JPH04135496A - グリコサミノグリカンの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬ
Ｃという）によるグリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧ
という）の分析に必要な前処理キットに関するものであ
る。

（従来の技術） 体液や組織中の各種ＧＡＧの分析は、ＧＡＧの生理機能
や、変形性関節症や慢性関節リウマチなどの結合組織疾
患の病態を知る上で有用である。実際に、軟骨が破壊さ
れると、血清中のグラタン硫酸濃度が増加することや（
ＷｉｌｌｉａｍｓＪ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、：　Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、、　３１５５７（１９８
８１）、肝炎では、血清中のヒアルロン酸濃度が増加す
ることが報告されている（Ｌａｕｒｅｎｔ、　Ｅ。

Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、　５
．６３８　（１９８５１１゜これらの研究では、ケラタ
ン硫酸の抗体やヒアルロン酸に対する特異的結合タンパ
クを用いて、目的のＧＡＧを定量している。抗体や特異
的結合タンパクを用いる方法は簡便で、高感度であるが
、ＧＡＧの硫酸含有量に関する知見は得られず、使用す
る抗体および検量線作製用の標準ＧＡＧの種類によって
定量結果が変動する欠点がある。

方、ＨＰＬＣによるＧＡＧの分析方法は前処理が繁雑で
ある反面、ＧＡＧの量及び硫酸含有量を度に分析できる
利点を有している。

ＨＰＬＣによるＧＡＧの分析は、通常、目的とするＧＡ
Ｇを特異的分解酵素で分解し、得られた三糖をＨＰＬＣ
で分離及び定量する方法が用いられる。ＨＰＬＣで定量
する場合、特異性と感度を高めるために、２−シアノア
セトアミド等により、ＧＡＧの三糖を螢光体に変えるポ
ストカラム螢光検出や、グンシルヒドラジン等を用いる
プレラベル螢光検出が一般に用いられる。

体液や組織中のＧＡＧをＨＰＬＣで分析する際には、通
常、以下のような手順を経ることになる。

ｌ）組織の溶解と、プロテオグリカンとしてタンパクと
結合しているＧＡＧの遊離を目的として、プロテアーゼ
を用いて試料を消化する。

２）陰イオン交換体、または、ＧＡＧに対するアフィニ
ティーゲルを充填したカラムを使用して、プロテアーゼ
消化液中のＧＡＧを単離する。

３）単離されたＧＡＧを対応する特異的分解酵素で消化
する。

４）消化液中のＧＡＧの三糖を、他の未消化のＧＡＧや
不純物から分離するために、分画分子量１万程度の限外
濾過膜で濾過する。

５）得られた７戸液をＨＰＬＣに注入し、ＧＡＧの三糖
に対して高感度かつ高特異性の検出法を用いて分析する
。

血清や尿中のヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸に関し
ては、概ねこの手順にしたがった分析例が報告されてい
る（Ｔｏｙｏｄａ、　Ｈ，、ａｔ　ａｌ、　：　Ａｎａ
ｌＳｃｉ、、　４．３８１　（１９８８１，Ｓｈｉｎｏ
ｍｉｙａ、　Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、：Ｃｈｅｍ、　Ｐｈ
ａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　３４．４８８７　（１９８６
））。

上述の手順に従ってＧＡＧを分析する場合、分析者は必
要な酵素、前処理用カラム、限外？濾過膜等を個別に用
意しなければならず、繁雑である。さらに、ＧＡＧ分析
の前処理における諸条件を決定する際には、ＧＡＧの専
門知識が必要である。

（本発明が解決しようとする課題） 本発明は、ＧＡＧの専門知識を必要とせずに、ＨＰＬＣ
を用いてＧＡＧの分析を簡単に行うための前処理キット
を提供するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、１）組織消化用プロテアーゼ、２）ＧＡＧ単
離用カラム、３）脱塩用カラム、４〕ＧＡＧ特異的分解
酵素、５）限外濾過膜、及び６）ＧＡＧの標準二糖、か
らなるＨＰＬＣによるＧＡＧ分析用前処理キットを要旨
とするものである。

