JPH04121188A - 高圧を利用した固定化酵素の殺菌方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮！上皮机且分！ 本発明は、固定化酵素に高圧装置内で高圧を適用して固
定化酵素に付着している微生物を殺菌することよりなる
高圧を利用した固定化酵素の殺菌方法に関する。

皿米ｑ肢歪 従来、固定化酵素を使用して物質の生産あるいは改質が
行われている。

しかし、固定化酵素を長期間使用していると固定化酵素
に付着している細菌等の微生物が増殖し、その結果、分
解物の微生物汚染固定化酵素の活性の低下、あるいは処
理効率の低下等の問題が生じてくる。

このような点を改善するために、固定化酵素を殺菌剤あ
るいは洗浄剤で洗浄する方法が行われていた０例えば、
特開昭５６−９２７９１号公報には、固定化酵素をジオ
クチルエチレントリアミン等の置換ジエチレントリアミ
ンの希薄水溶液と接触させて殺菌する方法が、また特開
昭５９−１７５８７９号公報には、細菌で汚染された酵
素を多価アルコールに浸漬して殺菌する方法が、さらに
特開昭５９−９８６８９号公報には固定化酵素をラウリ
ルベンゼンスルホン酸塩とエタノールとを含む混液で処
理して固定化酵素を洗浄殺菌する方法が開示されている
。しかし、これらの固定化酵素を殺菌剤や洗浄剤で洗浄
殺菌する方法は、その洗浄殺菌に長時間を要したり、あ
るいは洗浄殺菌効率が必ずしも充分ではなく、また固定
化酵素の活性を低下させたり、洗浄殺菌後固定化酵素に
残存付着している洗浄剤あるいは殺菌剤を完全に除去す
る操作を必要とするなどの種々の解決しなければならな
い問題点があった。

また、特開平１−２２８４５４号公報では、固定化酵素
に紫外線を照射して付着する微生物を殺菌する方法が開
示されている。しかし、紫外線照射で固定化酵素に付着
している微生物を完全に殺菌することは困難であった。

゛　しよ゛と　る 本発明は、このような従来行われている固定化酵素の殺
菌方法の問題点を解決することを目的としてなされたも
のである。

すなわち、本発明の目的は、効率よく、しかも固定化酵
素の活性を損わずに固定化酵素に付着する微生物を殺菌
する新規な方法を提供することにある。

ｆ　　　″　　るための 本発明者らは、上記課題を解決するために固定化酵素に
適用できる種々の殺菌方法について検討をしたところ、
固定化酵素を高圧装置に入れ、高圧を通用すると、固定
化酵素の酵素活性を損なうことなく固定化酵素に付着し
ている微生物だけを殺菌することができることを見出し
、本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、固定化酵素に高圧装置内で高圧を
適用して酵素活性を低下させることな（付着する微生物
を殺菌する方法に関する。

本発明では、固定化酵素として従来知られている種々の
固定化酵素が用いられる。このような固定化酵素として
は、ラクターゼ、グルコースイソメラーゼ、プロテアー
ゼ等を水に不溶性の担体、例えばキトサン、キチンある
いは樹脂等に化学結合させるかあるいはセルローストリ
アセテート、ポリアクリルアミドゲル等に包括させて固
定化させたものを例示することができる。これらは、バ
ルクの状態であってもカラム等に充填された状態であっ
ても撹拌槽に収納された状態であってもあるいは流動層
、膜型等となった状態であってもさらにこれらの装置か
ら固定化酵素を取り出した状態であっても使用すること
ができる。

高圧装置は、従来食品等の高圧装置として知られている
装置を使用することができる。このような装置としては
、例えば、三菱重工■製高圧試験装置がある。この装置
によると、圧力媒体として水を使用し最高圧力１０，０
００ｋｇ／ｃｄ、使用温度常温〜６０°Ｃで高圧処理を
行うことができる。また、■丸善発行、大杉治部他著「
高圧実験技術とその応用」第２６１頁（１９８０年）、
食品資材研究会発行宮用金二部著「食品の物性」第６集
第９９頁（１９８０年）等に記載されている高圧発生装
置を用いることもできる。

本発明を完成させるに当り、次の高圧発生装置を用い実
験を行った。

１、　高圧発生装置 三菱重工業株式会社製高圧試験装置を使用した。

（１）　　この装置の主な仕様は次の通りである。

ａ）最高仕様圧力１０．０００ｋｇ／ｃｉｉｂ）使用温
度　　常温〜６０°Ｃ Ｃ）処理室寸法　５４閣φＸ２００　ｘｍｄ）圧力媒体
　　水 （２）次の試験条件で試験を行った。

ａ）圧力　０〜４，０００　ｋｇ／ｃｈ１ｂ）温度　２
０〜６０゛Ｃ Ｃ）時間　０〜３０分 （３）試料 （１）酵素溶液（対照）。酵素溶液としてプロテアーゼ
Ｓ　１００Ｕ／＋ｄをｐＨ７，０のリン酸緩衝液に溶解
し、■０Ｉ１１ビニール製シールバック材に封入したも
のを用いた。

（２）固定化酵素、前記プロテアーゼＳをキトサンビー
ズ（キトバール、商品名）にグルタルアルデヒドで架橋
した固定化酵素を用い、これをカゼイン液液中に浸漬し
て汚染させたものを使用した。この汚染固定化酵素を蒸
留水で水洗して前処理し、この５ｇ−ｗｅｔを５ｔａＭ
酢酸カルシウム水溶液１０Ｍ１とともにビニール製シー
ルバック材に封入したものを用いた。

これらの試料は、それぞれ６パツクずつ使用した。

（３）試験方法 上記試料を高圧発生装置に入れ、（１）高圧を適用した
ときの圧力の変化による酵素の残存活性及び生菌数、（
２）高圧を適用したときの温度の変化による酵素の残存
活性及び生菌数、（３）さらに、時間の経過による酵素
の残存活性及び生菌数について試験した。

（４）試験結果 前記実験を行った結果を第１〜６図に示す。

第１図によると、酵素液（対照）をＯ〜４０００ｋｇ／
ｃｆ１１の高圧を適用するとその活性はいちじるしく低
下するのに対し、固定化酵素に高圧を適用してもその活
性はほとんど低下しないことが分る。また、このさいの
生菌数は、第２図にみられるように高圧発生装置の圧力
が３０００ｋｇ／ｃ−ｆｉ１以上になるといちしろしく
低下し、殺菌効果が生じている。このことから固定化酵
素に高圧を通用するとその活性を低下させることなく殺
菌を行うことができ、この殺菌効果は３０００ｋｇ／ｃ
ｍ２以上でいちじるしく高まることが分る。

次に、第３図によると、酵素液を高圧３０００ｋｇ／ｃ
ｄ　　に１０分間保持し、その間高圧装置の保持温度を
２０〜６０°Ｃに保持すると、酵素液の場合は酵素活性
が最初の２０°Ｃのときからいちじるしく低下し、さら
に温度が上昇するにつれてその活性は少しずつ低下して
いるのに対し、固定化酵素は温度が上昇しても活性はほ
とんど低下せず、最初の活性を維持できることが分る。

またこのさいの生菌数は、第４図にみられるように５０
°Ｃ以上でいちじるしく低下している。このことから、
高圧装置の保持温度は５０°Ｃ以上が好適である。

さらに、高圧装置の保持時間についてみると、第５図に
示すように固定化酵素を圧力３０００ｋｇ／ｄ、温度６
０″Ｃに保持したとき保持時間５〜３０分の間ではほと
んど最初の活性が保持され、また第６図に示すように生
菌数は５分間の保持でほとんどなくなることが分る。

これらの実験から、固定化酵素を高圧装置に保持し、高
圧を適用すると、固定化酵素特有の性質としてその活性
を損なわずに固定化酵素に付着する微生物を殺菌するこ
とができ、この殺菌効果は圧力３０００ｋｇ／ｃｄ以上
、保持温度５０℃以上のときに顕著であることが分る。

固定化酵素は、塩化ビニール、ポリエチレン等柔軟な合
成樹脂製の袋に蒸留水、緩衝液等と共に充填して高圧発
生装置に収納し、高圧を適用するとよい。適用条件とし
ては前記実験の結果から圧力３０００ｋｇ／ｃｆｆｌ、
保持温度５０″Ｃ以上とすると酵素活性を損なわず殺菌
を行うことができる。なお、高圧発生装置内で高圧の適
用によって酵素活性力ぐ低下しないのは、前記実験の結
果から酵素液では認められず固定化酵素特有の作用のよ
うに思われる。

このようにして高圧を適用した固定化酵素は、合成樹脂
製の袋等から取り出し、蒸留水、緩衝液等で洗浄し、再
び使用することができる。

本発明の方法は、牛乳をラクターゼを担体に固定化した
固定化酵素を使用し、グルコースとラクトースとに分解
するさいの固定化酵素の殺菌、あるいは同様に乳糖、ホ
エー等に作用させて乳糖分解乳、甘味シロップ製造のさ
いの固定化酵素の殺菌等に用いることができる。さらに
プロテアーゼ、イソメラーゼ等を担体に固定化した固定
化酵素の殺菌等にも用いることができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ カラムＣ６ｃｍ　（直径）Ｘ１８Ｃ１（長さ）］に、３
００　ｄの固定化プロテアーゼＳを充填し、これにダウ
ンフローで１０％カゼインを反応温度４０’Ｃ，Ｓシー
３で連続通液を行った。時間経過と共に菌の生育が始ま
り、固定化酵素への乳タンパクの付着と細菌による汚染
蓄積が生した。１２時間通液後、細菌数は１０ｂオーダ
ーとなった。このときカラムから固定化酵素を取り出し
、リン酸緩衝液（ｐＦＩ７．０）で洗浄して乳固形分を
除去した。これを５ｗＭ酢酸カルシウム水溶液とともに
ビニール製シールバック材に封入し、高圧発生装置に充
填し、圧力３０００ｋｇ／ａｌｌ保持温度５０℃で１０
分間高圧を適用した。その後、固定化酵素を袋から取り
出し、無菌のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した。

この酵素活性はほとんど低下せず、付着菌数は０に近い
状態であった。この固定化酵素を再びカラムに充填し、
脱脂乳の通液を開始した。

発！９と１果 本発明の方法によると、固定化酵素に用いる担体の形状
や構造が異なっていても固定化酵素に高圧を適用するこ
とにより酵素活性を低下させることなく、固定化酵素に
付着し繁殖している細菌等の微生物を殺菌することがで
きる。この方法は、殺菌剤、洗浄剤等を使用する化学的
方法にくらべて殺菌後の固定化酵素の後処理が簡単で、
しかも酵素活性の低下がほとんどみられず、殺菌効果が
高く工業的に有利な固定化酵素の殺菌方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は固定化酵素に高圧を適用したときの圧力と残存
酵素活性との関係を、また第２図は、圧力と残存生菌数
との関係を示す。第３図は、固定化酵素に高圧を適用し
たときの保持温度と残存酵素活性との関係を、第４図は
保持温度と残存生菌数との関係を示す。第５図は同様に
保持時間と残存酵素活性との関係を、第６図は保持時間
と残存生菌数との関係を示す。 図中、○−○は、高圧を固定化酵素に適用した場合を、
・・・・・・・・は酵素溶液（対照）に適用した場合を
それぞれ示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）固定化酵素に高圧装置内で高圧を適用して酵素活
   性を低下させず付着する微生物を殺菌することを特徴と
   する高圧を利用した固定化酵素の殺菌方法
2. （２）高圧装置の高圧が３，０００ｋｇ／ｃｍ＾２以上
   である請求項（１）に記載の高圧を利用した固定化酵素
   の殺菌方法
3. （３）高圧装置の保持温度が５０℃以上である請求項（
   １）または（２）に記載の高圧を利用した固定化酵素の
   殺菌方法