JPH04120100A - 精製されたリボ核蛋白質複合体を構成するポリペプチド鎖、その製造法および抗スミス抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、自己免疫病、自己免疫現象の予知、診断、経
過観察等に有効に利用される精製されたリボ核蛋白質複
合体を構成するポリペプチド鎖の製造法およびこのポリ
ペプチド鎖を用いた抗スミス抗体の測定法に関する。

〔従来の技術〕

リボ核蛋白質複合体は、数本のポリペプチド鎖がウリジ
ン高含有低分子核内ＲＮＡに非共有的に結合した構造を
しており、動物の核内に普遍的に存在する。したがって
、健常生体の免疫系は該複合体を認識する機会がなく、
また仮に、その機会があったとしても該複合体に対する
抗体を産すべき細胞は、禁止クローンとなり抗体を産す
ることはない。ところが、自己免疫病、特に全身性紅斑
性狼蒼（ＳＬＥ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）では
、何らかの機構により該複合体に対する抗体が産生され
、それが原因となって例えば炎症、潰瘍、皮疹など様々
な自己免疫現象に伴う病変が発現される。

したがって、これら自己免疫病の罹患者血清中に出現す
る該抗体群を検出することの臨床上の本質的意義は、自
己免疫病および自己免疫現象の予知９診断または経過観
察にある。

従来から、該抗体群を検出するために使用される抗原と
しては、ヒトの培養細胞や哺乳動物細胞の抽出液または
細胞そのものが用いられてきた。

これは、該複合体の抗原性が種を越えて共通であるので
自己免疫疾患罹患者血清中に見出される自己成分に対す
る抗体すなわち自己抗体を検出するだめの抗原としてい
かなる哺乳動物由来のものも使用できるからである。

また、従来からリボ核蛋白質複合体に対する抗体群とし
ては抗リボ核蛋白質抗体群と抗スミス抗体群が広く知ら
れている。ところが、これら両抗体群はいずれも対応す
るリボ核蛋白質複合体上の異なった抗原決定基に対する
抗体の集合体であり、構成抗体の組み合せおよび量は患
者によって多様である。しかしながら実際に、リボ核蛋
白質複合体に対する抗体は、抗リボ核蛋白質抗体群およ
び抗スミス抗体群の２群に区別して検出されているにす
ぎない。これは因習的に管理された抗リボ核蛋白質抗体
あるいは抗スミス抗体を含有する基準血清と粗抗原液と
の反応様式に対比させて例えば２元免疫拡散法による出
現沈降線の融合現象により検出されているからであり、
抗原が精製されたものである必要はなかったからである
。

リボ核蛋白質複合体の精製および単離については多くの
方法が科学文献に記載されている［Ｊ、Ｂｉ。

１、ｃｈｅｍ、第２５８巻第２６０４〜２６１３頁（１
９８３）等参照〕。大抵の方法においては、イオン交換
クロマトグラフィ、分子篩クロマトグラフィあるいはこ
れら両クロマトグラフィを組み合わせることにより、ま
た方法によってはさらに免疫吸着クロマトグラフィを組
み合わせることにより精製が行われる。しかし、いずれ
の場合もリボ核蛋白質複合体として精製および単離する
方法に関するものであった。

さらに、免疫吸着クロマトグラフィによる該複合体の精
製は、固定化するリガンドとして患者血清由来のものを
使用するため、相当量の該血清の入手が困難であるばか
りか血清中に含有する抗体組成が一様でないなど工業的
目的で精製する手段としては不適切であった。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述のごとく、リボ核蛋白質複合体は、−本のＲＮＡ鎖
に強固に非共有結合した数本のポリペプチド鎖より構成
されるが、この結合は生理的条件下では解離しない。ま
た、構成ポリペプチド鎖のうちあるものは抗リボ核蛋白
質抗体と、またあるものは抗スミス抗体と反応する。さ
らにいずれの抗体とも反応するポリペプチド鎖もある。

したがって従来の技術では抗スミス抗体とのみ反応する
抗原標品を得ることは困難であるばかりか、このような
抗原標品を使った自己免疫疾患罹患者の抗体を検出する
方法を開発することも困難であった。

