JPH04135491A - オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の検出方法に関する。

〔従来の技術〕

ウィルス性肝炎のうちＡ型肝炎およびＢ型肝炎と呼ばれ
るものはその原因ウィルスが見い出され、現在では免疫
学的な方法による診断がすでになされている。一方、輸
血後に発症するＡ型でもＢ型でもない肝炎、いわゆる非
Ａ非Ｂ型肝炎は慢性化し、高い確率で肝硬変または肝癌
に移行するにもかかわらず、長い間その原因ウィルスが
分離、同定できなかった。そのため非Ａ非Ｂ型肝炎は現
在、輸血後肝炎の９０％以」二を占めると言われており
大きな社会的問題となっている。この非Ａ非Ｂ型肝炎関
連の抗原抗体検出系の作成は、多くの研究者によって試
みられてきたが、その大半は明確なものとはなり得てい
なかった。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断は原因の明ら
かな種々の病因の排除試験の結果に頼っていた。

最近、血液伝ばん性非Ａ非Ｂ型肝炎に感染しているチン
パンジーの血漿から非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子が
単離され、同定がなされ、その遺伝子の核酸配列と推定
されるものの一部はすでに明らかにされている〔サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４４巻、３５９頁（１９
８８年）；サイエンス、第２４４巻、３６２頁（１９８
８年）；およびヨーロッパ特許第０３１８２１６号明細
書参照］。一方、本発明者らの一人を含む数人によって
非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス保持者と思われる人の血清から
上記の遺伝子とは核酸配列の異なるウィルス遺伝子が単
離され、同定されたことが報告されている　［ガストロ
エンテロロシア１ジヤポニカ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ）　、第２４巻、第５
号、第５４０頁（１９８９年）；ガストロエンテロロシ
ア・ジャポニカ、第２４巻、第５号、第５４５頁（１９
８９年）および内科、第６４巻、第６号、第１０２２頁
（１９８９年）参照１゜〔発明が解決しようとする課題
〕 非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の発見により、この遺伝
子をもとに作成した組換え抗原を用いれば抗体検査が可
能となる。すなわち、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに感染す
れば抗体が生じるた必、これらの抗体テストキットを用
いれば非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体の保持者は
明らかとなり、この抗体保持者の血液を輸血に供する血
液から除外することによりかなりの割合で輸血後非Ａ非
Ｂ型肝炎に感染することが防御しうると考えられる。

しかしながら、輸血による感染防御は抗体を用いること
により可能であっても、非Ａ非Ｂ型肝炎自体の診断にお
いては、該ウィルスの存在を直接判定することができれ
ば、その診断がより正確なものとなることは言うまでも
ない。

このようなウィルスを検出する方法としては、船釣には
免疫学的手法が用いられるが、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
はその存在量が少ないため検出限界以下となり、免疫学
的手法は有効な検出手段とはなり得ていなかった。また
遺伝子を用いた検出方法としては、検体中の標的とする
遺伝子とハイブリダイズするに充分な長さを持った相補
的な標識化された核酸配列をプローブとして用いる方法
が知られているが、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスのように目
的遺伝子が微量にしか存在しない場合には有効な手段と
はなり得ない。

近年、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らによる遺伝子断片の増幅
技術が知られており、増幅させた遺伝子断片を用いて検
出する方法が種々試みられている。しかし、増幅に際し
ては目的とする遺伝子配列のどの部分を用いてもよい訳
ではなく、増幅されやすい部分とされにくい部分、非特
異的な増幅を起こす部分とそうでない部分とがある。

例えば、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの構造タンパク質の一
部を構成するＣ−１００抗原（非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
遺伝子の３３５７１目−４４４５番目の核酸配列に相当
するアミノ酸配列を有するペプチド）をコードする遺伝
子の核酸配列に相当する部分を用いて、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルス遺伝子に特異的な核酸配列を増幅させることが
できたことが報告されている（ヨーロッパ特許第０３１
８２１６号明細書参照）。しかしながら、本発明者らが
上記の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の核酸配列を用い
て数種の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体陽性者の血清中に
存在するウィルス遺伝子の核酸配列の増幅および検出を
試みたが、後述の参考例で示すように、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスにのみ特異的な核酸配列の増幅を８忍めること
ができなかった。

