JPH04126023A - ニコチアナ グルチノザ変種、その種子および葉、ニコチアナ タバクム植物、その種子および葉、ニコチアナ植物の取得方法、スクラレオールの取得方法ならびにシス‐アビエノールの取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、異常に高い濃度のラブダンを生じる新規植物
に関する。より詳述すれば、本発明は、天然に生じる植
物に対してスクラレオールおよびシス−アビエノールの
ような化合物の製造の場合に数倍の増大量を示すニコチ
アナの体細胞クロナール変種に関する。前記の新規植物
系の有用性は、商業的品質で生じることができる前記化
合物の有利な好ましい源を生じる。

従来の技術 スクラレオール ラブダンジテルペンスクラレオール（ラブド−１４−エ
ン−８，１３−ジオール）は、香料工業にとって実質的
に価値のある化合物である。スクラレオールおよび関遍
誘導体は、香料製造における出発物質として注目され、
ならびにタバコの香りを増大させるために注目されてい
る（米国特許第、４４４１５１４号明細書）。この化合
物は、自然においてアカノアＡｃａｃｉａ　ｓｐ、（Ｆ
。

ｎ５Ｌｅｒ他、Ｐｂｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４　
：　２９９１−１９９３、＋９８５）、サルビア５ａｌ
ｖｉａ　ｐａｌｅｓｔｉｎａ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　　２　４　　：　　ｌ　　３　８　６　−　１
　３　８７、＋９８５）、ステビア　５ｔｅｖｉａ　ｍ
ｏｎａｒｄａｅｆ。

１ｉａ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　２１　：　
２３６９〜１３７１．１９８２）、タバコ　Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ　ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（バイリー（Ｂｉｌｅｙ
）他、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、８５：５
７−８４．１９７４）およびサルビア５ａｌｖｉａ　５
ｃｌａｒｅａ（米国特許第３０６０１７２号明細書）を
含めて数多くの植物源に見い出される。

オニサルビアｃｌａｒｙ　ｓａｇｅとしても知られてい
るサルビア５ａｌｖｉａ　５ｃｌａｒｅａ種は、現在ス
クラレオールの商業的−次源を表わす。ニス・スクラレ
アＳ、　５ｃｌａｒｅａによって生産されたスクラレオ
ールは、花の茎の場合に表皮系超厚の突起様構造として
知られた表皮外波または毛状体中で生じる。この毛状体
中のスクラレオールの濃度は、比較的に高いけれども、
この毛状体は、スクラレオールが生産される植物で唯一
の位置であり：オニサルビアｃｌａｒｙ　ｓａｇｅの葉
、根または茎中には、スクラレオールは、殆ど存在しな
いかまたは全く存在しない。従って、この植物から導か
れるスクラレオールの量は、比較的に制限されている。

更に、煩雑なことに、オニサルビアｃＩａｒｙ　ｓａｇ
ｅ花の茎は、雨に対して敏感であり、したがって通常の
環境条件下ではスクラレオールの標準の収量は、さらに
かなり減少されうる。

スクラレオールの選択的な源が望まれていることは明ら
かであるが、スクラレオールの他の知られた植物生産者
の誰もがオニサルビアｅｔａｒｙ　ｓａｇｅの適当な代
替物を見い出すには至っていない。しかし、最近、ニコ
チアナ　グルチノザ　（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｇｌｕｔ
ｉｎｏｓａ）は、葉、茎および蔓中でスクラレオールを
生じることが見い出された。しかし、このニコチアナ　
グルチノザＮ、　ｇｌｕｔｉｎｏｓａは、商業的品質で
は決して生ぜず、生産される全体量は、未だ比較的に少
量である。植物中のスクラレオールの広範な分布および
その相対的な強壮さは、スクラレオール生産を増大させ
ることができた場合には、ニコチアナ　グルチノザをオ
ニサルビアの代替および／または補足のための有効な代
表例にする。恐らく達成することができた１つの可能な
手段は、体細胞クロナール変種である。

シス−アビエノール 商業的なタバコ、ニコチアナ　タバクムＮ１ｃｏｔｉａ
ｎａ　ｔａｂａｃｕ＋＊の葉は、ゴム状滲出物まタハ表
皮ロウによって被覆されていることが知られており；こ
の物質は、明らかに表皮系超厚の突起様構造または集毛
状体（ｌｅａｆ　ｈａｉｒ）によって植物表面上で生産
される。この表皮成分の化学的組成は、多くの研究者に
よる研究の対象であった（例えば、５ｅｖｅｒｓｏｎ他
、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ、３２：５
６６〜５７０．１９８４参照）。表皮ロウから奉離され
かつ同定された大多数の化金物は、ジテルペンおよび長
鎖状（ｃ２５〜Ｃａａ）脂肪族炭化水素である。一般に
、前記の滲出物の１つ以上の成分、特にジテルベノイド
成分は、硬化および老化の間の崩壊下に有利にタバコ様
の匂いを生じさせることができる揮発性テルペンを発生
させるものと信じられている。

種々の型のジテルペンの分布は、数多くの公知の栽培タ
バコを通じて首尾一貫しているものではない。特殊な系
統の遺伝的背景に応じて、この分布は、デュバンデテル
ペン中で特に著しくともよく、またはラブダン中で著し
くともよい。商業的に生産されたアメリカンタバコ　（
Ａ＋＋＋ｅｒｉｃａｎ　ｔｏｂａｃｃｏ）の葉で見い出
された大多数のデュバンは、ζ＋β−４，８，１３−デ
ュバトリエン−１，３−ジオールであり；ラブダンを生
産する植物上で見い出された原理的なジテルペンは（１
２２）−ラブダ−１２，１４−ジエン−８＝ｒ−オール
（シス−アビエノール）および（１３ｇ）ラブダ−１３
−エン−８σ、１５−ジオールである。こｔらの化合物
は、表皮ロウ中で見い出された数少ないラブダノイック
成分に対する前駆物質であろう。