そこで、本発明者らは抗スミス抗体に反応するリボ核蛋
白質を構成するポリペプチド鎖を、その抗原性を消失さ
せることなく単離する方法につき鋭意研究した結果、本
発明を完成させた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、動物の組織抽出物からリボ核蛋白質複合体を
抽出し、次いで、非イオン系界面活性剤を存在させてリ
ボ核蛋白質複合体の一部のポリペプチド鎖を解離させた
状態でイオン交換クロマトグラフィを行ない、解離して
いないポリペプチド鎖を含むリボ核蛋白質複合体派生物
を含有する画分を分取し、次いで生理的溶液環境下で分
子篩クロマトグラフィを行って、解離していないポリペ
プチド鎖を含むリボ核蛋白質複合体派生物を含有する画
分を分取し、さらに、そこへ陰イオン系界面活性剤およ
び蛋白質の高次構造変性剤を存在させて単離対象である
ポリペプチド鎖を解離させ、その後に分子篩クロマトグ
ラフィを行なって単離対象であるポリペプチド鎖を分別
することを特徴とする精製されたリボ核蛋白質複合体を
構成するポリペプチド鎖の製造法（以下、第１の発明と
いう）並びに、前記の製造法により分離分別した該複合
体の精製された構成ポリペプチド鎖を抗原として使用し
、被検対象物中に存在する抗スミス抗体を検出又は定量
する抗スミス抗体の測定法（以下、第２の発明という）
に関する。

まず第１の発明について詳細に説明する。

動物の組織抽出物として細胞抽出液または細胞核抽出液
を使用し、これからリボ核蛋白質複合体を抽出する過程
において、該複合体は希薄塩濃度または生理的塩濃度で
可溶化されるが、同時に可溶化される考えられうるすべ
ての蛋白分解酵素による侵襲から保護するために蛋白分
解酵素に対する阻害剤を添加した抽出用緩衝液で抽出さ
れるのが好ましい。さらにこの抽出操作に関し、なる入
く多くのリボ核蛋白質複合体を得るために被抽出対象物
からの抽出は２回行い、２回の抽出物を合体するのが好
ましい。また、抽出液中のリボ核蛋白質複合体の検出は
、操作が簡易であることから２元免疫拡散法により行う
のが好ましい。

その後に、該抽出液に粉末の硫酸アンモニウム等の塩析
剤を除々に添加することで蛋白質およびその複合体の塩
析沈澱を行う。例えば硫酸アンモニウムの飽和度３ｏ％
ないし６０％で沈澱する画分を遠心により集める。次に
、得られた沈澱蛋白をなるべく少量のイオン交換クロマ
トグラフィ用開始緩衝液に溶解し、かつイオン交換クロ
マトグラフィ用開始緩衝液に対し２昼夜透析する。本発
明においてはこのイオン交換クロマトグラフィ用開始緩
衝液に非イオン系界面活性剤を含有させる。

このような緩衝液を用いた場合、単離対象であるポリペ
プチド鎖の大部分は解離していないが、あるポリペプチ
ド鎖は、その溶液環境下で該複合体から解離すると思わ
れる。したがって、本操作およびこれに引き続くイオン
交換クロマトグラフィの目的は、目的とするポリペプチ
ド鎖が結合しているリボ核蛋白質複合体の派生物と他の
一部の解離したポリペプチド鎖の分別にある。非イオン
系界面活性剤は、一部のポリペプチド鎖を解離させうる
に必要な濃度で存在させる。

非イオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンノ
ニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフ
ェニルエーテル、ポリオキシエチレンメチルヘキシルエ
ーテル、ポリオキシエチレンメチルドデシルエーテル、
ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレ
ンソルビトールエステルなどが使用できる。またその濃
度は、０．０３〜０．３％（重量／容積）が好ましい。

つづいてこの透析物を、イオン交換クロマトグラフィ用
担体を充填したカラムに通し、解離していないポリペプ
チド鎖を含むリボ核蛋白質複合体の派生物を担体の官能
基とイオン結合させる。