本発明のキットは、分析対象となる組織または体液とＧ
ＡＧに応じて、その構成数を変えることができる。−例
を第１表に示す。また、本発明のキットには必要に応じ
て各種緩衝液を添付してもよい。これらは本発明の構成
物を溶解または操作するために使用する。

組織消化用プロテアーゼとしては、あらゆる組織に対応
するために、基質特異性が低く、軟骨等も消化できる高
い分解活性を特徴とするものを使用する。たとえば、パ
パイン（ＥＣ３，４，２２，２）、キモパパイン（ＥＣ
３，４，２２，６）　、　　トリプシン（ＥＣ３，４，
２１，４）及びアクチナーゼＥ（科研製薬販売、商品名
）等を挙げることができる。

ＧＡＧ単離用カラムとしては、陰イオン交換体またはア
フィニティーゲルを充填したカラムを使用する。陰イオ
ン交換体としては、イオン交換基として第４級アンモニ
ウム基やジエチルアミノエチル基等の陽荷電を有する官
能基をポリスチレン等の樹脂（陰イオン交換樹脂）、ま
たは、セルロースやデキストラン等のゲル（陰イオン交
換ゲル）等の支持体に導入したものを使用し、交換容量
が大きく、高流速が得られるものが望ましい。陰イオン
交換樹脂の一例を第２表に、陰イオン交換ゲルの一例を
第３表に示す。また、アフィニティーゲルとしては、Ｇ
ＡＧの抗体または特異的結合タンパクを結合させたゲル
を使用する。

第３表　陰イオン交換ゲルの一例 商　　品 名 販売会社 ＢＤ−セル口 ス １０カラム（ファルマシア社販売、商品名）等を挙げる
ことかできる。

第４表　脱塩用ゲル濾過剤の一例 商　　品 名 販売会社 ＤＥＡＥ−セル口ファイン Ｑ−セファロース セレックスーＤ バイオゲル　Ｐ−６ＤＧ 脱塩用カラムとしては、分画分子量１万〜数百のゲル濾
過剤を充填したカラムを使用する。脱塩用カラムの充填
剤として使用できるゲル濾過剤の一例を第４表に示す。

また、適当なゲル濾過剤を充填しであるカラムも使用で
きる。例えば、ＰＤＧＡＧ特異的分解酵素としては、第
５表に示す酵素であって、対象とするＧＡＧに応じて第
５表に示すような組み合わせを必要とする。

ＧＡ′Ｇの三糖分離用の限外濾過膜としては、分画分子
量数千〜敵方のものを使用し、ＧＡＧ二糖三糖着がなく
、小液量の試料の処理に適したものが望ましい。たとえ
ば、ウルトラフリーＣ３ＧＧ（ミリボア社販売、商品名
、分画分子量１万）、ウルトラフリーＣ３７Ｋ　（ミリ
ボア社販売、商品名、分画分子量３万）、ミニセント−
１０（トーソー販売、商品名、分画分子量１万）、ミニ
セント−３０（トーソー販売、商品名、分画分子量３万
）、ウルトラセント−１０（トーソー販売、商品名、分
画分子量１万）、ウルトラセント−３０（トーソー販売
、商品名、分画分子量３万）、セントリカット−１０（
クラボウ販売、商品名、分画分子量１万）、セントリカ
ット−２０（クラボウ販売、商品名、分画分子量２万）
セントリフローＣＦ２５　（ブレースジャパン販売、商
品名、分画分子量２万５千）、セントリープレツブ−１
０（同、分画分子量１万）、セントリーブレツブ−３０
（同、分画分子量３万）、ＭＰＳ−１、ＹＭ、Ｔメンブ
レン（同、分画分子量１万）、ＭＰＳ−３、（同、分画
分子量１万）等を挙げることができる。

ＧＡＧの標準二糖は、ヒアルロン酸由来の不飽和三糖（
△Ｄｉ−ＨＡ）、コンドロイチン硫酸由来の不飽和三糖
（△Ｄｉ−Ｏ８、△Ｄｉ−４Ｓ、△Ｄｉ−６Ｓ等）、ケ
ラタン硫酸由来の三糖（ＤｉＫＳ−Ｇａｌ−ＧＮ　（６
Ｓ）、ＤｉＫＳＧａｌ　（６Ｓ）・ＧＮ（６Ｓ））、ヘ
パラン硫酸由来の不飽和三糖（△ＤｉＨ３−Ｏ５、△Ｄ
ｉＨ５−６Ｓ、△ＤｉＨ５−ＮＳ等）から構成される。