上記したように、ラブダノイドの存在は、明うカにタバ
コの一定の芳香および匂いと関連する。特に重要なこと
は、シス−アビエノールを生じる能力の遺伝学および遺
伝モードを決定することであることが判明した（Ｔｉｍ
ｏＬｅ他、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅａ＋、４４：
２５１７−２５１６．１９８０　；　Ｋｕｂｏ他、Ｔｏ
ｂ、　Ｓｃｉ、　ＸＸＶＩ　：　ｌ　２６〜ｌ　２８．
１９８２）。数多くの変種を概観すれば、著しく小さい
割合、恐らく四分の一以下が重要な量のシス−アビエノ
ールを生じることが示唆される。アビエノールの存在は
、恐らくタバコの硬化処理の間にタバコから誘導された
崩壊生成物によりタバコの匂いに対して望ましい効果を
有する。また、このアビエノールは、アンブロックス（
ａｍｂｒｏｘ）、アンバーグリス化合物の成分または基
質への化学的変性のために基質として香料工業で有用で
ある。従って、如何にシス−アビエノール生産特性を与
え、またはラブダン生産系が存在する場合に如何にシス
−アビエノール生産を増大させるかに努力が集中した。

伝統的な育種法は、この点に関連して幾つかの１を要な
進委を生じさせるのに失敗し、全ての存在するタバコ系
は、なおかなり低い濃度のシス−アビエノールを生じる
。また、前記化合物の有利な合成源は全く存在しない。

しかし、体細胞クロナール変種の方法により、収穫量の
改善の点で伝統的な育種法に対して有効な選択を得るこ
とができる。

体細胞クロナール変種 ところで、植物組織培、養の方法は、伝統的な栄養増殖
を用いて得ることができる場合よりも迅速な速度の増殖
を可能にする、無性生殖の手段として数年間使用されて
きた。勿論、生殖された植物は組織外植片が取られた植
物の正確なコピーであろうことは予想される。植物組織
培養の早期の歴史において、表現型変種が通常生殖植物
の中で生じることは、注目された。これらの変種は、物
珍しさ以外の何物でもない科学的に価値のない“後生学
的”事実を表わす、組織培養の工芸品として典型的には
放逐された。

このような変種の出現は一定の植物の場合に比較的規則
的に存在し、このことにより収穫量の改善に使用するた
めの遺伝的変化性の潜在的に有効な源が得られることは
、最近確認された（ＬａｒｋｉｎおよびＳｃｏｗｃｒｏ
ｆｔ％Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、６０　
：１９７−２１４、ｌ　９８１　　；　Ｅｖａｎｓ他、
Ａ＋ｎｅｒ、Ｊ、　Ｂｏｔ、７１　：　７５９−７７４
．１９８４）。ところで、生じる変種は、体細胞クロナ
ール変種または体細胞クローンと呼称され、かつタバコ
を含めて若干の異なる植物種に観察されｔこ。

若干の異なる技術は、体細胞変種の生産を誘発させるか
またはこの生産に役立たせるために使用された（Ｒｅｉ
ｓｃｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌＣｕｌｔｕｒｅ１第１ｌＣｕｌｔｕｒｅ９８３、Ｍｃ
Ｍｉｌｌａｎ社刊、中の“Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖｉａｂｉ
ｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｐｌａｎｔ
ｓ“）。変種を促進させるために使用することができる
操作法は、長期間培養作業周期、◆ プロトプラスト培養作業周期、カルス培養作業周期、特
殊な組織型からの外植、特殊な栄養媒体上での成長また
はホルモン処方、または増大した量の変種を生じるため
に知られた特殊な遺伝子型の使用であ名。これらの方法
は、互いｌ：排除されるものではなく、１つまたはそれ
以上の方法は、望ましい水準の変種を達成するために組
み合わせることができる。

しかし、上記の方法が、全ての植物に普通に適用できる
ものとは証明されなかった。幾つかの種は、例えばプロ
トプラスト培養作業周期において体細胞クロナール変種
を直ちに生産することができ、他の種は、同属内であっ
ても生産することができないであろう。同様に、特別の
種に対して変種を誘発する条件が決定されるまで、生産
されるであろう体細胞クローンの性質を予め予測する方
法は、存在しなかった。本質的に、問題の種が如何なる
程度であっても予め体細胞クローンを生産することが示
されなかった場合には、如何なる体細胞クローンが生産
されるか、どのような型の特性変態が観察されるのかを
知ることは不可能である。

ニコチアナＮ１ｃｏｔｉａｎａにおける体細胞クロナー
ル変種 培養されたニコチアナ　スプＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ｓｐ
。

からの試験管内での突然変異体の単離は、数多くの研究
者によって報告された（ＦｌｉｃｋおよびＥｖａｎｓ、
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ中の“Ｔｏｂａｃｃｏ”：第２巻、第２１
章、第５表、１９８４　；　ＢａｒｌｉｅｒおよびＤｕ
ｌｉｅｒｉ、　Ａｎｎ、　Ａｍｅｌｉｏｒ。

Ｐｌａｎｔ、３０　：　：第３２１−３４４頁、１９８
０）。これら突然変異体の大部分は、ニコチアナタバク
ムＮ、　ｔａｂａｃｕｍ、栽培タバコから単離された。

報告されたものの大部分は、特に抗代謝産物、例えば抗
生物質、殺真菌剤および除草剤に対する耐性のために特
に選択された。ニコチアナＮ１ｃｏｔｉａｎａの他の野
生種、特にニコチアナシルベストリスＮ、５ｙｌｖｅｓ
ｔｒｉｓおよびニコチアナ　プルムバギニ７オリアＮ、
ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａも試験管内で突然変異
体を生じることが判明した。しかし、体細胞クローンを
ニコチアナ　グルチノザ　Ｎ、　ｇｌｕｔｉｎｏｓａか
ら生じることは、これまで如何なる証明もなされていな
いし、或いは実際に如何なる試みもなされていない。

ところで、本発明によれば、ニコチアナＮ１ｃｏｔｉａ
ｎａ種において体細胞クロナール変種およびこれから生
殖された植物を生産する方法が確認されたが：しかし、
より重要なことは生産された体細胞クロナール変種が平
均濃度よりも高いラブダンを生じる若干の系統にあるこ
とである？。前記変種のような系統は、ニコチアナ　グ
ルチノザＮ−ｇｌｕｔｉｎｏｓａおよびニコチアナ　タ
パクム　Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ体細胞クロナール変種プ
ログラムの双方から繰返し確実に得られたので、重要な
商業的品質の生産のために新規で有効な源を表わす。