イオン交換クロマトグラフィ用担体としては、ジエチル
アミノエチル基、ジエチル−（α−ハイドロキシ−プロ
ピル）アミノエチル基、ポリエチレンイミン基、アミン
混合体等の官能基を保有する球状または微顆粒状の架橋
アガロース、架橋デキストラン、架橋セルロース、ポリ
メタクリレート系樹脂、スチレン／ジビニルベンゼンコ
ポリマ、親木性シリカ等が使用できる。

このようなイオン交換クロマトグラフィー用担体として
、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　＋
ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ）　、　
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ＝セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）　
、　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−バイオゲル（Ｂｉｏ　Ｇｅ１）、
セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）　−Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ
　。

ＱＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　、セル
ロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）　−Ｔ　Ｅ　Ａ　Ｅ等が
市販されている。

イオン交換クロマトグラフィーに供する試料の蛋白量は
、カラムに充填したイオン交換担体の全イオン交換容量
の範囲内の量で、流速１５０ｍＱ／時間以下（Ｆａｓｔ
　ｆｌｏｗの場合は０．７Ｑ／時間以下）、特に５０〜
１００ｒｒ＋Ｑ／時間の条件で行なうのが好ましい。

その後、該カラムを過剰量のイオン交換クロマトグラフ
ィ用開始緩衝液で官能基とイオン結合していない他の核
酸および蛋白成分またはポリペプチド鎖を洗浄除去する
。カラム洗浄後、緩衝液中のイオン強度を塩類を添加す
ることにより増加させ、官能基に捕捉された解離してい
ないポリペプチド鎖を含むリボ核蛋白質複合体の派生物
との間でイオン交換反応を行いこれらを溶離する。溶離
液は、画分として集め、２元免疫拡散法により、リボ核
蛋白質複合体の派生物を含む画分を検出し、合体して排
除限界分子量が１０，０００である例えばポリサルフオ
ンを材質とする限外濾過膜で窒素ガス加圧下、その後に
つづいて行う生理的溶液環境下での分子篩クロマトグラ
フィのカラム体積の約１１５０まで濃縮される。

なお、限外濾過膜としては、ポリサルフオン系の他、ポ
リ−ｎ−フェニレンイソフタルアミド系（芳香族ポリア
ミド系）、ポリスチレンスルホン酸ソーダとポリビニル
ベンジルトリメチルアンモニウムクロライドの複合体、
セルロース系のものなどを使用することもできる。

その後、生理的溶液環境下で分子篩クロマトグラフィを
行うが、具体的にはキレート剤を含有するｗ４酸緩衝生
理食塩液で平衡化したＩ　Ｘ　１０’ないし１．３Ｘ１
０’の蛋白分画範囲を有する球状架橋アガロースを充填
したカラムを通すことにより分子篩クロマトグラフィを
行うことができる。こうして単離対象であるポリペプチ
ド鎖をリボ核蛋白質複合体派生物として分離する。

担体としては、前記球状アガロースの他、前記蛋白質分
画範囲を有する球状または微顆粒状の架橋デキストラン
、架橋セルロース、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミドとアリルデキストランの架橋物、多孔性ポリアクリ
ルアミドなどを用いることもできる。

このような担体としては、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）、セファクリル（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｃｒｙ
ｌ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、セファロ
ースＣＬ、セルロファイン（Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ）
、パイオーゲル（Ｂｉｏ　　Ｇｅ１）Ｐ、バイオ−ゲル
Ａなどが市販されている。

この分子篩クロマトグラフィの条件としては、カラム体
積の１７２５体積以下、特に１／１００体積の試料、ま
たはカラム体積の水重量の１／２００以下、特に１／１
０００以下の試料を用いるのが好ましく、流速は、担体
毎に定められた許容物理強度以下の流水圧を得る流速、
−船釣にはカラム長１０■にっき１時間以下の流速で行
うのが好ましい。

溶出液は画分として集め、２元免疫拡散法により抗スミ
ス抗体と反応する画分を集め合体して排除限界分子量が
１０，０００である例えばポリサルフォンを材質とする
限外濾過膜で窒素ガス加圧下、その後につづいて行う分
子節クロマトグラフィカラム体積の約１１５ｏまで濃縮
する。