これらの標準二糖は、分析対象となるＧＡＧの種類に応
じて、その種類を変えることができる。

必要に応じて添付される緩衝液としては、５０ｍ１Ｊト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）、４１ＪＬｉＣｊ２を含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）、１０ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）　、　　１０ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）等を挙げることが
できる。

［実施例］ 次に説明する注１）〜注３）は、実施例に使用する単位
または略号を示す。

注１）ＴＲＵは濁度減少単位（ＴｕｒｂｉｄｉｔｙＲｅ
ｄｕｃｉｎｇ　Ｕｎｉｔｌの略で、ｐＨ６，０，６０℃
、３０分間に、Ａ　ａａａを５０％減少する酵素量；注
２）ＩＵは各基質から１分間に１　ｐｍｏｌの三糖また
はそれに相当する還元未満を遊離する酵素量 注３）ＧＡＧ及びそれらの三糖の略記法は以下の通り ＨＡ；ヒアルロン酸 Ｃ８：コンドロイチン硫酸 ＤＳ＝デルマクン硫酸 ＫＳ：ケラクン硫酸 △Ｄ　ｉ　−ＨＡ　：β−△４−グルクロノシル（１→
３）−Ｎ−アセチルグルコサミン△Ｄｉ−Ｏ３：β−Δ
４−グルクロノシル（ｌ→３）−Ｎ−アセチルガラクト
サミン△Ｄｉ−４Ｓ、△Ｄｉ−６Ｓ：△Ｄｉ−Ｏ９のガ
ラクトサミンの４−１または６−硫酸エステル ＤｉＫＳ−Ｇａｌ−ＧＮ　（６Ｓ）：β−ガラクトシル
−（１→４）−６−０−スルホ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミン ＤｉＫＳ−Ｇａｌ　（６Ｓ）　　・ＧＮ　（６Ｓ）：６
−〇−スルホ−β−ガラクトシル−（ｌ→４）６−０−
スルホ−Ｎ−アセチルグルコサミン実施例１ 本発明のキットを用いたヒト髄核および線維輪軟骨のヒ
アルロン酸、コンドロイチン硫酸及びケラクン硫酸のＨ
ＰＬＣによる分析例 ［試料の前処理法とＧＡＧの分析法］ １）組織の消化 凍結乾燥したヒト髄核４点（１２〜４６オ）及び線維輪
軟骨３点（３２〜５５才）の５〜１０ｍｇを精秤したの
ち、２．５％（Ｗ／Ｖ）のアクチナーゼＥ（科研製薬販
売、商品名）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，６）を２−加え、５５°Ｃで１５時間消化した。

２）ＧＡＧの単離 アクチナーゼ消化液を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，６）で平衡化しであるＱ−セファロースカラム
（ファルマシア社販売、商品名）に負荷し、同一緩衝液
で洗浄した。次に、４ＭのＬｉＣρを加えた同一緩衝液
でＱ−セファロースに吸着したＧＡＧを溶出した。

３）脱塩 溶出液中の塩を除くために、溶出液を蒸留水で洗浄しで
あるＰＤ−１０カラム（セファデックスＧ−２５を充填
した脱塩用カラム；ファルマシア社販売、商品名）に負
荷し、ＧＡＧ部分を回収した。この回収液（３，５−）
にはＧＡＧとしてＨＡ、、Ｃ３，ＫＳ、ＤＳ等が含まれ
ている。この回収液をＧＡＧ特異的分解酵素消化用の試
料とした。

４）ＨＡの消化と不飽和三糖の分離 試料２００−にストレプトミセス由来のヒアルロニダー
ゼ（生化学工業販売）２ＴＲＵ”／２０パ、１０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨｅ、０）８０ｔｔｌ’及び蒸
留水１００パを加えて、５５℃で２時間消化した。次に
、消化液を分画分子量１０，０００の遠心限外？濾過チ
ューブ（ウルトラフリーＣ３ＧＣ：ミリボア社販売、商
品名）で遠心限外？濾過した。炉液中には、ＨＡの不飽
和六糖及び不飽和四糖が回収される。この不飽和六糖及
び不飽和四糖を不飽和三糖にするために、炉液３００ｐ
１にストレプトコッカス由来のヒアルロニダーゼＳＤ（
生化学工業販売）　１５ｍＵ２）／　３０ｐｌ。