このように、増幅遺伝子を用いる方法は、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスのように検体中に微量にしか存在しないウィ
ルスを検出する場合には、−船釣には有益な方法ではあ
るが、該遺伝子を特異的にかつ大量に増幅できる部位を
発見することが重要であり、そのためにどのようなプラ
イマーを作製するかが検出の成否の要となっている。

非Ａ非Ｂ型肝炎の診断方法の確立は、医療上急務とされ
ており、そのため当該技術分野では該ウィルスを特異的
に検出するためのプライマーの作一 製が強く要請され、これまで種々の試みがなされている
が、未だ満足できるものは見い出されていないのが実情
である。

本発明の１つの目的は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを特異
的に検出するためのプライマーとして利用できる特定の
オリゴヌクレオチドを提供することにある。

本発明の他の１つの目的は、そのようなオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いて特定の核酸断片を増幅し
、増幅した該断片を検出することによる非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスの検出方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手、段〕

本発明者らは、上記目的を達成すべく種々研究を重ねた
結果、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスのある特定部分に相補的
な部分および該部分に更に相補的な部分に含まれる特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることに
より、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の特異的な増幅が
可能となることを見い出し、さらに研究を重ねて本発明
を完成するに至った。

即ち、本発明は下記の（ａ）もしくは（５）配列からな
るオリゴヌクレオチド、または（ａ）もしくは（ｂ）配
列のうち、それぞれ（ａ）配列においては、少なくとも
ＴＡＡＴＣＴＧＡＴＡを、（ｂ）配列においては、少な
くともＧＣＣＡＧＣＡＡＴ＆を一部に有する１５〜４９
個の塩基からなる（ａ）配列断片または（ｂ）配列断片
であるオリゴヌクレオチドに関する。

（ａ）　：　　ＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＴＣＴＧＡ
ＴＡ　ＴＧＣＧＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＧＧ
ＴＴＣＣＡＧＴＴ（ｂ）：Ａへ〇へＡＡへへＡＡ　　Ｇ
ＧＧＡＧ八八Ｇ［へへ　　ＡＧＣ八八へへＧ八ＧへＡへ
ＣＣＧＡＡＡＡ　　ＣＧＡＣＡＣＡＣ八Ｃまた、本発へ
は（ａ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）
配列断片であるオリゴヌクレオチドを一方のプライマー
とし、かつ（ｂ）配列からなるオリゴヌクレオチドまた
は（５）配列断片であるオ＋）　−１ヌクレオチドを他
方のプライマーとして用いてＤＮＡの複製反応を繰り返
すことにより、上記のオリゴヌクレオチドの伸長物同士
のハイブリッドを増幅することを特徴きする増幅工程２
、増幅された該ハイブリッドを検出する工程を有するこ
とを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の検出方
法に関する。そして、該増幅工程としては、更に具体的
には下記の（イ）〜（ト）の工程からなる。

（イ）検体中の標的ヌクレオチド（ＲＮＡ）に対し、（
ａ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）配列
断片であるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、４種
の異なったヌクレオシドトリフオスフェートを逆転写酵
素と反応させることにより、該オリゴヌクレオチドの伸
長物（伸長物（ａ））−ＲＮＡハイブリッドを作成する
こと。

（ロ）工程（イ）で得られたハイブリッドから伸長物（
ａ）を遊離させること。

（ｂ）工程（ロ）で得られた伸長物（ａ）を鋳型とし、
（ｂ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ｂ）配
列断片であるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、４
種の異なったヌクレオシドトリフオスフェートをＤＮＡ
ポリメラーゼと反応させることにより伸長物（ａ）−該
オリゴヌクレオチドの伸長物（伸長物（ｂ））ハイブリ
ッドを作成すること。

（ニ）工程（ｂ）で得られた伸長物（ａ）−伸長物ら〕
ハイブリッドから伸長物（ａ）および伸長物（ｂ）をそ
れぞれ遊離させること。

（ホ）工程（ニ）で得られた伸長物〔日を鋳型とし、（
ａ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）配列
断片であるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、４種
の異なったヌクレオシドトリフオスフェートをＤＮＡポ
リメラーゼと反応させることにより、伸長物（ａ）−伸
長物（ｂ）ハイブリッドを作成すること。