発明を達成するための手段 本発明によれば、上記平均ラブダン含量を有するニコチ
アナ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ系統を生産する方法が得られ
、この方法は、ニコチアナ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａの若い
細胞の外植片を、少なくとも１つのサイトカイニンを約
５〜２０μＭの濃度で含有する栄養媒体上でカルスを得
るのに十分な時間の間培養し；植物をカルスから生殖さ
せ；かっ生殖させた植物を平均濃度よりも高いスクラレ
オールを生じる変種のためにスクリーニングすることを
特徴とする。

本発明によれば、１つの実施態様において、ラグダンジ
テルペンスクラレオールの異常に高い濃度を生じるニコ
チアナ　グルチノザ　Ｎｉｃ。

ｔｉａｎａ　ｇｌｕ口ｎｏｓａ種の新規の系統が得られ
る。

特に、この新規の系統は、新しい植物材料１ｋｇあたり
スクラレオール少なくとも約８００ｍｇを生じる。これ
は、通常的３００〜６００ｍｇ／ｋｇの最大を生じる、
未変性のニコチアナ　グルチノザＮ、　ｇｌｌｔｉｎｏ
ｓａの場合の少なくとも２〜３倍のスクラレオール生産
の増大を表わす。

また、この改善されたニコチアナ　グルチノザＮ、　ｇ
ｌｕｔｉｎｏｓａの使用は、スクラレオールをオニサル
ビアｃｌａｒｙ　ｓａｇｅから取得する伝統的な方法を
越える利点をも提供する。オニサルビアＣＩａｒｙ　ｓ
ａｇｅは大量のスクラレオールを生じることができるけ
れども、生産のレベルは極端に変動する傾向にある。例
えば、オニサルビア。！ａｒｙ　ｓａｇｅの収量は、如
何なる所でも１ニーカーあたり２〜３１ｋｇであること
ができる。このことは、未変性のニコチアナ　グルチノ
ザＮ、　ｇｌｕｔｉｎｏｓａに体細胞クローンの７−１
０　ｋｇ／　ｓ　−カーと比較される。また、オニサル
ビアｃｌａｒｙｓａｇｅは、スクラレオールを重要な量
で得ることができる前に約１８カ月の成長期間を必要と
する。

従って、本発明による体細胞クローン系統は、伝統的な
源の場合よりも信頼できる有利なスクラレオール源を提
供する。

本発明によれば、第２の実施態様において、ラブダンシ
ス−アビエノールの異常に高い濃度を生じるニコチアナ
　タバクム　Ｎ１ｃｏＬｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍの新
規系統が得られる。特に、この新規植物系統は、新しい
植物物質１ｋｇあたり約８００ｍｇよりも高いシス−ア
ビエノール、有利に少なくとも約１０００ｍｇ／ｋｇ、
最も有利には新しい植物物質１ｋｇあたり少なくとも約
１２００ｍｇ〜約１６００ｍｇを生じる。１つの好まし
い実施態様の場合、このことは、通常アビエノールを生
じないが、アビエノールが存在する場合には一般に約２
００　ｍｇ／ｋｇの最大を生じる未変性のニコチアナ　
タバクムＮ、　ｔａｂａｃｕ−よりも４〜８倍の７スー
アビエノール生産の増大を表わす。この改善されたニコ
チアナ　タバクムＮ、ｔａｂａｃｕ園系統の使用により
、天然源からも合成源からもこれまで商業的量で生産す
ることが不可能であった化合物シス−アビエノールの有
利な源が得られる。

また、この変性された系統により、片親または両親とし
て利用される、本発明による新規系統のハイブリッド系
統の生産の基礎が得られる。また、本発明の範囲内で、
新規系統のクローン、体細胞クローン、配偶子クローン
および突然変異体が存在する。

体細胞クロナール変種の取得 上記のように、体細胞クロナール変種は、組織外植片を
適当な成長媒体中に置くことによって誘発させることが
できる。本発明方法の場合、組織は、有利に植物の全て
の若い組織、特に若い葉の組織から誘導される。本明細
書中で・若い“とは、開花前の植物からの組織を意味す
る。選択された組織の滅菌は、通常汚染された微生物の
成長を阻止するために培養前に実施される。組織は、次
亜塩素酸ナトリウム（例えば、　Ｃ１ｏｒｏｘ）の希釈
された溶液中に約１０分間浸漬することができ、滅菌蒸
留水で２または３回洗浄される。また、滅菌の他の方法
は、当業者によって認められている。

それぞれ炭素源、塩、無機質およびビタミンの特殊な組
成を有する、植物組織培養に適当な若干の栄養媒体は、
刊行物に知られている。基礎媒体として適当であるもの
は、Ｂ　５　（Ｇａ＋ｍｂｏｒｇ他、ｌ：ｚｐ、　Ｃｅ
１ｌ　Ｒｅｓ、５０　：　１５１−１５８．１９６８）
、ホワイツ（Ｗｈｉｔｅ’ｓ）　（Ｗｈｉｔｅ、　Ａ　
Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ａｎｉ
ｍａｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｊａｑｕｅ
ｓ　Ｃａｔｔｅｌ　Ｐｒｅｓｓ社、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ
％ＰＡ、　　１９６３）およびＳ　Ｈ（Ｓｃｈｅｎｋお
よび旧１ｄｅｂｒａｎｄｔ、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、５　
６　　：　　ｌ　　６６〜２　０　４、　ｌ　９６２）
である。しかし、栽培方法に好ましいのは、ＭＳ媒体で
ある（　ＭｕｒａｓｈｉｇａおよびＳｋｏｏｇ、　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、　１５　：　４７３−４９７
．１９６２）。

生殖された植物の変種は、媒体中での特殊なホルモン組
成の存在で誘発される。少なくとも１つのサイトカイニ
ンの比較的に高い濃度の存在は変種を誘発させる場合に
有効であることが判明した。公知のサイトカイニンは、
６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）、ゼアチン、キネチ
ンおよび２−イソペンチルアデニン（２−ｉ　Ｐ）であ
る。サイトカイニン少なくとも約５μＭの濃度は、生殖
された植物の中の変種を栽培する場合に有効であるが；
しかじ、得られた変種の量および品質は、サイトカイニ
ン濃度で変動するように思われる。変種は、低い頻度で
５μＭの濃度で生じ、かつサイトカイニン濃度が増加す
るにつれて増大する。２０μＭのサイトカイニン濃度で
、変種の頻度は高く、観察された変種は、損傷を受けが
ちであるかまたは望ましくないものになる傾向にある。

従って、高いスクラレオール生産系統を製造するための
好ましい濃度は、約５ｐＭ〜２０μＭであり、この場合
膜も好ましい濃度は、約ｌＯμＭである。好ましいサイ
トカイニンは、６−Ｂ　Ａである。

変種の誘発は不必要であるのだけれども、成長媒体中に
オートキシンを含めることは、望ましいことでもある。

変種は、サイトカイニンの唯一の有効量を有する媒体中
で生じるが、生殖された植物の品質は、オートキシン含
有媒体およびサイトカイニン含有媒体上での成長によっ
て著しく改善されている。本発明による方法に有用なオ
ートキシンは、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール
酪酸（ＩＢＡ）、ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）および２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−）を包含し、こ
の場合には、ＩＡＡが好ましい。オートキシン、特にＩ
ＡＡの存在は、苗条形成を促進する傾向にあり；このこ
とは、区別のない成長期間を限定し、それ故に苗木後代
における多数の望ましくない突然変異の蓄積と関連した
問題を未然に防ぐことができる。一般に、オートキシン
約１．ｕＭ〜約２０μＭの濃度は、苗木生殖の望ましい
レベルを保証するのに十分である。

生殖を開始させるために、通常数ｃｍ”以下の外植片は
、供与体植物から切除され、かつ適当なホルモン濃度を
有する塩基性媒体上に置かれる。カルス質量、すなわち
区別のない組織質量は、約５〜ＩＯ日間で切断端部に現
われ：２〜３週間内で苗条は現われ始める。

苗条生殖に続き、通常は、生殖された苗条を発根媒体に
移すのが好ましい。１つの好ましい発根媒体は、濃度１
／２のＭＳおよびナフタリン酢酸（ＮＡＡ）を含有し；
　ＮＡＡの使用は、十分に発根した植物の頻度を増大さ
せる。使用した場合には、ＮＡＡの好ましい濃度は、約
２μＭであるが；しかじ、発根媒体の組成物中での可能
な変種は、当業者には明らかなことである。生殖させた
植物が角根した場合には、この植物は、ポットに移され
かつ成熟するまで成長される。

変種のスクリーニング ラブダンの高い濃度を有する生殖させた変種植物は、形
質的に標準の生殖させた植物と異ならないので、望まし
い変種のスクリーニングは、化学的に生殖させた植物で
実施しなければならない。ラブダンは、植物の葉からメ
タノールで抽出可能である。各植物から活性の葉が捕集
され、秤量され、かつ抽出された場合には、メタノール
抽出液は、乾燥され、ラブダン画分は、固相抽出によっ
て得られる。また、ラブダン画分は、溶剤としての塩化
メチレンの使用によって抽出することができる。この方
法は、実質的に試料中の全部の有効なアビエノールが抽
出され、また澄明な生成物を生じ、それによって固相抽
出の必要性を回避する場合には、有利である６何れの方
法の最終生成物に関しても、ガスクロマトグラフィーは
、セバーソン（Ｒ，Ｆ、５ｅｖｅｒｓｏｎ）他（Ｊ、Ａ
ｇ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、３８　：　５６６　）　１７
）方法により実施例１１以降に記載された少ない変種を
用いて有利に実施される。ピークの同定は、確実なラブ
ダン標準と比較することによって達成することができる
。選択したラブダンの濃度は、それぞれの体細胞クロー
ン系統について測定され、次いで最高の生産非変種対象
系統中で観察された濃度と比較される。上記のように、
平均の非体ａ胞クローン　ニコチアナ　グルチノザ（Ｎ
−ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）系統に対するスクラレオール収
量の範囲は、約３００〜６００ｍｇ／ｋｇである。スク
ラレオール８００　ｍｇ　／ｋｇまたはそれ以上を生産
する任意の系統は、１つの変種が考えられる。同様に、
平均の非体細胞クローンニコチアナ　タバクム（Ｎ−ｔ
ａｂａｃｕｍ）系統に対するシス−アビエノール収量の
範囲は、約０〜２００ｍｇ／ｋｇであり、この場合殆ど
使用されない系統は、約７００　ｍｇ／ｋｇ程度生産さ
れる。従って、約８００　ｍｇ／ｋｇを越えるシス−ア
ビエノールを生産する任意の系統は、１つの変種と考え
られる。

高いスクラレオール生産量の体細胞クローン本試験の場
合、ニコチアナ　グルチノザＮ。

ｇｌｕｔｉｎｏｓａの２つの異なる遺伝子型（ＶＳおよ
びＤＥと呼称される）からの葉の外植片は、栽培され、
かつスクラレオールの高い濃度を生シる体細胞クローン
に対してスクリーニングされた。１つの系統、ＤＥの場
合、全部で９４種類から２６種類の体＃Ｉ胞糸系統、最
高の対象を１１〜３２％越えたスクラレオール生産の範
囲を示した（第１図）。しかし、１つの系統は、最高の
対象を越えてスクラレオール中で２．５倍の増大を示し
た（１５８１ｍｇ／ｋｇ）、また、この系統、ＤＥ−７
２は、マヌール（ｍａｎｏｏｌ）、別のラブダン４１５
ｍｇ／ｋｇを生じ：これは、最高の対象の約２倍の増加
である。他面、クロロフィルの崩壊によって生じた非ラ
ブダンアルコール、フィトール（ｐｂｙｔｏｌ）は、対
象の場合と同量で存在し、この場合には、系統７２を区
別する生化学的変化および遺伝子学的変化は、ラブダン
経路のみを包含することが指摘される、これは、全生化
学的経路を制御するゲノム中へ単独の遺伝子変化を導入
するための体細胞クロナール変種の有用性について予め
観察することと一致している。

１つの相違をもってＤＥを用いて認められる平行なもの
のｖＳ体細胞クローンについての観察：この遺伝子塁は
、全てスクラレオール合成のためにＤＥとは同様に生産
されず、それ故に７５体細胞クローンは、ＤＥ体細胞ク
ローンが行なうようなレベルまでスクラレオールを蓄積
しない。しかし、ＤＥ体細胞クローンと比較した場合に
増大したスクラレオール合成の極めて同様の分布がＶＳ
体細胞クローン中に存在することは、価値のあることで
ある。すなわち、この技術によれば、任意の記載のニコ
チアナＮｉｃ。

ｔｉａｎａ系統の場合に増大したラブダン生産量を取得
する確実な方法が得られ、実際に記載した結果は、標準
範囲の高い末端、すなわち少なくとも約５００〜６００
ｒｑｇ／ｋｇでスクラレオール生産量を既に示している
系統である。

本発明による変性系統による平均的スクラレオール生産
量および同様の対象の系統を記載した図面がニコチアナ
　グルチノサＮ１ｃｏＬｉａｎａ　ｇｊｕｔ　１ｎｏｓ
ａに対する寅質的に理想的な成長条件下で１つの季節の
生産の場合に観察される生産量に帰因することは、当業
者によって認められるところである。明らかに、環境条
件は、植物の全収量ならびにスクラレオールそれ自体の
生産に影響を及ぼす可能性を有する。当業者であれば、
植物を成長させるべき領域の環境条件下でスクラレオー
ルの収量を最適にするであろう栽培計画を設計すること
ができる。しかし、一般に、伝統的なタバコの農耕法は
、ニコチアナグルチノサ　Ｎ、ｇｌｕｔｉｎｏｓａの成
長に適用しうる。最適なスクラレオール合成は開花の開
始時に起こり、かつスクラレオール生産の約７０％は植
物ノドツブ２／３の部分で起こることが測定された。そ
れ故に、開化後の植物のドッグ２／３の部分を収穫する
ことにより、最適なスクラレオール濃度は得ることがで
き、十分な植物物質は、土壌中に留まり、地面の同じ区
画から第２の収穫を可能ならしめる良好な第２の成長を
保証する。本明細書中に示された全ての収量／ニーカー
図は、２つの収穫の結果を表わす。

本発明方法は、ニコチアナ　グルチノサの高いラブダン
生産量の系統を繰返し生産するために使用された。特に
高いラブダン生産量の系統の種子は、寄託番号ｐ、ＴＣ
Ｃ４０４６３で米国寄託機関に寄託された。しかし、本
発明の範囲は、単に体細胞変種系統それ自体にも１つの
寄託された系統にも限定されない。また、本発明は、高
いスクラレオール生産量の同定特性を保持する、元来の
体細胞クロナール変種から誘導された全てのハイブリッ
ド、種間および特異性内の双方の突然変異体、体細胞ク
ロナール変種および配偶子クロナールを包含する。

このようなニコチアナ　グルチノサの有用性は、スクラ
レオールを有業的規模で生産することができる新規方法
を提供する。ニコチアナグルチノサによるスクラレオー
ルの生産は、これまでに知られていたけれども、この植
物は、この目的のためには決して利用されなかった。

それというのも、恐らくこの植物の自然の収量は、極く
僅かであるからである。しかし、ところで高い収量の体
細胞クローンの本発明による有用性は、スクラレオール
を商業的に実行できる量で生産することができる１つの
方法を提供する。従って、本発明による体細胞クローン
は、新しい植物重量少なくとも８００ｍｇ／ｋｇのスク
ラレオール含量を有する、ニコチアナ　グルチノサの葉
および新規体細胞クローンの他の植物部分の抽出によっ
て植物源からスクラレオールを取得する方法の改善を表
わす。

高いシス−アビエノール生産量の体細胞クローン 同様の成功は、増大したアビエノール生産の源としてニ
コチアナ　タバクムを使用することにより達成された。

系統Ｔｉ−１３９６は、体細胞クロナール変種の組織外
植片のための源として使用され：源変種は、若干の変種
をスクリーニングした後に選択され、ニコチアナ　タパ
クムに対してアビエノール生産の標準範囲内で何れが最
適のアビエノール生産者であるかを決定した。第１表に
は、３回の収穫に亘って３つの系統の中のアビエノール
の相対的収量が示されている。

下記の例１に記載の方法により、２００を上廻る体細胞
クローン（ＲＯ）は、生殖され、土壌に移植され、かつ
温室に移された。体細胞クローンは、開花するまで成長
され、次いで葉は、実験分析のために除去された。アビ
エノール合成に重要な変種量は、業物質０〜約１０００
ｍｇ／ｋｇまでの範囲の濃度で体細胞系統中で観察され
た。この栽培の場合には、対象植物は、葉物質４００〜
４５０　ｍ９／ｋｇの範囲内で平均化された。この体細
胞クローンのＲ１世代で観察される変種の図面による描
写は、第１図に表わされている。体細胞クローンから生
産された全ての系統が必ずしも十分に対象の濃度に到達
しないのだけれども、若干のより能力が凌駕している対
象系統は、約１．５〜２．０倍の量のアビエノールを生
産する。２回の収穫に基づく最適の体細胞クローン系統
を示す前記試験の結果は、第■表に総括されている。同
様に、アビエノール生産の増大により改善された植物の
生存能力または収量に対して如何なる不利な作用も現わ
れないという事実は、重要であり：また、第■表は、体
細胞クローンの生物体量が本質的に対象系統に関する体
細胞の場合と本質的に同じであることを示す。

第 ■ 表 ９７９．０ ８６６．２ ７７６．９ ７６４．３ ７５６．３ ７４９．７ ７４８．６ ６９９．５ ６８７．０ ６８６．７ ６７４．３ ６５０．８ ６３８．５ ６３７．５ ６２３．８ ６１５．９ ５９５．６ ２９４．０ ３４９．０ ３１８．０ ３３９．６ ４８９．５ ３０１．０ ２８０．０ ３７０．０ ３２３．０ ４９３．７ ６１８．２ ３５２．０ ３１７．３ ２７８．０ ３３６．０ ２７４．０ ３２６．０ ６３６．０ ２．３２ ２．５５ ２．９１ ２．２７ ２．６４ １．７３ ３．３２ ２．３６ ２．８２ ３．３６ ２．１８ ２．３６ ２．４１ ３．０９ ２．２７ ２．２７ ２．６８ ２．６４ 本明細書中で特許の保護が請求された体細胞クローンの
特徴を定義することは、１つの成長の季節でタバコに対
して実質的に理想的な成長条件下で平均的なアビエノー
ル生産量に基づく。不利な環境条件は、植物の全収量な
らびにアビエノールそれ自体の生産量に影響を及ぼす可
能性を有する。当業者であれば、植物を成長させること
ができる環境条件下でアビエノールの収量を最適にする
であろう栽培計画を設計することができる。しかし、体
細胞クローンは、両親植物に必要とされるものとは異な
る成長条件を必要とはせず、それ故に概して伝統的なタ
バコ農耕法は、本発明によるニコチアナ　タバクム体細
胞クローンの成長に適用されるであろう。収穫は、成長
期の間、１回またはそれ以上であることかでさる。それ
というのも、最初の収穫は、屡々完全な葉および花を有
する新しい垂直の茎の成長を生じる２５箋らである。ア
ビエノール産のピークは、開花時に起こる。更に、日の
中にアビエノール生産量の変動が生じ、したがって収穫
は、有利にアビエノール収量を最大にするために正午な
いし午後遅くに行なうべきである。最初の収穫は、第２
の収穫のアビエノール含量を増大させる目的のために肥
料の付加的な施用を引続き行なうべきである。また、激
しい雨降りはアビエノール含量の一時的な減少を惹き起
こしうろことが認められ、この含量は、１０日内に次第
に標準値に回復する。アビエノールは主として植物の葉
上で生産されるのだけれども、実質的には、植物の全て
の部分から得ることができ、この場合に得られた図面は
、全植物が使用されていることを反映している本発明に
よる体細胞クローン、９６〜１６９として表わされた系
統、の１つの種子は、寄託番号ＡＴＣＣ４０４６２で米
国寄託機関に寄託された。しかし、寄託物は、単に例示
的なものにすぎず、かつ本発明の特許請求の範囲を体細
胞クローン系統それ自体または１つの寄託系統に限定す
るものではない。本発明の特許請求の範囲内の多数の植
物は、常法で生産することができることは、第■表から
容易に認めることができる。また、本発明は、高いアビ
エノール生産量の同定特性を保持する、片親または両親
としての本発明による植物を使用することにより生産さ
れたハイブリッド、種間および特異性内の双方ならびに
特許請求の範囲に記載されたクローン、体細胞クローン
、配偶子クローンおよび突然変異体を包含する。また、
高い収量のタバコ系統の他の体細胞クローンは、本発明
による使用に記載された方法を使用することにより得る
ことができる。

本発明の高い収量を生じるニコチアナ　タバクム系統の
有用性は、シス−アビエノールｔ−商業的規模で生産す
ることかでさる１つの方法を提供する。ニコチアナ　タ
バクムによるアビエノールの生産は、これまでに知られ
ていたけれども、タバコは、この目的のためには決して
利用されなかった。それというのも、恐らく通常比較的
に僅かな収量であるからである。従って、本発明による
体細胞クローンは、新しいニコチアナ　タバクム体細胞
クローンの葉および他の植物部分の抽出によってアビエ
ノールヲ取得する方法の改善を表わす。

次の非限定的実施例は、より明瞭に本発明による植物系
統および方法を詳説する。

実施例 体細胞クロナール変種の誘発 次の例は、ラブダンの標準量よりも高いニコチアナ　ス
プ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｓｐ、生産量が繰返し生産さ
れた条件を詳説する： ニコチアナ　グルチノサ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｇｌｕ
ｔｉｎｏｓａまたはニコチアナ　タバクム　Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ＋ｓの十分に広がった若い葉を
供与体の植物から分離し、表面を滅菌する。温室で成長
した植物の滅菌を通常８％の市販の漂白液（０，４２％
の次亜塩素酸ナトリウム）中で約６分間行なう。滅菌蒸
留水を３回変えることにより漂白液を洗浄除去する。こ
の葉を１〜５ｃｍ”の部分に切断し、かつ無菌状態で約
１０μＭの濃度の６−Ｂ　Ａおよび約ＩＯμＭの濃度の
Ｉ　ＡＡＩ）添加しながら固体ＭＳ媒体（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ
、　１５　：　４７３−４７９．１９６２）を有する容
器に移す。カルス集団が約５〜ｌＯ日間で発生し、苗条
は２〜３週間で生殖する。カルスから生殖された全ての
苗条は２μＭのＮＡＡを有するＭＳ媒体からなる発根媒
体に移される。小植物は、栽培開始後８〜ＩＯ週間目か
ら発根媒体上に回復する。２〜ｌＯの植物は、典型的に
苗条を生殖するそれぞれの外植片から得られる。

２００を土建る生殖した植物（Ｒｏ）は、それぞれの群
から得られ：これらは、土壌中に置かれかつ温室に移さ
れた。Ｒ，植物は、自己受精し、種子は次の（Ｒｓ＞世
代の評価のためにそれぞれの生殖植物から選択される。

Ｒ１植物の種子は、温室中で播種され、かつ遺伝的可変
性のために複製された小区画の畑に移植されたラブダン
生産量のスクリーニング 次の方法によりＲ１系統の集中のスクラレオール含量に
ついての試験方法が詳説される。

メタノール抽出は、有利に植物のトップのｌ／３の部分
からの葉上で実施される。任意に摘出され、次に幾つか
の葉ディスク（ｄｉｓｋ）は、葉の中央葉脈を除いて１
．５ｃｍのコルク穿孔器を用いてそこから発生される。

葉ディスクＩＯｇが秤量され、かつ２５０ｍＱのビーカ
ーまたは抽出フラスコ中に入れられる。試薬用メタノー
ル１００ｍ１２をそれぞれのフラスコに入れ、かっ１６
０　ｒｐｍで８〜ｌＯ時間回転振盪機で振盪させる。溶
剤をデカンテーションし、かつ減少させる。次に、メタ
ノールの新しい１００ｍＱのアリコートを添加し、かつ
２時間振盪させる。溶剤をデカンテーションし、かつ第
１の準備された溶剤画分と組合わす。

メタノールの乾燥は、若干の異なる方法で達成すること
ができる。多数の試料が準備される場合には、乾燥時間
は、層流７−ド（ｈｏｏｄ）中でｌ〜２日間蒸発させる
ことによって達成することができる。少数の試料を評価
すべき場合には、メタノールは、２〜３時間窒素ガスを
メタノールに通して泡立たせることによって蒸発させる
ことができる。

乾燥後、残留物を、ヘキサン：塩化メチレン（１：　１
）の２つの５ｍＱのアリコートに溶解し、蒸留水２．０
　ｍＱを第２の５ｍ１２のアリコートに添加し、残留物
の水溶性成分を溶解する。

１５ｍＱの円錐形遠心分離管中で、■−ヘプタデカノー
ルの５ｍｇ／ｍＩ２溶液０．５　ｍＱ　（内部標準）を
溶解残留物と組合せ、相を分離させた。必要な場合には
、容量を付加的なヘキサン：塩化メチレンでｌＱｍ１２
にまで上昇させることができる。

固体相抽出カラム（シリカゲル、吸着剤５００ｍｇ、生
産能力３ｍＱ＞を設け、かつヘキサン：塩化メチレン２
ｍｇで状態調節する。試料のトップ相から１ｍＩ２を除
去し、かつカラム上に負荷する。試料をカラム上でヘキ
サン：塩化メチレン２ｒｒ＋Ｑを用いて洗浄する。カラ
ムをアセトンのアリコート４　Ｘ　０．５　ｍＱで溶離
し、溶出液′を０．５ドラム（ａｒａｗ）の小壜中に捕
集する。

溶出液を窒素ガスで蒸発させ、残留物を酢酸エチル１ｍ
１２で再溶解させる。次に、試料をガスクロマトグラフ
ィーへの注入のために読み取るクロマトグラフィーを上
記のサバーソン（Ｓｅｒｅｒｓｏｎ）他の方法により次
の変法を用いて行なうニ スプリット比　　　　　　　　　　２００：１カラム　
　２５ＭＸ０．２２ｍｍ　　ＩＤ　　ＣＰ−５Ｉ　Ｌ　
　５　ＣＢ　（ｃＨＲＯＭＯＰＡＫ）１１度プログラム
　　１６０℃の恒＠（９分間）５℃／分〜２９５℃、お
よ び４分間保持した 運転時間　　　　　　　　　　　　　４０分間注入量　
　　　　　　　　　　　　　　　１μａ付加的な規定は
次のものを包含する： Ｈｅ　　　　　　　　　　　　　　３０　ｒｒｌ／ｗｉ
ｎＨ２３０ｍ４／ｗｉｎ 空気４００　ｍｌ、／ｗｉｎ カラム流量　　　　　　　　　０．９９　ｍＱ／ｓｉｎ
注入温度　　　　　　　　　　　　　２５０℃検出温度
　　　　　　　　　　　　　３００℃この方法の場合に
は、それぞれＶＳ系統およびＤＥ糸系統らの２００を土
建る生殖された植物をスクラレオール生産量のために試
験した。

結果は、第１図および第２図に示されている。

この方法の場合、Ｔｉ−１３９６から発生したＲ１世代
植物は、アビエノール生産のためにスクリーニングした
。第■表および第１図に設けられている選択された系統
の纒めによれば、全世代に亘ってのアビエノール生産量
の分布が指摘すれている。更に、アビエノールを生産す
る変種を用いての試験（鷹、以下に記載されている。

Ｒ２世代 高いアビエノール生産量の変種のＲ２世代は、畑の条件
下でも評価された。アビエノール合成の遺伝的複雑さに
より、遺伝的分離の予想量が観察された。しかし、第■
表に示した結果はＲ１体体細胞クローントップ性能は、
高い濃度のアビエノールの生産を連続させることが判明
する。注釈：例えばＤＮＡＰ−６２およびＤＮＡＰ−１
７９、これらは、アビエノール合成の点でより良好な８
１体細胞クローンであった。対照と体細胞クローンとの
双方の場合に複製１と、複製２との間で観察された差は
、複製ｌおよび複製２の収穫と分析との間の時間的間隔
に帰因することができる。複製２は、ピーク収穫日によ
り近い日に収穫され、したがってより高いアビエノール
濃度を証明することが期待されるであろう。しかし、全
体的にＲ２体細胞クローンは、第２図で認められるよう
に双方の複製の場合にＴｉ−１３９６対照よりも能力が
優れている。重要な数の体細胞クローンは、双方の複製
の場合にＴｉ−１３９６対照の平均的アビエノール濃度
を土建る。

体細胞ハイブリッド 高いアビエノール生産量を生じる体細胞クローンを相互
交雑させかつＦｌハイブリッドを改善されたアビエノー
ル生産量にために評価することも努力がなされた。トッ
プ１０体細胞系統からのＲ１種子を温室内で播種し、次
にこの植物をスクリーニングし、最高の生産量を生じる
植物を相互交雑のために選択した。全ての交雑およびそ
の相反交雑を温室内で１月から３月に亘って行なった（
第■表）。全部で７１回の交雑を行ない、Ｒ１種子を捕
集し、畑での評価のために播種した。Ｆｌを２つの型の
対照と一緒にｌ小区画あたり１５種類の植物の複製した
小区画に栽培した。Ｔｉ−１３９６を１つの対照として
使用し、かつ５つのＦ１ｔ＼イブリッド小区画あたり１
つのＴｉ−１３９６対照の小区画（１５種類の植物）の
明度で栽培した。他の組の対照は、自己親体細絢クロー
ンであった。アビエノールを成長期を涌じて試験し、試
料を９月の初旬に収穫した。分析は試料採取プロトコー
ルに基づいており、この場合１枚の葉は、１０種類の異
なる植物／小区画のトップｌ／３から除去され、大きい
葉で包み、かつ紙バッグ中に入れた。化学分析を上記の
記載と同様に行なつｔ二。

生じるハイブリッド系統は、アビエノール生産量の広い
範囲を示し、この場合幾つかのＦｌハイブリッド系統は
、親またはＴｉ−１３９６対照の場合よりも高いアビエ
ノール濃度を生じ、他のものは、Ｔｉ−１３９６対照の
場合よりも高いアビエノール濃度を示したが、双方の脱
型の場合と等しかった。

幾つかのハイブリッドの著しい増大は、恐らく２つの体
細胞クローン間の遺伝的に補足的な組合せの反映である
。

アビエノールを生産するＦ１ハイブリッド系統のトップ
２０％（１５種類の系統）は、前記系統内で見出された
アビエノール濃度を、最モ近いＴｉ−１３９６対照小区
画と、相応する親小区画との双方の場合に見出されたも
のと比較することによって選択された。それぞれ選択さ
れたハイブリッドの場合、Ｆ、ハイブリッド系統で見出
されたアビエノール濃度ハ、最モ近いＴｉ−１３９６対
照小区画の場合に見出されたアビエノールの平均濃度の
場合よりも著しく高い。選択された大多数のハイブリッ
ド組合せ物は、脱型の場合よりも著しく高いアビエノー
ル濃度を示した。トップハイブリッド系統についての観
察の纒めは、第７表に示されている。従って、トップア
ビエノールを生産する体細胞クローンの相互交雑は、全
てのアビエノール合成を増大させるための価値のある技
術を表わす。

【図面の簡単な説明】

第１図は、全世代に亘ってのアビエノール生産量の分布
を示す線図、 第２図は、Ｒ２体細胞クローンの場合のアビエノール生
産量の分布を示す線図、 第３図は、体細胞クロナール変種の場合のアビエノール
生産量の分布を示す図、 第４図ａは、複製ｌの集団分析によるＲ２体細胞クロー
ンの分布を示す図、かつ 第４図すは、複製２の集団分析によるＲ１体細胞クロー
ンの分布を示す図である。 （呂云二 ０ｎ）２５０２５０・４５０４５０４５０５５０・６５
０８５０−１０００アビエノール■／ゆ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成長期において新しい植物重量１ｋｇあたりスクラ
   レオール少なくとも約８００ｍｇを生じる変種ニコチア
   ナグルチノザ植物。 ２、スクラレオール少なくとも約１０００ｍｇ／ｋｇを
   生じる、請求項１記載の植物。 ３、スクラレオール少なくとも約１４００ｍｇ／ｋｇを
   生じる、請求項１記載の植物。 ４、寄託番号ＡＴＣＣ４０４６３で米国寄託機関に寄託
   された種子；そのハイブリッド、クローン、突然変異体
   、体細胞クローンおよび配偶子クローンから誘導されて
   いる変種ニコチアナグルチノザ植物。 ５、ハイブリッドである、請求項１から４までのいずれ
   か１項に記載の植物。 ６、請求項１記載の植物の種子。 ７、請求項２記載の植物の種子。 ８、請求項３記載の植物の種子。 ９、請求項４記載の植物の種子。 １０、請求項５記載の植物の種子。 １１、寄託番号ＡＴＣＣ４０４６３で米国寄託機関に寄
   託されたニコチアナグルチノザ変種の種子。 １２、請求項１記載の植物の葉。 １３、請求項２記載の植物の葉。 １４、請求項３記載の植物の葉。 １５、請求項４記載の植物の葉。 １６、請求項５記載の植物の葉。 １７、成長期において新しい植物重量１ｋｇあたりシス
   −アビエノール少なくとも約８００ｍｇを生じる変種ニ
   コチアナタバクム植物。 １８、シス−アビエノール少なくとも約１０００ｍｇ／
   ｋｇを生じる、請求項１６記載の植物。 １９、シス−アビエノール少なくとも約１２００ｍｇ／
   ｋｇを生じる、請求項１６記載の植物。 ２０、シス−アビエノール少なくとも約１６００ｍｇ／
   ｋｇを生じる、請求項１６記載の植物。 ２１、ハイブリッドである、請求項１６から１９までの
   いずれか１項に記載の植物。 ２２、寄託番号ＡＴＣＣ４０４６２で米国寄託機関に寄
   託された種子；そのハイブリッド、前駆体、クローン、
   突然変異体、体細胞クローンおよび配偶子クローンから
   誘導されている変種ニコチアナタバクム植物。 ２３、請求項１７記載の植物の種子。 ２４、請求項１８記載の植物の種子。 ２５、請求項１９記載の植物の種子。 ２６、請求項２０記載の植物の種子。 ２７、請求項２１記載の植物の種子。 ２８、請求項２２記載の植物の種子。 ２９、請求項１７記載の植物の葉。 ３０、請求項１８記載の植物の葉。 ３１、請求項１９記載の植物の葉。 ３２、請求項２０記載の植物の葉。 ３３、請求項２１記載の植物の葉。 ３４、請求項２２記載の植物の葉。 ３５、平均量よりも高いラブダンを生じることができる
   ニコチアナ植物を取得する方法において、 （ａ）ニコチアナの外植片を適当な培地上で少なくとも
   １つのサイトカイニンの変種生産有効量の存在下で培養
   し、カルスを得； （ｂ）このカルスから成熟植物を生殖し； （ｃ）平均量よりも高い少なくとも１つのラブダンを生
   じる変種のために成熟植物をスクリーニングすることを
   特徴とする、平均量よりも高いラブダンを生じることが
   できるニコチアナ植物を取得する方法。 ３６、植物を成熟するまで成長させかつスクラレオール
   を植物部分から抽出することによってスクラレオールを
   植物源から得る方法において、植物源として新しい植物
   の重量１ｋｇあたりスクラレオール少なくとも約８００
   ｍｇを生じる変種ニコチアナグルチノザ、またはそのハ
   イブリッド、突然変異体、配偶子クローンまたは体細胞
   クローンを使用することを特徴とするスクラレオールを
   植物源から得る方法。 ３７、植物を成熟するまで成長させかつシス−アビエノ
   ールを植物部分から抽出することによってシス−アビエ
   ノールを植物源から得る方法において、植物源として新
   しい植物の重量１ｋｇあたり約８０ｍｇよりも多いアビ
   エノールを生じるニコチアナタバクムを使用することを
   特徴とする、シス−アビエノールを植物源から得る方法
   。 ３８、植物がシス−アビエノール少なくとも約１０００
   ｍｇ／ｋｇを生じる、請求項３６または３７に記載の方
   法。 ３９、植物がシス−アビエノール少なくとも約１２００
   ｍｇ／ｋｇを生じる、請求項３６または３７に記載の方
   法。 ４０、植物がシス−アビエノール少なくとも約１６００
   ｍｇ／ｋｇを生じる、請求項３６または３７に記載の方
   法。