトリル１０．ＬＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶
液（ｐＨ７，２）を用いて勾配溶出させた。尚使用した
システムは東ソー株式会社製のポン１００２Ｍ１紫外可
視検出器ＵＶ−８０００、コントローラーＣＣＰである
。
とするオリゴヌクレオチドから効率よく除くために高速
液体クロマトグラフィーを用いて単一ピークとなるまで
分取、精製を行なった。ここで用いたカラムは、ＹＭＣ
Ａ−ＰＡＣＫ ＡＭ−３０３００５（山村化学研究所社
製、４ 、 ６ Ｘ ２５０ ｍｍ、 Ｗａｔｅｒｓｔ
ｙｐｅ ）であり、溶出溶媒としては５％→４０％アセ
トニトリル１０．ＬＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶
液（ｐＨ７，２）を用いて勾配溶出させた。尚使用した
システムは東ソー株式会社製のポン１００２Ｍ１紫外可
視検出器ＵＶ−８０００、コントローラーＣＣＰである
。
７、アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル濃度は０．９又は１．６％とした。アガ
ロースＩ（同口化学研究所製）を上記濃度となるように
秤量しＴＨＥ緩衝液（０，０８９Ｍトリス−ホウ酸、０
．０２Ｍ ＥＤＴＡを含む）を加えて加熱溶解させて
ゲルを作成した。泳動は、ミニゲル電気泳動システム
ミューピッド２（コスモ・バイオ株式会社製）を用い、
またＴＢＥ緩衝液を泳動用緩衝液として用いて行なった
。泳動後、０．５μｇ ／ ｘｉ！エチジウムブロマイ
ド溶液にゲルをつけ紫外線照射により蛍光を発するＤＮ
Ａ断片を確認した。ゲルからのＤＮＡの溶出は目的のバ
ンド部分をナイフ等で切取り、透析チューブ（３５００
ＭＷカット）に入れ、ＴＥ緩衝液を満たし、同ミニゲル
電気泳動装置で３０分間泳動させることにより行なった
。上記で溶出されたＤＮＡは濃縮乾固後、これに少量の
蒸留水を加え、前記フェノール抽出法に従って回収した
。
ロースＩ（同口化学研究所製）を上記濃度となるように
秤量しＴＨＥ緩衝液（０，０８９Ｍトリス−ホウ酸、０
．０２Ｍ ＥＤＴＡを含む）を加えて加熱溶解させて
ゲルを作成した。泳動は、ミニゲル電気泳動システム
ミューピッド２（コスモ・バイオ株式会社製）を用い、
またＴＢＥ緩衝液を泳動用緩衝液として用いて行なった
。泳動後、０．５μｇ ／ ｘｉ！エチジウムブロマイ
ド溶液にゲルをつけ紫外線照射により蛍光を発するＤＮ
Ａ断片を確認した。ゲルからのＤＮＡの溶出は目的のバ
ンド部分をナイフ等で切取り、透析チューブ（３５００
ＭＷカット）に入れ、ＴＥ緩衝液を満たし、同ミニゲル
電気泳動装置で３０分間泳動させることにより行なった
。上記で溶出されたＤＮＡは濃縮乾固後、これに少量の
蒸留水を加え、前記フェノール抽出法に従って回収した
。
８、塩基配列の解析
構築したストレプトキナーゼ及びその誘導体蛋白質の塩
基配列は、Ｍ−１３ジデオキシ法〔Ｊ・Ｍｅｓｓｉｎｇ
、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
１０１．２０（１９８３））にて行なった。その操作
は東洋紡績株式会社のＭ−１３シークエンシングキツト
（Ｍ−１３ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ） ［［ａ
−３２Ｐコ ｄＣＴＰ使用、アマジャム社製］を用い、
同キットのマニュアルに従った。泳動ゲルとしては富士
写真フィル株式会社％ 度）を使用した。
基配列は、Ｍ−１３ジデオキシ法〔Ｊ・Ｍｅｓｓｉｎｇ
、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
１０１．２０（１９８３））にて行なった。その操作
は東洋紡績株式会社のＭ−１３シークエンシングキツト
（Ｍ−１３ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ） ［［ａ
−３２Ｐコ ｄＣＴＰ使用、アマジャム社製］を用い、
同キットのマニュアルに従った。泳動ゲルとしては富士
写真フィル株式会社％ 度）を使用した。
実施例 １ ストレプトキナーゼ発現ベクターｐｓＫＸ
Ｔの作製 （１）ｐｓＫＸの構築 天然型ストレプトキナーゼの化学合成遺伝子をクローニ
ングしたプラスミドｐＳＫＸの構築を以下に詳述する。
Ｔの作製 （１）ｐｓＫＸの構築 天然型ストレプトキナーゼの化学合成遺伝子をクローニ
ングしたプラスミドｐＳＫＸの構築を以下に詳述する。
■ オリゴヌクレオチドの合成
ストレプトキナーゼ構造遺伝子を含む前記式（３）に示
す全塩基配列の構築に当り、まず同塩基配列を下記第１
表〜第４表に示す４３〜５６鎖長のオリゴヌクレオチド
断片５２個（Ａ−１〜Ａ−１４Ｂ−１、、、Ｂ−１２、
Ｃ−１〜Ｃ−１２及びＤ−１、Ｄ−１４）に分け、それ
ぞれの断片を固相β−シアノエチルホスフォアミダイド
法にて化学合成した。
す全塩基配列の構築に当り、まず同塩基配列を下記第１
表〜第４表に示す４３〜５６鎖長のオリゴヌクレオチド
断片５２個（Ａ−１〜Ａ−１４Ｂ−１、、、Ｂ−１２、
Ｃ−１〜Ｃ−１２及びＤ−１、Ｄ−１４）に分け、それ
ぞれの断片を固相β−シアノエチルホスフォアミダイド
法にて化学合成した。
箪
裏
第
表
■ 合成オリゴヌクレオチドの連結
前記式（３）に示す全塩基配列の構築は、サブユニット
ＳＫＡ、５ＫＢＳＳＫＣ及びＳＫＤに分けて別々に実施
した。
ＳＫＡ、５ＫＢＳＳＫＣ及びＳＫＤに分けて別々に実施
した。
サブユニットＳＫＡは、次式（５）に示される通り上記
全塩基配列のＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位より仲ＬＩ
、、μｉｅ Ｉ制限酵素認識部位を含むシリー■制限酵
素認識部位までから構成される。サブユニットＳＫＢは
、次式（６）に示される通りＥｃｏＲＩ制限酵素認識部
位よりＮｈｅ Ｉ 、Ｓａｃ Ｉ制限酵素認識部位を含
むＳａｌエエ制限酵素認識部位までから構成される。サ
ブユニットＳＫＣは、次式（７）に示される通りＥｃｏ
ＲＩ制限酵素認識部位よりＳａｃ Ｉ〜ｉｔ ＩＩ制限
酵素認識部位を含むジリエＩ制限酵素認識部位までから
構成される。またサブユニットＳＫＤは、次式（８）に
示される通りＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位より４ａｔ
ＩＩ制限酵素認識部位を含むジリエエ制限酵素認識部位
までから構成される装〈サブユニットＳＫＡ） （ＥｃｏＲＩ） Ａ−１ ５’ ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＧＧ
ＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡ３’
ＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴ
ＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＡ
ＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＴ
ＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＴＧＡＧＧＧＴ
ＣＧＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＴ一−→
Ａ−７ＴＡＡＣＧＴＡＣＡ
ＴＴＣＴＡＡＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＧＧＴＡ
ＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＴＴＧＣＴＧ
ＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＡＧＣＴＧＡ−″
８−−−ヘー−−−一−一一−一−ＴＴＣＧＣＴＡＧＣ
Ｇ ３’ＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＧＣＴ
５ ＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣ
ＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣ
ＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧ
ＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＧ’ＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴ
ＧＡＣＣＴＣＴＣＧＴＣＣＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡ
ＧＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣ−−−−＝−−−−−−−
Ａ − １２ＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧ
ＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＣＧＡＣ
ＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧ
ＣＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴ ＣＧ ＣＴＡ Ｃ
Ｔ ＧＡ Ｃ Ｔ ＣＴＧＧＣ Ｇ ＣＴＡＴＧＴ Ｃ
Ｔ ＣＡＴＡＡＡ Ｃ ＴＣＧＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴ
ＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴ
ＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡ
ＧＣＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＴＣ
ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣ
ＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＧＣＧ一−−一−→
Ａ−９〈サブユニットＳＫＢ） （ＥｃｏＲＩ） Ｂ−１ ＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣ
ＣＧＡＣＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧ
ＣＧＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴ
ＴＡＧＴＡＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＧＧ
ＴＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＣＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＴＧＡ
ＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＴ
ＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＧ
ＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧ
ＡＣＣＧＧＴＡＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＡＣ
ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧ
ＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴｃＴＴＴＴＴＧ
ＧｃＴＡＧＧＴｃＴＴＧＧＴｃｃＧＢ − １０
８一一一一一一一一一．Ｂ−４ ＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣ
ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴ
ＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＧＡ
ＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡ
ＴＴＧＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧＧＣＡ
ＴＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＴ
ＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡ
ＧＡＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧ
ＧＣＣＣＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＡＣＣＡ
ＧＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣ
ＣＧＣＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＡ
ＡＴＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＣＴＡＡＡ
ＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＧＧＴＧ
ＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧ
Ｂ−７ ＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧ ＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴ〈サブユニット
ＳＫＣ＞ （ＥｃｏＲＩ） Ｃ−１ ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＡ
ＧＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣ
ＣＧＡＧＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧＧＡＣＴＴＧＴ
ＴＡＡＡＣＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡ
ＣＧＡＡＣＧＣＧＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＧ
ＣＣＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧ
ＡＧＡＡＧＧＣ − １１ −−−− ＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡ
ＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＴＧ
ＧＣＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴ
ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴ
ＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＴＣＴＡ
ＡＴＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴ
ＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣ←−−−−一一一一一−・ Ｃ−
８ ＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＡ
ＴＧＡＣＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴ
ＴＣＣＡＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧ
ＣＴＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡ
ＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＡＧ
ＴＡＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴ
ＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣ−７ Ｇ ＣＡＧＣＴ （ＳａｌＩ） くサブユニット５ＫＤ） （ＥｃｏＲＩ） ＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＧＡＡＴＴ
ＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡ
ＴＧＧＴＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＧ
ＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＴＡＡ
ＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＴＧ
ＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧ
ＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＡ
ＡＡＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡ
ＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＡＣＴＧＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＡ
ＣＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＣ
ＧＧＴＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧ
ＧＴＧＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＴＡＣＣ
ＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＧＡ
ＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＴ
ＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＡ
ＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＣＧ
ＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧ
ＴＧＡＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＣ
ＧＴＴＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＣＧＴ
ＡＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧ
ＡＣＣＧＴＴＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＡＧ
ＡＣＣＧＴＡＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧ
ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＴＴ
ＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＣＧＣＧＡ
ＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＣＣＧＧＡＴＡＡ
ＣＣＣＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧ
ＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡ
ＴＣＡＧＣＴ（ＳａｌＩ） 各サブユニットは、ブロック１〜８に分けそれぞれ別々
に構築した。各ブロックの構築は、以下の通り実施し、
その概略は第１図に示した。尚、第１図において化学合
成した各オリゴヌクレオチドを示す実線の末端の黒点中
（ドツト）は５′末端フオスフエート基の導入を示す。
全塩基配列のＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位より仲ＬＩ
、、μｉｅ Ｉ制限酵素認識部位を含むシリー■制限酵
素認識部位までから構成される。サブユニットＳＫＢは
、次式（６）に示される通りＥｃｏＲＩ制限酵素認識部
位よりＮｈｅ Ｉ 、Ｓａｃ Ｉ制限酵素認識部位を含
むＳａｌエエ制限酵素認識部位までから構成される。サ
ブユニットＳＫＣは、次式（７）に示される通りＥｃｏ
ＲＩ制限酵素認識部位よりＳａｃ Ｉ〜ｉｔ ＩＩ制限
酵素認識部位を含むジリエＩ制限酵素認識部位までから
構成される。またサブユニットＳＫＤは、次式（８）に
示される通りＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位より４ａｔ
ＩＩ制限酵素認識部位を含むジリエエ制限酵素認識部位
までから構成される装〈サブユニットＳＫＡ） （ＥｃｏＲＩ） Ａ−１ ５’ ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＧＧ
ＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡ３’
ＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴ
ＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＡ
ＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＴ
ＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＧＴＴＧＡＧＧＧＴ
ＣＧＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＴ一−→
Ａ−７ＴＡＡＣＧＴＡＣＡ
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ＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＴＴＧＣＴＧ
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ＡＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＧ’ＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴ
ＧＡＣＣＴＣＴＣＧＴＣＣＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡ
ＧＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣ−−−−＝−−−−−−−
Ａ − １２ＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧ
ＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＣＧＡＣ
ＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧ
ＣＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴ ＣＧ ＣＴＡ Ｃ
Ｔ ＧＡ Ｃ Ｔ ＣＴＧＧＣ Ｇ ＣＴＡＴＧＴ Ｃ
Ｔ ＣＡＴＡＡＡ Ｃ ＴＣＧＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴ
ＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＧＣＧＡＴＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴ
ＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡ
ＧＣＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＴＣ
ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＧＴＴＡＧＧＴＣＣ
ＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＧＣＧ一−−一−→
Ａ−９〈サブユニットＳＫＢ） （ＥｃｏＲＩ） Ｂ−１ ＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣ
ＣＧＡＣＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧ
ＣＧＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴ
ＴＡＧＴＡＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＧＧ
ＴＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＣＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＴＧＡ
ＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＡＴ
ＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＧ
ＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧ
ＡＣＣＧＧＴＡＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＡＣ
ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧ
ＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴｃＴＴＴＴＴＧ
ＧｃＴＡＧＧＴｃＴＴＧＧＴｃｃＧＢ − １０
８一一一一一一一一一．Ｂ−４ ＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣ
ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴ
ＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＧＡ
ＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡ
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ＴＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＴ
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ＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＧＧＴＧ
ＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＡＴＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧ
Ｂ−７ ＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧ ＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＴ〈サブユニット
ＳＫＣ＞ （ＥｃｏＲＩ） Ｃ−１ ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＡ
ＧＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＣ
ＣＧＡＧＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧＧＡＣＴＴＧＴ
ＴＡＡＡＣＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡ
ＣＧＡＡＣＧＣＧＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＧ
ＣＣＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧ
ＡＧＡＡＧＧＣ − １１ −−−− ＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡ
ＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＴＧ
ＧＣＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴ
ＴＡＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴ
ＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＴＣＴＡ
ＡＴＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴ
ＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣ←−−−−一一一一一−・ Ｃ−
８ ＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＣＣＧＴＡ
ＴＧＡＣＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＴ
ＴＣＣＡＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧ
ＣＴＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡ
ＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＡＧ
ＴＡＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴ
ＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣ−７ Ｇ ＣＡＧＣＴ （ＳａｌＩ） くサブユニット５ＫＤ） （ＥｃｏＲＩ） ＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＧＡＡＴＴ
ＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡ
ＴＧＧＴＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＧ
ＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＴＡＡ
ＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＴＧ
ＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧ
ＧＣＧＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＡ
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ＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＣＣＧＧＡＴＡＡ
ＣＣＣＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧ
ＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡ
ＴＣＡＧＣＴ（ＳａｌＩ） 各サブユニットは、ブロック１〜８に分けそれぞれ別々
に構築した。各ブロックの構築は、以下の通り実施し、
その概略は第１図に示した。尚、第１図において化学合
成した各オリゴヌクレオチドを示す実線の末端の黒点中
（ドツト）は５′末端フオスフエート基の導入を示す。
前記Ａ−１〜Ｄ−１４の５２本の化学合成オリゴヌクレ
オチドの内、Ａ−Ｉ Ａ−８Ｂ−Ｉ Ｂ−７Ｃ−Ｉ
Ｃ−７、Ｄ−１及びＤ−８を除く４４本について、之等
の１〜３μｇ ／ ｘｉ温溶液各２０μ！すっとり、こ
れにＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式
会社製）５ユニツト、同社指定組成の反応緩衝液５μ！
及び１００ｍＭ ＡＴＰ１μＡ’を加え、更に水を加
えて最終反応液量を５０μ！とし、３７℃で１時間反応
させて、各オリゴヌクレオチドの５′末端にフォスフェ
ート基を導入させた。
オチドの内、Ａ−Ｉ Ａ−８Ｂ−Ｉ Ｂ−７Ｃ−Ｉ
Ｃ−７、Ｄ−１及びＤ−８を除く４４本について、之等
の１〜３μｇ ／ ｘｉ温溶液各２０μ！すっとり、こ
れにＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式
会社製）５ユニツト、同社指定組成の反応緩衝液５μ！
及び１００ｍＭ ＡＴＰ１μＡ’を加え、更に水を加
えて最終反応液量を５０μ！とし、３７℃で１時間反応
させて、各オリゴヌクレオチドの５′末端にフォスフェ
ート基を導入させた。
次いで構築すべき各ブロック毎に、原料とする各オリゴ
ヌクレオチドのＤＮＡ溶液２μｌをとり（例えばブロッ
ク１の場合はオリゴヌクレオチドＡ−１、Ａ−２、Ａ−
３、Ａ−１２、Ａ−１３及びＡ−１９、これに１００ｍ
Ｍ ＡＴＰ１μＡ’及びリガーゼ反応緩衝液［６６０
ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、６６ｍＭ塩化マグネ
シウム、１００ｍＭジチオスレイトール溶液］１０μｌ
を加え、最終反応液量を１００μｌとして、１００℃の
温浴中で２分間加熱処理後、自然冷却した。次に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）２．５ユニツトを
添加し、４℃下に一晩反応させ之等を連結させた。
ヌクレオチドのＤＮＡ溶液２μｌをとり（例えばブロッ
ク１の場合はオリゴヌクレオチドＡ−１、Ａ−２、Ａ−
３、Ａ−１２、Ａ−１３及びＡ−１９、これに１００ｍ
Ｍ ＡＴＰ１μＡ’及びリガーゼ反応緩衝液［６６０
ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、６６ｍＭ塩化マグネ
シウム、１００ｍＭジチオスレイトール溶液］１０μｌ
を加え、最終反応液量を１００μｌとして、１００℃の
温浴中で２分間加熱処理後、自然冷却した。次に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）２．５ユニツトを
添加し、４℃下に一晩反応させ之等を連結させた。
上記各連結反応物をフェノール抽出後、１０％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法を実施し、目的の大きさのブ
ロックである二本鎖ＤＮＡ部分をかきとり溶出させた。
リルアミドゲル電気泳動法を実施し、目的の大きさのブ
ロックである二本鎖ＤＮＡ部分をかきとり溶出させた。
以上の操作により、各ブロック１〜８のそれぞれを構築
した。
した。
■ ｐＳＫＡ、、ｐｓＫＢＳｐｓＫｃ及びｐｓＫＤの作
製 上記■で構築したブロック１及びブロック２からなるサ
ブユニットＳＫＡをプラスミドｐＢＲ３２２に組込んだ
ベクターｐｓＫＡを、以下の操作により作製した。また
同様にしてｐＳＫＢ。
製 上記■で構築したブロック１及びブロック２からなるサ
ブユニットＳＫＡをプラスミドｐＢＲ３２２に組込んだ
ベクターｐｓＫＡを、以下の操作により作製した。また
同様にしてｐＳＫＢ。
ｐＳＫＣ及びｐｓＫＤをそれぞれ作製した。
その概略を第２図に示す。図においてＡｐ はアンピ
シリン耐性を、Ｔｃ アトラサイクリン耐性を、ｏｒ
ｉは複製開始点をそれぞれ示す。また各塩基配列におけ
る制限酵素認識部位は、以下の略号で表示するものとし
、以降の各図においても同様とする。
シリン耐性を、Ｔｃ アトラサイクリン耐性を、ｏｒ
ｉは複製開始点をそれぞれ示す。また各塩基配列におけ
る制限酵素認識部位は、以下の略号で表示するものとし
、以降の各図においても同様とする。
Ａ 、−Ａａｔ ＩＩ Ａ ｐ 、−１卸しＩ
１３ 、、、Ｂａ！ａＨＩＥ・・・肘ＯＲＩ
Ｅ Ｖ・・・肘聾Ｖ’ Ｎ・・１埠？ＩＮａ、−
Ｎ＆ｅ Ｉ ｐ 、−１ＰＢｔ Ｉ ３、
−５ａｌ ｌ５ｃ１１．５ａｃＩ ■−１ｐｓＫＡの作製 まずｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌエエ
で処理した後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行な
って、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片と、先に得られたブロック１及びブ。ツク２、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、ＡＴＰ並びにリガーゼ反応用緩衝液を混
ぜ、４℃下、−晩反応させてＤＮＡを連結させた。この
反応液を用いてカルシウム法により大腸菌ＨＢ−１０１
株の形質転換を行なった。得られたコロニーから簡易煮
沸法によりＤＮＡを採取し、スクリーニングを行ない、
目的のｐＳＫＡを含有するコロニーを選択した。
１３ 、、、Ｂａ！ａＨＩＥ・・・肘ＯＲＩ
Ｅ Ｖ・・・肘聾Ｖ’ Ｎ・・１埠？ＩＮａ、−
Ｎ＆ｅ Ｉ ｐ 、−１ＰＢｔ Ｉ ３、
−５ａｌ ｌ５ｃ１１．５ａｃＩ ■−１ｐｓＫＡの作製 まずｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌエエ
で処理した後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行な
って、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片と、先に得られたブロック１及びブ。ツク２、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、ＡＴＰ並びにリガーゼ反応用緩衝液を混
ぜ、４℃下、−晩反応させてＤＮＡを連結させた。この
反応液を用いてカルシウム法により大腸菌ＨＢ−１０１
株の形質転換を行なった。得られたコロニーから簡易煮
沸法によりＤＮＡを採取し、スクリーニングを行ない、
目的のｐＳＫＡを含有するコロニーを選択した。
更にアルカリ−８ＤＳ抽出法、ＣｓＣ７平衡密度超遠心
法、バイオゲルＡ−５０カラムクロマトグラフィー法を
行なって、精製ＤＮＡを採取し、制限酵素（ヒ朝１１鮭
ＩＩ、仲ａＩ、μ恕−■、ジリュＩ 、 Ｘｈｏ ＩＩ
、 Ｈｉｎｆ Ｉ等）を用いて制限酵素切断地図を作成
した。
法、バイオゲルＡ−５０カラムクロマトグラフィー法を
行なって、精製ＤＮＡを採取し、制限酵素（ヒ朝１１鮭
ＩＩ、仲ａＩ、μ恕−■、ジリュＩ 、 Ｘｈｏ ＩＩ
、 Ｈｉｎｆ Ｉ等）を用いて制限酵素切断地図を作成
した。
その結果、選択したコロニーは目的のｐｓＫＡを含有す
るものであることが確認された。
るものであることが確認された。
更にｐＳＫＡのＳＫＡ導入部分の塩基配列の確認をＭ−
１３ジデオキシ法により行なった。即ちＥｃｏＲＩ−５
ｔ１．Ｉ断片をＭ−１３”ｐ１８又は”Ｉ）１９４：サ
ブクローニングして塩基配列の解析を行なった。
１３ジデオキシ法により行なった。即ちＥｃｏＲＩ−５
ｔ１．Ｉ断片をＭ−１３”ｐ１８又は”Ｉ）１９４：サ
ブクローニングして塩基配列の解析を行なった。
その結果、目的通りの配列を有していることが確認され
た。
た。
■−２ｐｓＫＢ、ｐＳＫＣ及びｐＳＫＤの作成上記■−
１と同様にして、ブロック３及びブロック４とからなる
サブユニットＳＫＢを大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換
し、コロニーのスクリーニング及びプラスミドＤＮＡの
採取、精製を行ないｐＳＫＢの作製、確認を行なった。
１と同様にして、ブロック３及びブロック４とからなる
サブユニットＳＫＢを大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換
し、コロニーのスクリーニング及びプラスミドＤＮＡの
採取、精製を行ないｐＳＫＢの作製、確認を行なった。
また同様に、ブロック５とブロック６とからなるサブユ
ニットＳＫＣを大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換し、コ
ロニーのスクリーニング及びプラスミドＤＮＡの採取、
精製を行ないｐＳＫＣの作製、確認を行なうと共に、ブ
ロック７とブロック８とからなるサブユニットＳＫＤを
大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換し、コロニーのスクリ
ーニング及びプラスミドＤＮＡの採取、精製を行なった
。
ニットＳＫＣを大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換し、コ
ロニーのスクリーニング及びプラスミドＤＮＡの採取、
精製を行ないｐＳＫＣの作製、確認を行なうと共に、ブ
ロック７とブロック８とからなるサブユニットＳＫＤを
大腸菌ＨＢ−１０１株に形質転換し、コロニーのスクリ
ーニング及びプラスミドＤＮＡの採取、精製を行なった
。
■ ｐＳＫＡＢの作製
このプラスミドは目的とするｐＳＫＸ構築のための中間
ベクターであり、その作製の概略は第２図に示す通りで
あり、以下の通り実施した。
ベクターであり、その作製の概略は第２図に示す通りで
あり、以下の通り実施した。
上記■で得たｐｓＫＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＮｈｅ
Ｉで処理し、アガロースゲル電気泳動法により１０７
２ｂｐのＤＮＡ断片を単離、精製した。
Ｉで処理し、アガロースゲル電気泳動法により１０７
２ｂｐのＤＮＡ断片を単離、精製した。
同様にして上記■で得たｐＳＫＢを同制限酵素で処理し
て、３２５０ｂｐのＤＮＡ断片を単離、精製した。
て、３２５０ｂｐのＤＮＡ断片を単離、精製した。
上記両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反
応させ、反応物で大腸菌ＨＢ−１０１株を形質転換させ
て目的のｐｓＫＡＢを含むコロニーを得た。得られたコ
ロニーよりプラスミドＤＮＡを採取、精製し、制限酵素
切断地図を作成して、４３２３ｂｌ）のｐｓＫＡＢの確
認を行なった。
応させ、反応物で大腸菌ＨＢ−１０１株を形質転換させ
て目的のｐｓＫＡＢを含むコロニーを得た。得られたコ
ロニーよりプラスミドＤＮＡを採取、精製し、制限酵素
切断地図を作成して、４３２３ｂｌ）のｐｓＫＡＢの確
認を行なった。
■ ｐＳＫＡＢＸの作製
ストレプトキナーゼ分泌発現系ベクターの構築にはスト
レプトキナーゼの第−位アミノ酸の前に付置したＮｅｔ
のコドンを有しない塩基配列のプラスミドベクターが必
要である。そのためｐｓＫＡＢのＮ末端側を変更したｐ
ｓＫＡＢＸの作製を以下の通り行なった。
レプトキナーゼの第−位アミノ酸の前に付置したＮｅｔ
のコドンを有しない塩基配列のプラスミドベクターが必
要である。そのためｐｓＫＡＢのＮ末端側を変更したｐ
ｓＫＡＢＸの作製を以下の通り行なった。
その概略は第２図に示す通りである。
即ち、ｐＳＫＡＢを制限酵素ＥＣ０ＲＩ及び卸ＬＩで処
理し、新たに化学合成したオリゴヌクレオチドＥ−１及
びＥ−２を加えてＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結反
応させ、この反応液にて大腸菌を形質転換し、得られた
コロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵素
切断地図を作成して、目的のｐｓＫＡＢＸを得た。
理し、新たに化学合成したオリゴヌクレオチドＥ−１及
びＥ−２を加えてＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結反
応させ、この反応液にて大腸菌を形質転換し、得られた
コロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵素
切断地図を作成して、目的のｐｓＫＡＢＸを得た。
尚、上記オリゴヌクレオチドＥ−１及びＥ−２並びに之
等を用いて得られる分泌発現系ベクター構築用リンカ−
の塩基配列は、以下の通りである。
等を用いて得られる分泌発現系ベクター構築用リンカ−
の塩基配列は、以下の通りである。
リンカ−塩基数 塩 基 配 列
Ｅ １ １ ｇ ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣ
ＧＧＧＣＣＥ −２１０ＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧ 〈分泌発現系ベクター構築用リンカ−〉ＡＡＴＴＣＧＡ
ＴＡＴＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＧＣＧＣ （ＥｃｏＲＩ） （ＡｐａＩ）かくして得られ
たプラスミドベクターは、ストレプトキナーゼの分泌発
現系構築に利用できる。
ＧＧＧＣＣＥ −２１０ＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧ 〈分泌発現系ベクター構築用リンカ−〉ＡＡＴＴＣＧＡ
ＴＡＴＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＧＣＧＣ （ＥｃｏＲＩ） （ＡｐａＩ）かくして得られ
たプラスミドベクターは、ストレプトキナーゼの分泌発
現系構築に利用できる。
尚、ｐＳＫＡＢＸのＥ−１及びＥ−２の導入部分の塩基
配列はＭ−１３ジデオキシ法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ。
配列はＭ−１３ジデオキシ法［Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １０
１．２０ （１９８３）） ニテ上記の通りであること
が確認された。
１．２０ （１９８３）） ニテ上記の通りであること
が確認された。
■ ｐＳＫＸの作製
このｐＳＫＸの作製の概略を第２図に示す。
ｐｓＫＡＢＸを制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＰｓｔ工Ｉで処
理し、生成する１３５２ｂＩ）のＤＮＡ断片と、ｐＳＫ
Ｃを制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＡａｔ ＩＩで処理して生
成する３０９ｂｐのＤＮＡ断片及びｐｓＫＤを制限酵素
Ａａｔ ＩＩ及び均１エエで処理して生成する３３０５
ｂｐのＤＮＡ断片と連結反応させ、反応物で大腸菌を形
質転換させ、以下前記と同様にして、ベクターＤＮＡを
採取、精製し、制限酵素地図を作成して解析した。
理し、生成する１３５２ｂＩ）のＤＮＡ断片と、ｐＳＫ
Ｃを制限酵素Ｓａｃ Ｉ及びＡａｔ ＩＩで処理して生
成する３０９ｂｐのＤＮＡ断片及びｐｓＫＤを制限酵素
Ａａｔ ＩＩ及び均１エエで処理して生成する３３０５
ｂｐのＤＮＡ断片と連結反応させ、反応物で大腸菌を形
質転換させ、以下前記と同様にして、ベクターＤＮＡを
採取、精製し、制限酵素地図を作成して解析した。
その結果、目的のｐ ＳＫＸ （４９６６ｂｐ）が得ら
れたことが確認された。
れたことが確認された。
実施例２ ストレプトキナーゼ分泌発現ベクターの構築
この例はストレプトキナーゼを大腸菌ペリプラズム層に
分泌発現するベクターの構築例であり、以下に示す通り
、田（プロモーター、ｂｌａ Ｅ／グナルペプチドの下
流に、化学合成したストレプトキナーゼ遺伝子を挿入し
、且つ上記ｂｌａシグナルペプチドのアミノ酸配列に対
するコドンの流れに沿ってストレプトキナーゼの構造遺
伝子のコドンフレームがずれないように、該構造遺伝子
を結合させ、目的のストレプトキナーゼ分泌発現ベクタ
ーを構築した。
分泌発現するベクターの構築例であり、以下に示す通り
、田（プロモーター、ｂｌａ Ｅ／グナルペプチドの下
流に、化学合成したストレプトキナーゼ遺伝子を挿入し
、且つ上記ｂｌａシグナルペプチドのアミノ酸配列に対
するコドンの流れに沿ってストレプトキナーゼの構造遺
伝子のコドンフレームがずれないように、該構造遺伝子
を結合させ、目的のストレプトキナーゼ分泌発現ベクタ
ーを構築した。
その構築の概略は、第３図に示す通りである。
図中、制限酵素認識部位における略号は前記に同じであ
り、またＳｐ ｂｌａはｂｌａシグナルペプチドを、Ｓ
Ｄはリポソーム結合サイトを、ＰｔａＣは！プロモータ
ーをそれぞれ示し、白抜きの部分がυ些−プロモーター
を、斜線部分がｂｌａシグナルペプチドを、黒塗り部分
がストレプトキナーゼ化学合成遺伝子をそれぞれコード
する塩基配列部分を示している。
り、またＳｐ ｂｌａはｂｌａシグナルペプチドを、Ｓ
Ｄはリポソーム結合サイトを、ＰｔａＣは！プロモータ
ーをそれぞれ示し、白抜きの部分がυ些−プロモーター
を、斜線部分がｂｌａシグナルペプチドを、黒塗り部分
がストレプトキナーゼ化学合成遺伝子をそれぞれコード
する塩基配列部分を示している。
■ ｐＳＫＸＴの作製
ｐＳＫＸを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びジリュＩで処理して
生成する１２５１ｂｌ）のＤＮＡ断片と同ｐＳＫＸを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びジリエＩで処理して生成する３７
１１ｂｐのＤＮＡ断片と、！プロモーター及び凹シグナ
ルペプチド部分を有するｐＫＴＮ２−２〔これを保有す
る大腸菌ＪＭ−１０３株は微工研菌寄託第９１４６号と
して寄託されている〕を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びμｈｅ
Ｉで処理して生成する４６０ｂｐのＤＮＡ断片とを、
それぞれアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により採取し、２等３種のＤＮＡ断片を連結反
応させた後、大腸菌ＪＭ−１０９株に形質転換した。
生成する１２５１ｂｌ）のＤＮＡ断片と同ｐＳＫＸを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びジリエＩで処理して生成する３７
１１ｂｐのＤＮＡ断片と、！プロモーター及び凹シグナ
ルペプチド部分を有するｐＫＴＮ２−２〔これを保有す
る大腸菌ＪＭ−１０３株は微工研菌寄託第９１４６号と
して寄託されている〕を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びμｈｅ
Ｉで処理して生成する４６０ｂｐのＤＮＡ断片とを、
それぞれアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により採取し、２等３種のＤＮＡ断片を連結反
応させた後、大腸菌ＪＭ−１０９株に形質転換した。
得られたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、
制限酵素切断地図の作成を行ない、目的のベクターｐＳ
ＫＸＴを得た。
制限酵素切断地図の作成を行ない、目的のベクターｐＳ
ＫＸＴを得た。
上記ｐｓＫＸＴを有する大腸菌ＪＭ−１０９株によれば
、゛υ煕−プロモーターの働きにより、ｂｌａｌシュナ
ルペプチドとストレプトキナーゼが融合した蛋白が細胞
内で産生され、次いで肛シグナルペプチドの働きにより
該蛋白は細胞内膜に移行され、ここで内膜に存在するプ
ロテアーゼの作用によりシグナルペプチドが切断され、
ストレプトキナーゼのみが外膜と内膜との間、即ちペリ
プラズム層に分泌産生され得る。
、゛υ煕−プロモーターの働きにより、ｂｌａｌシュナ
ルペプチドとストレプトキナーゼが融合した蛋白が細胞
内で産生され、次いで肛シグナルペプチドの働きにより
該蛋白は細胞内膜に移行され、ここで内膜に存在するプ
ロテアーゼの作用によりシグナルペプチドが切断され、
ストレプトキナーゼのみが外膜と内膜との間、即ちペリ
プラズム層に分泌産生され得る。
実施例３ ストレプトキナーゼの発現及び確認■ スト
レプトキナーゼ分泌発現ベクターｐｓＫＸＴを保有する
大腸菌ＪＭ−１０９株の培養 実施例２で得たベクターｐＳＫＸＴを保有する大腸菌Ｊ
Ｍ−１０９株を、下記第５表に示す組成のＭ−９力ザミ
ノ酸液体培地を用いて、以下の通り振盪培養により培養
した。
レプトキナーゼ分泌発現ベクターｐｓＫＸＴを保有する
大腸菌ＪＭ−１０９株の培養 実施例２で得たベクターｐＳＫＸＴを保有する大腸菌Ｊ
Ｍ−１０９株を、下記第５表に示す組成のＭ−９力ザミ
ノ酸液体培地を用いて、以下の通り振盪培養により培養
した。
第 ５ 表
但し、表中”印は別途オートクレーブ滅菌処理（１２１
℃、１５分間）した試薬の使用を示す。
℃、１５分間）した試薬の使用を示す。
また必要に応じて濾過滅菌したアンピシリンを最終濃度
５０μｇ ／ ｚｌとなるように添加して用いた。
５０μｇ ／ ｚｌとなるように添加して用いた。
前培養液１１１を同培地１００ｚＡ’を含む坂ロフラス
コに加え、３７℃にて往復振盪培養を行なった。
コに加え、３７℃にて往復振盪培養を行なった。
培養開始後約３時間（ＯＤ６００＝約０．３）にて、Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、シ
グマ社製）を最終濃度０．２５■／ ｘｉとなるように
添加し、更に培養を継続した。
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、シ
グマ社製）を最終濃度０．２５■／ ｘｉとなるように
添加し、更に培養を継続した。
■ 菌体からの目的物の抽出
上記■の条件で培養しＩ ＰＴＧ添加後約４時間で培養
を停止し、次の各操作にて各画分を得た。
を停止し、次の各操作にて各画分を得た。
即ち、まず培養液を遠心分離（５０００回転／分、１０
分間）して、菌体と培養上清とを分離した。かくして得
られた培養上清を培地画分とする。
分間）して、菌体と培養上清とを分離した。かくして得
られた培養上清を培地画分とする。
また得られた菌体に３０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）
−２０％ショ糖緩衝液を培養液と等量加えて懸濁させ、
更に最終濃度０．ＯＩＭとなる量のＥＤＴＡ水溶液を加
え、ロータリーシェーカーにて２４℃下、１８０回転／
分で１０分間振盪攪拌し、次いで遠心分離（６０００回
転／分、１０分間）した。かくして得られた上清をショ
糖緩衝液画分とする。
−２０％ショ糖緩衝液を培養液と等量加えて懸濁させ、
更に最終濃度０．ＯＩＭとなる量のＥＤＴＡ水溶液を加
え、ロータリーシェーカーにて２４℃下、１８０回転／
分で１０分間振盪攪拌し、次いで遠心分離（６０００回
転／分、１０分間）した。かくして得られた上清をショ
糖緩衝液画分とする。
更に上記遠心分離後の沈渣に、培養液と等量の氷冷した
水を加えて再懸濁させ、水中に１５分間静置し、時々攪
拌した後、遠心分離（１００００回転／分、５分間）に
より上清液と沈渣とを分離した。かくして得られた上清
液をペリプラズム画分とする。
水を加えて再懸濁させ、水中に１５分間静置し、時々攪
拌した後、遠心分離（１００００回転／分、５分間）に
より上清液と沈渣とを分離した。かくして得られた上清
液をペリプラズム画分とする。
■ ストレプトキナーゼ活性測定
ストレプトキナーゼのプラスミノーゲンアクチベーター
活性は、ジャクソンらの方法（Ｋ、 Ｗ・Ｊａｃｋｓｏ
ｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、 ８０゜３８７ （１９８１））に従
い、ストレプトキナーゼのプラスミノーゲン活性化によ
り生成したプラスミンの活性を測定することにより行な
った。
活性は、ジャクソンらの方法（Ｋ、 Ｗ・Ｊａｃｋｓｏ
ｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、 ８０゜３８７ （１９８１））に従
い、ストレプトキナーゼのプラスミノーゲン活性化によ
り生成したプラスミンの活性を測定することにより行な
った。
プラスミンの活性は、合成基質であるＳ−２２５１［Ｄ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリン、カビ
・ビトラム社製］を用いて、プラスミンにより遊離した
ｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｌｌ’における吸収の増
加を測定することにより行なった。以下にこの測定法の
詳細を示す。
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリン、カビ
・ビトラム社製］を用いて、プラスミンにより遊離した
ｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｌｌ’における吸収の増
加を測定することにより行なった。以下にこの測定法の
詳細を示す。
測定試料を０．０２５％トライトンＸ−１００水溶液に
て希釈し、その２５μｌと５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）２５μｌとを試験管に入れ、３７℃で５分
間予めインキュベートした後、１■／１７＋濃度のウシ
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を含む５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて８０Ｍｇ ／ｘｉ
濃度となるように希釈したヒトプラスミノーゲン（シグ
マ社製）２５μｌを加えて３７℃でインキュベートした
。
て希釈し、その２５μｌと５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）２５μｌとを試験管に入れ、３７℃で５分
間予めインキュベートした後、１■／１７＋濃度のウシ
血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）を含む５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて８０Ｍｇ ／ｘｉ
濃度となるように希釈したヒトプラスミノーゲン（シグ
マ社製）２５μｌを加えて３７℃でインキュベートした
。
その１５分後に１．６Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて２．５■／ ｘｌ
に希釈したＳ−２２５１を２５μ！加え、３７℃で１０
分間インキュベートした後、１．５ｘｌの０．２Ｍ酢酸
水溶液を加えて反応を停止させ、４０５ｎ”の吸光度を
測定した。
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて２．５■／ ｘｌ
に希釈したＳ−２２５１を２５μ！加え、３７℃で１０
分間インキュベートした後、１．５ｘｌの０．２Ｍ酢酸
水溶液を加えて反応を停止させ、４０５ｎ”の吸光度を
測定した。
測定試料の活性単位は、標準物質に１００国際単位／μ
ｇの比活性を有するストレプトコッカスエクイシミリス
Ｈ４６Ａ （グループＣ）由来のストレプトキナーゼを
用いて上記方法に従って測定した後、その標準曲線より
求めた。
ｇの比活性を有するストレプトコッカスエクイシミリス
Ｈ４６Ａ （グループＣ）由来のストレプトキナーゼを
用いて上記方法に従って測定した後、その標準曲線より
求めた。
■ ウェスタンブロッティング
上記■で得た菌体中のストレプトキナーゼは、ストレプ
トキナーゼ特異抗体を用いたウェスタンブロッティング
法［Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ、 Ｔ、 ５ｔａｅｈｅｌｉｎａ
ｎｄ Ｊ、 Ｇｏｒｄｏｎ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、。
トキナーゼ特異抗体を用いたウェスタンブロッティング
法［Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ、 Ｔ、 ５ｔａｅｈｅｌｉｎａ
ｎｄ Ｊ、 Ｇｏｒｄｏｎ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、。
７６、４３５０ （１９７９） ）により検出した。以
下にその詳細を示す。
下にその詳細を示す。
ストレプトキナーゼの特異抗血清は、ストレプトコッカ
ス エクイシミリスＨ４６Ａ （グループＣ）由来のス
トレプトキナーゼ精製品を抗原として家兎に免疫するこ
とにより調製した。これは凍結乾燥したストレプトキナ
ーゼ１■を生理食塩水０．５ｘｌに溶解後、フロイント
完全アジュバント０．５ｘｌ！を加えて乳化させ、これ
を家兎３羽の背部に皮下注射し、２週間毎に同量の上記
乳化ストレプトキナーゼを家兎の背部に皮内注射して合
計４回免疫し、最終免疫の１０日後に全採血して血清を
分離することにより調製した。かくして得られる抗血清
をストレプトキナーゼの検出に用いた。
ス エクイシミリスＨ４６Ａ （グループＣ）由来のス
トレプトキナーゼ精製品を抗原として家兎に免疫するこ
とにより調製した。これは凍結乾燥したストレプトキナ
ーゼ１■を生理食塩水０．５ｘｌに溶解後、フロイント
完全アジュバント０．５ｘｌ！を加えて乳化させ、これ
を家兎３羽の背部に皮下注射し、２週間毎に同量の上記
乳化ストレプトキナーゼを家兎の背部に皮内注射して合
計４回免疫し、最終免疫の１０日後に全採血して血清を
分離することにより調製した。かくして得られる抗血清
をストレプトキナーゼの検出に用いた。
ドデシル硫酸ナトリウム存在下ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以下ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥＪという）用の試料
は、例えば１ ｘｉ培養液から得た菌体を２％ＳＤＳと
２％ジチオスレイトールとを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０） １ｚｌに懸濁させ、１００℃で５
分間加熱後、遠心分離（１２０００回転／分、１０分間
）して得られる上清として調製した。
電気泳動（以下ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥＪという）用の試料
は、例えば１ ｘｉ培養液から得た菌体を２％ＳＤＳと
２％ジチオスレイトールとを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０） １ｚｌに懸濁させ、１００℃で５
分間加熱後、遠心分離（１２０００回転／分、１０分間
）して得られる上清として調製した。
５ＤＳ−ＰＡＧＥは、レムリの方法（Ｕ、 Ｋ。
Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７．６８０
（１９７０） ） ニ従い、０．１％ＳＤＳを含む１
５％ポリアクリルアミドゲルを用い、上記方法で調製し
た試料を２１１１Ａ／ａｎで約３時間泳動させて行なっ
た。ストレプトキナーゼの検出は、泳動後のゲル中の蛋
白質を電気泳動的にニトロセルロース膜（バイオ・ラッ
ド社製）に転写し、その蛋白質中より特異抗体を用いて
ストレプトキナーゼを特異的に染色して実施した。
（１９７０） ） ニ従い、０．１％ＳＤＳを含む１
５％ポリアクリルアミドゲルを用い、上記方法で調製し
た試料を２１１１Ａ／ａｎで約３時間泳動させて行なっ
た。ストレプトキナーゼの検出は、泳動後のゲル中の蛋
白質を電気泳動的にニトロセルロース膜（バイオ・ラッ
ド社製）に転写し、その蛋白質中より特異抗体を用いて
ストレプトキナーゼを特異的に染色して実施した。
上記染色は、まず転写後のニトロセルロース膜を０．１
５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５、以下ｒＴＢＳＪと略す）で１０％濃度と
なるように溶解したウシ血清アルブミン（以下ｒＢｓＡ
Ｊと略す）の溶液中に室温で１時間振盪後、０．１％Ｂ
ＳＡ−ＴＢＳで１０００倍に希釈した上記ストレプトキ
ナーゼ抗血清と室温で３時間反応させ、反応終了後、Ｔ
ＢＳで４回洗浄し更に０．１％ＢＳＡ−ＴＢＳで２００
０倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（カ
ッペル社製）で６０分間処理し、再度洗浄後、０．０３
％過酸化水素と０．５■／１１の４−クロロ−１−ナフ
トールを含む０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
で発色させて実施した。
５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５、以下ｒＴＢＳＪと略す）で１０％濃度と
なるように溶解したウシ血清アルブミン（以下ｒＢｓＡ
Ｊと略す）の溶液中に室温で１時間振盪後、０．１％Ｂ
ＳＡ−ＴＢＳで１０００倍に希釈した上記ストレプトキ
ナーゼ抗血清と室温で３時間反応させ、反応終了後、Ｔ
ＢＳで４回洗浄し更に０．１％ＢＳＡ−ＴＢＳで２００
０倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（カ
ッペル社製）で６０分間処理し、再度洗浄後、０．０３
％過酸化水素と０．５■／１１の４−クロロ−１−ナフ
トールを含む０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
で発色させて実施した。
■ ストレプトキナーゼ発現量の測定
分泌発現ベクターｐＳＫＸＴを保有する大腸菌ＪＭ−１
０９株を上記■及び■に従い培養、分画後、上記■に従
い測定してストレプトキナーゼ発現量を求めた。
０９株を上記■及び■に従い培養、分画後、上記■に従
い測定してストレプトキナーゼ発現量を求めた。
その結果、培地上清には検出されず、菌体画分に２００
国際単位／１１の発現量が認められた。その殆どはべり
プラズム画分に存在していた。更に上記■に従い解析し
た所、その免疫活性は天然型と同じ分子量的４７０００
の位置に現れた。
国際単位／１１の発現量が認められた。その殆どはべり
プラズム画分に存在していた。更に上記■に従い解析し
た所、その免疫活性は天然型と同じ分子量的４７０００
の位置に現れた。
以上の結果より、本発明により検出されたストレプトキ
ナーゼは、菌体内で翻訳された後、シグナルペプチドの
作用により細胞内膜を通過し、プロセッシングを受けて
シグナルペプチドが切り離され天然型と同じストレプト
キナーゼが分泌されるものと判断された。
ナーゼは、菌体内で翻訳された後、シグナルペプチドの
作用により細胞内膜を通過し、プロセッシングを受けて
シグナルペプチドが切り離され天然型と同じストレプト
キナーゼが分泌されるものと判断された。
実施例４ 組換え体ストレプトキナーゼの製造と同定
■ 菌体からの抽出
実施例３の■に示す培養法により得た培養液２．４４’
を遠心分離（８０００回転／分、１０分間）して菌体を
集め、これを実施例３の■に記載の浸透圧ショック法に
従い処理してペリプラズム画分を抽出した。
を遠心分離（８０００回転／分、１０分間）して菌体を
集め、これを実施例３の■に記載の浸透圧ショック法に
従い処理してペリプラズム画分を抽出した。
■ ストレプトキナーゼの精製
上記画分抽出液からのストレプトキナーゼの回収は硫安
塩析法、等電点電気泳動法、ゲル濾過法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の分離
方法の組合せにより実施でき、これにより単一精製品を
収得できる。その−例として疎水性クロマトグラフィー
と陰イオン交換クロマトグラフィーによる方法を以下に
詳述する。
塩析法、等電点電気泳動法、ゲル濾過法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の分離
方法の組合せにより実施でき、これにより単一精製品を
収得できる。その−例として疎水性クロマトグラフィー
と陰イオン交換クロマトグラフィーによる方法を以下に
詳述する。
まず上記ペリプラズム画分６００ｚ／に、硫酸アンモニ
ウムを０．６Ｍ濃度となるように加え、これを０．６Ｍ
硫酸アンモニウムで平衡化したブチルトヨパールカラム
（東ソー社製、３Ｘ２０ａｎ）に流した。カラムを０．
３Ｍ硫酸アンモニウム５００ｙＡ’で洗浄後、５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を流して、ストレプト
キナーゼ活性を含む画分を溶出させた。次いで得られた
溶出画分を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に
対して透析後、ＤＥＡＥ−５ＰＷ （東ソー社製、２．
１５ｘ１５ａｎ）を用いた分取用ＨＰＬＣシステム（東
ソー社製、ＨＬＣ−８３７型）で分離した。分離条件は
流速４１１／分とし、溶出液として５０ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，５）を用いて０．１Ｍから０．３Ｍ塩
化ナトリウムの直線濃度勾配を使用した。本ＨＰＬＣシ
ステムに上記透析後のブチルトヨパール溶出画分をイン
ジエクシジン後、主要蛋白質ピーク部分をプールした。
ウムを０．６Ｍ濃度となるように加え、これを０．６Ｍ
硫酸アンモニウムで平衡化したブチルトヨパールカラム
（東ソー社製、３Ｘ２０ａｎ）に流した。カラムを０．
３Ｍ硫酸アンモニウム５００ｙＡ’で洗浄後、５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を流して、ストレプト
キナーゼ活性を含む画分を溶出させた。次いで得られた
溶出画分を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に
対して透析後、ＤＥＡＥ−５ＰＷ （東ソー社製、２．
１５ｘ１５ａｎ）を用いた分取用ＨＰＬＣシステム（東
ソー社製、ＨＬＣ−８３７型）で分離した。分離条件は
流速４１１／分とし、溶出液として５０ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，５）を用いて０．１Ｍから０．３Ｍ塩
化ナトリウムの直線濃度勾配を使用した。本ＨＰＬＣシ
ステムに上記透析後のブチルトヨパール溶出画分をイン
ジエクシジン後、主要蛋白質ピーク部分をプールした。
ストレプトキナーゼ活性は本蛋白質ピークと一致するピ
ークに溶出された。更に溶出活性画分のプールをセファ
デックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製、２．５Ｘ
２５ａｎ）にて脱塩後、上記と同条件で再度、ＤＥＡＥ
−５ＰＷカラムで分離した。
ークに溶出された。更に溶出活性画分のプールをセファ
デックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製、２．５Ｘ
２５ａｎ）にて脱塩後、上記と同条件で再度、ＤＥＡＥ
−５ＰＷカラムで分離した。
最後にストレプトキナーゼ活性画分を同セファデックス
Ｇ−２５カラムで脱塩した後、凍結乾燥して最終精製品
を得た。
Ｇ−２５カラムで脱塩した後、凍結乾燥して最終精製品
を得た。
■ 最終精製品の同定
■−Ｉ ５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定上記■で
得た精製標品を還元剤の存在下及び非存在下で５ＤＳ−
ＰＡＧＥにて分析した。
得た精製標品を還元剤の存在下及び非存在下で５ＤＳ−
ＰＡＧＥにて分析した。
その結果、ストレプトコッカス エクイシミリスＨ４６
Ａ （グループＣ）由来ストレプトキナーゼと同じ分子
量４７３００の位置に単一バンドを示した。
Ａ （グループＣ）由来ストレプトキナーゼと同じ分子
量４７３００の位置に単一バンドを示した。
■−２アミノ酸分析
同精製標品に６Ｎ塩酸を加えて１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてニン
ヒドリン法によりアミノ酸分析を行なった。
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてニン
ヒドリン法によりアミノ酸分析を行なった。
結果を下記第６表に示す。
尚、第６表には比較のためストレプトコッカスエクイシ
ミリスＨ４６Ａ（グループＣ）由来ストレプトキナーゼ
（第６表では「天然体」と表示する）の同結果を併記す
る。
ミリスＨ４６Ａ（グループＣ）由来ストレプトキナーゼ
（第６表では「天然体」と表示する）の同結果を併記す
る。
第 ６ 表
■−３アミノ酸配列の分析
同精製標品のアミノ末端アミノ酸２０残基の配列分析を
ヘイウィックらの方法［：Ｒ，Ｍ、 Ｈｅ１ｗ１ｃｋ。
ヘイウィックらの方法［：Ｒ，Ｍ、 Ｈｅ１ｗ１ｃｋ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２
５６．７９９０ （１９８１） ］に従い行なった。
５６．７９９０ （１９８１） ］に従い行なった。
その結果、上記精製標品におけるアミノ末端よりアミノ
酸２０残基の配列は、ストレプトコッカス エクイシミ
リスＨ４６Ａ （グループＣ）由来ストレプトキナーゼ
（天然体）のものと同一であると同定された。
酸２０残基の配列は、ストレプトコッカス エクイシミ
リスＨ４６Ａ （グループＣ）由来ストレプトキナーゼ
（天然体）のものと同一であると同定された。
尚、同アミノ酸配列の分析は、上記■−２のアミノ酸分
析では検出できなかったＮ末端から６番目のアミノ酸で
あるＴｒｐの同定を可能とした。
析では検出できなかったＮ末端から６番目のアミノ酸で
あるＴｒｐの同定を可能とした。
上記方法に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼの
回収量は最終精製標品のアミノ酸分析より２．５■であ
った。
回収量は最終精製標品のアミノ酸分析より２．５■であ
った。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は１
０１．５国際単位／μｇであり、上記天然体のそれ（１
００国際単位／μｇ）と同程度であった。
０１．５国際単位／μｇであり、上記天然体のそれ（１
００国際単位／μｇ）と同程度であった。
以上の結果より、上記で得たストレプトキナーゼはスト
レプトコッカス エクイシミリスＨ４６Ａ（グループＣ
）由来ストレプトキナーゼ（天然体）と同一物質である
ことが確認された。
レプトコッカス エクイシミリスＨ４６Ａ（グループＣ
）由来ストレプトキナーゼ（天然体）と同一物質である
ことが確認された。
実施例 ５ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベク
ターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）の作製とその
発現 実施例２で得たストレプトキナーゼ発現ベクターｐＳＫ
ＸＴを用いて、ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−
３７２）の発現ベクターを次の通り作製した。その概略
は第４図に示した通りである。
ターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）の作製とその
発現 実施例２で得たストレプトキナーゼ発現ベクターｐＳＫ
ＸＴを用いて、ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−
３７２）の発現ベクターを次の通り作製した。その概略
は第４図に示した通りである。
■ ＤＮＡ断片の化学合成
ストレプトキナーゼのＣ末端側が欠落した誘導体蛋白質
（１−３７２）の製造のために、以下の新たに化学合成
したオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）断片（Ｆ−１及びＦ
−２）を利用した。
（１−３７２）の製造のために、以下の新たに化学合成
したオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）断片（Ｆ−１及びＦ
−２）を利用した。
ＡＴＡＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴ
ＡＣＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴ（Ａｃｃ
Ｉ） Ｆ −２（Ｓａｌ Ｉ）２等ＤＮＡ
断片の合成法は前記と同様とした。
ＡＣＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴ（Ａｃｃ
Ｉ） Ｆ −２（Ｓａｌ Ｉ）２等ＤＮＡ
断片の合成法は前記と同様とした。
上記誘導体蛋白発現ベクターの作製は、まずｐｓＫＸＴ
に存在する制限酵素認識部位Ａｃｃ Ｉ（ストレプトキ
ナーゼの３６７位に存在。他に３箇所存在）と同Ｓａｌ
ユＩ （同終始コドンの後に存在。
に存在する制限酵素認識部位Ａｃｃ Ｉ（ストレプトキ
ナーゼの３６７位に存在。他に３箇所存在）と同Ｓａｌ
ユＩ （同終始コドンの後に存在。
他に１箇所存在）の断片を抜き取り、上記断片Ｆ−１及
びＦ−２を入れることにより行なった。
びＦ−２を入れることにより行なった。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）の構築ｐｓＫ
ＸＴを制限酵素ｐｓｔ Ｉ及びＭｌｕ ！で処理して生
成する１６３５ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素ｐｓｔ
Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理して生成する２９６２ｂｐのＤ
ＮＡ断片と、更に制限酵素〜匹−Ｉ及びＭｌｕＩで処理
して生成する６７７ｂｐのＤＮＡ断片とを、それぞれア
ガロースゲル電気泳動法により採取し、之等と上記■で
得た化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた後、反応物
で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られたコロニ
ーよりベクターＤＮＡを採取−１精製し、制限酵素地図
を作成して、目的のベクターｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−
３７２） ヲ得た。
ＸＴを制限酵素ｐｓｔ Ｉ及びＭｌｕ ！で処理して生
成する１６３５ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素ｐｓｔ
Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理して生成する２９６２ｂｐのＤ
ＮＡ断片と、更に制限酵素〜匹−Ｉ及びＭｌｕＩで処理
して生成する６７７ｂｐのＤＮＡ断片とを、それぞれア
ガロースゲル電気泳動法により採取し、之等と上記■で
得た化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた後、反応物
で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られたコロニ
ーよりベクターＤＮＡを採取−１精製し、制限酵素地図
を作成して、目的のベクターｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−
３７２） ヲ得た。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２）の発現及び確認上記■
で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を
保有する大腸菌ＪＭ−１０９株を、前記第５表に示す組
成のＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて、実施例３の■
と同様にして振盪培養した。
で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を
保有する大腸菌ＪＭ−１０９株を、前記第５表に示す組
成のＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて、実施例３の■
と同様にして振盪培養した。
Ｉ ＰＴＧ添加後約４時間で培養を停止し、集菌し、実
施例３の■と同様にして、菌体と培養上清とを分離し、
ショ糖緩衝液画分及びペリプラズム画分を得た。
施例３の■と同様にして、菌体と培養上清とを分離し、
ショ糖緩衝液画分及びペリプラズム画分を得た。
各画分につき、実施例３の■及び■と同様にそれぞれス
トレプトキナーゼ活性測定及びウェスタンブロッティン
グを行ない、その発現量を求めた。
トレプトキナーゼ活性測定及びウェスタンブロッティン
グを行ない、その発現量を求めた。
その結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約１０
００国除重位／ ｉｌｌの発現量が認められた。
００国除重位／ ｉｌｌの発現量が認められた。
その殆どはべりプラズム画分に存在していた。更にウェ
スタンブロッティングに従う解析の結果、その免疫活性
は計算される分子量約４２３００の位置に現れた。
スタンブロッティングに従う解析の結果、その免疫活性
は計算される分子量約４２３００の位置に現れた。
以上の結果より、ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１
−３７２）は、菌体内で翻訳された後、シグナルペプチ
ドの作用により細胞内膜を通過しプロセッシングを受け
てシグナルペプチドが切り離されて分泌されるものと判
断された。
−３７２）は、菌体内で翻訳された後、シグナルペプチ
ドの作用により細胞内膜を通過しプロセッシングを受け
てシグナルペプチドが切り離されて分泌されるものと判
断された。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２）の製造と同定 上記■と同様にして培養液２．４１を遠心分離（８００
０回転／分、１０分間）して菌体を集め、浸透圧ショッ
ク法によりペリプラズム画分を抽出し、該抽出液からス
トレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２）を、実施
例４の■と同様にして回収及び精製し最終的に凍結乾燥
して精製品を得た。
７２）の製造と同定 上記■と同様にして培養液２．４１を遠心分離（８００
０回転／分、１０分間）して菌体を集め、浸透圧ショッ
ク法によりペリプラズム画分を抽出し、該抽出液からス
トレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２）を、実施
例４の■と同様にして回収及び精製し最終的に凍結乾燥
して精製品を得た。
上記精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに
て分析した結果、目的の分子量約４２３００の位置に単
一バンドを示した。
て分析した結果、目的の分子量約４２３００の位置に単
一バンドを示した。
また同精製品に６Ｎ塩酸を加え１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてニン
ヒドリン法によりアミノ酸分析を行なった結果を下記第
７表に示す。
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてニン
ヒドリン法によりアミノ酸分析を行なった結果を下記第
７表に示す。
第 ７ 表
更に同精製品のアミノ末端よりアミノ酸２０残基の配列
分析をヘイウィックらの方法に従い行なうと共に、カル
ボキシル末端より５残基の配列分析をカルボキシペプチ
ダーゼＡとＢとを用いて行なった。之等の結果より、目
的のストレプトコッカス誘導体蛋白質（１−３７２）を
同定できた。
分析をヘイウィックらの方法に従い行なうと共に、カル
ボキシル末端より５残基の配列分析をカルボキシペプチ
ダーゼＡとＢとを用いて行なった。之等の結果より、目
的のストレプトコッカス誘導体蛋白質（１−３７２）を
同定できた。
上記方法に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘
導体蛋白質（１−３７２）の回収量は、最終精製標品の
アミノ酸分析より９■であった。
導体蛋白質（１−３７２）の回収量は、最終精製標品の
アミノ酸分析より９■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で１０７であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
然体のそれを１００としてモル比で１０７であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
実施例 ６ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベク
ターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ（１−３７２，１１８欠落）の
作製とその発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を用いて、本ストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２・１１８欠落）
の発現ベクターを次の通り作製した。その概略は第５図
に示す通りである。
ターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ（１−３７２，１１８欠落）の
作製とその発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を用いて、本ストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２・１１８欠落）
の発現ベクターを次の通り作製した。その概略は第５図
に示す通りである。
■ ＤＮＡ断片の化学合成
目的の誘導体蛋白発現ベクターは、ｐｓＫＸＴ（１−３
７２）の制限酵素認識部位Ｎｈｅ ＩとＨｉｎｆ Ｉの
間を、以下に示す新たに化学合成したオリゴヌクレオチ
ド（ＤＮＡ）断片（イー１〜イー４）に置き換えること
により作製した。
７２）の制限酵素認識部位Ｎｈｅ ＩとＨｉｎｆ Ｉの
間を、以下に示す新たに化学合成したオリゴヌクレオチ
ド（ＤＮＡ）断片（イー１〜イー４）に置き換えること
により作製した。
イー２
ＴＡＣＧＣＴＡＡＡＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＣＴＣ
ＴＴＣＣＧＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＡ
ＴＴＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡ（ＢａｍＨＩ） イー３
（Ｈｉｎｆ Ｉ）之等各ＤＮＡ断片は別々に前記と同様
にして化学合成した。尚、−後の解析のためｐＳＫＸＴ
（１−３７２）には存在しない制限酵素認識部位Ｂａｍ
ＨＩを設定した。
ＴＴＣＣＧＡＴＧＣＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＡ
ＴＴＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡ（ＢａｍＨＩ） イー３
（Ｈｉｎｆ Ｉ）之等各ＤＮＡ断片は別々に前記と同様
にして化学合成した。尚、−後の解析のためｐＳＫＸＴ
（１−３７２）には存在しない制限酵素認識部位Ｂａｍ
ＨＩを設定した。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１１８欠落）
の構築ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を制限酵素
Ｐｓｔ Ｉ及び坦トー■で処理して生成する１５２２ｂ
ｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＳａｃ Ｉ
で処理して生成する３４８８ｂｌ）のＤＮＡ断片と、更
に制限酵素ジ些−■及びＨｉｎｆ Ｉで処理して生成す
る２１２ｂｐのＤＮＡ断片とをそれぞれアガロースゲル
電気泳動法により採取し、之等と上記■で得た４本の化
学合成りＮＡ断片とを連結反応させた（但しオリゴマー
イー２及びイー（４はそれらの５末端をリン酸化した）
後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得ら
れたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限
酵素地図を作成して、目的のベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ
Ｔ （１−３７２，１１８欠落） ヲ得り。
の構築ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を制限酵素
Ｐｓｔ Ｉ及び坦トー■で処理して生成する１５２２ｂ
ｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＳａｃ Ｉ
で処理して生成する３４８８ｂｌ）のＤＮＡ断片と、更
に制限酵素ジ些−■及びＨｉｎｆ Ｉで処理して生成す
る２１２ｂｐのＤＮＡ断片とをそれぞれアガロースゲル
電気泳動法により採取し、之等と上記■で得た４本の化
学合成りＮＡ断片とを連結反応させた（但しオリゴマー
イー２及びイー（４はそれらの５末端をリン酸化した）
後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得ら
れたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限
酵素地図を作成して、目的のベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ
Ｔ （１−３７２，１１８欠落） ヲ得り。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２・１１８欠落）の発現及
び確認 上記■で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ ’ｌ’ （１−
３７２，１１８欠落）を保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
び確認 上記■で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ ’ｌ’ （１−
３７２，１１８欠落）を保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
Ｉ ＰＴＧ添加後、同様に集菌し、ストレプトキナーゼ
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約２５０
国除重位／ ｚｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量的４２２００の位置に現れた。
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約２５０
国除重位／ ｚｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量的４２２００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，１１８欠落）の製造と同定実施例５の■と同様に
して、培養液１．６１を遠心分離して菌体を集め、浸透
圧ショック法によりペリプラズム画分を抽出し、抽出液
から目的誘導体蛋白質（１−３７２・１１８欠落）を回
収及び精製した。
７２，１１８欠落）の製造と同定実施例５の■と同様に
して、培養液１．６１を遠心分離して菌体を集め、浸透
圧ショック法によりペリプラズム画分を抽出し、抽出液
から目的誘導体蛋白質（１−３７２・１１８欠落）を回
収及び精製した。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて分析した結果、目的の分子量的４２２００の位置
に単一バンドを示した。
Ｅにて分析した結果、目的の分子量的４２２００の位置
に単一バンドを示した。
また同精製品に６Ｎ塩酸を加え１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第８表に示す。
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第８表に示す。
第 ８ 表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２、１１８欠落）の回収量は、最終精
製品のアミノ酸分析より２．４■であった。
蛋白質（１−３７２、１１８欠落）の回収量は、最終精
製品のアミノ酸分析より２．４■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で１００であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
然体のそれを１００としてモル比で１００であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
実施例 ７ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ヘク
ター ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８
欠落）の作製とその発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を用いて、本ストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質（１″″３７２・４５−６８
欠落）の発現ベクターを次の通り作製した。
ター ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８
欠落）の作製とその発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を用いて、本ストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質（１″″３７２・４５−６８
欠落）の発現ベクターを次の通り作製した。
その概略は第６図に示す通りである。
■ ＤＮＡ断片の化学合成
目的誘導体蛋白発現ベクターは、ｐＳＫＸＴ（１−３７
２）の制限酵素認識部位匣匹７５２４） Ｖと虱Ｉの間
を、下記新規化学合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）断
片（ロー１及びロー２）に置き換えることにより作製し
た。
２）の制限酵素認識部位匣匹７５２４） Ｖと虱Ｉの間
を、下記新規化学合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）断
片（ロー１及びロー２）に置き換えることにより作製し
た。
（Ｎｓｐ（７５２４） Ｖ） ｏ −１ＣＧＡＡＡ
ＴＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡ
ＴＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＧＡ
ＴＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＣＴロー２
（Ｘｈｏ Ｉ）このＤＮＡ断片はストレプトキナ
ーゼの４５〜６８位が欠落した部分を含んでおり、２等
ＤＮＡ断片は別々に前記と同様にして化学合成した。
ＴＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡ
ＴＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＧＡ
ＴＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＣＴロー２
（Ｘｈｏ Ｉ）このＤＮＡ断片はストレプトキナ
ーゼの４５〜６８位が欠落した部分を含んでおり、２等
ＤＮＡ断片は別々に前記と同様にして化学合成した。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８欠
落）の構築１） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び懸と（７５２４）■で処理して生
成する１３２５ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ及びＸｈｏ Ｉで処理して生成する３８６４ｂｐのＤ
ＮＡ断片とをアガロースゲル電気泳動法により採取し、
之等と上記■で得た２本の化学合成りＮＡ断片とを連結
反応させた後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
させ、得られたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精
製し、制限酵素地図を作成して、目的のベクターｐ Ｓ
Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８欠落）を得た
。
落）の構築１） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び懸と（７５２４）■で処理して生
成する１３２５ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ及びＸｈｏ Ｉで処理して生成する３８６４ｂｐのＤ
ＮＡ断片とをアガロースゲル電気泳動法により採取し、
之等と上記■で得た２本の化学合成りＮＡ断片とを連結
反応させた後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
させ、得られたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精
製し、制限酵素地図を作成して、目的のベクターｐ Ｓ
Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８欠落）を得た
。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２・４５−６８欠落）の発
現及び確認 上記■で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７
２，４５−６８欠落）を保有する大腸菌７Ｍ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、集菌後、ストレプトキナーゼ活性（プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定した結果、
菌体画分に約１２００国除重位／１！の発現量が認めら
れ、その殆どはべりプラズム画分に存在していた。更に
ウェスタンブロッティングに従う解析を行なった結果、
その免疫活性は計算される分子量的３９６００の位置に
現れた。
現及び確認 上記■で得たベクターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７
２，４５−６８欠落）を保有する大腸菌７Ｍ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、集菌後、ストレプトキナーゼ活性（プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定した結果、
菌体画分に約１２００国除重位／１！の発現量が認めら
れ、その殆どはべりプラズム画分に存在していた。更に
ウェスタンブロッティングに従う解析を行なった結果、
その免疫活性は計算される分子量的３９６００の位置に
現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，４５＝６８欠落）の製造と同定実施例５の■と同
様にして、培養液８００ｚＡ’より集菌し、浸透圧ショ
ック法によりペリプラズム画分を抽出し、抽出液から目
的誘導体蛋白質（１−３７２，４５″″６８欠落）を回
収及び精製して凍結乾燥精製品を得た。
７２，４５＝６８欠落）の製造と同定実施例５の■と同
様にして、培養液８００ｚＡ’より集菌し、浸透圧ショ
ック法によりペリプラズム画分を抽出し、抽出液から目
的誘導体蛋白質（１−３７２，４５″″６８欠落）を回
収及び精製して凍結乾燥精製品を得た。
得られた精製品のアミノ酸分析結果を下記第９表に示す
。
。
第
表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落）の回収量は、最
終精製品のアミノ酸分析より２■であった。
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落）の回収量は、最
終精製品のアミノ酸分析より２■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で１１２であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
然体のそれを１００としてモル比で１１２であり、天然
型ストレプトキナーゼと同等であった。
実施例 ８ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベク
ターｐ ＳＫ Ｘ Ｔ（１−３７２，２５６Ｇｉｎ、２
５７ＧＩｎ置換）の作製トソノ発現実施例５で得たスト
レプトキナーゼ誘導体発現ベクター１） Ｓ Ｋ Ｘ
Ｔ （１−３７２） ヲ用イテ、本ストレプトキナーゼ
誘導体蛋白質（２５６位及び２５７位をそれぞれＧｉｎ
に置換したもの）の発現ベクターを次の通り作製した。
ターｐ ＳＫ Ｘ Ｔ（１−３７２，２５６Ｇｉｎ、２
５７ＧＩｎ置換）の作製トソノ発現実施例５で得たスト
レプトキナーゼ誘導体発現ベクター１） Ｓ Ｋ Ｘ
Ｔ （１−３７２） ヲ用イテ、本ストレプトキナーゼ
誘導体蛋白質（２５６位及び２５７位をそれぞれＧｉｎ
に置換したもの）の発現ベクターを次の通り作製した。
その概略は第７図に示す通りである。
■ ＤＮＡ断片の化学合成
目的誘導体蛋白発現ベクターは、ｐｓＫＸＴ（１−３７
２）の制限酵素認識部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩと陀すエの間
を、下記新規化学合成りＮＡ）断片（バー１〜バー４）
に置き換えることにより作製した。
２）の制限酵素認識部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩと陀すエの間
を、下記新規化学合成りＮＡ）断片（バー１〜バー４）
に置き換えることにより作製した。
（）ｆｉｎｄ ＩＩＩ） バーＩＡＧＣＴＴＡ
ＣＣＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧ
ＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣ
ＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣバー４ このＤＮＡ断片はストレプトキナーゼの２５６位及び２
５７位がそれぞれＧｉｎに置換された部分を含んでおり
、バー１〜バー４の４本に分けて、それぞれ前記と同様
にして化学合成した。尚、後の解析のために新たに制限
酵素認識部位ＥｃｏＲＶを設定した。
ＣＣＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧ
ＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣ
ＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣバー４ このＤＮＡ断片はストレプトキナーゼの２５６位及び２
５７位がそれぞれＧｉｎに置換された部分を含んでおり
、バー１〜バー４の４本に分けて、それぞれ前記と同様
にして化学合成した。尚、後の解析のために新たに制限
酵素認識部位ＥｃｏＲＶを設定した。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，２５６ＧＩｎ
、２５７ＧＩｎ置換）の構築 ｐ ３ Ｋ Ｘ ７ （１−３７２）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ及びＮｃｏ Ｉで処理して生成する６０８ｂ
ｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び５ｎａＢ
Ｉで処理して生成する４６１２ｂｌ）のＤＮＡ断片とを
アガロースゲル電気泳動法によ−り採取し、之等と上記
■で得た４本の化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた
（但しオリゴマーバー２及びバー４は５′末端をリン酸
化した）後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換さ
せ、得られたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製
し、制限酵素地図を作成して、目的のベクターを得た。
、２５７ＧＩｎ置換）の構築 ｐ ３ Ｋ Ｘ ７ （１−３７２）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ及びＮｃｏ Ｉで処理して生成する６０８ｂ
ｐのＤＮＡ断片と、制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び５ｎａＢ
Ｉで処理して生成する４６１２ｂｌ）のＤＮＡ断片とを
アガロースゲル電気泳動法によ−り採取し、之等と上記
■で得た４本の化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた
（但しオリゴマーバー２及びバー４は５′末端をリン酸
化した）後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換さ
せ、得られたコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製
し、制限酵素地図を作成して、目的のベクターを得た。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２、２５６ＧＩｎ、 ２５
７ＧＩｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、Ｉ ＰＴＧ添加後集菌し、ストレプト
キナーゼ活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）
を測定した結果、培地上清には検出されず菌体画分に約
７０国除重位／ｘｌｌの発現量が認められ、その殆どは
べりプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロ
ッティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は
計算される分子量約４２３００の位置に現れた。
７ＧＩｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、Ｉ ＰＴＧ添加後集菌し、ストレプト
キナーゼ活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）
を測定した結果、培地上清には検出されず菌体画分に約
７０国除重位／ｘｌｌの発現量が認められ、その殆どは
べりプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロ
ッティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は
計算される分子量約４２３００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）の製造と同定
実施例５の■と同様にして培養液２．４１を遠心分離し
て集菌し、浸透圧ショック法によりペリプラズム画分を
抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７２，２
５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を回収及ヒ精製して凍
結乾燥精製品を得た。
７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）の製造と同定
実施例５の■と同様にして培養液２．４１を遠心分離し
て集菌し、浸透圧ショック法によりペリプラズム画分を
抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７２，２
５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を回収及ヒ精製して凍
結乾燥精製品を得た。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ４こで分析した結果、目的の分子量約４２３００の位
置に単一バンドを示した。
Ｅ４こで分析した結果、目的の分子量約４２３００の位
置に単一バンドを示した。
また同精製品のアミノ酸分析を行なった結果を下記第１
０表に示す。
０表に示す。
第 １０ 表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２、２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置
換）の回収量は、最終精製品のアミノ酸分析より４■で
あった。
蛋白質（１−３７２、２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置
換）の回収量は、最終精製品のアミノ酸分析より４■で
あった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で７であった。
然体のそれを１００としてモル比で７であった。
実施例 ９ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベク
ターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１１８欠落、
２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の作成とその発
現 実施例６で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１１８欠落）と実施
例８で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクターｐ
Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７
ＧＩｎ置換）トラ用イて、本ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２゜１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）の発現ヘクターヲ次の通り作製し
た。
ターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１１８欠落、
２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の作成とその発
現 実施例６で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１１８欠落）と実施
例８で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクターｐ
Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７
ＧＩｎ置換）トラ用イて、本ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２゜１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）の発現ヘクターヲ次の通り作製し
た。
その概略は第８図に示す通りである。
■ ｐｓＫ ｘＴ、（１−３７２，１１８欠落、 ２５
６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の構築 ｐ３ Ｋ Ｘ ７ （１−３７２，１１８欠落）を制限
酵素！！ＩＬＩ Ｉ及びＨｌｎｄＩＩＩで処理して生成
する５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ
（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び相ＬＩＩで処理して生成する１４
４３ｂｐのＤＮＡ断片と、更に制限酵素ｐｓｔ工Ｉ及び
ＨｌｎｄＩＩＩで処理して生成する３３３５ｂｐのＤＮ
Ａ断片とを、それぞれアガロースゲル電気泳動法により
採取し、之等のＤＮＡ断片を連結反応させた。反応物で
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られたコロニー
よりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵素地図を作
成して、目的のベクターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３
７２，１１８欠落、２５６ＧＩｎ。
６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の構築 ｐ３ Ｋ Ｘ ７ （１−３７２，１１８欠落）を制限
酵素！！ＩＬＩ Ｉ及びＨｌｎｄＩＩＩで処理して生成
する５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ
（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び相ＬＩＩで処理して生成する１４
４３ｂｐのＤＮＡ断片と、更に制限酵素ｐｓｔ工Ｉ及び
ＨｌｎｄＩＩＩで処理して生成する３３３５ｂｐのＤＮ
Ａ断片とを、それぞれアガロースゲル電気泳動法により
採取し、之等のＤＮＡ断片を連結反応させた。反応物で
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られたコロニー
よりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵素地図を作
成して、目的のベクターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３
７２，１１８欠落、２５６ＧＩｎ。
２５７Ｇ１ｎ置換）ヲ得り。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２，１１８欠落、 ２５６
ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
Ｉ ＰＴＧ添加後、同様に集菌し、ストレプトキナーゼ
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約１６０
国除重位／ ｚｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約４２２００の位置に現れた。
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約１６０
国除重位／ ｚｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約４２２００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置
換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液１．２１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２、１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置
換）を回収及び精製した。
７２，１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置
換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液１．２１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２、１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置
換）を回収及び精製した。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約４２２００の位置
に単一バンドを示した。
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約４２２００の位置
に単一バンドを示した。
また同精製品に６Ｎ塩酸を加え１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５゛型アミノ酸自動分析計を用いてア
ミノ酸分析を行なった。結果を下記第１１表に示す。
分解し、日立８３５゛型アミノ酸自動分析計を用いてア
ミノ酸分析を行なった。結果を下記第１１表に示す。
第
表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２，１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製品のアミノ
酸分析より５．４■であった。
蛋白質（１−３７２，１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製品のアミノ
酸分析より５．４■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で９．９８であった。
然体のそれを１００としてモル比で９．９８であった。
実施例 １ｏ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベ
クターｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２゜４５−６８欠
落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の作製とそ
の発現 実施例７及び実施例８で得たストレプトキナーゼ誘導体
発現ベクター１） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４
５−６８欠落）及びｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２
，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を用いて、本スト
レプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２，４５−６８
欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の発現
ベクターを次の通り作製した。
クターｐＳ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２゜４５−６８欠
落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の作製とそ
の発現 実施例７及び実施例８で得たストレプトキナーゼ誘導体
発現ベクター１） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４
５−６８欠落）及びｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２
，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を用いて、本スト
レプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３７２，４５−６８
欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）の発現
ベクターを次の通り作製した。
その概略は第９図に示す通りである。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８欠
落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の構築 １） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２・４５″″６８欠
落）を制限酵素りリエＩ及びＭｌｕ Ｉで処理して生成
する１５６３ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ ＳＫ Ｘ Ｔ
（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＭｌｕ Ｉで処理して生成する３
６６１ｂｐのＤＮＡ断片とを、アガロースゲル電気泳動
法により採取し、之等のＤＮＡ断片を連結反応させた後
、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られ
たコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵
素地図を作成して、目的（７） ベクターｐ ＳＫＸ
Ｔ （１−３７２，４５−６８欠落。
落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩｎ置換）の構築 １） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２・４５″″６８欠
落）を制限酵素りリエＩ及びＭｌｕ Ｉで処理して生成
する１５６３ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ ＳＫ Ｘ Ｔ
（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を制
限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＭｌｕ Ｉで処理して生成する３
６６１ｂｐのＤＮＡ断片とを、アガロースゲル電気泳動
法により採取し、之等のＤＮＡ断片を連結反応させた後
、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られ
たコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵
素地図を作成して、目的（７） ベクターｐ ＳＫＸ
Ｔ （１−３７２，４５−６８欠落。
２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）を得た。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、２５
６ＧＩｎ、２５７Ｇｉｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
６ＧＩｎ、２５７Ｇｉｎ置換）の発現及び確認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養した。
Ｉ ＰＴＧ添加後、同様に集菌し、ストレプトキナーゼ
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約４０国
除重位／ ｉｌｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約３９８００の位置に現れた。
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約４０国
除重位／ ｉｌｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約３９８００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩ
ｎ置換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液０．８１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７Ｇｌ
ｎ置換）を回収及び精製した。
７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ、 ２５７ＧＩ
ｎ置換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液０．８１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７Ｇｌ
ｎ置換）を回収及び精製した。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約３９８００の位置
に単一バンドを示した。
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約３９８００の位置
に単一バンドを示した。
また同精製品に６Ｎ塩酸を加え１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第１２表に示す。
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第１２表に示す。
第 １２ 表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ
、 ２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製品のアミ
ノ酸分析より０．５６■であった。
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ
、 ２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製品のアミ
ノ酸分析より０．５６■であった。
またブラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で６．３０であった。
然体のそれを１００としてモル比で６．３０であった。
実施例 １１ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベ
クターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２゜４５−６８
欠落、１１８欠落、 ２５６Ｇｌｎ 、 ２５７Ｇｉｎ
置換）の作製とその発現 実施例６及び実施例１０で得たストレプトキナーゼ誘導
体発現ベクターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１
１８欠落）及びｐｓＫＸ ’１’ （１−３７２，４５
−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）
を用いて、本ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２
５７Ｇ１ｎ置換）の発現ベクターを次の通り作製した。
クターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２゜４５−６８
欠落、１１８欠落、 ２５６Ｇｌｎ 、 ２５７Ｇｉｎ
置換）の作製とその発現 実施例６及び実施例１０で得たストレプトキナーゼ誘導
体発現ベクターｐ ３ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，１
１８欠落）及びｐｓＫＸ ’１’ （１−３７２，４５
−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、 ２５７ＧＩｎ置換）
を用いて、本ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２
５７Ｇ１ｎ置換）の発現ベクターを次の通り作製した。
その概略は第１０図に示す通りである。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８欠
落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）ノ
構築 ｐ ｓＫ Ｘ ’ｌ’ （１−３７２，１１８欠落）を
制限酵素用ｌユＩ Ｉ及びＨｌｎｄＩＩＩで処理して生
成する５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ
（１−３７２，４５−６８欠落、２５６Ｇｌｎ、 ２
５７ＧＩｎ置換）を制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び！！ＩＬ
Ｉ Ｉ テ処理して生成する１３７１ｂｐのＤＮＡ断片
と、更に制限酵素Ｐｓｔ工Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理
して生成する３３３５ｂｐのＤＮＡ断片とを、それぞれ
アガロースゲル電気泳動法により採取し、°之等のＤＮ
Ａ断片を連結反応させた後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換させ、得られたコロニーよりベクターＤＮ
Ａを採取、精製し、制限酵素地図を作成して、目的のベ
クターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８
欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）
を得た。
落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）ノ
構築 ｐ ｓＫ Ｘ ’ｌ’ （１−３７２，１１８欠落）を
制限酵素用ｌユＩ Ｉ及びＨｌｎｄＩＩＩで処理して生
成する５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ
（１−３７２，４５−６８欠落、２５６Ｇｌｎ、 ２
５７ＧＩｎ置換）を制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及び！！ＩＬ
Ｉ Ｉ テ処理して生成する１３７１ｂｐのＤＮＡ断片
と、更に制限酵素Ｐｓｔ工Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理
して生成する３３３５ｂｐのＤＮＡ断片とを、それぞれ
アガロースゲル電気泳動法により採取し、°之等のＤＮ
Ａ断片を連結反応させた後、反応物で大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換させ、得られたコロニーよりベクターＤＮ
Ａを採取、精製し、制限酵素地図を作成して、目的のベ
クターｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，４５−６８
欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）
を得た。
上記ベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株は、「Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−１０９，ｐ
ｓＫＸＴ（１−３７２゜Δ４５−６８．Δ１１８．ＱＱ
） Ｊなる表示で微工研に寄託されており、その寄託番
号は微工研条寄第２８２８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８
２８）である。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、 ＪＭ−１０９，ｐ
ｓＫＸＴ（１−３７２゜Δ４５−６８．Δ１１８．ＱＱ
） Ｊなる表示で微工研に寄託されており、その寄託番
号は微工研条寄第２８２８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８
２８）である。
■ 誘導体蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、１１
Ｂ欠落、２５６Ｇｉｎ、２５７ＧＩｎ置換）の発現及び
確認上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０
９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８２８）を前記したＭ−９力
ザミノ酸液体培地を用いて同様にして振盪培養した。
Ｂ欠落、２５６Ｇｉｎ、２５７ＧＩｎ置換）の発現及び
確認上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０
９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８２８）を前記したＭ−９力
ザミノ酸液体培地を用いて同様にして振盪培養した。
Ｉ ＰＴＧ添加後、同様に集菌し、ストレプトキナーゼ
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約１７０
国除重位／ ｘｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量的３９７００の位置に現れた。
活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）を測定し
た結果、培地上清には検出されず、菌体画分に約１７０
国除重位／ ｘｌの発現量が認められた。その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量的３９７００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２，４５−６８欠落、１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ
、 ２５７ＧＩｎ置換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液１．２１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ。
７２，４５−６８欠落、１１８欠落、 ２５６ＧＩｎ
、 ２５７ＧＩｎ置換）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液１．２１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５６ＧＩｎ。
２５７ＧＩｎ置換）を回収及び精製した。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて分析した結果、目的の分子量的３９７００の位置
に単一バンドを示した。
Ｅにて分析した結果、目的の分子量的３９７００の位置
に単一バンドを示した。
また同精製品に６Ｎ塩酸を加え１１０℃で２４時間加水
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第１３表に示す。
分解し、日立８３５型アミノ酸自動分析計を用いてアミ
ノ酸分析を行なった。結果を下記第１３表に示す。
第 １３ 表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーゼ誘導体
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２
５６Ｇｉｎ・２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製
品のアミノ酸分析より２．４■であった。
蛋白質（１−３７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２
５６Ｇｉｎ・２５７ＧＩｎ置換）の回収量は、最終精製
品のアミノ酸分析より２．４■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で７．７４であった。
然体のそれを１００としてモル比で７．７４であった。
実施例 １２ ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質発現ベ
クターｐ ＳＫ Ｘ Ｔ（１−３７２゜２５６ 、２５
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変更）の作製とその
発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐｓＫＸＴ（１″″３７２）を用いて、本ストレプトキ
ナーゼ誘導体蛋白質（２５６位及び２５７位を−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ニ変更しタモノ）ノ発現ベ
クターを次の通り作製した。
クターｐ ＳＫ Ｘ Ｔ（１−３７２゜２５６ 、２５
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変更）の作製とその
発現 実施例５で得たストレプトキナーゼ誘導体発現ベクター
ｐｓＫＸＴ（１″″３７２）を用いて、本ストレプトキ
ナーゼ誘導体蛋白質（２５６位及び２５７位を−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ニ変更しタモノ）ノ発現ベ
クターを次の通り作製した。
その概略は第１１図に示す通りである。
■ ＤＮＡ断片の化学合成
目的誘導体蛋白発現ベクターは、ｐＳＫＸＴ（１−３７
２）の制限酵素認識部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩと陀すＩの間
を、下記新規化学合成りＮＡ断片（ニー１〜ニー４）に
置き換えることにより作製した。
２）の制限酵素認識部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩと陀すＩの間
を、下記新規化学合成りＮＡ断片（ニー１〜ニー４）に
置き換えることにより作製した。
（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ） ニー −１ＡＧＣＴＴ
ＡＣＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧ
ＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣ
ＴＴニー４ このＤＮＡ断片はストレプトキナーゼの２５６位及び２
５７位（ｙ）Ｌｙｓ−ＬｙｓをＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏに置き換えた部分を含み、本発明におけるアミ
ノ酸の置換及び挿入を行なわせた変更を実施するもので
ある。上記ニー１〜ニー４の４本のオリゴヌクレオチド
に分けて、それぞれを前記と同様にして化学合成した。
ＡＣＣＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧ
ＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣ
ＴＴニー４ このＤＮＡ断片はストレプトキナーゼの２５６位及び２
５７位（ｙ）Ｌｙｓ−ＬｙｓをＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏに置き換えた部分を含み、本発明におけるアミ
ノ酸の置換及び挿入を行なわせた変更を実施するもので
ある。上記ニー１〜ニー４の４本のオリゴヌクレオチド
に分けて、それぞれを前記と同様にして化学合成した。
尚、後の解析のために新たに制限酵素認識部位ＥｃｏＲ
Ｖを設定した。
Ｖを設定した。
■ ｐ Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２，２５６，２５
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。
変更）の構築
１） Ｓ Ｋ Ｘ Ｔ （１−３７２）を制限酵素Ｈ１
ｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏ Ｉで処理して生成するｅｏｓ
ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素μＣＯＩ及び並すＩで処
理して生成する４６１２ｂｐのＤＮＡ断片とをアガロー
スゲル電気泳動法により採取し、之等と上記■で得た４
本の化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた（但しオリ
ゴマーニー２及びニー４は５′末端をリン酸化した）後
、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られ
たコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵
素地図を作成して、目的のベクターを得た。
ｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏ Ｉで処理して生成するｅｏｓ
ｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素μＣＯＩ及び並すＩで処
理して生成する４６１２ｂｐのＤＮＡ断片とをアガロー
スゲル電気泳動法により採取し、之等と上記■で得た４
本の化学合成りＮＡ断片とを連結反応させた（但しオリ
ゴマーニー２及びニー４は５′末端をリン酸化した）後
、反応物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、得られ
たコロニーよりベクターＤＮＡを採取、精製し、制限酵
素地図を作成して、目的のベクターを得た。
■ 誘導体蛋白質（１−３’ｒ２ 、２５６ 、２５’
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変更）の発現及び確
認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、Ｉ ＰＴＧ添加後集菌し、ストレプト
キナーゼ活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）
を測定した結果、培地上清には検出されず、菌体画分に
約７国除重位／１１の発現量が認められ、その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約４２５００の位置に現れた。
７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変更）の発現及び確
認 上記■で得たベクターを保有する大腸菌ＪＭ−１０９株
を、前記したＭ−９力ザミノ酸液体培地を用いて同様に
して振盪培養し、Ｉ ＰＴＧ添加後集菌し、ストレプト
キナーゼ活性（プラスミノーゲンアクチベーター活性）
を測定した結果、培地上清には検出されず、菌体画分に
約７国除重位／１１の発現量が認められ、その殆どはべ
りプラズム画分に存在していた。更にウェスタンブロッ
ティングに従う解析を行なった結果、その免疫活性は計
算される分子量約４２５００の位置に現れた。
■ 組換え体ストレプトキナーゼ誘導体蛋白質（１−３
７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
変更）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液２．４１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変
更）を回収及び精製し、て、凍結乾燥精製品を得た。
７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
変更）の製造と同定 実施例５の■と同様にして、培養液２．４１を遠心分離
して菌体を集め、浸透圧ショック法によりペリプラズム
画分を抽出し、抽出液から目的誘導体蛋白質（１−３７
２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ変
更）を回収及び精製し、て、凍結乾燥精製品を得た。
得られた精製品につき還元剤の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約４２５００の位置
に単一バンドを示した。
Ｅにて分析した結果、目的の分子量約４２５００の位置
に単一バンドを示した。
また同精製品のアミノ酸分析を行なった結果を下記第１
４表に示す。
４表に示す。
第
表
上記に従い得られた組換え体ストレプトキナーセ誘導体
蛋白質（１−３７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｌｙｓ−Ｐｒ。
蛋白質（１−３７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｌｙｓ−Ｐｒ。
変更）の回収量は、最終精製品のアミノ酸分析より０．
４６■であった。
４６■であった。
またプラスミノーゲンアクチベーター活性の比活性は天
然体のそれを１００としてモル比で１７．７であった。
然体のそれを１００としてモル比で１７．７であった。
第１図は合成オリゴヌクレオチドよりブロック１〜８を
構築し之等よりストレプトキナーゼ遺伝子のサブユニッ
トＳＫＡ、ＳＫＢ、ＳＫＣ及びＳＫＤを構築する概略図
を示す。 第２図は上記各サブユニットを保有するプラスミドｐｓ
ＫＡ、ｐｓＫＢ、ｐｓＫｃ及びｐＳＫＤを構築し之等か
らプラスミドベクターｐｓＫＡＢ及び同ｐＳＫＡＢＸを
経てストレプトキナーゼクローニングベクターｐｓＫＸ
を構築する概略図を示す。 第３図は上記ベクターｐＳＫＸとプラスミドｐＫＴＮ２
−２とからストレプトキナーゼ分泌発現ベクターｐｓＫ
ＸＴを構築する概略図を示す。 第４図は実施例１に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２）発現ベクターの構築の概略図である。 第５図は実施例２に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２・１１８欠落）発現ベクターの構築の概
略図である。 第６図は実施例３に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２・４５−６８欠落）発現ベクターの構築
の概略図である。 第７図は実施例４に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）発
現ベクターの構築の概略図である。 第８図は実施例５に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，１１８欠落、２５６Ｇｌｎ、２５７Ｇ
ｌｎ置換）発現ベクターの構築の概略図である。 第９図は実施例６に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）発現ベクターの構築の概略図であ
る。 第１０図は実施例７に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋
白質（１−３７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５
６ＧＩｎ。 ２５７ＧＩｎ置換）発現ベクターの構築の概略図である
。 第１１図は実施例８に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋
白質（１−３７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ変更）発現ベクターの構築の概略図である
。 （以 上） 第 図 ｉｉ精 ａｌ Ｉ 第 図 壇粒 ε 第 図 連結 第 図 連結 第１０ 図 遠特 第 連結 第 図 連結 図 手続補正書（自発） 発明の名称 ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラス
ミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社大塚製薬工場
構築し之等よりストレプトキナーゼ遺伝子のサブユニッ
トＳＫＡ、ＳＫＢ、ＳＫＣ及びＳＫＤを構築する概略図
を示す。 第２図は上記各サブユニットを保有するプラスミドｐｓ
ＫＡ、ｐｓＫＢ、ｐｓＫｃ及びｐＳＫＤを構築し之等か
らプラスミドベクターｐｓＫＡＢ及び同ｐＳＫＡＢＸを
経てストレプトキナーゼクローニングベクターｐｓＫＸ
を構築する概略図を示す。 第３図は上記ベクターｐＳＫＸとプラスミドｐＫＴＮ２
−２とからストレプトキナーゼ分泌発現ベクターｐｓＫ
ＸＴを構築する概略図を示す。 第４図は実施例１に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２）発現ベクターの構築の概略図である。 第５図は実施例２に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２・１１８欠落）発現ベクターの構築の概
略図である。 第６図は実施例３に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２・４５−６８欠落）発現ベクターの構築
の概略図である。 第７図は実施例４に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，２５６ＧＩｎ、２５７ＧＩｎ置換）発
現ベクターの構築の概略図である。 第８図は実施例５に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，１１８欠落、２５６Ｇｌｎ、２５７Ｇ
ｌｎ置換）発現ベクターの構築の概略図である。 第９図は実施例６に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質（１−３７２，４５−６８欠落、 ２５６ＧＩｎ 、
２５７ＧＩｎ置換）発現ベクターの構築の概略図であ
る。 第１０図は実施例７に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋
白質（１−３７２，４５−６８欠落、１１８欠落、２５
６ＧＩｎ。 ２５７ＧＩｎ置換）発現ベクターの構築の概略図である
。 第１１図は実施例８に従うストレプトキナーゼ誘導体蛋
白質（１−３７２、２５６、２５７Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ変更）発現ベクターの構築の概略図である
。 （以 上） 第 図 ｉｉ精 ａｌ Ｉ 第 図 壇粒 ε 第 図 連結 第 図 連結 第１０ 図 遠特 第 連結 第 図 連結 図 手続補正書（自発） 発明の名称 ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラス
ミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社大塚製薬工場
Claims (17)
- （１）下記アミノ酸配列のストレプトキナーゼをコード
する塩基配列を含む化学合成遺伝子。 【遺伝子の配列があります。】 【遺伝子の配列があります。】 - （２）ストレプトキナーゼをコードする塩基配列が下記
のものである請求項（１）に記載の化学合成遺伝子。 【遺伝子の配列があります。】 【遺伝子の配列があります。】 - （３）下記塩基配列を有する請求項（１）に記載の化学
合成遺伝子。 【遺伝子の配列があります。】 【遺伝子の配列があります。】 - （４）請求項（１）に記載の化学合成遺伝子をプラスミ
ドベクターに挿入してなるプラスミド組換え体。 - （５）請求項（４）に記載のプラスミド組換え体で形質
転換された形質転換体。 - （６）ストレプトキナーゼ活性を有し、ストレプトキナ
ーゼの下式（１）で示されるアミノ酸配列のＣ末端側３
７３位以降を欠失すると共に、更に該配列中に少なくと
も１個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入がなされる
ことのある改変されたアミノ酸一次配列を有するストレ
プトキナーゼ誘導体蛋白質。 式（１）： 【遺伝子の配列があります。】 【遺伝子の配列あります。】 - （７）更に４５位Ａｒｇから６８位Ｇｌｙが欠失された
改変アミノ酸一次配列を有する請求項（６）に記載のス
トレプトキナーゼ誘導体蛋白質。 - （８）更に１１８位Ｐｈｅが欠失もしくは他のアミノ酸
残基に置換された改変アミノ酸一次配列を有する請求項
（６）に記載のストレプトキナーゼ誘導体蛋白質。 - （９）更に２５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓが欠失も
しくは他のアミノ酸残基に置換された改変アミノ酸一次
配列を有する請求項（６）に記載のストレプトキナーゼ
誘導体蛋白質。 - （１０）更に２５６位Ｌｙｓ及び２５７位Ｌｙｓのそれ
ぞれの後に他のアミノ酸残基が挿入された改変アミノ酸
一次配列を有する請求項（６）に記載のストレプトキナ
ーゼ誘導体蛋白質。 - （１１）請求項（７）〜（１０）に記載の改変の少なく
とも２種を組み合わせた改変アミノ酸一次配列を有する
請求項（６）に記載のストレプトキナーゼ誘導体蛋白質
。 - （１２）請求項（６）に記載の改変されたアミノ酸一次
配列を有するストレプトキナーゼ誘導体蛋白質をコード
する化学合成遺伝子。 - （１３）請求項（１２）に記載の化学合成遺伝子をプラ
スミドベクターに挿入してなるプラスミド組換え体。 - （１４）請求項（１３）に記載の組換え体で形質転換さ
れた形質転換体。 - （１５）宿主細胞が大腸菌である請求項（１４）に記載
の形質転換体。 - （１６）請求項（５）に記載の形質転換体を培養して発
現されるストレプトキナーゼを採取、精製することを特
徴とするストレプトキナーゼの製造法。 - （１７）請求項（１４）に記載の形質転換体を培養して
発現されるストレプトキナーゼ誘導体蛋白質を採取、精
製することを特徴とするストレプトキナーゼ誘導体蛋白
質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17985190A JPH0411892A (ja) | 1989-07-11 | 1990-07-06 | ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-179432 | 1989-07-11 | ||
| JP17943289 | 1989-07-11 | ||
| JP1-307957 | 1989-11-27 | ||
| JP2-96830 | 1990-04-11 | ||
| JP17985190A JPH0411892A (ja) | 1989-07-11 | 1990-07-06 | ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0411892A true JPH0411892A (ja) | 1992-01-16 |
Family
ID=26499288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17985190A Pending JPH0411892A (ja) | 1989-07-11 | 1990-07-06 | ストレプトキナーゼ類蛋白質、対応遺伝子、対応プラスミド組換え体、対応形質転換体及び之等の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0411892A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012519487A (ja) * | 2009-03-03 | 2012-08-30 | グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツド | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット；ならびにそれから製造されるプラスミン |
-
1990
- 1990-07-06 JP JP17985190A patent/JPH0411892A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012519487A (ja) * | 2009-03-03 | 2012-08-30 | グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツド | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット；ならびにそれから製造されるプラスミン |
| JP2015171376A (ja) * | 2009-03-03 | 2015-10-01 | グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドＧｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | プラスミノーゲンを製造するための組成物、方法およびキット；ならびにそれから製造されるプラスミン |
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