（へ）工程（ホ）で得られたハイブリッドをそれぞれ遊
離させること。

（ト）必要に応じ、工程（ｂ）〜（へ）を繰り返し実施
することによって伸長物（ａ）−伸長物（ｂ）ハイブリ
ッドを増幅させること。

本発明においてプライマーとしては、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス遺伝子に含まれる核酸配列と相補的であり、かつ
ハイブリダイズするに充分な長さを有した上記の（ａ）
配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）配列断片
である１５〜４９個の塩基からなるオリゴヌクレオチド
を一方のプライマーとし、また、それらをプライマーと
して伸長させた結果生じるオリゴヌクレオチドの伸長物
（伸長物（ａ））と相補的なオリゴヌクレオチドとして
の（ｂ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ｂ）
配列断片である１５〜４９個の塩基からなるオリゴヌク
レオチドを他方のプライマーとして用いる。本発明でプ
ライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、特異性、
検出感度等からみて、少なくとも１５塩基以上、好まし
くは２０〜３０塩基程度のヌクレオチド断片がよい。こ
れらのプライマーは、通常のＤＮＡ合成方法により容易
に作成することができる。また、このようにして作成さ
れるプライマー間の増幅領域としては通常、１６０〜１
８７塩基であり、例えば、次のものが挙げられる。

ＡＡＡＧＧＧ八ＧＡＡ　へＧＣ［：ＡＧＣＡＡＴＧ　　
ＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡ　　ＡＡＡＣＧＡＣＡＣ八ＴＴＴ
ＣＣＣＴへＴＴ　　ＣＧＧＴＣＧＴＴ八ＣＣＴＣへＴＣ
ＧＧＣＴ　　ＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＣＡＣＡ八Ｇ八八八
ＣＡ八八ＧＧ八ＧへＴへへへへへへへ八八へ八八　へへ
へへへへへＣＧＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧ　　ＴＴＴ［：
ＣＴＣＣ八Ｔ　へＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴ　　ＣＴＴＴＴ
ＴＴＧ［：Ｃ上記の（ａ）配列からなるオリゴヌクレオ
チドまたは（ａ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用い、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子
を特異的に増幅させるためには、まず検体１＝ｌ−１１
ご存在する非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス核酸（ＲＮＡ）の抽
出が行なわれる。

血漿からのＲＮＡの抽出方法としては、例えばプラトレ
イ　（Ｂｒａｄｌｅｙ、口、１ｌｌ）らの方法〔ガスト
ロエンテロロジ−（ＧａＳｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ
）　、第８８巻、７７３−７７９頁、１９８５年〕、グ
アニジン・チオシアネート、酢酸ソーダ等を添加したの
ち、フェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出するチャメジンスキー（Ｐ、Ｃｈａｍｅｚｙ
ｎｓｋｉ）　らの方法〔アナリティカル　オブ　バイオ
ケミストリー　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、
第１６２巻、１５６頁、１９８７年〕、ショ糖密度勾配
遠心法により沈澱物を得、該沈澱物をグアニシンチオシ
アネートに溶解して得られた溶液をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコールで抽出する有高らの方法
〔モダンメディシン、第１７巻、９１頁、１９８８年〕
等が用いられる。

これらの方法により目的とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
遺伝子を単離することができる。

ついで、得られたＲＮＡを用いて、先の工程（イ）〜（
ト）の反応を行なう。

工程（イ）において、逆転写酵素としては、例えば、ラ
イフサイエンス社製の逆転写酵素など汎用のものが用い
られる。プライマーをハイブリダイズさせるアニーリン
グ操作は、通常３７〜６０℃の範囲の温度、好ましくは
５５〜６０℃の範囲の温度で１〜３分間、好ましくは１
〜２分間行なわれる。

伸長物（ａ）を取得するた必の伸長反応は、通常７０〜
７３℃の範囲の温度、好ましくは７２〜７３℃の範囲の
温度で、１〜３分間、好ましくは１〜２分間実施される
。

工程（ロ）、（ニ）および（へ）での伸長物の遊離は種
々の公知の方法により行なわれるが、熱変性により行な
うのが好ましい。熱変性は通常９０〜９５℃の範囲の温
度、好ましくは９４〜９５℃の範囲の温度で１〜３分間
、好ましくは１〜２分間加熱することにより行なわれる
。

工程（ｂ）および（ホ）において、ＤＮＡポリメラーゼ
としては公知の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが用いられ、
例えば、宝酒造株式会社製のＤＮＡポリメラーゼなどが
用いられる。プライマーのアニーリング操作および伸長
反応は上記の工程（イ）の場合と同様にして行なわれる
。これら工程（ｂ）〜（へ）の反応を１ザイクルとし、
通常１５〜５０回、好ましくは２５〜５０回程度繰り返
して実施する。