を加え、３７℃で２時間消化し、前述の遠心限外濾過チ
ューブで限外濾過した。得られた炉液をＨＰＬＣ用の試
料とした。

５）Ｃ３の消化と不飽和三糖の分離 試料２０μにコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業販
売）　１００ｍＵ”／　２０ｐＪ！、１’ＯｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，０）８０ｕ及び蒸留水２８０
−を加え、３７°Ｃで２時間消化した。デルマタン硫酸
（ＤＳ）構造に関する知見を得るために、コンドロイチ
ナーゼＡＢＣの代わりにコンドロイチナーゼＡＣ−ＩＩ
（生化学工業販売）１００ｍＵ”　／　２０　ｇｌ、ｐ
Ｈ，８，，０の酢酸ナトリウム緩衝液の代わりにｐＨ６
，０の酢酸ナトリウム緩衝液を使用して、試料２０ｔｔ
＋’を同様に消化した。消化液を分画分子量１０．００
０の遠心限外濾過チューブで濾過し、得られた炉液なＨ
ＰＬＣ用の試料とした。

６）ＫＳの消化と三糖の分離 試料２００μにケラタナーゼＩＩ　（生化学工業販売）
　５ｍＵ”／　５０ｐｌ！、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６，０）　８０ｐＩ！及び蒸留水７０パを加
え、３７℃で４時間消化した。消化液をＨＡやＣ８の場
合と同様に遠心限外濾過し、得られた２戸液をＨＰＬＣ
用の試料とした。

７）ＨＰＬＣによる分析 アミノプロピル基を結合させたシリカゲル（ＹＭＣゲル
ＰＡ　　１２０Ａ　　Ａ−５：山村化学販売、商品名）
を充填した内径４ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレススチ
ールカラムを使用し、試料および標準二糖として既知濃
度の△Ｄ　ｉ　−ＨＡ△Ｄｉ−Ｏ３，△Ｄｉ−４５、△
Ｄｉ−６Ｓ。

Ｄ　ｉ　ＫＳ−Ｇａ　１　・ＧＮ　（６Ｓ）　、さらに
ＤｉＫＳ−Ｇａｌ　　（６Ｓ）　　・ＧＮ　（６Ｓ）を
、それぞれ６０分間の０〜１００ｍＭ　Ｎａ２ＳＯ４の
直線的濃度勾配（流速＋　０．５−／ｍ１ｎ）により溶
出した。溶出液に１％（Ｗ’／Ｖｌの２−シアノアセト
アミドを含む１ｏｏｒ＋＋Ｍ四ホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，０）を０．５−／ｍｉｎの流速で混合した後
、１３０℃に加熱した容量５−１長さ１０ｍの反応チュ
ーブを通過させ、励起波長３３１　ｎｍ、螢光波長３８
３ｎｍで検出した。

標準二糖の検出結果より検量線を作製し、該検量線から
試料中のそれぞれの三糖量な求めた。

髄核中のＣ８とＫＳのクロマトグラムを第１図及び第２
図に、髄核４点、線維輪軟骨３点の分析結果を第６表及
び第７表に示す。コンドロイチン由来の不飽和三糖（Δ
Ｄｉ−Ｏ３）’″ｔはＨＡ由来の不飽和三糖（△Ｄｉ−
ＨＡ）”と同位置に溶出されるため、△Ｄｉ−Ｏ３量は
コンードロイチナーゼＡＢＣ消化で得られた△Ｄｉ−Ｏ
５と△Ｄｉ−ＨＡの合計量から△Ｄ　ｉ　−ＨＡの量を
差し引いて算出した。また、ＤＳ構造由来の不飽和三糖
（△Ｄｉ−４Ｓ）”量は、コンドロイチナーゼＡＢＣ消
化で得られたΔＤｉ−４３の量からコンドロイチナーