JPH04126100A - 有機体の同定および特徴づけ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細菌、植物および動物のような前核細胞およ
び真核細胞有機体を含む有機体を迅速且つ正確に特徴づ
けおよび同定する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

生きている有機体の分類は伝統的に、多かれ少かれ任意
で、いくらか人為的な線に沿って行われてきた。例えば
生物の世界は二つの界に分けられている：植物（Ｐｌａ
ｎｔａｅ）および動物（Ａｎｉｍａｌｉａ）。

この分類は一般に知られている有機体に対しては都合が
よいが、単細胞生物のような有機体（例えば、緑鞭毛虫
類、細菌、藍藻類）に対しては困難となる。なぜならば
これらは基本的には「植物」および「動物」とは違うか
らである。

有機体をその細菌の内部構造によって単純に分けること
が提案された。このやり方では、すべての細胞生物は前
核性（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）か真核性（ｅｕｋａｒ
ｙｏｔｉｓ）かのどちらかである。前植生物（ｐｒｏｋ
ａｒｙｏｔｅｓ）は真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）
はど複雑でなく、それらには、単位膜組織による内部の
仕切りがなく、明瞭な核を欠いている。前核細胞の遺伝
情報は２本鎖の環状ＤＮＡにのって細胞質に運ばれる。

その他のＤＮＡは細胞中に存在しない（ファージ、細菌
性ウィールス、および自律的複製のできる環状ＤＮＡプ
ラスミドが存在する場合は除く）。他方、真核生物には
、多種多様の単位膜組織があり、これは多くの機能成分
を、特殊化され孤立化された領域に分離する役目をもっ
ている。

例えば、遺伝情報（ＤＮＡ）は明瞭に仕切られた核の中
に見出され、小器官である糸粒体（ミトコンドリア）お
よび（光合成有機体では）葉緑体中にも見出される。真
核細胞のゲノムの複製、転写および翻訳は、細胞内の二
又は三個所の別個の部位。

核細胞質部分、糸粒体および葉緑体でおこる。

しかしながら、前核生物と真核生物との差は、前核細胞
で糸粒体および葉緑体の比較を行う時、打砕かれる。こ
れらの細胞小器官は今日ではフリーリビング（ｆｒｅｅ
−１ｉｖｉｎｇ）前核生物に由来するものと考えられて
おり、そのフリーリビング前核生物は原始的真核生物と
、内共生（ｅｎ＋ｊｏｓｙｍｉｏｔｉｃ）関係に入り、
究極的に宿主細胞の構造と密接に統合され、独立的存在
が不可能になったものである（参照例、　ＦＯＸ、　Ｇ
、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、　　ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　　Ｊ　２
０９；４５７−４６３（１９８０）ｐ、４６２；　５ｔ
ａｎｉｅｒ、　Ｒ，Ｙ、ｅｔ　ａｌ。

ｒＴｈｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｗｏｒｌｄ　Ｊ第４版
、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌ１社発行、　１９７６、
　ｐ、８６）　。例えばリポソームＲＮＡ遺伝子領域を
担うマウスＬ細胞糸粒体から得たＤＮＡは大腸菌（Ｂｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）リポソームＲＮＡとの
顕著な配列相同性を示すことが証明され、内共生モデル
を強く支持している（Ｖａｎ　Ｅｔｔｅｎ、Ｒ，Ａ。

ａｔ　ａｌ、　ｒｃｅｌｌＪ　２２：１５７−１７０（
１９８０））　。また、とうもろこしくＺｅａ　ｍａｙ
ｓ）葉緑体の２３３型リポソームＤＮへのヌクレオチド
配列は、大腸菌の２３３型リポソームＤＮＡと７１％の
相同性を有することも示されている（Ｅｄｗａｒｄｓ、
に、　＆　Ｋｏｓｓｅｌ、　Ｈ，、ｒＮｕｃｌｅｉｃ八
ｃｉｄｓ　Ｒへ５ｅａｒｃｈ」９：２８５３−２８６９
（１９８１））：その他の関連研究も（Ｂｏｎｅｎ、　
Ｌ、＆　Ｇｒａｙ、　Ｍ、Ｗ、、同上８：３１９−３３
５　（１９８０）　）。更にその一般概念を支持してい
る。

このモデルでは真核細胞は、性質からみると明らかに前
核性である小器官部分をもった、系統発生的「キメラ」
である。「前核性−真核性」二分法もまた広い分類の方
法としてすら欠点がある。

有機体の分類が科学的課題以上のものとなるのは、交雑
および育種（ｂｒｅｅｄｉｇ）の目的で植物か動物を同
定しようとする場合、およびいわゆる「より高等な」有
機体又はその他の媒体に感染するかも知れない微生物を
、正確且つ信頼をもって同定しようとする場合である。

例えば植物栽培者、家畜飼育者又は魚飼育者は異種およ
び異型株を同定する迅速且つ信頼できる方法を得たいと
思うだろう。獣医、医師又は園芸家は、試験植物、およ
び動物組織中の感染性有機体（寄生虫、菌類、細菌等）
およびウィールスを正確に同定したいと思うだろう。こ
れら有機体およびウィールスの種の正しい同定は特に重
要なことである。

この問題は、細菌の同定について説明すると最も良くわ
かる。細菌種の名前は、多くの菌株をあられすのが普通
であり、−菌株は一個の細胞から派生する集団と考えら
れる。種の菌株はその種を定義するのに役立つ属性の相
似な組み合わせをもっている。細菌種の、正確な定義を
表現することは、種の境を設けるために、種内の菌株の
多様さに対し境界を定めることが必要であるたｔ難かし
い（Ｂｕｃｈａｎａｎ、　Ｒ，Ｅ、、　ｒｌｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎ
ｄＴａｘｏｎｏｍｙＪ　、　１５：２５−３２（１９６
５））　ｏ種の定義を未知の細菌菌株の同定に実際に応
用するには表現型の属性を検出するたｔの基質および条
件のような適切なプローブの選択、および同種からの散
財性物質で標識化されたＤＮＡが必要である。菌株を同
定するための適切なプローブが選択されうるように、仮
に菌株を確認するスクリーニング法を用いることが必要
である。挑戦していることは、種の境界を厳密に定める
ことであり、好ましくは、種に特異的な情報を与える標
準プローブを使ってこれを行うことである。そうするこ
とにより種の定義づけが未知の菌株の同定に直接、且つ
等しく適用できる。

バージ−のマニユアル・オブ・デターミネティブ・バク
テリオロジ＝（Ｂｕｃｈａｎａｎ、　Ｒ，ｔｌ’、ａｎ
ｄ　Ｇｉｂｂｏ−ｎｓ、　Ｎ、Ｅ、編集、　１９７４．
第８版、　Ｗｉｌｌｉａｎｓ　　＆　Ｗｉｌ−ｋｉｎｓ
社、バルチモア）は最も理解し易い細菌分類法、特に命
名法、基本型菌株、関連文献等について示しである。し
かしながら、これは種の同定の出発点に過ぎないもので
ある。なぜならば、特にこれは時代遅れであり、スペー
ス的に限られるた約種についての記述が簡単すぎるため
である。

（参照例；ブレンナー〇、Ｊ　（Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｄ、
Ｊ　）ｒＭａｎｕａｌ　　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第３版。

米国微生物学会、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８０，１−
６頁）。

細菌に用いた場合「種」という語は、成る他と区別でき
る特徴をもった、有機物の異なった種類として、又、本
質的な有機体組織の特徴において、一般に相互に近い類
似性をもった有機体の一部と定義されてきた。これらの
定義の問題点は、それらが主観的であるということであ
る　（Ｂｒｅｎｎｅｒ、同上、ｐ２）。又、種は単に宿
主の範囲、病原性。

成る糖の発酵の際にガスを生産するかしないか、糖発酵
が速いか遅いかのような基準に基づいて定義されたこと
もあった。

１９６０年代には数的細菌分類法（コンピューター分類
法又は遺伝的表現型分類法とも呼ばれる）が広く用いら
れるようになった。数的分類法は、有機体の遺伝能力（
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をできるだけ多く試験することに
基づいている。多数の特性に基づいて分類することによ
り、一定程度の相似性をもった菌株のグループを形成す
ることができ、これらを種と考えることができる。しか
しながら、成る一つの種を特徴づけるのに有効なテスト
が次の種のために役立つとは限らないので種のこの定義
法は未知の菌株の同定に直接的且つ実際的に適用できな
い。たとえこれが種に特異的であると思われる属性を選
ぶことによって、これらの属性が未知の菌株の確認のた
ｔに用いられ、部分的に克服できるとしても、この種の
定義法は間接的に応用されているに過ぎない（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ、同上、ｐ、２−６参照）。その上−射的方法は
、これを種を定めるための唯一の根拠として用いた場合
、い（つかの問題をかかえており、それらの中には用い
るべき試験の数および性質、その試験をどの程度評価す
べきか関連性を反映させるためにはどのようにして、ど
の位の程度の類似性を選ぶべきか、同じ類似性の基準が
すべての群に適用できるかどうか等がある。ヒユー　Ｒ
，Ｈ（Ｈｕｇｈ、　Ｒ，Ｈ）およびギリアージＧ、Ｌ　
（Ｇｉｌｉａｒｄｉ、　Ｇ、Ｌ）著ｒＭａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｃｌｉｎｉｃａ１ＭｉｃｒｏＣ１１ｎｉｃａ１第２
版、米国微生物協会、ワシントンＤ、［”、、　１９７
４．　ｐ、２５０−２６９には、ゲノムのフラクション
を利用して細菌の種を定める手段としての最少の表現型
の特質が列挙しである。

つの種の中から多数のそしてランダムに選ばれた菌株試
料を研究することによって、最も高度に保存されている
か又は非常に多くの菌株に共通である属性を選びだし、
種を定義することができる。

最少特性を使用するようになったことは進歩であり、菌
株を仮に同定するためのスクリーニング法から始と、適
当な追加の培地が選択できるようにする。次いでその菌
株が最少の特性のほとんどを有することを予想しながら
当該種に保存されている既知の属性を調べる。最少特性
の中のいくつかは当該種のすべての菌株にあられれるわ
けではない。これに関連した考え方としては、その属の
種のタイプ、ネオタイプ又は確認済みの対照菌株の比較
研究がある。各研究室によって培地および方法が異なる
から、この照合は必要であり、菌株こそ種の標準（ｓｔ
ａｎｄａｒｄ）であって、方法ではないのである。

細菌分類への分子レベルでのアプローチは二つのゲノム
をＤＮＡ−ＤＮＡ再対合（ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
）によって比較することである。種の遺伝的定義には種
の菌株が７０％以上関連しているという仮定が含まれる
。ＤＮＡ−ＤＮＡ再対合で菌株が同定できるのは、放射
性標ｍＤＮＡプローブと未知のＤＮＡが同じ種のもので
ある場合のみである。しかしこの７０％種一定義の実際
的適用は、適切なプローブを選択しなければならないこ
とによって制限される。これは、再対合群と相互関係が
ありそうにみえる表現型属性を選択することにより一部
は克服されるかもしれないが、これらが単独で用いられ
た場合、ＤＮＡ−ＤＮＡ再対合による種の定義はやはり
間接的に適用されるにとどまる。

ブレンナー、前出、第３頁は、細菌の種を確認する理想
的手段は、遺伝子を分離し、直ちに当該菌株中の核酸配
列をあらゆる既知の種の何か（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｏｍ
ｅｔｈｉｎｇ）の標準パターンと比較する、質量分光光
変法分析に似ている「ブラックボックス」であると述べ
ている。

しかしながらブレンナーは分離された遺伝子と一般的配
列を決めるための制限エンドヌクレア。

ゼ分析をすることはできるけれども、［我々は−切なブ
ラックボックス、特に露天研究室で使用］るために適し
たブラックボックスは手に入りそ・もない。」と認めて
いる。彼の言葉は有機体の２らゆる種に等しくあてはぬ
られる。

先行技術のこの短かい再検討から、未知の細日およびそ
の他の有機体を同定し、それを速かに５類し、特に病原
性有機体又は利用できる生化学ム応をおこす有機体を同
定するための迅速、正確１つ信頼できる方法が今必要で
あるとの結論に達する。その方法は臨床研究室で普遍的
に、モして苓易に利用できるものでなければならないし
、行。

た試験の数や、臨床医の主観的偏見に依存して１；なら
ず、又、過去の、偶発的又は必然的試行Ｐｇ法（Ｔｒｉ
ａｌ　ａｎｄ　ｅｒｒｏｒ　ｍｅｔｈｏｄ）に依存して
もイｌｊない。更に、いかなる生きている有機体のＲお
まび種の同定および区別にも役立ち、獣医、植物懇培者
、毒物学者、動物飼育者、昆虫学者にょって、又そのよ
うな同定が必要な他の関連領域において容易に且つ信頼
性をもって使える方法であることも必要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の目的は有機体、これに限定するものでは
ないが特に微生物を、客観的に同定する迅速、正確且つ
信頼できる方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は細菌のような有機体を、有機
体のゲノムを利用して同定する方法を提供することであ
る。

本発明のもう一つの目的は、動物又は植物の病気の原因
を特徴づけ同定することができるように臨床研究室にお
いて病原性有機体の種および属を特徴づけ、同定する方
法を提供することである。

本発明の今一つの目的は、以上に述べた分類法に有用な
種々の生産物を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明のこれらおよびその他の目的は、以下においてよ
り容易に判明するように、次の方法を提供することによ
り達せられた。

未知の有機体を特徴づける方法にして、当該有機体から
得られる、プローブ有機体からの、又はその有機体に由
来するリポソームＲＮ＾情報−念有核酸とハイブリッド
形成又は再対合した制限エンドヌクレアーゼ−消化ＤＮ
Ａのクロマトグラフ−パターンを、少くとも二種類の異
なる既知の有機体積の同等のクロマトグラフパターンと
比較することからなる方法。

本発明の又別の目的は次の方法を提供することにより達
せられた。

成るサンプル中の病原性の有機体感染を診断する方法で
、当該サンプル中の有機体を上述の方法により同定する
ことからなる方法。

本発明は、もし種が共通の種属形成事象に関連づけられ
る個々に分離した菌株の集合体であるならば、分散化に
もかかわらず、客観的に種の境界を定める、菌株が共有
する類似性があるはずであり、種の菌株はそれらの共通
の根源を探る手がかりとなる構造情報をもっているはず
であるという発明者の認識に基づいている。有機体の過
去の歴史は最も多くセマンタイド＜ｓｅｍａｎｔｉｄｅ
ｓ）、ＤＮＡおよびＲＮＡ　ノ中に残っているから（Ｚ
ｕｃｋｅｒｋａｎｄｌｅ、　Ｅ。

およびＰａｕｌｉｎｇ、　Ｌ、　ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ　Ｊ第８巻
：　３５７−３６６（１９１３５））、発明者は若干の
保存遺伝子に含まれる情報を利用する実験的アプローチ
はｒＲＮＡを使用することであると結論した。リポソー
ムＲＮＡは蛋白合成に構造的並びに機能的役割を有しく
５ｃｈａｕｐ、　　ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｅｏ
ｒｅｔ−＋ｃａｌ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ第７０巻：　２１
５−２２４（１９７８））、モしてｒＲＮＡ−ＤＮＡ　
ハイブリッド化の研究から得られた一般的結論は、リポ
ソームＲＮＡ遺伝子の基本的配列は他の大多数の遺伝子
に比べて進化の過程で変化を受けにくく、より保存され
るらしいということである（Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｌ、著
、　　ｒｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ＩｎＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ」、６４巻、　１０５−１２８＜１９７４＞　、　　
Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ社、＝ｙ−：ｌ−り）。

例えば、多数の細菌種から得られる１６Ｓ型ｒＲＮＡの
一次構造は、オリゴヌクレオチット分析から推定された
　（Ｆｏｘ、　Ｇ、Ｅ、　　ｅｔ　ａｌ著、　ｒｌｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、第２７巻
：４４−５７　（１９７７）　）。大腸菌の数菌株の１
６３型オリゴマーカタログには無視できる程の差がある
（　ＵｃｈｉｃｌａＴ、　ａｔ　ａｌ著；　ｒＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｒ＋」３巻：　６３−７７（１９７４））が、種間の実
質的な差は細菌系統学的分類表作成のだｔに用いること
ができる（ＦＯＸ、　Ｇ、Ｅ、　ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ
　２０９巻：４５７−４６３（１９８０））。

成る一細菌種の異なる菌株は、かならずしも同一ではな
く、制限酵素地図は、異なるＥｃｏＲｌサイトが大腸菌
の二菌株のｒＲＮＡ遺伝子中に生ずることを示している
（１３ｏｒｏｓ、　１．＾、　ａｔ　ａｌ著、「Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃＪ第５ｅａｒｃＪ
１７−１８３０（１９７９））。細菌は保存ｒＲＮ八遺
へ子配列を共有しているようにみえ、そしてその他の配
列は変化し得る（ＦＯＸ、　１９７７゜同上）。

本発明者は更に、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化
物は、成る種の有機体（例えば細菌）の菌株では相似す
るが、他の種の有機体の菌株では異なるｒＲＮＡ遺伝子
配列を含む断片の組み合わせをもっていること、即ち菌
株の変異にもかかわらず、高い発生頻度をもち、最小共
通遺伝子型特質をもつ制限断片の、酵素の特異的組み合
わせが種を決定することも見出した。これが本発明の本
質である。発明者はこの方法が、分類学（古典的）にお
いて同一であるか異なっているかを問わす前核細胞性、
真核細胞性を問わず同定しようとする有機体以外の有機
体からのリポソーム核酸プローブを用い、前核および真
核ＤＮＡ両方に適用できるという点で一般的であること
をも見出した。

本発明は、制限エンドヌクレアーゼ消化物中のリポソー
ムＲＮＡ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を検出することに
基づいて有機体を定める客観的方法を提供する。その検
出はＤＮＡ断片をプローブ有機体からのｒＲＮＡ情報を
含む核酸とハイブリッド化又は再対合させることによっ
て行われる。

本発明の工程によって特徴づけられる「有機体」（この
言葉は「同定する」を含むと解釈される）という語によ
って、定義によりＤＮＡを含む事実上すべての有機体を
意味する。この点に関して参考のために伝統的分類表に
ふれておくことが有用である。

植物および動物が含まれる、例えばモネラ（ｍｏｎｅｒ
ａ）界には、ミコバクテリウム（ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ）。

スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）　、ニーバク
テリア（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、　　リケッチ＋　−
（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）　１ｌｉｉｌの分裂品（細
菌）および藍藻類：サイＴノフィータ（ｃｙａｎｏｐｈ
ｙｔｈａ）を挙げることができる。植物界には、ユーグ
レノイド類（εｕｇｌｅｎｏｐｈｔａ）　、緑藻類：り
ｏｏフィータ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）　、クロロフ
ィセエ（ｃｈ　１ｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）および力ロフ
ィセエ（ｃｈａｒｏｐｈｙ−ｃｅａｅ）　ｗ！、　クリ
ソファータ（ｃｈｒｙｓｏｐｈｔａ）類キサントフイセ
エ（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）　、クリソフイセエ
（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｓｅａｅ）　、バシラリオフイセ
エ（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）綱；ピロツ
イータ（ｐｙｒｒｏｐｈｙｔａ）類デイノフラゲラータ
（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）　、褐藻類：ファ
オフィータ（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）　；紅藻類：ロド
フィータ（Ｒｈｏｄｏｐｈｔａ）　　；粘菌類：ミＤフ
イコフィータ（Ｍｙｘｏｍｙｃｏｐｈｙｔａ）　、　　
ミコマイセタ（ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）　。

アクラシエ（ａｃｒａｓｉａｅｓ）　、ブラズモディオ
ホレエ（ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｅａｅ）　、　　
ラブリンタリＺ　（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａｅ）Ｉ
ｌｉｉＩ；　ユーフイコフィータ：真菌＠　（Ｅｕｍｙ
ｃｏｐｈｙｔａ）　、フイコミセタ（ｐｈｙｃｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）　、　　アズコミセタ（ａｓｃｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ）　＊　バシドミセタ（ｈａｓｉｄｏｍｙｃｅｔ−
ｅｓ）綱；蘇苔類、ヘバティエ（ｈｅｐａｔｉｃａｅ）
　、　アントセロテ（ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔａｅ）　、
　　ムスク（ｍｕｓｃｉ）　ｉｍｌ　：維管束植物トラ
ケオフィータ（Ｔｒａｃｈｅｏｐｈｙｔａ）　、プシイ
ロシダ（ｐｓｉｌｏｐｓｉｄａ）、　　リコサイダ（ｌ
ｙｃｏｐｓｙｄａ）　。

スヘノプシダ（ｓｐｈｅｎｏｐｓｉｄａ）　、ブチロブ
シダ（ｐｔｅ−ｒｏｐｓｉｄａ）、スペルモプシダ（ｓ
ｐｅｒｍｏｐｓ　１ｄａ）豆類。

サイカブ（ｃｙｃａｄａｅ）　、　　ジンクコ゛工軸ｉ
ｎｋｇｏａｅ）、　　］二ヘレ（ｃｏｎｉｆｅｒａｅ）
　、　グネテ軸ｎｅｔｅａｅ）およびアンギロスベルマ
エ（ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）ｌｉｌ、デコテレドネ
エ（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）　　、モノコチロ
エドネ（ｍｏｎ−ｏｃｏｔｙｌｏｅｄｏｎｅａｅ）型網
が記載される。動物界には、原生動物亜界、原生動物門
プロトシア（ｐｒｏｔｏｚｏａ）　。

プラスモドロマ（ｐｌａｓｍｏｃｌｒｏｍａ）西門、フ
ラゲラータ（ｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、サルコヂナ（ｓ
ａｒｃｏｄｉｎａ）およびスポロシア（ｓｐｏｒｏｚｏ
ａ）綱；シリオフォーラ（ｃｉｌｉ。

ｐｈｏｒａ）西門、シリアタ（ｃｉｌｉａｔａ）綱；側
生動物亜界、ポリヘラ（海綿動物門ｐａｒ　ｉ　ｆ　ｅ
ｒａ）　、カルヵレ（ｃａｌｃａｒｅａ）ｉｉｌ、　ヘ
キサチネーラダ（ｈｅｘａｃｔｉｎｅｌｌｉｄａ）綱お
よびデスモスポギＸ　（ｄｅｓｍｏｓｐｏｎｇｉａｅ）
　ｉｉｌ　；中生動物亜界、中生動物門；後生動物亜界
うディアタ（Ｒａｄｉａｔａ）部門、コレンテラタ（ｃ
ｏｅｌｅｎｔｅｒａｔａ）門、ヒドロシア（ｈｙｄｒｏ
ｚｏａ）　、　　シフォゾア（ｓｃｙｐｈｏｚ−ｏａ）
　、ウドシア（ａｕｔｈｏｚｏａ）綱、ステノフォラ（
ｃｔｅ−ｎｏｐｈｏｒａ）門、テンタクラータ（ｔｅｎ
ｔａｃｕｌａｔａ）およびヌダ（ｎｕｄａ）綱；ブロト
ストミ（ｐｒｏｔｏｓｔｏｍｉａ）部門扁形動物門プラ
チェルミンタ（ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｅｓ）。

ッペルラナ（ｔｕｂｅｌｌａｎａ）　、　　）レマトー
ダ（ｔｒｅｍａｔｏ−ｄａ）およびセストダ（ｃｅｓｔ
ｏｄａ）綱；ネメルチナ（ｎｅｍｅｒｔ　１ｎａ）門、
アカントセファラ（ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）門
；アシエルミンタ（ａｓｃｈｅｌｍｉｎｔｌｅｓ）門、
ロチヘラ（ｒｏｔｉｆｅｒａ）、　ガストロトリ力（ｇ
ａｓｔｒｏｔｒ　１ｃｈ−ａ）、キノリンカ（ｋｉｎｏ
ｒｈｙｎｃｈａ）、ブリアプラダ＜ｐｒｉａｐｕｌｉｄ
ａ）、ネマトーダ（ｎｅ＋ｎａｔｏｄａ）およびネマト
モルフｙ　（ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）属；エントプ
ロクタ（ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）門；エクトブロクタ（
ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）門、ギムル−マタ（ｇｙｍｎｏ
ｌａｅｍａｔａ）およびフィラクトレ７−タ（ｐｈｙｌ
ａｃｔｏｌａｅｍａｔａ）　ｉ！；　７オロニダ（ｐｈ
ｏｒｏｎｉ−ｄａ）門；ブラチオポダ（ｂｒａｃｉｏｐ
ｏｄａ）門、イナルテクラタ（ｉｎａｒｔｉｃｕｌａｔ
ａ）およびアルチクラータ（ａｒｔｉｃｕｌａｔａ）綱
；モルスカ軟体動物（ｍｏ　Ｉ　］　ｕｓｃａ）門、Ｔ
ムフィニューラ（ａｍｐｈ　１ｎｅｕｒａ）　、モノプ
ラコフォラ（ｍｏｎｏｐｌａｃｏｐｈｏｒａ）　、ガス
トロトリ力（ｇａｓｔｒｏｐｏｄ−ａ）、スカフォボー
ダ（ｓｃａｐｈｏｐｏｄａ）　、ペレサイボーダ（ｐｅ
ｌｅｃｙｐｏｄａ）およびセファ０ポーダ（ｃｅｐｈａ
ｌｏｐ。

ｄａ）綱；シプンクラダ（ｓｉｐｕｎｃｕｌｉｄａ）門
；エテウリーダ（ｅｃｈｉｕｒｉｃｌａ）門、アイ・ラ
ダ（ａｎｎｅｌｉｄａ）門。

ポリケータ（ｐｏｌｙｃｈａｅｔａ）　、　　オリゴケ
ータ（ｏｌ　ｉｇｏｃｈ−ａｅｔａ）およびヒルデイネ
ア（ｈｉｒｕｃｌｉｎｅａ）　１！Ｉ；オニコフォラ（
ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）門；タルデイグラダ（ｔａｒ
ｄｉｇｒａｄａ）門；ペンタ−ストイミダ（ｐｅｎｔａ
ｓｔｏｉｍｉｄａ）門；アルソロポーダ（ａｒｔｈｒｏ
ｐｏｄａ）門ニトリロビータ（ｔｒｙｌｏｂｉｔａ）門
、ケリセラータ（ｃｈｅｌ　１ｃｅｒａｔａ）豆量、キ
フォスラ（ｘｉｐｈｏｓｕｒａ）　、アラキミダ（ａｒ
ａ−ｃｈｍｉｃｌａ）　、　　ピクノゴミダ（ｐｙｃｎ
ｏｇｏｍｉｄａ）　ｗ４．　マンデブラタ（ｍａｎｄｉ
ｂｕｌａｔａ）豆量、クルスタエ（ｃｒｕｓｔａｃｅａ
）　、チロポダ（ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）　、デイブロボ
ーダ（ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）　、ポロボーダ（ｐａｕｒ
ｏｐｏｄａ）　、　シンフィラ（ｓｙｍｐｈｙｌａ）綱
、コレンボラ（ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）、プロチュラ（
ｐｒｏｔｕｒａ）　、ディブルラ（ｄｉｐｌｕｒａ）　
、チサヌラ（ｔｈｙｓａｎｕｒａ）　、　エフエメラダ
（ｅｐｈｅｍｅｒ　１ｄａ）　。

オドナタ（ｏｄｏｎａｔａ）　、オルドブテラ（ｏｒｔ
ｈｏｐｔｅｒａ）　。

デルマプテラ（ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、　ｘンビニア
（ｅｍｂｉａｎｉａ）プレコブテラ（ｐｌｅｃｏｐｔｅ
ｒａ）　、ゾラブテラ（ｚｏｒａｐｔｅｒａ）　、コロ
デンティア（ｃｏｒｒｏｄｅｎｔｉａ）　、マルロファ
ガ（ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、アノプルラ（ａｎｏｐｌ
ｕｒａ）、チサスノブテラ（ｔｈｙｓａｓｎｏｐｔｅｒ
ａ）　、　ヘミブテラ（ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）　、　ノ
イロプテラ（ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、　　コレオプテ
ラ（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）　、　　ヒメノブテラ（ｈ
ｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）　。

メコブテラ（ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）　、　　シホナブテ
ラ（ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）　、デプテラ（ｄｉｐ
ｔｅｒａ）　、　　）リコブテラ（ｔｒｉｃｈｏｐｔｅ
ｒａ）およびレピドプテラ（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）
目の昆虫類；デンテロストミア（Ｄｅｎｔｅｒｏｓｔｏ
ｍｉａ）部門の動物、ケトグナタ（ｃｈａｅｔｏｇｎａ
ｔｈａ）門、エチノデルマタ（ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａ
ｔａ）門、クリノイデア（ｃｒｉｎｏｉｄｅａ）　、ア
ステロデア（ａｓｔｅｒｏｄｅａ）　、オフィウロイデ
ア（ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅａ）　、エチノイデア（ｅｃ
ｈｉｎｏｉ−ｄｅａ）、およびホロッロイデア（ｈｏｌ
ｏｔｕｒｏｉｄｅａ）１ｊＡ。

ボゴノフオラ（ｐｏｇｏｎｏｐｈｏｒａ）門、ヘミコロ
データ（ｈｅｍｉｃｈｏｒｄａｔａ）門、エンテロツイ
スタ（ｅｎｔｅｒｏｐｎｅｕｓｔａ）およびブテロブラ
ンキア（ｐｔｅｒｏｂｒａｎｃｈ　ｉａ）綱ニコルデー
タ（ｃｈｏｒｄａｔａ）門、ウロコルデータ（ｕｒｏｃ
ｈｏｒｄａｔａ）豆量、アシデアシエ（ａｓｃｉｄｉａ
ｃｉａｅ）。

タリアセエア（ｔｈａｌｉａｃｅａｅ）、　　ラルバセ
ア（Ｉ　ａｒｖａｃｅａ）綱；セファロコルデータ（ｃ
ｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｃｌａｔａ）豆量。

ベルテブラータ（ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ）豆量、アグナ
タ（ａｇｎ−ａｔｈａ）、　：］ンドリキチ’Ｌ　（ｃ
ｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｅｓ）、オステキテス（ｏｓｔ
ｅｉｃｈｔｈｙｅｓ）、サ−／　コティジ（ｓａｃｃｏ
ｐｔｅｉ−ｙｇｉｉ）型網、クロソブテリジ（ｃｒｏｓ
ｓｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）およびディブノイ（ｄｉｐｎｏ
ｉ）目、アンフィビア（ａｍｐｈｉ−ｂｉａ）、　　レ
ピチリア（ｒｅｐｉｔｉｌｉａ）　、　　アベス（ａｖ
ｅｓ）Ｊよびマンマリア（ｍａｍｍａｌｉａ）＊、　プ
ロトチリア（ｐｒ。

ｔｏｔｈｅｒｉａ）型網、テリア（ｔｈｅｒｉａ）型網
、マルサビアリス（ｍａｒｓｕｐｉａｌｉｓ）　、　イ
ンセフティボラ（ｉｎｓｅｃｔｉｖｏｒａ）、デルモプ
テラ（ｄｅｒｍｏｐｔｅｒａ）　、　チロプテラ（ｃｈ
　１ｒｏｐｔｅｒａ）　、ブリマチス（ｐｒ　ｉｍａｔ
ｅｓ）　、　エデタタ（ｅｄｅｎｔａｔａ）、　　フォ
リドータ（ｐｈｏｌｉｄｏｔａ）　、　　ラボモルフ７
　（Ｉａｇｏｍｏｒｐｈａ）、　　ｏデンティア（ｒｏ
ｄｅｎｔ　ｉａ）　。

セタセエ（ｃｅｔａｃｅａｅ）　、カルニボラ（ｃａｒ
ｎｉｖｏｒａ）　。

ソブリデンタータ（ｔｕｂｕｌｉｃｌｅｎｔａｔａ）　
、　プロポジデア（ｐｒｏｂｏｓｉｃｄｅａ）　、　　
ヒラコイデア（ｈｙｒａｃｏｉｄｅａ）　。

シレニア（ｓｉｒｅｎｉａ）　、ベリソダクチラ（ｐｅ
ｒ　１ｓｓｏｄａ−ｃｔｙｌａ）およびアルチオダチラ
（ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）目を挙げることができる
。目の下にはまだ科、族、属、種および亜種まであり、
亜種外の分類群、株又は個体があることが知られている
。更に、細胞分類群、及び菌株又は個体がある。その上
、培養細胞（植物又は動物）も、ウィールスと同様同定
することができる。これらの分類はこの出願において説
明的目的のためにのみ用いられ、限定的に使用されるも
のでない。同定する有機体は既知のものでも未知のもの
でもよいが最も普通には未知のものである。

機能的には、本発明の目的のためにはすべての有機体を
真核細胞群と前核細胞群に分けるのが便利である。前核
有機体であると同定された場合には、エンドヌクレアー
ゼ消化にかけられるＤＮＡは細胞の中、又は区画されて
いない染色体中に存在するものである。真核有機体と同
定された場合には、核ＤＮＡ又は小器官内ＤＮＡ　（糸
粒体ｆｌＮＡ又は葉緑体ＤＮＡ　）を用い、同様にエン
ドヌクレアーゼ消化を行えばよい。

簡単に言うと、ｒＲＮＡ遺伝子配列、多分種レベル以下
の分類又は亜種以下の小分類（ｉｎｆ　ｒａｓｕｂｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ　５ｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）を作り出すた
めに用いることができる配列を分析するために、高分子
量ＤＮＡおよび／又は小環状ＤＮＡが有機体から分離さ
れ同定されるのである。ＤＮＡは当業者には周知の方法
により抽出される。ＤＮＡを制限酵素によって特殊の部
位で切り、断片とする。この断片をゲル電気泳動法のよ
うな標準クロマトグラフ系で、大きさによって分ける。

そのゲルを、当業者が周知の方法で、染色し、大きさが
既知の断片で作った標準曲線を用いて、断片の大きさに
ついて標準化する。

次いで分離した断片をサウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）
のスポット法（Ｓｏｕｔｈｉ、　　Ｂ、Ｍ、　ｒＪｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　
Ｊ　、　３８：５０３−５１７（１９７５）、　ここに
参照として挿入されている）により、亜硝酸セルローズ
紙に移し、加熱によりそこに共有結合させる。ｒＲＮＡ
遺伝子配列を含む断片はそれから、ｒＲＮＡ情報を含む
核酸プローブとハイブリッド化する能力によって、位置
が定められる。核酸プローブは、非放射性物質で標識化
されるか、又は、好ましくは放射性物質で標識化される
。放射性物質で標識化する場合、プローブはリポソーム
ＲＮ＾（ｒＲＮＡ）でもよいし、逆転写によって合成さ
れるか、例えば切り込み翻訳（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ）によって標識化され得るクローン断片上に
含まれる、リポソームＲＮＡに相補的な放射性標識化Ｄ
ＮＡ（ｒＲＮＡｃＤＮ＾）でもよい。

プローブは、後で見るように任意に選ばれた有機体から
得る。−度ハイブリッド化がおこったら、ハイブリッド
を形成した断片は、二重鎖の核酸を選択的に検出するこ
とにより検出するか（非放射性標識化プローブ）、又は
例えばラジオオートグラフ法によって目に見えるように
する（放射性標識化プローブ）。ハイブリッドを形成し
た各断片の大きさは、既述の標準曲線を用いて、移動距
離から決められる。ハイブリッド化量、ハイブリッド化
パターン、ハイブリッドを形成した断片の大きさが個々
に、又は組み合わせて有機体を同定するのに使用される
。

このハイブリッド化からあられれるパターンは、少くと
も二個、さもなければ多数の既知の標準有機体、属又は
種から得られた同等のクロマトグラフパターンと容易に
比較できる。予備的な広い分類が（例えば古典的分類法
を用いて）既に行われた後で、視覚による検査および適
当なりロマトグラフパターンとの照合により、核酸断片
の大きさの比較により、バンド強度（ハイブリッド化量
）により、又はこれらを組み合わせることによって比較
をおこなうことができる。理想的にはポイントーオブー
セール（ｐａｉｎｔ　−ｏｆ　−５ａｌｅ）処理に用い
られるような、−次元コンピューターパターン認識装置
によって比較するのがよい。

発明者は前記の方法を用いる時は、同じ種の有機体のク
ロマトグラフパターンは非常に似ており、わずかな差は
、菌株の変化による亜種間の差にとどまるが、種間の差
および態量の差（そしてもっと高レベルの分類において
も）は非常に大きい。

成る一つの種の株間において酵素−特異的断片の変異の
あることを利用して、種々の目的、例えば細菌の場合、
疫学的目的のために株をタイプ分けすることもできる。

実際、制限酵素は種内の株を区別することができるもの
を選ぶことができる。

本研究に用いられる「プローブ有機体」　くそしでそれ
から核酸プローブが得られる）は、上に挙げた有機体の
どれでもよく、真核有機体でも前核有機体でもよい。唯
一の制限は、ｒＲＮＡ−含有プローブが、未知有機体の
ＤＮへのエンドヌクレアーゼ消化物と最大にハイブリッ
ド化しなければならない、という事実によって与えられ
る。

リポソームＲＮＡ情報−含有プローブに４種類ある： ｌ）　前核リポソームプローブ（特に細菌から得られた
ｒＲＮＡ）　、２）　　真核糸粒体リポソームプローブ
、３）真核葉緑体リポソームプローブ、４）真核非−小
器官性すポソームブローブ。

ＤＮＡ　（エンドヌクレアーゼで消化される）の出所も
４種類ある： ｌ）　前核細胞ＤＮＡ、２）　　真核糸粒体ＤＮ＾、３
）真核葉緑体ＤＮＡ　、４）　　真核細胞核ＯＮ＾。

斯くして次のハイブリッド代表が作られた（第１表）。

第１表 真核糸粒体　　　　　十 （Ｅｕ、　”’　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）＋ ＋ 真核葉緑体 （Ｂｕ、　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ） ＋ ＋ ＋ 注（１）　　Ｂｕ、＝真核細胞 （２）＝効果のより小さいハイブリッド化後記実施例４
参照 表は、リポソームＲＮＡプローブが未知の有機体体の［
１ｌｌＡと最大にハイブリッド形成することができるこ
とを示している。例えば、成る真核有機体を同定するた
めには、種−特異的糸粒体又は葉緑体ＤＮＡを抽出し、
それをエンドヌクレアーゼで消化し、この消化物を前核
リポソームＲＮＡプローブか又は小器官から抽出した真
核リポソームプローブとハイブリッド化すればよい。同
様にして、前核有機体を同定するためには、種−特異的
細胞ＤＮＡを抽出し、エンドヌクレアーゼでこれを消化
し、消化物を前核リポソームＲＮＡプローブ又は小器官
から抽出した真核リポソームＲＮＡプローブとハイブリ
ッド化すればよい。又、種−特異的核ＤＮＡを抽出、消
化し、これを非−小器官性の真核リポソームプローブと
ハイブリッド化することによっても、真核有機体を同定
することができる。

真核細胞は、核、糸粒体、又は若干の場合では葉緑体系
の中の一つ又は何らかの組み合わせによって定めること
ができた。これらの交叉ハイブリッド化は、前に述べた
、真核小器官から抽出したｒＲＮＡ核酸は、前核ｒＲＮ
Ａ核酸と広い相同性をもっているが、核−抽出真核ＤＮ
Ａと、前核ＤＮＡとの間では当該相同性はそのように広
くは存在しないという事実に基づいている。

要約すれば、遺伝暗号は普遍的であるが故に、すべての
細胞（真核細胞又は前核細胞）は暗号情報を蛋白質に翻
訳するためにリポソームを必要とするが故に、そしてリ
ポソームＲＮＡは高度に保存されているが故に、交叉−
ハイブリッド形成要素（第１表中の“＋”）間には十分
な相同性が存在し、この方法が有効であることが保証さ
れる。

消化すべきＤＮＡおよびこれに付随するリポソームプロ
ーブの対の選択は任意であり、同定するべき有機体によ
るであろう。即ちそれは問われた問題によるだろう。例
えば、感染物質を検出し、同定する目的で、真核細胞（
例えば動物又は植物）中に存在する前核細胞の種（例え
ば細菌）を検出する場合は、前核リポソームプローブを
選び、小器官由来のＤＮＡは抽出されないか、最小限量
抽出される条件で処理すればよい。このやり方を用いれ
ば、小器官由来のＤＮＡと前核ＤＮＡとの干渉は最小で
あると確信することができる。真核種（それは前核細胞
によっては感染されない）を前核リポソームプローブで
同定する場合、例えば核から小器官を分離し、次いで小
器官のＤＮＡのみを抽出するというようにして、小器官
由来のＯＮへの濃度を最大にするのが最も良い。前核有
機体の感染を受けた真核有機体を同定したい場合は、非
−小器官、非−前核細胞由来のリポソームプローブを用
いるのが最良である。なぜならばこのリポソームプロー
ブは前核細胞からのＤＮＡとは十分にハイブリッドを形
成しないからである。

同じ界、又は同じ亜界、又は同じ部門、又は同じ門、又
は同じ面間、又は同じ綱、又は同じ型網、又は同じ目、
又は同じ科、又は同じ族、又は同じ属からの一対（ＤＮ
Ａ　＃よびリポソームプローブ）を用いるのが好ましい
。前核ＯＮ＾とハイブリッドを形成させるためには前核
細胞リポソームプローブ（例えば細菌のリポソームプロ
ーブ）を用いるのが特に好ましい。このやり方で、前核
有機体の属、種および株を検出し、定量し、そして同定
することができるだろう。最も好ましい前核リポソーム
プローブの１つは細菌から得られるもので、その中でも
特に、使い易い、手に入り易いという点で大腸菌からの
ものがよい。大腸菌から得たリポソームプローブは、い
かなる有機体にも、特にすべての前核有機体の同定に用
いることができ、細菌のあらゆる属、種および菌株の同
定のために最も好ましい。他の、特に好ましい実施態様
は、成る与えられた科に由来する真核リポソームプロー
ブを用いて、同じ科の真核細胞有機体を同定することで
ある（例えば哺乳類有機体を確認するために哺乳類リポ
ソームプローブを用いる）。最も好ましいのは同じ亜科
および／又は目および／又は族の有機体から得たリポソ
ームプローブとＤＮＡを用いることである（例えばマウ
スの成る種を同定する場合には、マウス由来のリポソー
ムプローブを用いるのがよい）。

最も鋭敏で有効な対の系は、リポソームプローブのａ所
と制限ＤＮＡの出所との間が進化的にあまり距離がない
か又は分散がより少い、という系である。

この技術に含まれる個々のステップは一般的に当業者に
は知られている。これからそれらを、真核細胞および前
核細胞（適用できる場合）の両方に言及しつつ、又は技
術的に何らかの相異がある場合には、細胞の各々のタイ
プについて別々に、述べるつもりである。

第一段階は未知有機体からのＤＮへの抽出である。

真核細胞からの核ＯＮ＾は当業者には既知の標準的方法
によって選択的に抽出することができる（例としてＤｒ
ｏｈａｎ、　Ｗ　ｅｔ　ａｌ著、　　ｒＢｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

＾ｃｔａＪ　、　５２Ｈ１９７８）、　１−１５　、　
ニーこには参考文献として挿入されている）。小器官Ｄ
ＮＡは小さくて環状であるからスプーリング（ｓｐｏｏ
ｌｉｎｇ）法が、非環成核ＤＮＡを、環状、小器官由来
のＤＮＡから分離するのに役立つ。結果として、スプー
リングされなかった物質は、小器官由来のＤＮＡを含み
、これは密度勾配遠心法によって個々に分離することが
できる。もう一つの方法として、糸粒体（又は葉緑体）
を、打ち砕いた細胞の混合物から分離し、精製した糸粒
体（又は葉緑体）フラクションを小器官由来のＤＮＡの
調製に用い、精製した核フラクションを核ＤＮＡの調製
に用いる。（例えばＢｏｎｅｎ　Ｌ。

ａｎｃｌ　　Ｇｒａｙ　　Ｍ、ｌｌｌ著　ｒＮｕｃｌｅ
ｉｃ　　八ｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃＪ　　８　　：
３１９−３３５　（１９８０）参照）。

前核［］ＮＡ抽出も当業者には良く知られている。

例えば、工業的発酵懸濁液、寒天培地、植物又は動物組
織又は試料その他のような媒質中に存在する未知の細菌
を、高分子量ＤＮＡを抽出するように設定された周知の
条件下で処理する。例えば、未知の有機体の細胞を抽出
緩衝液に懸濁し、リゾチームをこれに加え、この懸濁液
をインキュベートする。細胞破壊は、洗浄剤の添加およ
び／又は温度上昇によって一層促進することができる。

プロテアーゼ消化後りロロホルム／フェノール抽出およ
びエタノール沈澱を行ないＤＮＡの抽出は完了する。フ
ェノール／クロロホルム抽出よりずっと早いもう一つの
抽出法は、エタノール沈澱を用いてＤＮＡを速やかに分
離する方法である。この方法はＤＮＡを直接コロニー又
は少量の液体培地から分離するたとに好んで使われる。

この方法はＤａｖｉｓ。

Ｒ，Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、著「＾Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　
ＧｅｎｅｔｉｃＢｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、＾ｄｖａｎｃ
ｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（今後
は「デービス」と記す）　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ研究所、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　、　　ニューヨーク、　１９８０．　ｐ、１２
０−１２１に記載されている。

ＤＮＡ　（前核細胞又は真核細胞の（核又は核以外の）
）は次の段階のために生理的Ｍ衡液に溶解される。

抽出されたＯＮへの消化は制限エンドヌクレアーゼ酵素
で行う。どんな制限エンドヌクレアーゼ酵素でも用いる
ことができるが、勿論確認しようとするものと同じ種の
有機体から得たものでないならば、という条件がつく。

なぜならば、もしこの条件に反する場合は、ＤＮＡは完
全無傷のまま残るであろうから（このことが、結局は有
機体を同定することになるだろう。なぜならば酵素がそ
れ自身の起源である種から得られたＤＮＡを切断すると
は思われないからである）。特徴づけるべき有機体種は
未知であろうから、断片の消化物を得るには最少量の試
行錯誤が課されるが、これは熟練した当業者が不必要な
実験を行わずに日常的に実行できる程度の仕事である。

可能性のある制限エンドヌクレアーゼ酵素の例は、Ｂｇ
ｌ　　Ｉ、　Ｂａｍ）Ｉ　　Ｉ。

ＥｃｏＲＬ　Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｈｉｎｄ　　ｍ、　Ｂａｌ
　　Ｌ　Ｈｇａ　Ｉ。

Ｓａｌ　　Ｉ、　Ｘｂａ　ｒ、　Ｓａｃ　Ｉ、　５ｓｔ
−Ｔ、　Ｂｃｌ　　Ｉ、Ｘｈ。

１、　Ｋｐｎ　Ｉ、　Ｐｖｕ　Ｉ［、Ｓａｕ　ｍａ、そ
の他である。

デービス、同上、　ｐ、　２２８−２３０もみよ。一種
類以上のエンドヌクレアーゼ混合物も消化のだ於に用い
ることができる。普通は、ＤＮＡとエンドヌクレアーゼ
は適当な緩衝液中で一緒に、適当な時間（１〜４８時間
の範囲内、温度範囲は２５℃−６５℃で、好ましくは３
７℃）インキュベートする。

その結果得られたクロマトグラフパターンは、用いた１
又はそれ以上のエンドヌクレアーゼのタイプに依存する
だろうし、エンドヌクレアーゼに特異的であるだろう。

従って消化のためにどの酵素（１種類か又は数種類）を
用いたかに注意する必要がある。なぜならば、カタログ
に用いられる比較用パターンは、同じ酵素又は酵素類を
用いて作られていなければならないからである。

エンドヌクレアーゼ消化後、種々の大きさの断片を含む
インキニベーション混合物は適当なりロフトグラフィー
法によって分離される。核酸消化物を大きさによって分
離することができて、その後の核酸プローブとのハイブ
リッド化を可能とする方法ならなんでも用いることがで
きる。好ましいのはゲル電気泳動法であり、特に好まし
いのは、アガロース・ゲル電気泳動法である。この装置
では、ＤＮＡ消化物は、普通は適当な！ｌ［？液中で電
気泳動にかけられ、ゲルは普通は、臭化エチジウム溶液
に浸され、多分加えられる標準マーカー断片が見えるよ
うにするためにＵＶ−光一箱に置かれる。

分離し、目で見えるようにした後、そのＤＮＡ断片をサ
ウザーン法によりニトロセルローズ濾紙に移す（ｒＪｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙｊ　３８：５０３５１７（１９７５））。この移し換
えは、変性および中和段階後に行うことができ、普通は
長時間かけ（約１０−２０時間）るか又は電気的力をか
けて、ゲルから濾紙へと移される。ゲルから濾紙への移
動を促進する機器は市販されている。受けとったニトロ
セルローズ濾紙は次いでＤＮＡを濾紙に結合するため高
温（６０−８０℃）で数時間加熱される。濾紙に結合し
たＤＮＡ消化断片のハイブリッド化に利用されるプロー
ブは、核酸プローブであり、成る与えられたよくわかっ
ている有機体から得られたものであることが望ましい。

それは検出可能なように標識化されているか、又は標識
化されていないかのどちらかであるが、検出可能なよう
に標識化さされているものが望ましい。この場合には、
核酸プローブは、そのような有機体から得られた検出可
能な標識化リポソームＤＮＡ（ｒＲＮＡ）、リポソーム
情報を含む切り込み翻訳標識化ＤＮＡプローブ、リポソ
ーム情報を含むクローンＤＮＡプローブ又はプローブ有
機体からのリポソームＲＮ＾に相補的である検出可能な
標識化ＤＮＡ　ｂＲＮＡｃＤＮ＾）のいずれかである。

組合せの選択によって、リポソームプローブは前核細胞
からのものでも真核細胞（細胞質由来、又は小器官出来
）からのものでもよい。最も好ましいのは、検出可能な
標識が放射性燐のような放射性標識であることである（
例、”Ｐ、　　３Ｈ又は１４Ｃ）。核酸プローブは金属
原子で標識化してもよい。例えば、ウリジンおよびシチ
ジンヌクレオチットは共有結合水銀誘導体を形成するこ
とができる。水銀と結合したヌクレオシド・三燐酸は逆
転写酵素を含む多くの核酸ポリメラーゼの良い基質であ
る　（Ｄａｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ＾ｃａｄｅｍｙ
　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ」７０：　２２３ｇ２２４．
２．１９７３）。天然核酸の直接的共有結合による水銀
化が報告された（　Ｄａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　＋’　ｒ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　１４　：　２４４７
−２４５７）。水銀化重合体のリアニーリング（ｒｅａ
ｎｎｅａｌｉｎｇ）性は、対応する水銀のない重合体の
それと似ている　（Ｄａｌｅ　ａｎｄ　Ｗａｒｄ。

ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　１４　：　２４５Ｂ−
２４６９）　ｏ金属標識化プローブは、例えば光−聴音
スペクトロスコピーＸ線スペクトロスコピー、例えばＸ
線蛍光、Ｘ線吸収又は光子スペクトロスコピーによって
検出することができる。

真核細胞および前核細胞からのｒＲＮＡの分離は、当業
者にはよく知られている。例えば真核細胞質リポソーム
からｒＲＮＡを調製するためには、ＲＮＡを全細胞又は
リポソームから抽圧し、スクロース勾配遠心法により分
離することができ、１８Ｓ型および２ＢＳ型フラクシヨ
ンを分子量既知のマーカーを用いて集めることができる
（例えばＰｅｒｒｙ、　Ｒ，Ｐ。

およびにｅｌｌｙ、　Ｄ、Ｂ、、著「２８Ｓおよび１８
ＳリポソームＲＮＡの生産が少量のアクチノマイシンＤ
によって阻害される時の５Ｓ　ＲＮＡの持続性合成ｊ　
Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、、？２：２３５−２４６（１９６８）
　、ここに参考文献として記されている）。当然の結果
として、小器官由来ｒＲＮＡは、同様な方法で、小器官
フラクションから分離され精製される（例えばＶａｎ　
Ｂｔｔｅｎ　Ｒ，Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、　ｒｃｅｌｌＪ　　２２：１５７−１７
０　（１９８０）、又はＥｄｗａｒｄｓ、に、　ａｔ　
ａｌ、、　ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒ
ｃｈ　Ｊ　。

９　：　２８５３−２８６９（１９８１））。

もし放射性標識化リポソームＲＮＡプローブを用いるな
らば、このものは、適当な放射能をもつ化合物を含んだ
栄養物、又はそのような化合物を含む培養培地中で、生
育又は培養されたプローブ有機体から分離される。プロ
ーブが相補性ＤＮＡである場合（ｒＲＮＡｃＤＮ＾）、
このものは、プローブ有機体から分離されたｒＲＮＡを
放射性ヌクレオシド・三燐酸（例えば３２Ｐ−ヌクレオ
シド又は３Ｈ−ヌクレオシド）の存在下、逆転写するこ
とによって作られる。

標識化リポソームプローブは、又切り込み翻訳ＤＮＡ分
子、特に小器官由来の全環状ＤＮＡから得られたもので
あってもよい。具体的には、葉緑体又は糸粒体の環状Ｄ
ＮＡが、放射性標識の存在下切り込み翻訳されることに
よって標識化ＯＮ＾リポソームプローブが得られる。葉
緑体標識化プローブは、葉緑体ＤＮＡと最も良くハイブ
リッド化し、糸粒体標識化プローブは、糸粒体ＤＮＡと
最も良くハイブリッド化するであろう。葉緑体（又は糸
粒体）の切り込み翻訳標識化リポソームプローブは、糸
粒体（又は葉緑体）　ＤＮＡと２番目に良くハイブリッ
ド化するであろう。それは、あまり好ましくない形では
あるが、全植物（又は動物）のＤＮＡともハイブリッド
化するだろう。リポソームプローブは、実用性を考慮し
た場合はこの方法が良いとはいえないとしても真核細胞
の核ＤＮＡからも切り込み翻訳によって得られるかも知
れない。これを実現するより有用なアプローチは、真核
細胞の核ＤＮＡからｒＲＮＡ遺伝子を切りとり（制限酵
素により）、断片を分け、リポソーム遺伝子配列を同定
しくハイブリッド化によって）、そしてそのリポソーム
遺伝子配列を分離する（電気泳動法によって）ことであ
る。次いで分離したｒＲＮＡＲＮＡプラスミド又はベク
ターに再結合され、適当な宿主の形質転換（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）後Ｑ２ｐ−含有媒質中でクローニ
ングを行えばよい。もう一つの方法は、形質転換宿主を
増殖し、次いでＤＮＡを分離し、切り込み翻訳によって
それを標識化するか、又はＤＮＡを分離し、ｒＲＮＡ配
列を切りとり、次いでＭＡ識化する。

得られたリポソームプローブはｒＲＮＡｃＤＮ＾と同じ
状態でハイブリッド化する（後記参照）。

好ましい核酸プローブは、プローブ有機体からのｒＲＮ
Ａに相補的な、放射性標識化ＤＮＡである。具体的には
、ｒＲＮＡはプローブ有機体からリポソームを分離し、
個々に分け、そして適したＲＮＡを上述のようにして実
質的に精製する。斯くして得られたリポソームＲＮＡは
、リポソームを含まず、運搬ＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）。又
は伝達ＲＮ＾（＋ＩＩＲＮＡ）のような他のＲＮＡもほ
とんど含まない。前核細胞ｒＲＮＡは普通は３種類のサ
ブグループを含む。いわゆる５Ｓ、　１６Ｓ。

および２３Ｓ−断片である。ｃＤＮＡへの逆転写は３種
類すべての混合物で行われるか、さもなければ１６Ｓお
よび２３Ｓ断片の混合物で行われる。これら成分のうち
一つだけで逆転写を行うのは、成る状態では可能である
とはいえ、あまり好ましくはない。

真核ｒＲＮＡは、普通は２種類のサブグループ、１８Ｓ
型および２ＢＳ型を含む。そしてｃＤＮＡへの逆転写は
１８Ｓおよび２８Ｓ断片の混合物か、これらの中の各々
によって行われる。

他の種類のＲＮＡをほとんど含まない純粋のｒＲＮＡを
、ｃＤＮＡに逆転写することのできる逆転写酵素と共に
インキュベートする。この場合より好ましいのは、分生
甲状腺ＤＮＡ加水分解物のようなブライマーの存在下に
おいて、鳥骨髄芽球症つイールス（＾ＭＶ）からの逆転
写酵素とインキュベートすることである。混合物は適当
なデオキシヌクレオシド三燐酸を含んでいなければなら
ず、そのヌクレオシドのうち少くとも一つは、例えば３
２Ｐによって、放射性標識化されている。例えば、デオ
キシアデン５’　−（３２Ｐ）　、デオキシチミジン５
′（３２Ｐ）　、デオキシアデニン５’　−（”Ｐ）　
、又はデオキシグアニジン５’　−（３２Ｐ）　　・三
燐酸がＭ対性ヌクレオシドとして用いられる。３０分〜
５時間、２５℃−４０℃でインキュベートシ、クロロホ
ルムおよびフェノールによる抽出および遠心分離並びに
クロマトグラフィー後、放射性標識化フラクションを合
一し、ｃＤＮＡプローブとする。実質的には純粋な型の
放射性標識化ｃＤＮＡブローフ、即ち非標識化分子がな
く、他の型のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡもなく、蛋白性
物質もなく、膜、小器官等の細胞成分もない放射性標識
化ｃＤＮ＾ＤＮＡブも、本発明の一面を構成する。好ま
しいプローブは前核細胞の標識化ｒＲＮＡｃＤＮＡで、
最も好ましいのは細菌の標識化ｒＲＮＡｃＤＮＡである
。プローブの種は、細菌性微生物、例えばエンテロバク
テリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　１ａｃｅａｅ
）、プルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）　、ハエモフィルス（Ｈａｅ＋ｎｏｐｈｉｌｌｕｓ
）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ネイセリア（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ）　、バタトロイデス（Ｂａｃｔｒｏ　１
ｄｅｓ）科に含まれる種、およびその他の嫌気性群、例
えばレジオネラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）等が使われる
。本出願において前核細胞の実施例は、細菌性前核プロ
ーブ有機体としての大腸菌の使用に限られているとはい
え、決してこの微生物に限られるものではない。

プローブとして放射性標識化型のｃＤＮＡの使用は、Ｄ
ＮＡのハイブリッド化中の安定性がより大きいので放射
性標識化リポソームＲＮ＾の使用より好ましい。

標識化ｃＤＮＡプローブがｒＲＮＡの忠実なコピーでな
ければならないこと、即ち合成が行われるあらゆる時に
鋳型ｒＲＮＡの全ヌクレオタイド配列が転写されたもの
であることを認識することが重要である。

ブライマーの使用はこの点で必須である。ｃＤＮＡが忠
実なコピーであるということは、ハイブリッド化後にこ
れが二つの特性をもっているという事実によって証明す
ることができる： Ｌ　　ｃＤＮＡは標識化ｒＲＮＡの１００％をリボヌク
レアーゼ消化から保護しなければならない：そして２、
標識化ｃＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼに対する抵抗によ
ってわかるように、ｒＲＮＡに特異的にアニールしなけ
ればならない。

ペルジャンスキーＭ、　Ｍ、らのｒ　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ
、　５ｃＰａｒｉｓ　Ｊ　ｔ２８６．　　シリーズＤ、
、　ｐ、１Ｂ２５−１８２８（１９７８）には大腸菌ｒ
ＲＮＡに出来する３Ｈ−放射性標識化ｃＤＮＡについて
記載されている。この研究におけるｃＤＮＡは、本発明
のようにブライマーの存在下逆転写酵素で調製したもの
ではなく、リボヌクレアーゼＵ２を用いてあらかじめ分
割しておいたｒＲＮＡを鋳型として用いＤＮＡポリメラ
ーゼ■で調製したものである。ペルジャンスキーらのｒ
ＲＮＡ消化産物（ＲＮＡｓｅ　Ｌ１２による）は、最初
のｒＲＮＡと異なる塩基比を有し、塩基および／又は短
かい断片が失なわれたことを示している。このようにし
て得られたｃＤＮ＾は忠実なコピーではない。その上ペ
ルジャンスキーが用いたＤＮＡポリメラーゼ■の使用は
、ｒＲＮＡのへテロ重合転写に対するホモ重合転写の優
位に拍車をかけることが知られている（参照、５ａｒｉ
ｎ　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　Ｊ　、　５９：２０２−２１４（１９７４
））。

これらをまとめると、「リポソーム」プローブは、ａ）
　　ｒＲＮＡ遺伝子を含むゲノムＤＮＡから、クロニン
グおよび／又は切り込み翻訳によって、ｂ）リポソーム
ＲＮ＾それ自身から、又はｃ）　ｒＲＮＡｃ、ＤＮＡか
ら、ｒＲＮＡの逆転写によって得られる。

本発明工程の次の段階は、未知有機体からの分離ＤＮＡ
消化物の、標識化していないか又は（好ましくは）放射
性標識化したｒＲＮＡ又はｃＤＮＡプローブとのハイブ
リッド化である。ハイブリッド化は未知有機体からの共
有結合的に標識化されたＤＮＡ消化物を含有する紙を、
リポソームプローブを含むハイブリッド化混合物と接触
することによって行われる。インキユベーションは加温
下（５０−７０℃）長時間かけて行い、その後、濾紙を
洗って結合していない散財能を除去しく必要な場合）、
次いで空気乾燥し、検出の用意をする。もう一つの、上
記方法より遥かに迅速にできる、非常に好ましいハイブ
リッド化は、コーンＤ、Ｅ　（Ｋｏｈｎｅ、　Ｄ、Ｅ）
らのｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　１６　：　５３２
９−５３４１（１９７７）に参考文献として記載の、室
温フェノール乳濁液再封合法である。

ハイブリッド化後、この方法では適当にハイブリッド形
成した断片の選択的検出が必要である。

この検出は、ハイブリッド形成した断片が二重鎖構造で
あることを利用し、これによる選択的方法（非［ｍ化プ
ローブの場合）、ラジオオートグラフ法又はコンピュー
ター化されていてもされていなくてもよく、これにより
検出スピードを増すのであろう適当な放射線スキャナー
法（標識化プローブの場合）によって行うことができる
。これらの方法は熟練した当業者にはよく知られており
、この点でこれ以上記すことはないだろう。

この方法の最終産物は、特定の位置に種々の強度の明お
よび暗領域をもったクロマトグラフ帯パターンである。

これらの位置はＢｃｏＲＩ消化λバクテリオファージＤ
ＮＡのようなマーカーの分離法にかけることによって、
特定の断片サイズ（キ四ベース対）に容易に照合させる
ことができる。このようにして帯相互の相対的位置も多
帯の絶対的大きさも容易に確かめることができる。未知
有機体の帯パターンをカタログ又はライブラリーにある
帯パターンと比較する。カタログ又はライブラリーには
少くとも２から、はとんど無限といってよい程の数の確
足せる種々の有機体の属および種のパターンを掲載する
本からなっていても良い。例えば人の病気を発生させる
病理学的に関係のある最近は約１００と推定され、その
ため、病原細菌の標準カタログは５０〜１５０のそのよ
うなパターンを含むだろうと推定される。疫学的判定シ
ステムのための細菌菌株の型のカタログもまた含まれて
いても良い。

箒パターンは用いたエンドヌクレアーゼ酵素のタイプ又
はタイプ群に依存し、多分放射性標識化プローブの出所
（プローブ有機体）として用いられた特定の有機体に、
モして又プローブ調製のだ約に利用したリポソームＲＮ
Ａ情報の組成（例えば前核細胞の５Ｓ、　１６５又は２
３Ｓ型サブタイプか、１６Ｓおよび２３Ｓ型のみか等）
に依存するだろう。

こうして、カタログは各プローブ毎に、記録された帯サ
イズおよび相対的強度をもった、種々の酵素−特異的帯
パターンを含むかも知れない。濾紙に結合した結合ＯＮ
＾の濃度が減るにつれて、最も強い帯のみが見えるよう
になり、この又はこれらの帯のサイズで種を確認するこ
とができる。これら帯パターンの一つずつは、それぞれ
に完全なリポソームＲＮＡで得られる帯パターンおよび
／又は成るサブタイプのみを含むリポソームＲＮ＾で得
られる帯パターンを含むかも知れない。叙上の変化又は
順列は、勿論、全てライブラリーに利用される。その上
真核有機体につい“ては、ライブラリーは一つのタイプ
のＤＮＡ　、又は小器官および／又は核−ＤＮＡの組み
合わせを用いることにより生じる諸パターンを含むかも
知れない。各ＤＮＡ消化物のパターンは、プローブ組成
に依るであろう。カタログは、もし１種類以上の株又は
種が、抽出サンプル中に存在していて、プローブによっ
て検出される場合、それから生ずるパターンを解釈でき
るように整理されている。

ユーザーは、得られた帯パターンを視覚的に比較するこ
ともできるし、パターン認識用にプログラムされた一次
元のコンピューター式デジタルスキャナーによっても比
較することもできる。これらのコンピュータースキャナ
ーは、タイムーオブーセール（ｔｉｍｅ　−ｏｆ　−５
ａｌｅ）処理（一般に利用される「スーパーマーケット
」チエツクアウトパターン読みとり装置）の当業者には
よく知られている。理想としては、ライブラリー又はカ
タログは複数の有機体の相対的帯パターンと、断片の分
子量又はサイズの絶対値とでコンピューターメモリーの
中に入っているべきである。そうなれば、カタログ比較
は、貯蔵情報要素の一つ又は両方（相対的パターンおよ
び／又は絶対的サイズ要素）によって、未知のパターン
をライブラリーに存在するパターンの一つと照合するこ
とによって行われる。標準と比較した時の多帯の強度は
、ノ＼イブリッド化した結合ＤＮＡの量をあられすこと
もできるので有機体の存在の程度、例えば真核細胞中の
前核細胞の存在の程度を推定するのに用いることができ
る。

もしもユーザーが与えられた有機体の性質を確認し、同
定を更に進めたいと思うならば、そのようなユーザーは
、未知の有機体を第二の異るエンドヌクレアーゼで消化
し、得られた帯パターンを、二番目に選んだエンドヌク
レアーゼの場合の有機体のカタログ帯パターンと比較す
ればよい。この過程は、正確な同定を行うために必要な
だけ何回も繰返すことができる。しかしながら、普通は
単一プローブで一回分析をすれば大抵の場合は十分であ
る。

本発明およびその変法は無数に応用できる。本発明は植
物栽培者又は動物飼育者が彼等の対象物を正しく確認す
るたｔに用いてもよいし、臨床および微生物学研究室で
、真核細胞も含む何らかの媒体中に存在する細菌、寄生
虫又は菌類を同定するために用いてもよい。この後者の
場合は、この方法は標準微生物検定法として用いられる
。なぜならば微生物の分離および増殖の必要がないから
である。試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）増殖および特徴
づけは、現在、マイコバクテリウム・レプラ（Ｍｙｃｏ
ｂａｃ−ｔｅｒｉｕｎ　Ｉｅｐｒａｅ）　（ライ病の病
原菌）のような若干の微生物にとっては不可能であり、
必常的細胞内細菌（例えばリケッチャ−、グラミジＴ等
）のような若干の微生物は標準培地上では不可能である
か、不可能でなくても非常に危険である（例えばＢ、ア
ントラシス（Ｂ、　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）　　（炭痩病
の病原菌）。本性は核酸の単離に基づいており、それは
従来の細菌分離および特徴づけを行わないから、これら
の問題を排除することができる。この方法はこれまで正
式には記載のなかった微生物を検出することができると
思われる。その上本性は、種の異なる菌株を見分けるこ
とができ、これは、例えば細菌学における疫学的類型化
に役立つ。この方法は犯罪捜査で植物又は動物組織を正
しく、はっきりと同定するために、法医学実験室で用い
ることができる。又作物被害の性質を確かする場合、昆
虫学者が昆虫の種を速かに同定するためにも用いられる
。

更にこの方法を亜種以外の分類群（例えば植物根の窒素
酵素遺伝子：参照：　Ｈｅｎｎｅｃｋｅ　Ｈ２９１ｒＮ
ａｔｕｒｅ」３５４（１９８１＞）の同定と結びつける
ことによって、この方法論は個々の菌株の遺伝子型を調
査し、同定するために用いることができる。

この発明の方法は、微生物が見出されるあらゆる場所で
、微生物の同定に好ましく使用される。

これら微生物は生理学的物質中にも非生理学的物質中に
も見出されるだろう。それらは工業的増殖培養基、培養
肉汁等の中に見出され、そして例えば遠沈法によって濃
縮させられるだろう。微生物が生理学的培地に見出され
るのが好ましいし、それが感染した動物源に見出される
のが最も好ましい。この後者の具体例では不法は動物、
特に好ましいのはヒトにおける細菌感染を診断するのに
用いられる。前核リポソームプローブによる細菌ＤＮＡ
の検出および同定は高度に選択的で、動物（例えば哺乳
類）　ＯＮへの存在においてさえ障害なしにおこなえる
。もし前核リポソームプローブを用いるならば、糸粒体
ＤＮＡとのハイブリッド化を最小にする条件を選ぶか、
糸粒体の帯を当該パターンから差し引くことができる。

このようにしてこの技術は臨床研究室、菌寄託機関、工
業的発酵研究室等において用いることができる。

特に興味深いことは感染微生物の種および菌株の同定に
加えて、微生物の中に何らかの特殊な遺伝子配列の存在
を発見できる可能性のあることである。例えば、薬剤耐
性を仲介する伝達件プラスミツドＲ因子上に見出される
抗生物質耐性配列の存在を検出することができる。標識
化Ｒ因子ＤＮＡ又はクローン標識抗生物質耐性配列をハ
イブリット化混合物に加えることによって、その有機体
の抗生物質耐性の有無を正しく決めることができる（正
規でない一本又は数本の帯があられれる）。

又、加えた抗生物質耐性配列プローブ（１又は数種）の
存在下で一度ハイブリッド化した濾紙を再ハイブリッド
化してもよい。又、別の方法として、未知のＤＮＡを了
りコートに分け、第一のアリコートを同定のだｔに、第
二のアリコートを薬剤耐性配列の存否のために、第三の
アリコートを毒素遺伝子のために用いるというように試
験することもできる。又、別の方法として、−放射線核
種（例えば３２Ｐ）でａｉａ化したリポソームプローブ
を別の放射線核種（例えば３Ｈ又はｌ４ｃ）でＭＡｍ化
したＲ−因子プローブを加えてハイブリッド化混合物中
で用いることもできるだろう。ハイブリッド化後、未知
ＤＮＡ中のＲ−因子ＤＮＡの存在を、二種類のスキャナ
ーによる走査でテストすることができる。一つは種およ
び菌株同定のためであり（例えば”Ｐ）　、他の一つは
薬剤耐性等のためのものである（例えば３Ｈ又はｌ４Ｃ
）。この方法で実験者は、微生物の分離および特徴づけ
をする必要なしに、属および種を同定、菌株をタイプ分
け、薬剤耐性、毒性生産若しくはその他の特性、又は標
識核酸配列若しくはプローブで検出しうる種レベル以下
の分類群のテストのすべてを、一つの実験で行うことが
できる。

Ｒ−因子は普遍的で、種の境界と交差しているので、同
定は、いかなる細菌属又は種においても、同じＲ−因子
プローブで行うことができる（参照：Ｔｏｍｋｉｎｓ、
　Ｌ、Ｓ、　ｅｔａｌ、Ｊ、　　Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、、　
１４１　：　　６２５−６３６　（１９８１）　）。

更に、真核細胞又は前核細胞におけるウィールス又はウ
ィールス関連配列の存在も本発明の方法を結合して検出
および同定することができる。

ｒＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ第三版（発行者Ｌｅｎｎｅｔｔｅ、
　Ｅ、Ｈ，Ａｍｅｒ　Ｓａｃ　Ｍｉｃｒｏｂ　１９８０
゜７７４−７７８）に掲載されているすべてのウィール
スを同定することができる。例えば、ピコルナヴイリデ
（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｃｌａｅ）、カリシヴイリデ
（ｃａｌｉｃｉｖｉｒ−ｉｄａｅ）　、レオヴイリデ（
ｒｅｏｖ　ｉ　ｒ　１ｄａｅ）、トガヴイリデ（ｔｏｇ
ａｖｉｒｉｄａｅ）　、オルトマイコヴイリデ（ｏｒｔ
ｈ。

ｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、バラマイコヴイリデ（ｐａ
ｒａｍｙｘｏｖ　１−ｒｉｄａｅ）、ラブドヴイリデ（
ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）　、レトロヴイリデ（ｒ
ｅｔｒｏｖ　ｉｒ　１ｄａｅ）、アレナヴイリデ（ａｒ
ｅｎａｖ　ｉｒ　１ｄａｅ）、コロナヴイリデ（ｃｏｒ
ｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）ブニアヴイリデ（ｂｕｎｙａｖ
　ｉｒ　１ｄａｅ）、バブオウ゛イリデ（ｐａｒｖｏｖ
ｉｒｉｄａｅ）、パポバヴイリデ（ｐａｐｏｖａｖｉｒ
ｉｄａｅ）アデノヴイリデ（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ
）、ヘルペスヴイリデ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）
　、ヴイドヴイリデ（ｖｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）および
ポキシヴイリデ（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）等。

１）　ウィールス性ゲノムが宿主ＤＮＡに組み込まれて
いる場合（ＤＮＡウィールス例えばバポバヴイリデメン
バー、ＲＮＡウィールス例えばレトロヴイリデメンバー
）は、高分子量ＤＮＡを組織から抽出し、制限酵素によ
って消化する。全体的手順は細菌の場合と同様である。

ウィールス性プローブの選択は、この場合も、求められ
ている課題次第であり、「ブローブウィールス」および
検出すべきウィールス関連配列間の相同性の程度に依存
する。

都合よい配列相同性を得るためには、プローブおよび組
織の配列がウィールスの同じ科属又は種に関係している
ことが必要だろう。保存された配列の程度に加えて、ウ
ィールスゲローブが宿主ＤＮＡのウィールス関連配列と
ハイブリッドを形成するかしないかは、ハイブリッド化
の条件、例えばストリンジェント条件であるかリラック
ス条件であるかによって決まるだろう。ハイブリッド化
の結果は、宿主ＤＮＡに組み込まれたウィールスゲツム
があることを示す一本の帯又は帯パターンであるだろう
。この情報は、発癌の予測に役立つ。クローン化つィー
ルス配列を含む標識化相補性核酸プローブのいずれをも
プローブとすることができる。

ＲＮ＾ウィールスの場合には、例えばウィールスＲＮ＾
を用いて逆転写酵素でＤＮＡを作ることができ、ＯＮ＾
ウィールスの場合には、例えば切り込み翻訳によって標
識化したウィールスＤＮＡを用いることができる。ここ
でも複数のプローブ、特に、異なる標識をしたプローブ
を用いることができる。

同じ一般的特徴がＤＮＡ　＃よびＲＮ＾ウイールスに等
しくあてはまる。ウイールスのゲノムは相対的に小さく
、沈降核酸は遠心分離によって集めるのが好ましい。全
操作を核酸全部を用いて行ってもよいし、種々の操作を
別々に行ってもよい。遠心分離する前に、細胞ＲＮ＾を
スプーリングで、取り除くことにより、ウイールス核酸
を濃縮することができると考えられる。これは、ウィー
ルスゲツムが組み込まれているかどうかを調べるた於に
も用いることができる。

ウィールスゲローブをハイブリッド化するためには、そ
のプローブが未知有機体と同じ科、属又は種であること
が必要だし、少くとも最も好ましい。反応条件、ストリ
ンジェントかりラックスかが、与えられたプローブと関
連性の低いゲノムとがハイブリッドを形成するか否かを
決める。プローブは、標識化されたクローンウイールス
配列であるかも知れないし、完全なゲノム又はその一部
であるかも知れない。

前記したサウザーンに記載の方法は、大きいＤＮＡ断片
（約０．５キロベ一ス以上）を、アルカリ変性後、ニト
ロセルロース紙に移し換えるために有用である。この方
法はＯＮ＾ウィールスの場合には有用で、ＲＮ＾ウィー
ルスの場合には役に立たないかも知れない。ＲＮＡを活
性化セルロース紙（ジアゾベンジルオキシメチル紙）に
移して共有結合で結合させ、そしてこれをＲＮ＾ウィー
ルスのために用いることができる。サウナーン法のトー
ツスによる変法（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、、　ｒＰｒｏｃ
、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、５ｃｉＪ［ＩＳ＾７７：　５２
０１−５２０５（１９８０））は、ＲＮＡおよび小さい
ＤＮＡ断片を、ハイブリッド化のために、ニトロセルロ
ース紙に効率的に移すのに用いることができる。ＲＮＡ
　＃よび小ＤＮ＾断片を、グリオキザールおよびジメチ
ルスルフオキシドで変性し、アガロースゲル中で電気泳
動にかける。この操作で、１００〜２０００ヌクレオタ
イドであるＤＮＡ断片、及びＲＮＡは効率的に移動し、
ハイブリッド孔中ニトロセルロース紙上に残留する。こ
れは、小さいリポソームＤＮＡ断片に対しても有用であ
る。そこで、最も好ましいのは制限酵素によって消化さ
れた標本を分割し、その一部の核酸をグリオキザールで
変性することである。サウザーンおよびトーマス操作法
は、最大量の情報を与えるであろう。

２）　　ＤＮＡウィールスの場合、二重鎖（Ｏ３）ウィ
ールスＤＮＡで制限分析を行うことによって存在するウ
ィールスを同定することができる。単鎖（ＳＳ）ＤＮＡ
ウィールスは種々異る長さのゲノムを有するだろう。ハ
イブリッドを形成するプローブ（配列情報はＤＳ−ＤＮ
Ａに変換され得る）、ハイブリッドを形成した断片のパ
ターンおよび／又は１若しくは複数のサイズはウィール
スの同定に使用できる。

ここでも又、相補性核酸プローブを得る多数の方法があ
る。例えば０Ｓ−ＤＮＡの場合は、切り込み翻訳を用い
ることができ、５Ｓ−ＤＮＡの場合には、ＤＮＡポリメ
ラーゼがｃＤＮＤＮＡのために用いられる。

３）　　ＲＮＡウィールスの場合、ＲＮＡは制限エンド
ヌクレアーゼによって消化されない（配列情報は０３−
ＤＮＡに変換されたかも知れない）。異るＲＮＡウィー
ルスのゲノムは異る大きさをもち、若干のＲＮＡウィー
ルスのゲノムには１分子以上の分子がある。このことに
より、成るプローブ又は合一プローブによって検出され
た塩基配列に沿って、ＲＮＡウィールスを同定すること
ができる。プローブの１例は、ウィールスＲＮＡを用い
て合成したｃＤＮＡである。

標本中の感染性病原菌を探す場合、その標本から核酸を
抽出することにより、又は先づ培地又は細胞で培養して
病原菌の数をふやすこと、又は遠心法のような濃縮過程
を用いること又はすべてのアプローチを試みることによ
って直接的に探すことができる。

本発明から、その方法を実行するたｔに必要な要素を含
む「キット」を作成することは容易である。そのような
キットは、試験管又はバイアルのような１個以上の容器
をその中にきっちりと詰められるように仕切られたキャ
リヤーからなるものであろう。上記容器の一つは、非標
識化核酸プローブ又は例えば有機体プローブからのリポ
ソームＲＮＡに対する放射性標識化ｃＤＮ＾のような検
出可能に標識された核酸プローブ（細菌を確認するた約
のキットの場合は、前核細胞のｒＲＮＡｃＤＮ八が一層
好ましい）を含んでいて良い。標識化核酸プローブは、
凍結乾燥の形か又は必要ならば適当な緩衝液中に存在す
るだろう。１又はそれ以上の容器は未知有機体からのＤ
ＮＡの消化に利用される一種類かそれ以上のエンドヌク
レアーゼ酵素を含むだろう。これら酵素はそれだけで、
又は混合物として、凍結乾坦形か、適当な緩衝液溶液と
なって存在する。キットに採用される酵素類は、そのた
めのカタログが用意されているような酵素であることが
理想的である。しかしユーザーが実験時に自分達自身の
比較標準を作ることを妨げるものは何もないので、もし
ユーザーが、成る未知のものが実際に、与えられた属又
は種のものであることを疑うならば、その人は既知のも
のの帯パターンを作り、それを未知のものの帯パターン
と比較すればよい。

このように、キットはこのサブプロセスを行うのに必要
なすべての要素を含んでもよい。これらの要素とは、１
以上の既知有機体（細菌のような）又は既知有機体から
分離されたＤＮＡを含む。その他に、キットは、広く小
冊子、又は本又はパンフレットと定義される「カタログ
」又はコンピューターテープ又はディスク、又はコンビ
ニ−ターアクセスナンバー等々を含み、これらは植物の
種、曙乳類の種、細菌の種、特に病理学的に重要な細菌
、昆虫の種等のような成る群の種々の有機体のクロマト
グラフィー帯パターンを内蔵する。このようにしてユー
ザーは未知有機体の帯パターンを用意し、これをカタロ
グ内のパターンと視覚的に（又はコンピューターで）比
較するだけでよい。

キットは又、一つの容器中にはプローブ合成のだ袷のプ
ローブｒＲＮＡを、もう一つの容器中には放射性標識化
デオキシリポヌクレオジッド・三燐酸を、そしてもう一
つの容器にはプライマーを含んでいても良い。このよう
にしてユーザーは自分自身のプローブｒＲＮＡｃＤＮへ
を作ることができる。

最後に、キットは、緩衝液、増殖培地、酵素、ピペット
、プレート、核酸、ヌクレオジッド・三燐酸、濾紙、ゲ
ル原料、移し換え材料、オートラジオグラフィー補充品
のような、本発明の技術を行うために必要な付加的要素
のすべてを含んでいても良い。それは又、抗生物質耐性
配列プローブ、ウィールスゲローブ又はその他の特異的
性質をもつプローブも含んでいても良い。

これまで本発明を一般的に述べてきたが、本発明は一定
の実施例を参照することにより、より良く理解されるで
あろう。なお、実施例は単に説明の目的のためにのみ記
載されたものであり、特記しない限り本発明を制限する
意図はない。

材料および方法 Ａ、細菌 高分子量ＤＮＡの抽出 細菌肉汁培養物を遠沈し、細胞を冷食塩水で洗った。そ
の細胞を詰と込んだ（ｐａｃｋｅｄ）細胞のダラム重量
の約１０倍のｍｌ容量の抽出緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．ＩＭ　εＤＴＡ、　０．０３Ｍ　　）リ
スｐＨ８，５）に懸濁させた。リゾチーム１０ｍｇ／ｍ
ｆを最＃濃度０．５ｍｇ／ｒｎ１．となるように加えた
。懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。細胞
破壊は、２５％ＳＯＳを最終濃度２．５％になるように
加え、濃度を１０分間６０℃に上げることによっておこ
なった。

水浴中で冷却後、メルカプトエタノールを最終濃度１％
になるように加えた。プロナーゼ■２０ｒｎｇ　／ｍｆ
ｏ、０２Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，４）を３７℃で２時
間予備消化し、それから最終濃度１■／ｍｌ！になるよ
うに加えた。その溶液を３７℃で１８時間インキュベー
トした。フェノールは再蒸留したフェノール１１、二回
蒸留した水２．５Ｌ飽和トリス塩基２７〇−、メルカプ
トエタノール１２−及び最終濃度１０−３Ｍになるよう
な量のＥＤＴＡを混合し、４℃でその混合物を分離せし
めることにより調製した。そのフェノールを洗浄用緩衝
液（１［）−’Ｍ塩化す）　ＩＪウム、１０−’Ｍ　　
ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　　）リスｐＨ８，５）で洗った
。それから等量の新鮮緩衝液を加えた。メルカプトエタ
ノールを最＃濃度０．１％になるように加えた。

溶液を混合し、４℃で貯蔵した。調製したフェノール半
容量とクロロホルム半容量を溶菌細胞溶液に加えた。こ
れを約１０分聞損とうし、３４００Ｘ　ｇで１５分間遠
沈した。水相を２５ｍｇガラスピペットで除去した。境
界にほとんど沈澱物がなくなるまでこの抽出操作を繰返
した。１／９容量の２Ｎ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）
を水相に加えた。２倍容量の−２０”Ｃ９５％エチルア
ルコールをフラスコの壁面に沿ってゆっくりと注いだ。

バスツルルビペットの先端を溶融して閉じ、沈降ＤＮＡ
をスプールするために用いた。高分子量ＤＮＡは緩衝液
中に溶解した（１０−３Ｍ　ＥＤＴＡ　、１０−２Ｍ　
）　’Ｊ　スＩ］８７．４）。ＤＮＡ　ｍ＆は、換算係
数として吸光度１単位について３０μεを用い、２６Ｏ
ｒ＋ｎ＋における吸光度により測定した。

ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化 ＢｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ反応は、０．１Ｍト
リス−ＨＣｌｐ）１７，５．０．０５Ｍ　　ＮａＣ！！
、０．００５Ｍ　　ＭｇＣｊ！　２　、および１００μ
ｇ／−分生血清アルブミン中で行われた。ｐｃｏＲ１反
応混合物はＯＮ＾／μｇにつき５単位の酵素を含んでお
り、これを３７℃で４時間インキュベートした。ＰＳＴ
　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ反応は０．００６Ｍ　）リ
ス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，４，０、０５Ｍ塩化ナトリウム
、０．００６Ｍ塩化マグネシウム、　０．００６Ｍ　２
−メルカプトエタノール、および１００μｇ／−分生血
清アルブミン中で行われた。

ＰＳＴ　Ｉ反応混合物はＤＮＡ　／μｇにつき２単位の
酵素を含み、これを３７℃で４時間インキュベートした
。通常、１０ＭｇのＤＮＡは最終容量４０μｐに消化さ
れた。１０倍濃度の緩衝液を加えた。滅菌蒸留水をＤＮ
＾溶量に応じて加えた。λ−バクテリオファージＤＮＡ
は、断片の大きさ決定のためのマーカー帯を作るたり、
　ＥｃｏＲＩで制限された。普通２μｇλＤＮＡは２０
単位のＥＣＯＲＩで消化されて最終容量２０μｍになっ
た。

ゲル電気泳動法およびＤＮＡ転移 ＤＮＡ消化物に約２０％までのグリセロールおよびブロ
モフェノールブルー色素を加えた。λＤＮＡ消化物の場
合は、Ｉ　ＸＥｃｏＲＩ緩衝液２０μ矛を各２０Ｍ１反
応混合物に加えた。普通は７５％グリセロール１５μｌ
および０．５％ブロモフェノール色ｓ５μｌを各４０Ｍ
１反応混合物に加えた。

消化した細菌ＤＮＡ　１０Ｍｇおよび消化したλＤＮ＾
２μｇをパー・ウェル（ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）に入れ溶か
したアガロースで表面をおおう。消化物を０．０２Ｍ酢
酸ナトリウム、　０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０１８
Ｍ　）リス塩基、および０．０２８Ｍ　）リス　）Ｉｎ
　Ｉ！　ｐＨ８，０５を含む０．８％アガロース中、３
５Ｖで、色素が１３〜１６ｃｍ泳動するまで電気泳動を
おこなった。その後ゲルをエチジウムプロミド（０，０
０５■／ｉｆ）に浸し、λ断片を見えるようにするため
Ｕｖ光箱に置いた。ＤＮＡを上述のサウザーンの方法で
ニトロセルロース濾紙に移した。ゲルは、振動台上で２
０分間、変性溶液（１，５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ
水酸化ナトリウム）で処理した。変性溶液を中和溶液（
３，０Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ）リス　１ｌｃｆ　
　ｐＨ７，５）に置き代え、４０分後、そのゲルをｐｌ
（紙でチエツクした。

中和後、ゲルを６ＸＳＳＣ緩衡液（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で
１０分間処理した。ゲルと、ニトロセルロース紙を通し
、６ＸＳＳＣを、ペーパータオルの東で１５時間吸引す
ることによりＤＮＡ断片をゲルからニトロセルロース紙
に移した。３圓りロマトグラフ紙２枚の間にフィルター
を置き、アルミホイールで、光った側を外側にして包み
、真空オーブン中８０℃で４時間乾かした。

３２ＰリポソームＲＮＡ相補性ＯＮへの合成（３２Ｐｒ
ＲＮＡとＤＮＡ　） 大腸菌Ｒ−１３２３Ｓおよび１６Ｓ型リポソームＲＮ八
に相補的な３２ｐ−標識ＤＮＡを、鳥骨髄芽球症つイー
ルス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素を用いて合成した。

反応混合物は、５μｍの０．２Ｍ　ジチオトレイトール
、２５μｌのＩＭ）リス　ｐＨ８，０，８，３μｍの３
Ｍ塩化カリウム、４０μｌの０．ＬＭ　　塩化マク２、
カラム、７０μｌのアクチノマイシン、１４μｌの０．
０４Ｍ　ｄＡＴＰ　、　１４μ！の０．（１４Ｍ　ｄＧ
ＯＰ　、　１４μｌの０．０４Ｍ　ｃｌＴＴＰ　Ｓおよ
び９６．７μｌの水を含んでいた。

次のものをプラスチック製チューブに加えた：１３７、
５μｌの反応混合物、１５μｍの分生胸腺プライマー（
１０■／ｒｄ）、７μｌのＨ２Ｏ，３μｍのｒＲＮＡ（
４Ｄ　μｇ　１００単位濃度を用いると、２，７６μｇ
／μｌとなる）、４０μ！のデオキシシチジン５’　−
（”Ｐ）三燐酸（１０ｍＣｉ／ｍｉ）　、および１３μ
ｍのＡＭＶポリメラーゼ（６，９００単位／μｌ）。酵
酵反応を３７℃で１．５時間行なった。その後、その溶
ｉヲ５　ｉｆずつのクロロホルムおよび調製フェノール
で抽出した。遠心分離後（ＪＳ　１３，６０ＯＲＰＭ）
、水相を直接セファデックス■Ｇ−５０カラム（１，５
Ｘ２２ｃｍ）上に積層した。プラスチック製の１０ｒｄ
ピペツトをカラムとして用いた。小さいガラスピーズ１
個を先端に置き、ピンチ金具をつけたゴム管が装着され
、１晩０．０５％ＳＯ３に浸して膨潤した脱気Ｇ−５０
を加えた。水相を壁に沿って直接Ｇ−５０に流し込み、
それから０．０５％ＳＯ３で溶出した。０，５−ずつの
２０フラクシヨンをプラスチック製バイアルに集めた。

ピークフラクションを含むチューブは、３Ｈ−識別器を
用いて各試料毎に０．１分間計数を行い、全カウントを
記録する七しンコフ計測法で発見した。ピークフラクシ
ョンを合一した。

アリコートを了りエゾル■（市販で入手可）に加え、１
−当りの３２ｐのＣＰＭ　（毎分カウント）をシンチレ
ーション計数器によって測定した。

ハイブリッド化およびオートラジオグラフィーリポソー
ムＲＮＡ遺伝子配列を含む断片を、フィルター上のＤＮ
Ａを”Ｐ　−ｒＲＮＡｃＤＮＡにハイブリッド化した液
、オートラジオグラフィーによって検出した。

フィルターを、ハイブリッド化混合液（３×５ＳＣ１０
，１％ＳＯＳ　、　１００μｇ／−変性および超音波処
理した犬ＤＮＡおよびダインハルト溶液（それぞれ０．
２％の分生血清アルブミン、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ
）、およびポリビニールピロリジン））中に、６８℃で
１時間浸した。”Ｐ　ｒＲＮＡｃＤＮＡを４Ｘ１０’Ｃ
ＰＭ／ｍｌ！の割で加え、ハイブリッド化反応液を６８
℃で４８時間インキニベートした。それからフィルター
を３ＸＳＳＣで洗い、次いで０．１％ＳＯ３で１５分間
隔で２時間又は清浄溶液が約３．０００ｃｐｍ　　”　
Ｐ　／　ｍｌ。

を含むようになるまで洗った。フィルターを空気乾燥し
、プラスチックラップで包み、コダックＸ−ＯＭＡＴＲ
フィルムで一７０℃で約１時間オートラジオグラフィー
を行った。

Ｂ、哺乳類実験 ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）のｒＲ
ＮＡプローブを１８Ｓおよび２８Ｓ型および２８Ｓ型だ
けのｒＲＮＡから合成した。核酸をマウス肝から抽出し
沈澱させた。高分子量ＤＮＡをスプールし、除去した。

残った核酸を遠沈法により集め、５０ｍＭＭｇＣｆ　２
および１００ｍＭ　）リスｐＨ７，４の緩衝液に溶かし
た。ＤＮＡ５ｅ　（ＲＮＡｓｅは含まず）を濃度５０μ
ｇ／ｒｎｆになるまで加えた。混合物を３７℃で３０分
間インキュベートした。生成したＲＮＡを再抽出し、エ
タノール沈澱し、１ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，
８に溶解した。０．ＩＭＦリス　ｐＨ７、４および０．
０１ＭＥＤＴ＾の５〜２０％スクロース勾配溶液を用意
した。

試料を加え、その勾配を５Ｗ４０回転子で７時間、３５
Ｋ　ｒｐｍで回転させた。フラクションを光学密度によ
り集ｔた。既知の分子量マーカーとの比較により　１８
ＳＪよび２ＢＳフラクシヨンを選んだ。

すべての哺乳類実験で、リラックス（ｒｅｌａｘｅｄ）
ハイブリッド化条件を用いた。５４℃。洗浄処理は５４
℃で行い、０．０５％ＳＤＳを加え３ＸＳＳＣで１５分
間ずつ３回別々に洗った。

実施例１ 本実施例に用いられたＰ、アエルギノーザの数種の菌株
は、種を同定する最少の表現型特性を有する（Ｈｕｇｈ
　Ｒ，Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、　ｒＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ
ｌ１ｎｉｃａ］ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ第２版、＾
ＳＭ　、　１９７４　、　ｐｐ、２５０−２６９）　（
第２表）。他の３つのシュードモナスおよび２のアシネ
トバクタ−（＾ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の菌株を選
び、種および属を比較した（第３表）。

第２表 菌株の比較のためＰ、アエルギノーザの最少表シュード
モナスおよびアシネトバクタ一種の比較のために用いた
菌株は第３表に列挙する。

以下余白 第３表 種および属の比較のだ於の、 タイプ、 ネオタイ Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｐ、５ｔｕｔｚｅｒｉ Ｐ、　ｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐ、ｐｕｔｉｄａ Ａ、　ａｎｌｔｒａｔＬＩｓ ８１５　　　　１０１４５　　　１０３３２　　　　タ
イプ２６０１　　　　１７５８８　　　　　　　　　　
　　ネオタイプ８１８　　　　１３５２３　　　１００
３８　　　　ネオタイプ８２７　　　　１２６３３　　
　　　　　　　　　　ネオタイプ２２０８　　　　１９
６０６　　　　　　　　　　　　タイプアシネトバクタ
一種を属を、比較するために選んだのは、それらが一定
の属性を多くのシュードモナス種と共有するからである
。

ＥｃｏＲＩ消化物中の断片の大きさ（キロベース対）は
Ｐ、　ストウッゼリ（Ｐ、５ｔｕｔｚｅｒｉ）　１６．
０．１２．０．９．４；Ｐ、　　フルオレッセンス（Ｐ
、　ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）１６．０　．１０．０
．８．６　、？、８．７．０　；　Ｐ、プチダ（Ｐ、ｐ
ｕｔｉｄａ）　２４．０．１５．０．１０．０．８．９
　　；Ａ、アニトラタス（＾、ａｎｉｔｒａｔｕｓ）　
２０．０．１５．０．１２．５．９．８．７．８．６．
１．５．２．４．８．３．８．２．８　　（最も小さい
３断片の大きさは計算しなかった）；Ａ、ルオッフィ（
＾、１ｗｏｆｆｉｉ）　１２．０．１０．０．９．１．
７．０．６．４．５．７．５．５．５Ｊ、４．８．４．
４．３．６．３．２．２．９（最も小さい３断片の大き
さは計算しなかった）である。ＰＳＴ　Ｉ消化物中の断
片の大きさ（キロベース対）を次に示す；Ｐ、ストウツ
ゼリ　６，７．６，１．５．５　　；　Ｐ、　　フルオ
レッセンス１０．０．９．４．７．８．７．０　、　Ｐ
、プチダ１０．５．９．９．６．８．６．３．４．４　
　、　Ａ、アニトラタス３６，０．２８．０．２０．５
．１２．０．１０．０．５．８．３．７．２．６．２．
４；Ａ、　　ルオッフィ　９．９．８．７．７．２．５
．７．４．０．３．６．３．２．２．７゜ Ｐ、アエルギノーザの７菌株から得られたハイブリッド
を形成した制限断片を比較すると、この種は、１０．１
．９．４．７．６および５．９キロベース対（ＫＢＰ）
の、ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む断片ＥＣＯＲＩ−特異的
組み合わせによって定められる、という結論に達する（
第１図）。

７．６　ＫＢＰ　ＥｃｏＲｌ断片は、この試料では７菌
株中４菌株にあられれる。同様な情況が種の菌株のいく
つかの表現型特性の中にもおこる。７菌株からの断片の
ＢＣＯＲ１組み合わせがその菌株を２群に分けるために
用いられるという事実は、Ｐ、アエルギノーザの最少表
現型特性をもつ２つの種があるという推論をひき出す。

ＤＮ八をＰＳＴ　ｌで消化した実験結果（第２図）から
、ＥｃｏＲＩ　　７．６　ＫＢＰ断片によって示される
菌株の変異は棟内の変異をあられす、という結論を導く
。なぜならば、ＰＳＴ　ｌ断片の１つの保存組み合わせ
、９．４　、？、１．６．６および６．４ＫＢＰがあっ
て、それがその種を定めているからである。９．４およ
び６．６ＫＢＰのＰＳＴ　ｌ断片は、Ｐ、アエルギノー
ザの７菌株の中６菌株にあられれる；７．１および６．
４　ＫＢＰ　ＰＳＴ　ｌ断片は試料とした菌株のすべて
にあられれる。ＰＳＴ　ｌ断片の変異は、ＥｃｏＲＩ　
　７．６　ＫＢＰ断片を含まない菌株におこる；　　Ｒ
Ｉ１１５１は１０．１および８．２ＫＢＰ断片をもち、
ＲＨ８０９は９．４ＫＢＰ断片を含まないで、６．０Ｋ
ＢＰ断片をもっている。そしてタイプ菌株のＲＨ８１５
は６．６ＫＢＰ断片を含まない。ハイブリッドを形成し
た断片のパターンは、酵素に特異的な保存組み合わせが
種の決定に用いられ得る、という結論を支持する。

一つの種の菌株は多分多数の断片を保存組み合わせとし
てもっているのであろう。若干の菌株に断片の変異があ
っても、それは同定化を妨害するものではなく、疫学的
研究に役立つことを証明するものと言える。

Ｐ、アエルギノーザ菌株におけるＥｃｏＲｌ　　７．６
ＫＢＰ断片の変異発生は、他のシュードモナス種のタイ
プ菌株に見出されるハイブリッド形成ＥｃｏＲＩ断片を
試験することによって展望的に考えられるかも知れない
（第３図）。Ｐ、ストウラエリ、Ｐ。

フルオレッセンスおよびＰ、プチダのタイプ菌株は７．
６ＫＢＰ断片を含まないが、同じ大きさのＥｃｏＲＩ断
片を共通してもっている；Ｐ、アエルギノーザおよびＰ
、ストウラエリは９．４ＫＢＰ断片を有しＰ、ストウラ
エリおよびＰ、フルオレッセンスは１６ＫＢＰ断片を有
し、Ｐ、フルオレッセンスおよびＰ、プチダはｌ０ＫＢ
Ｐ断片をもっている。一般に断片の大きさは４つのシュ
ードモナス種のタイプ菌株各々に特有なものである：そ
して各々の種のタイプ菌株はそれぞれ異なるサイズ範囲
の断片を有する。これらの−射的説明はＰＳＴ　Ｉ消化
物についても言える（第４図）。

４つのシュードモナス種および２つのアンネトバクタ一
種のそれぞれの断片パターン又はその１菌株を比較する
場合、各属の種は似ているが、属同志は異なると結論づ
けることができる。２つのアシネトバクタ一種は４つの
シュードモナス種に比べて、ハイブリッド形成断片サイ
ズの範囲がより大きい。

大腸菌、バシルス・スリンシネンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびＢ、ズブチリス
（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）で得られるような制限酵素
地図の助けがなければ、どこで酵素がｒＲＮＡ遺伝子を
切るのか、１ゲノムあたりのコピーの数および複数の遺
伝子又は不均質遺伝子間に非相同性フランキング部（ｆ
ｌａｎｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ）があるのかを予想する
ことは不可能である。大腸菌のｒＲＮＡｃＤ’ＮＡプロ
ーブはｒＲＮＡ遺伝子配列を含む若干の制限断片とはハ
イブリッドを形成しないかも知れないし、もしそうなら
ば、これは試験有機体と大腸菌との間に進化的距離又は
分散があることを反映している。ｒＲＮＡの保存性質を
用いてこれがその場合にあたらないと論することができ
る。しかしながらこれは未知のいかなる種にも等しく適
用できる標準プローブがあるという利点に比べれば小さ
い問題である。

実施例２ 制限分析と、ＤＮＡ−ＤＮＡ液体ハイブリッド化との比
較： 本研究に用いた菌株は第４表および第５表に列挙する。

第４表 Ｂ、ズブチリスのネオタイプ菌株および下級類似物（ｊ
ｕｎｉｏｒ　ｓｙｎｏｎｙｍｓ）のタイプ菌株のそれぞ
れの菌株ナンバー Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　　　　　　　　　　　　３０２
１　　　　６０５１　　　　　ネオタイプＢ、ｕｎｉｆ
ｌａｇｅｌｌａｔｕｓ　　　２９９０　１５１３４　　
　タイプＢ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕａｆａｃｉｅｎｓ　　
３０６１　２３３５０　　　タイプ第 表 Ｂ−３５４（ＮＲ３−２３１） Ｂ−３５６（ＮＲ３−２３８） ＮＲ３−２６５ ＮＲＳ−６５９ ＮＲ３−７３Ｏ ＮＲ３−７３７ ＮＲＳ−７４１ ＮＲ３−７７３ ＮＲ３−１１０６ 高分子量ＤＮＡが各々の菌株から分離された。ＲＨ３０
２］およびＲＨ２９９０の標識化ＤＮＡを用いて液体Ｄ
ＮＡ　−ＯＮ＾ハイブリダイゼーンヨンデータを集めた
。結果を第６表に示す。

第６表 標識化ＯＮ＾プローブと、Ｂ　ズブチリスの菌株からＤ
ＮＡとの間のハイブリッド化％ このデータは二つのハイブリッド化群があることを示す
。同様なデータが、Ｂ、ズブチリスについて文献に報告
されている（Ｓｅｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　ｒｌｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＳｙＳｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」２５　：　２５
Ｂ−２７０（１９７５））。これら２群をＲＨ３０２１
およびＲＨ２９９０によって代表させることができる。

リポソームＲＮＡ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ分析
が行われる。ＥｃｏＲｌ消化物（第５図）は２群に分け
ることができた。ＲＩＩ３０２１によって代表される群
は二つの強くハイブリッド化する断片を有する（２．１
５および２．１ＫＢＰ）。ＲＨ２９９０によって代表さ
れる群は二つの強くハイブリッド化する断片（２，６お
よび２．５ＫＢＰ）を有する。ＥｃｏＲｌデータを用い
てＢ、ズブチリス菌株をＤＮＡ−０Ｎ＾ハイブリッド化
群の適当な所に置くことができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッド化７０％ルールによれば、Ｂ、ズブチリスは実
際には二つの種である。しかしながら、ＰＳＴ　ｌデー
タ（第６図）を考慮すれば、それらのグループを、共通
の祖先又は種属形成事象にかかわった二つの分散する集
団と考えることができる。

Ｂ、ズブチリスは１つの種であるとする結論は表現型デ
ータと相関している。第５表に並べた菌株は、ゴートン
Ｒ，Ｅら著のｒＴｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
」Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｎｏ、
４２７　　（アメリカ農務省、農業リサーチサービス　
ワシントンＤ、　Ｃ，）ｐ３６−４１でＢ、ズブチリス
と同定されている。制限分析は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リッド化データに匹敵するデータを用意することができ
るし、又、適切な酵素を選ぶことによって、制限分析は
分散にもかかわらず種を十分に定とることができる。Ｒ
Ｈ３０６１はＰＳＴ　ｌサイトを失った。しかしながら
ＥｃｏＲｌデータは、その菌株がＢ、ズブチリスである
ことを示唆する。同じことがＢｇＡ　　ＩＩｌデータ第
７図）およびＳａｃ　ｌデータ（第８図）から結論づけ
られる。

実施例３ 第７表 Ｂ、ズブチリスおよびＢ、ポリミカのネオタイＢ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ　　　３０２１　　６０５１Ｂ、ｐｏｌｙ
ｍｙｘａ　　　３０７４　　８４２ネオタイプ ネオタイプ Ｂ、　ｐｏｌｙｍｙｘａ ＲＳ ネオタイプ Ｂ、ズブチリスおよびＢ、ボリミヵは、ＥｃｏＲｌデー
タ（第９図）　、ＰＳＴ　ｌデータ（第１０図）Ｂｇｌ
　ＩＩｌデータ（第１１Ｅｍ左）およびＳａｃ　ｌデー
タ（第１１父君）によって区別することができる。

ＰＳＴ　Ｉ帯パターンにおける大きい差から、バンルス
・ポリミカは間違った属に入っていると結論づけること
ができる。両方の種は共に胞子を生成するが、それらは
表現型的には似ていない。ＡＴＣＣおよびＮＲＲＬ両方
の培養コレクションのＢ、ポリミカのタイプ菌株は同じ
帯パターンをもつことは確かである。しかし重要なデー
タは無胞子性突然変異体が同定できるということである
。もしそれらが胞子を作ることができないならばバンル
ス種を同定することは非常にむずかしく、多分不可能だ
ろう。

実施例４ マウス組織中の細菌種を分離せずに同定するスイスマウ
ス、ムス・ムスキニラス・ドメステイクス（Ｍｕｓ　ｍ
ｕｓｃｕｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）　　（同系交
配株）（こストレプトコッカス・ニニーモニエ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏ−ｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　Ｒ
Ｈ３０７７（ＡＴＣロ６３０３）の混Ｓ懸濁液０．５ｍ
ｆ’を腹腔内に接種した。マウスが瀕死の状態になった
時、心臓、肺、肝を摘出した。高分子量ＤＮＡをこれら
組織、Ｓ、ニューモニエＲＨ３０７７およびスイスマウ
ス器官から分離し、ＤＮＡを消化するための１ＥｃｏＲ
Ｉを用いて、ｒＲＮＡ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ
分析の操作を行った。フィルターを３ＸＳＳＣで洗う以
外に、２×１５分間　０．３ＸＳＳＣおよび０．０５％
ＳＯ３で洗った。オートラジオグラフィーを４８時間行
った。データ　（第１２図）はＳ。

ニューモニエが７ケのハイブリッド形成断片によって定
められることを示した（１７．０．８．０．６．０．４
．０．３．３．２．６および１．８ＫＢＰ）。この細菌
のｃＤＮＡプローブは２つのマウスＤＮＡ断片（１４，
０および６．８ＫＢＦ）とはあまりハイブリッド化しな
い。ハイブリッド形成断片は感染組織におけるＳ、　二
。

−モニエの存在を知らせるものである。心ｍＤＮＡ抽出
物中には７帯すべてが見られる。肝ＤＮＡ抽出物中では
それらの強度はより小さいが、オートラジオグラフィー
により全部を見ることができる。

肺ＤＮＡ抽出物中には６．０ＫＢＰ帯のみがあられれる
。

肺に細菌の数が少いのは、そのマウスが肺炎よりむしろ
敗血症にかかっているためと説明することができる。肺
は剖検で面質化を示していなかった。

この検定の感度を調べるた約に、細菌ＤＮＡをマウスＤ
ＮＡで稀釈し、電気泳動にかけた。０．１μｇ細菌ＤＮ
Ａを用いると、７つの帯すべてを万一トラジオグラフで
見ることができた。１０−３μｇ細菌ＤＮＡでは、１７
．０．８．０および６．０ＫＢＰ帯が見られた。

１０６Ｓ、ニューモニエの細胞あたり５　Ｘ　１０−３
μｇＤＮＡという数字を用いると（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ　２６：６８）　、１ｏ−’μｇ
は２Ｘ１０７細胞に相当する。末法はこの感度レベルで
感染症の診断に役立ものである。

この実施例も、細菌プローブがマウスに特異的なＥｃｏ
Ｒｌ断片とハイブリッド化することを示している（第９
図参照、１４．０および６．８ＫＢＰをもつ断片）これ
らの断片はマウス１８Ｓおよび２ＢＳ型リポソームＲＮ
Ａプローブによって検出されたＥｃｏＲｌ断片に対応す
る（第１４図、前記は６．８ＫＢＦ断片が２８３型ｒＲ
ＮＡ配列を含むことを示す）。細菌プローブは、哺乳類
リポソームＲＮ＾遺伝子配列とはあまりよくハイブリッ
ド化しないので、帯は強度がより小さく、細菌プローブ
および核哺乳類ＲＮＡの系は感度がより小さく、感染し
ている前核細胞のＤＮＡに対する選択性がはっきりあら
れれる。細菌プローブをレーン（ｌａｎｅ）当り１０μ
ｇ消化細菌ＤＮＡにハイブリッド化させた実験で、細菌
の帯は明らかに見えた時でもル−ン当り１０μｇ消化ヒ
ト又はマウスＤＮＡに対するハイブリッド形成は発見さ
れなかった。

実施例５−８ 哺乳類実験 これらの実施例は、ｒＲＮＡ制限分析によって有機体を
確認するという概念が、細菌のみならず複雑な真核有機
体にも成功裡に適用されることを説明するものである。

第１３図は哺乳類の属がムス・ムスキュラス・ドメステ
ィクス１８Ｓおよび２８Ｓ型ｒＲＮＡプローブで確認で
きること、およびムスのいくつかの種が区別できること
を示す。この図では、酵素はＰＳＴ　Ｉで、対象物およ
びそれぞれの帯は次のようである。

１、ムス・ムスキュラス・メロヌイナス（Ｍｕｓ　ｍｕ
ｓｃｕｌｕｓ　ｍｅｌｏｓｓｉｎｕｓ）　（マウス）１
４．５．１３．５．２．６２、ムス・ムスキュラス・ド
メスティクス（マウス）１３．５．２．６ ３、カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ　ｆａｍｉｌ
ｉａｒｉｓ）（犬）１２．０ ４、カビア・ポルセルス（口ａｖｉａ　ｐｏｒｃｅｌｌ
ｕｓ）　（モルモット）１７．０．１４．０．１３．０
．８，８．５．７．４．７および３．０以下の帯１個 ５、クリセトララス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕ
ｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）　（ハムスター）２５．０．４．
７６、ホ（−−サピエンス（Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ
）　（ヒト）１５．０．５．７ ７、フェリス・カタス（Ｆｅｌｉｓ　ｃａｔｕｓ）　　
（猫）２０．０．９．７ ８、マウス・ノルベジカス（Ｒａｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇ
ｉｃｕｓ）　（ラット）１２．５ ９、ムス・ムスキニラス・ドメスティクス（マウス）１
３．５．２．６ １０　　ムス・セルピコロー・セルピコロー（ＭＩＪＳ
ｃｅｒｖｉｃｏｌｏｒ　ｃｅｒｖｉｃｏｌｏｒ）　　（
７ウス）１４．０．２．７ １１、ムス・セルピコロー・バベウス（Ｍｕｓｃｅｒν
ｉｃ。

Ｊａｒ　ｐａｐｅｕｓ）　（マウス＞１３．５．２．６
１２、　　ムス・バハリ（Ｍｕｓ　ｐａｈａｒｉ）　（
マウス）１３．０．３．７ １３、ムス・コツキイー　（Ｍｕｓ　ｃｏｏｋｉｉ）　
（マウス）１３．５．２．６ 第１４図はマウスおよび猫ＤＮＡが、２ＢＳ型ｒＲＮＡ
ｃＤＮＡのみによって区別できること、およびノーイブ
リッド化した帯のパターンがプローブ配列の構成に依存
することを示す。第１４図では酵素はＥｃｏＲｌで、対
象物および帯は次のようである。

１、ムス・ムスキュラス・ドメスティクス（マウス）ｉ
３，３ＫＢＰ ２、フエリス・カタス（猫）　８．３ＫＢＰ第１５図で
は酵素はＳａｃ　Ｉ　、対象物および帯は次のようであ
る。

１、エリスロセバス・パタス（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕ
ｓ　ｐａｔａｓ）（バタス猿）　８．５．３．７　、＜
３．０２、マウス・ノルベジカス（ラット）２５．０．
９．５．３．６　、＜３．０ ３、ムス・ムス牛ユラス・ドメスティヵス（マウス）６
．８　、＜３．０ ４、フエリス・カタス（猫）９．５．５．３．４．０　
。

＜３．０　、　＜３．０ ５、ホモ・サピエンス　（ヒト）１０．５、〈３．。

６、マカカ゛ムラツタ（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ
）　（レーザス猿）　９．８　、＜３．０ 第１５図（Ｓａｃ　Ｉ消化）をその他の哺乳類の図と比
較する時、ハイブリッド形成パターンが酵素に特異的で
あることがわかる。

第１６図は霊長類（ｐｒ　ｉｍａｔｅｓ）の動物が区別
できることを示す。培養細胞は、その元の種の組織と共
通した帯を有し、異なるヒト培養細胞は帯が加わったり
欠けたりすることによって区別することができる。この
図では、酵素はＥｃｏＲｉで、対象物および帯は次の通
りである。

１、エリスロセバス・パタス（パタスｍ）　＞２２．０
．１１．０．７．６．２．６ ２．７カカ・ムラツタ（レーザス猿）２２．０．１１．
５．７．６ ３、ホモ・サピエンス（ヒト）＞２２．０．２２．０．
１６．０．８．１．６．６ ４、　Ｍ　２４１／８８　　（ランガー猿　培養細胞）
１４，０．７．２．５．７ ５、　　ＨａＬａ　（ヒト培養細胞）＞８．１．６．６
６、　Ｊ９６　（ヒト培養細胞）＞２２．０．２２．０
．１６．０゜１１．０．８．１　、６．６ ７、　ＡＯ（ヒト培養細胞）　２２．０．１６．０．８
，１．６．６８、　Ｘ−３８１（レーザス猿）２２．０
、〕１．５．７．にれで本発明について十分に述べたの
で、当業者には本発明又はその実施例の原理又は目的を
ゆがめることなく多くの変形および置換が広い範囲にわ
たって行われ得ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌株から分離
したＤＮＡのＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を
示す。 プローブとして大腸菌の１６Ｓ型および２３Ｓ型リポソ
ームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）に対するｃＤＮＡを用いた。 第２図はシュードモナス・了エルギノーザ（Ｐ、　ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株から分離したＤＮＡのｐｓｔ　
ｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。プローブとして
大腸菌の１６Ｓ型および２３Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤ
ＮＡを用いた。 第３図はグルコース−非発酵性　グラム桿菌性桿菌種か
ら分離したＤＮＡのＥｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ
消化を示す。プローブとして大腸菌の１６Ｓ型および２
３Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤＮＡを用いた。 第４図はグルコース−非発酵性　グラム−陰性桿菌種か
ら分離したＤＮＡのＰｓｔ　ｌ制限エンドヌクレアーゼ
消化を示す。プローブとして大腸菌の１６Ｓ型および２
３Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤＮＡを用いた。 第５図は種々のバシルス・ズブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）菌株から分離
したＤＮＡのＢｃｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼ消化を
示す。プローブとして大腸菌の１６Ｓ型および２３Ｓ型
ｒＲＮＡに対するｃＤＮＡを用いた。 第６図は第５図と同じ菌株に対して、同じプローブで用
いて得られたＰｓｔ　ｌデータを示す。 第７図は第５図および第６図と同じ菌株に対して同じプ
ローブを用いて得られたＢｇｌ　Ｉｔデータを示す。 第８図は第５−７図と同じ菌株に対して、同じプローブ
を用いて得られたＳａｃ　ｌデータを示す。 第９図はＢ、ズブチリスおよびＢ、ポリミカ（Ｂ、　ｐ
ｏｌｙｍｙｘａ）から分離したＤＮＡのＥｃｏＲｌ制限
エンドヌクレアーゼ消化を示す。プローブとして大腸菌
からの１６Ｓ型および２３Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤＮ
Ａを用いた。 第１Ｏ図は第９図と同じ菌株に対して、同じプローブを
用いて得られたＰｓｔ　ｌデータを示す。 第１１図は第９図および第１０図と同じ菌株に対して同
じプローブを用いて得られたＢｇｌ　ＩＩおよびＳａｃ
　ｌデータを示す。 第１２図はプローブとして大腸菌からの１６Ｓ型および
２３Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤＮＡを用い、感染マウス
組織から、ＥｃｏＲＩＭ化ＤＮＡ中のストレブｉコツカ
ス８ニニーモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）の検出を示す。 第１３図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス（Ｍｕ
ｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）　　（
７ウス）の細胞質リポソームからの１８Ｓ型および２Ｂ
Ｓ型ｒＲＮＡに対するｃＤＮＡを用い、哺乳類の組織か
ら分離したＤＮＡのＰｓｔ　ｌ消化を比較することによ
るマウス種の同定を示す。 第１４図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス２８Ｓ
型ｒＲＮＡｃＤＮＡプローブとハイブリッドを形成した
マウスおよび猫組織からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを示す
。 第１５図はムス・ムスキュラス・ドメスティカス１８Ｓ
型および２８Ｓ型ｒＲＮＡｃＤＮＡプローブとハイフリ
ット形成した哺乳類組織からのＳａｃ　Ｉ消化ＤＮＡを
示す。 ！１６１ｍはムス・ムスキュラス・ドメステイカス１８
Ｓ型および２８Ｓ型ｒＲＮＡｃＤＮ＾プローブとハイブ
リッド形成した哺乳類組織および細胞培養からのＥｃｏ
Ｒ Ｉ消化ＤＮＡを示す。 以 上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、前核生物のリボソールＲＮＡ情報を含む断片と検出
   可能に標識された前核ｒＲＮＡ情報を含むハイブリダイ
   ゼーションプローブを選択的にハイブリッド化させるこ
   とを特徴とする、真核生物中に存在するか又はこれと共
   生する前核生物の検出方法。