増幅された遺伝子の検出方法としては、工程（ｂ）〜（
へ）の反応を繰り返し行なって得られた反応混合液をメ
ンブレンにドツトブロッティングするか、または電気泳
動的手法で分離後メンブレンにブロッティングしたのち
、予想される増幅領域の一部でかつ、プライマーと重複
しない核酸配列の標識体をプローブとして用いるか、ま
たは増幅遺伝子の一部を例えばｐＨｃ−１９等のプラス
ミドに組み込んだのち、標識したものをプローブとして
用いる。標識方法としては、例えばラジオアイソトープ
標識法、ビオチン標識法、蛍光標識法、ヂゴキシゲニン
標識法その他の公知の方法が用いられる。これらの方法
で標識化した一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを、ブロッティングした
ザンプルにハイブリダイズする条件下で作用させる。そ
の後、通常の検出方法により目的とする非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルス遺伝子を検出することができる。また、増幅遺
伝子を電気泳動的手法で分離後、エチジウムブロマイド
により染色することにより、標識プローブとハイブリダ
イズさせることなく検出することもできる。

〔作用・効果〕

非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の遺伝子増幅において、
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
ことにより、検体中に含まれる非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
由来の核酸配列を特異的に増幅させることができる。

従って、本発明によりこれまで検体中に微量にしか存在
しないため検出が困難であった非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
の存在を、より簡単に、かつより特異的に検出すること
が可能となった。

また、本発明の一方のオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いることにより非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの核酸
配列を特異的に伸長し、逆転写産物を得、この逆転写産
物を他方のオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、
先のオリゴヌクレオチド伸長物から非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスに特異的な配列を見い出すことができる。従って、
本発明により非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの新規な核酸配列
を見い出すことが可能である。

〔実施例〕

以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない
。

実施例　１ 非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体陽性者血清１０ｍ１から常
法により抽出したＲＮＡのイソプロパツール溶液にその
１／１０容量の３Ｍ酢酸すトリウム溶液（ｐＨ５）を添
加し、水冷下１５０００ｒｐｍで１５分間遠心処理した
。得られた沈澱物を１　ｍＭ−ＢＤＴ八を含む１０ｍＭ
−）リス緩衝液　（Ｔロバッファー）１０μｍに溶解し
、この溶液をＲＮＡ画分とした。このＲＮＡ画分１μｍ
　、５０ｍＭの塩化カリウムを含む１００ｍＭ　）　’
Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８，３；アニーリングバッファー
）０．５μｍおよび一方のプライマーとしてＣＴＣＣＴ
ＴＴＴＴＣＴＡＡＴＣＴＧＡＴ八　を、他方のプライマ
ーとしてＡ＾ＡＧＧＧＡＧＡＡ　ＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧ
　　を各０．７μｇ用い、逆転写酵素（ライフサイエン
ス社製　２０［１／ｍｌ）　０．５μｍ、逆転写酵素バ
ッファー（組成：　４５０ｍＭ　）　ＩＪスス−酸バッ
フ　７−、　ｐＨ８，３，３７５ｍＭ塩化カリウム、６
０ｍＭ塩化マグネシウム）　　２　μｌ　、１００ｍＭ
ヂチオスレイトール２　μｌ　、２ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍ
ｉｘ、　２　μｍ　′Ｊ６よび蒸留水で２０μｍとし、
この溶液を４３℃で１時間反応させたのち、反応混合液
に緩衝液（組成：１ｍＭ　）リスー塩酸バッフｙ　　、
　ｐｉ（８，３，４２０ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化
マグネシウム、０．１％ゼラチン）　１０μＩを加え、
ポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）および２　ｍＭ　ｄ
ＮＴＰ　ｍｉｘ、を用いて９４℃で１分間（変性工程）
、５５℃で２分間（アニーリング工程）、７２℃で１分
間（伸長工程）のサイクルを５０回繰り返し、最後に７
２℃で７分間反応させたのち、反応を停止した。反応混
合液をアクリルアミドゲル電気泳動に付し、エチジウム
ブロマイドで染色したところ、ＤＮＡマーカーであるφ
ｘ１７４のＨａｅ　ＩＩＩ消化物の１１８ｂｐと１９４
ｂｐの間に明確なバンドを認めることができた（第１図
の（ａ）および（ｂ））。他の各マーカーの泳動距離を
測定して得られた検量線から、このものは予想された増
幅領域の長さに相当する１８０ｂｐと計算された。

実施例２ 実施例１における増幅領域に相当する部分のＣＣＴＧＧ
ＧＴＴＡＴ　ＴＴＧＴＴＧＣ［：ＧＴ　　からなるオリ
ゴヌクレオチドを５°末端標識法（メガラベルキット、
宝酒造株式会社製）によりＲＩ　　（”Ｐ−ＡＴＰ、ア
マジャム社製）標識化し、標識プローブを作成した。

実施例１で増幅され、アガロースゲル電気泳動で分離さ
れた増幅産物をナイロン膜（ｂイボンドＮ１アマジャム
社製）に転写（サザンブロッテイング）し、さきの標識
プローブと４　Ｘ５ＳＣ，２ｘＤｅｎｈａｒｄｔおよび
０．５％ＳＤＳからなる溶液中で反応させた。

そののち非特異的吸着物を除くた必に２ＸＳＳＣと１％
ＳＯ３とからなるバッファーおよび０．ｌＸ５ＳＣで順
次洗浄したのち、得られた膜をイメージアナライザー　
（モデルＢＡ１００型、富士写真フィルム株式会社製）
で分析したところ、実施例１で認められた第１図の（ａ
）のバンドに相当する部分に明確に反応するスポットを
認めた。またプライマーとして用いたオリゴヌクレオチ
ドを、ＤＮ八へ成機（ＡＢ１３８０Ｂ　、アプライド社
製）により５゛末端をアミノリンク化し、ビオチン−ｘ
ｘ−エステル（クロンチック社製）と反応させ、ビオチ
ン化プライマーを作成したのち、増幅反応に付し、得ら
れた反応混合液をアガロースゲル電気泳動に付し、サザ
ンブロッティングした。この膜を、ストレプトアビジン
−アルカリフォスファターゼコンジュゲートにより検出
したところ、実施例１で認められた第１図の（ａ）のバ
ンドに相当する部分に明確に反応するスポットを認めた
。

実施例３ 実施例２に用いたオリゴヌクレオチドをＤＮＡテーリン
グキット　（ベーリンガーマンハイム社製）を使用して
ヂゴキシゲニン標識し、非Ｒ１標識化したプローブを作
成した。実施例１で増幅され、アガロースゲル電気泳動
で分離された増幅産物をナイロン膜に転写し、さきの標
識プローブと４　ｘＳＳＣ，２ｘＤｅｎｈａｒｄｔ　′
Ｊ６よび０．５％ＳＯ８からなる溶液中で反応させた。

そののち非特異的吸着物を除くすこめに２ＸＳＳＣと１
％ＳＤＳとからなるバッファーおよび０．１ＸＳＳＣで
順次洗浄したのち、得られた膜を抗ジゴキシゲニン・ア
ルカリフォスファターゼコンジュゲートにより、交雑Ｄ
ＮＡを検出したところ、実施例１で認められた第１図の
（ａ）のバンドに相当する部分に明確に反応するスポッ
トを８忍狛た。

実施例４ 実施例１で増幅反応で得られた反応混合液をアガロース
ゲル電気泳動に付し、エチジウムブロマイド染色により
検出された増幅領域に相当するバンド部分の増幅産物を
ウルトラフ！ｌ−Ｃ３Ｔ　（ミリポア社製）を用いてゲ
ルより回収し、ポリヌクレオチドキナーゼ処理すること
により５゛末端を燐酸化した。これを、ブルースクリプ
トのＳ　ｍ　ａＩサイトに組み込み、大腸菌（ＨＢＩＯ
Ｉ）に感染させ、組換えプラスミドを公知の方法により
調製した。このプラスミドをセシウムクロライドを用い
て超遠心により精製し、ＤＮＡシークエンサ−（ＡＢＩ
３７０Ａ、アプライド　バイオシステムズ社製）により
遺伝子配列を確認したところ、予想される増幅領域と一
致した。

実施例５ 実施例１において一方のプライマーとしてＴＡＡＴＣＴ
ＧＡＴＡ　ＴＧＣＧＴＣＣＴＴＣを用い、かつ他方のプ
ライマーとしてＧＣＣＡＧ［：ＡＡＴＧ　ＧＡＧＡＡＧ
ＣＣＧＡ　　を用いた以外は同様にして反応を行ない、
得られた反応混合液を同様にして電気泳動に付したとこ
ろ、予想された増幅領域の長さにほぼ相当する１５０ｂ
ｐのところに明確なバンドを認めることができた。

参考例１ 実施例１において一方のプライマーとしてＧＡＧＴＴＴ
ＴＴＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴ　　を用い、かつ他方の
プライマーとしてＡＴＣ八ＴへＣＣＴＧ　ＡＣＡＧＧＧ
八ＡＧＴ　へを用いる以外は同様にして反応を行い、得
られた反応混合液を同様にして電気泳動に付したところ
、予想されるＣ−１００抗原の部分領域（１９２ｂｐ）
にバンドを認めることができなかった〔第１図の（Ｃ）
〕。

【図面の簡単な説明】

第１図の（ａ）は実施例１で得られた増幅産物をアクリ
ルアミドゲル電気泳動に付した結果を示す図であり、（
ｂ）はマーカーとして用いたφＸ１７４の■ａｅｌＩ［
消化物をアクリルアミドゲル電気泳動に付した結果を示
す図であり、（Ｃ）は参考例１で得られた産物をアクリ
ルアミドゲル電気泳動に付した結果を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の（ａ）もしくは（ｂ）配列からなるオリゴ
   ヌクレオチド、または（ａ）もしくは（ｂ）配列のうち
   、それぞれ（ａ）配列においては、少なくともＴＡＡＴ
   ＣＴＧＡＴＡを、（ｂ）配列においては、少なくともＧ
   ＣＣＡＧＣＡＡＴＧを一部に有する１５〜４９個の塩基
   からなる（ａ）配列断片または（ｂ）配列断片であるオ
   リゴヌクレオチド。 （ａ）：【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項（１）記載の（ａ）配列からなるオリゴヌ
   クレオチドまたは該（ａ）配列断片であるオリゴヌクレ
   オチドを一方のプライマーとし、かつ請求項（１）記載
   の（ｂ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは該（ｂ
   ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを他方のプライマ
   ーとして用いてＤＮＡの複製反応を繰り返すことにより
   、上記のオリゴヌクレオチドの伸長物同士のハイブリッ
   ドを増幅することを特徴とする増幅工程と、増幅された
   該ハイブリッドを検出する工程を有することを特徴とす
   る非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の検出方法。
3. （３）増幅工程が下記の（イ）〜（ト）の工程である請
   求項（２）記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子の検出
   方法。 （イ）検体中の標的ヌクレオチド（ＲＮＡ）に対し、請
   求項（１）記載の（ａ）配列からなるオリゴヌクレオチ
   ドまたは該（ａ）配列断片であるオリゴヌクレオチドを
   プライマーとし、４ 種の異なったヌクレオシドトリフオスフェ ートを逆転写酵素と反応させることにより、該オリゴヌ
   クレオチドの伸長物（伸長物 （ａ））−ＲＮＡハイブリッドを作成すること。 （ロ）工程（イ）で得られたハイブリッドから伸長物（
   ａ）を遊離させること。 （ハ）工程（ロ）で得られた伸長物（ａ）を鋳型とし、
   請求項（１）記載の（ｂ）配列からなるオリゴヌクレオ
   チドまたは該（ｂ）配列断片であるオリゴヌクレオチド
   をプライマーとし、４種 の異なったヌクレオシドトリフオスフェー トをＤＮＡポリメラーゼと反応させること により伸長物（ａ）−該オリゴヌクレオチドの伸長物（
   伸長物（ｂ））ハイブリッドを作成すること。 （ニ）工程（ハ）で得られた伸長物（ａ）−伸長物（ｂ
   ）ハイブリッドから伸長物（ａ）および伸長物（ｂ）を
   それぞれ遊離させること。 （ホ）工程（ニ）で得られた伸長物（ｂ）を鋳型とし、
   （ａ）配列からなるオリゴヌクレオチドまたは（ａ）配
   列断片であるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、４
   種の異なったヌクレ オシドトリフオスフェートをＤＮＡポリメ ラーゼと反応させることにより、伸長物（ａ）−伸長物
   （ｂ）ハイブリッドを作成すること。 （ヘ）工程（ホ）で得られたハイブリッドをそれぞれ遊
   離させること。 （ト）必要に応じ、工程（ハ）〜（ヘ）を繰り返し実施
   することによって伸長物（ａ）−伸長物（ｂ）ハイブリ
   ッドを増幅させること。