なお、限外濾過膜としては、ポリサルフォン系の他、ポ
リ−ｎ−フェニレンイソフタル酸アミド系（芳香族ポリ
アミド系）、ポリスチレンスルフオン酸ソーダとポリビ
ニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライドの複合
体、セルロース系のものなどを使用することもできる。

さらに引き続き、この濃縮液に陰イオン系界面活性剤な
らびに蛋白質の高次構造変性剤を添加し、単離対象であ
るポリペプチド鎖をリボ核蛋白質複合体の派生物から解
離させる。　陰イオン系界面活性剤としては、Ｎ−ラウ
ロイルザルコシンナトリウムを用いるのが好ましい。ま
た、その濃度は０．１〜１．０％（重量／容積）とする
のが好ましい。

また、蛋白質の高次構造変性剤としては、尿素を用いる
のが好ましい。尿素の濃度としては３Ｍ（モル濃度）以
上が好ましく、特に低温（４℃〜１０℃程度）で析出し
ない最大溶解濃度であることが好ましい。そしてその後
、このような陰イオン系界面活性剤及び蛋白質の高次構
造変性剤、さらにキレート剤を含有する燐酸緩衛生理食
塩液で平衡化したＩ　Ｘ　１０’ないし１．３Ｘ１０５
の蛋白分画範囲を有する球状架橋アガロースを充填した
カラムを通すことにより分子篩クロマトグラフィを行い
単離対象であるポリペプチド鎖を分離できる。

担体としては前記球状架橋アガロースの他、前記蛋白分
画範囲を有する球状又は微顆粒状の架橋デキストラン、
架橋セルロース　Ｎ　、　Ｎ　’　−メチレンビスアク
リルアミドとアリルデキストランの架橋物、多孔性ポリ
アクリルアミドなどを用いることもできる。

このような担体としては、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）　＋セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　、
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　＋セファロース
ＣＬ、セル口ファイン（Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｓ）　＋
バイオーゲル（Ｂｉｏ　−Ｇｅｌ）　Ｐ　、バイオ−ゲ
ルＡなどが市販されている。

この分子篩クロマトグラフィーの条件としては、カラム
体積の１７２５体積以下、特に約１／１００体積の試料
、又はカラム体積の水重量の１７２００以下、特に１／
１０００以下の試料を用いるのが好ましく、流速は、担
体毎に定められた許容物理強度以下の流水圧を得る流速
、−船釣にはカラム長１０―につき１時間以下の流速で
行なうのが好ましい。また、クロマトグラフィを行う温
度は１０℃以下で、添加しである蛋白質の高次構造変性
剤が析呂しない温度であることが好ましい。

溶出液は画分として集め、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル（１５％ゲル濃度、架橋度０．８）電気泳動後、蛋白
質バンドをニトロセルロース膜に転写し免疫プロッティ
ング解析を行う。該解析により抗スミス抗体と反応する
ポリペプチド鎖を含有する画分を検出し、これらの画分
を合体してスミス抗原を担う精製ポリペプチド鎖標品と
した。

このようにして得られるリボ核蛋白質複合体に由来する
ポリペプチド鎖は、分子置駒１５，０００ないし１８，
０００のポリペプチド鎖（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、比較対
照である分子量マーカーの泳動距離と、標品試料の泳動
距離との比較から算出した値）である。

これはリボ核蛋白質複合体を構成するＤサブユニットで
あると考えられる。分子量に前記のように幅があるのは
、動物種により該ポリペプチド鎖の分子量が異なるため
である。

いずれの動物種にせよ、本発明の方法によれば約１５，
０００〜１８，０００（７）分子量を有するポリペプチ
ド鎖が分離されるものである。

そして上述したポリペプチド鎖は免疫化学的に因習的に
使用される抗スミス抗体と特異的に反応するため、自己
細胞成分に対する抗体すなわち自己抗体検出用診断剤に
使用する抗原として用いることができる。

次に、第２の発明について詳述する。第２の発明におい
ては、前記第１の発明により分離分別したリボ核蛋白質
複合体由来のポリペプチド鎖を抗原として使用する。本
発明の測定法は、前記抗原を使用しさえすれば、どのよ
うな測定方法であってもよい。例えば、酵素免疫測定法
、放射免疫測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテッ
クス凝集法、血球凝集法、螢光免疫測定法、免疫化学発
光法２色素免疫測定法などを行なうことができる。

好ましい一例として、標識免疫測定法について説明する
。

固体表面、例えばポリスチレン孔を前記ポリペプチド鎖
で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用を
有する、例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド鎖
を溶解し０．０１　　ないし１００μｇ　／　ｍ　Ｑ溶
液として用い、低温下にて１夜中行う。その後に、固体
表面に物理吸着されなかったポリペプチド鎖を緩衝液と
共に吸引除去し、つづいて該ポリペプチド鎖と免疫化学
的交叉性のない親水性球状蛋白質、例えばミルクカゼイ
ンなどの０．０１　　ないし１％（重量／容積）溶液で
、室温玉量１時間ブロッキングを行う。これは、ポリペ
プチド鎖で被覆されながった固体表面あるいは固体表面
に物理吸着したポリペプチド鎖の分子表面上の易吸着性
部位を覆うことにより、その後に添加する被検対象溶液
または標識２吹拭体溶液中の蛋白成分が非特異的に吸着
するのを防ぐためである。

その後に、被覆あるいはブロッキングに使用されなかっ
たポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去す
るため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄液
で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリペ
プチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量を
行なう。

非イオン系界面活性剤と該ポリペプチド鎖と免疫化学的
交叉性のない親水性球状蛋白質とを含有する生理的緩衝
液で適宜に希釈した被検対象物、例えば患者血清を該ポ
リペプチド鎖で被覆した固体表面と抗原抗体結合反応が
完結するのに十分な時間接触させる。

その後頁に、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗
浄液で固体表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗体
を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反応
が完結するのに十分な時間接触させる。ここで標識物質
は、酵素、放射性同位元素、螢光物質等、特に制限され
ないが、酵素標識が特に好ましい。

そしてひきつづき、非イオン系界面活性剤を含有する中
性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標ｗｔ２吹拭
体の存在または量を検出する。酵素ｉｓｍの場合、酵素
に対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成
物が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵
素反応により生成される産物の量は被検対象中に含有さ
れる該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に
比例依存的であり、したがって間接的に被検対象中の該
抗体を定量することができる。

（実施例） 以下に、リボ核蛋白質複合体を構成する分子置駒１６，
０００のポリペプチド鎖の単離精製について、実施例に
より本発明を詳述する。

ポリペプチド鎖の単離精製 叢よ 緩衝液ＡＣＩＱ中に、塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウ
ム０．２ｇ、燐酸２ナトリウム ・１２水塩２．７ｇ　、燐酸１カリウム０．２　ｇ　　
を含有する燐酸系緩衝液。

緩衝液Ｂ：緩衝液Ａに蛋白分解酵素阻害剤として、ｔチ
ジングリコール４酢酸（ＥＧＴＡ）１０１Ｍ、フッ化フ
ェニルメチルスル フォニル（ＰＭＳＦ）１０−３Ｍ、ロイペプチン０．０
５％（重量／容積）、アンチパイン０．０５％（重量／
容積）、キモスタチン０．０５％（重量／容積）ペプス
タチンＡ０．０５％（重量／容 積）をさらに含有する緩衝液。

緩衝液Ｃ：塩化ナトリウム０．１４Ｍ　、ノニデットＰ
−４００，０５％（重量／容積）、エチレングリコール
４酢酸（ＥＧＴＡ）５Ｘ１０−’Ｍ、フッ化フェニルメ
チルスルフォニル（ＰＭＳＦ）２ＸＩ　Ｏ−’Ｍ。

ジチオスレイトール（ＤＴＴ）２ｘ １０−’Ｍを含有するトリス系緩衝液 ０．０２ＭＸＨＣＱ　　ｐＨ７，４゜ 緩衝液Ｄ：塩化ナトナトリウム１８Ｍ、ノニデットＰ−
４００，０５％（重量／容積）、エチレングリコール４
酢＃（ＥＧＴＡ）５ＸＩＯ−’Ｍ、フッ化フェニルメチ
ルスルフォニル（ＰＭＳＦ）２Ｘ１０−’Ｍ、ジチオス
レイトール（ＤＴＴ）２Ｘ １０−’Ｍを含有するトリス系緩衝液 ０．０２ＭＸＨＣΩ　ｐＨ７，４゜ 緩衝液Ｅ：塩化ナトナトリウム３Ｍ　、ノニデッドＰ−
４００，０５％（重量／容積）、 エチレングリコール４酢酸（ＥＧＴＡ）５ＸＩＯ−’Ｍ
　、フッ化フェニルメチルスル’：）オニ−）Ｌｉ　（
ＰＭＳ　Ｆ）　２　Ｘ　１０−’Ｍ、ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）２ ＸＩＯ−’Ｍ　を含有するトリス系緩衝液、０．０２Ｍ
　ｘＨＣｎ　　ｐＨ７，４゜緩衝液上緩衝液Ａにエチレ
ングリコール４酢酸（ＥＧＴＡ）２．５Ｘｌ○−４Ｍ　
をさらに含有する緩衝液。

緩衝液Ｇ：緩衝液Ａに尿素４．０Ｍ、Ｎ−ラウロイルザ
ルコシン０．５％（重量／容積）、エチレングリコール
４酢ｍｃＥＧＴＡ）２．５　Ｘ　１０−’Ｍ　をさらに
含有する緩衝液６ 以下に示す操作は、陰イオン系界面活性剤および尿素存
在下での分子篩クロマトグラフィを１０℃で行った以外
すべて４℃で行った。

（１）使用されるリボ核蛋白質複合体含有組織抽出液の
取得 緩衝液Ｂ４５０ｍＱを仔牛胸腺アセトン粉末（ペルーフ
リーズ（Ｐｅｌ　−Ｆｒｅｅｚｅ）社製）３０ｇに添加
し、該混合物を一夜昼溶解させた。その後、該懸濁液を
１０．０００　　ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄液を
抽出液Ａとした。この沈澱物から２回目の抽出を行うた
め、沈澱物に緩衝液ＢＬＯＯｍＱを添加し４時間攪拌し
た。その後、該懸濁液を１０．ＯＯＯＸｇで３０分間遠
心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合わせる
ことにより抽出液Ｃとした。得られる核可溶性画分の総
蛋白量は、Ｌｏｗｒｙ法による蛋白定量の結果、７．０
４ｇであった。

抽出液Ｃに、飽和度３０％になるように硫酸アンモニウ
ムを添加し、蛋白の塩析に充分な時間（４時間以上）攪
拌後、１０．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離した。その
後、さらに硫酸アンモニウムを６０％飽和させうる量を
上澄液に添加し、塩析に充分な時間攪拌後、１０．００
ＱＸｇで２０分間遠心分離し、リボ核蛋白質複合体含有
組織抽出液とした。

（２）イオン交換クロマトグラフィによる分画リボ核蛋
白質複合体画分として得られた沈澱物を、なるへく少量
の緩衝液Ｃに溶解しかつ緩衝液Ｃに対して２夜昼透析し
た。透析物を緩衝液Ｃで平衡化したφ３．２Ｘ１１ｃｍ
のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース（フ
ァルマシア社製）カラムに流速１００ｍｆｌ／時間で掛
けた。その後、該カラムを緩衝液りで、未結合または緩
衝液Ｃの溶液環境下で該イオン交換担体に結合した蛋白
質、核酸およびポリペプチド鎖が除去されるまで（１晩
）洗浄した。カラム洗浄後、被単離対象であるポリペプ
チド鎖を１構成酸分とするリボ核蛋白質複合体の派生物
を含有する画分を緩衝液Ｅで溶出した。また、分取体積
は１分画あたり８．０ｍＱとし、各画分の蛋白質はＬｏ
ｗｒｙ法により定量した。この分離溶離の状態を第１図
に示す。

（３）生理的溶液環境下での分子篩クロマトグラフィに
よる分画 得られたリボ核蛋白質複合体の派生物を含有する２１５
〜２３０番目の画分を排除限界分子量１０，０００　の
限外濾過膜（アトバンチツクＵＫ−１０）で窒素ガス加
圧下２．４ｍＱまで濃縮した。濃縮後の総蛋白量は１０
０．８ｍｇであった。

次いで、緩衝液Ｆで平衡化したφ１．６　×６８ａＯの
ウルトロゲルＡｃＡ４４　（ＬＫＢ社製）カラムに掛け
た。その後、該カラム中の試料を緩衝液Ｆにより１１ｍ
１／時間の流速で展開溶出し、１．８ｍｌずつ集液し、
２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。集液した分取画
分のうち２元免疫拡散法にてリボ核蛋白質複合体に由来
するスミス抗原を担うポリペプチド鎖の付加しているリ
ボ核蛋白質複合体を含有する画分第３４番目から第４２
番目を合わせ、排除限界分子量１０．０００の限外濾過
膜（アトパンチツクＵＫ−１０）で窒素ガス加圧下２ｍ
ｌまで濃縮した。

分別の状態を第２図に示す。

（４）陰イオン系界面活性剤および蛋白質の高次構造変
性剤を含有する溶液環境下での分子篩クロマトグラフィ
による分画 濃縮したリボ核蛋白質複合体を含有する画分に、陰イオ
ン系界面活性剤としてＮ−ラウロイルザルコシンを０．
５％（重量／容積）、蛋白質の高次構造変性剤として尿
素を４．０Ｍ濃度になるように添加した緩衝液Ｇで予め
平衡化したφ１．６　　Ｘ　　６８ｃｍのウルトロゲル
Ａ　ｃ　Ａ　４４　（ＬＫＢ社製）カラムに掛けた。そ
の後、該カラム中の試料を緩衝液Ｇにより１０ｍ１／時
間の流速で展開溶出し、１．６５ｍ１ずつ集液し、２８
０ｎｍにおける吸光度を測定した。集液した分取画分の
うち免疫ブロッティング解析法にてリボ核蛋白質複合体
に由来するスミス抗原を担うポリペプチド鎖の含有が認
められた第４４番目から第４７番目の画分を合わせて精
製ポリペプチド鎖標品とした。

分別の状態を第３図に示す。

なお、分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した。具
体的には、Ｌａｅｎ＋＋＋＋ｌｉらの方法に準じ、１２
．５％アクリルアミドゲル（架橋度０゜８）中で標品試
料を展開した。泳動条件は、泳動開始時４０ｍＡ、濃縮
泳動時１５ｍＡ、分離泳動時２０ｍＡとした。また、泳
動試料は予め還元剤を含まない試料用緩衝液（３１２，
５ｍＭトリス−塩酸、ＰＨ６，’８．０．１％ＢＰＢ、
１ｏ％ＳＤＳ、２ｏ％グリセリン）を０．２５体積加え
３０分間室温処理した。泳動後、０．０５％ＣＢＢでゲ
ルを１晩染色し、翌日、０．７％酢酸で脱色した。その
結果、精製したポリペプチド鎖は、分子量マーカーの泳
動位置から計算して約１６゜０００の位置に泳動された
。

疫プロッティング法による抗体の測定 性ｌ 得られたポリペプチド鎖の免疫化学的交叉性を免疫プロ
ッティング法により分析した。

Ｔｏｗｂｉｎ　らの方法に従って、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲルゲル泳動後の蛋白バンドをニトロセルロース
膜上に転写した。なお、この転写操作は、転写蛋白の抗
原性保持のため０℃水浴中で行った。

転写完了後、ニトロセルロース膜を２％牛血清アルブミ
ンを含むトリス緩衝食塩液（１５ｍＭ　　トリス−塩酸
、ｐＨ７，４，０，２Ｍ塩化ナトリウム）で未転写部位
を１晩被覆した。翌日、このニトロセルロース膜を０．
２％牛血清アルブミンを含む上記トリス緩衝食塩液で５
００分の１に希釈した１次抗体（抗スミス抗体）液およ
び同様に希釈した２次抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒ
トエｇＧ＋Ｉ　ｇＡ＋Ｉ　ｇＭ抗体）液に順次浸漬し、
それぞれ室温で３０分間反応させた。また、それぞれの
抗原抗体反応後に残存する未反応の１次抗体および２次
抗体は、過剰量の洗浄液（１５ｍＭトリス−塩酸、ＰＨ
７，４，０，１５％トリトンＸ−１００，０，２Ｍ　　
ＮａＣＱ）で、５分間３回洗浄除去した。これらの抗原
抗体反応終了後、ニトロセルロース膜を基質溶液（５０
ｍＭ　　トリス−塩酸、ｐＨ８，Ｃ）、０．９％塩化ナ
トリウム、０．０５％過酸化水素水、０．０５％ＤＡＢ
）に浸漬、発色させた。

なお、５法に用いた抗スミス抗体は、アメリカＣＤＣ標
準血清と同種抗体を含む患者血清を使用した。

その結果、精製された分子置駒１６，０００のポリペプ
チド鎖は抗入ミス抗体を含有する血清と強く反応した。

〔発明の効果〕

従来、リボ核蛋白質複合体に対する抗体測定時に使用す
る抗原としては細胞の抽出物がそのまま用いられてきた
。

しかし近年該複合体を構成する要素の分子生物学的機能
特性が明らかにされつつあり、これらの機能と自己免疫
疾患患者血清中に出現する、これらに対する抗体の役割
および病因との関連についても諸説が議論され、該複合
体の構成成分単位での生理的機能の認識が重要となって
きている。

したがって、本発明のごとく、該複合体を構成するポリ
ペプチド鎖単位で、それに対応する被検対象物中の抗体
を測定する方法の確立は重要な医学的情報を提供してく
れるものであり、本発明は自己免疫病等の診断や経過ｗ
Ａ祭、または自己免疫現象の予知に、非常に有効なもの
となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例におけるリボ核蛋白質複合体に
由来するポリペプチド鎖を含有する画分のイオン交換ク
ロマトグラフィによる分別溶離を示す図、第２図は本発
明の実施例におけるリボ核蛋白質複合体に由来するポリ
ペプチド鎖の生理的溶液環境下での分子篩クロマトグラ
フィによる分別を示す図、第３図は本発明の実施例にお
けるリボ核蛋白質複合体に由来するペリペプチド鎖の陰
イオン系界面活性剤および蛋白質の高次構造変性剤存在
下での分子篩クロマトグラフィによる分別を示す図であ
る。 Ｈ 口 魁 恢 円　［ 恢

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物の組織抽出物からリボ核蛋白質複合体を抽出し
   、次いで、非イオン系界面活性剤を存在させてリボ核蛋
   白質複合体の一部のポリペプチド鎖を解離させた状態で
   イオン交換クロマトグラフィを行ない、解離していない
   ポリペプチド鎖を含むリボ核蛋白質複合体派生物を含有
   する画分を分取し、次いで生理的溶液環境下で分子篩ク
   ロマトグラフィを行って、解離していないポリペプチド
   鎖を含むリボ核蛋白質複合体派生物を含有する画分を分
   取し、さらに、そこへ陰イオン系界面活性剤および蛋白
   質の高次構造変性剤を存在させて単離対象であるポリペ
   プチド鎖を解離させ、その後に分子篩クロマトグラフィ
   を行なって単離対象であるポリペプチド鎖を分別するこ
   とを特徴とする精製されたリボ核蛋白質複合体を構成す
   るポリペプチド鎖の製造法。 ２、単離するポリペプチド鎖の分子量が、約１５０００
   ないし１８０００である請求項１記載のポリペプチド鎖
   の製造法。 ３、請求項１又は２記載の製造法により分離分別した該
   ポリペプチド鎖を抗原として使用し、被検対象物中に存
   在するポリペプチド鎖に対する抗体を検出又は定量する
   抗スミス抗体の測定法。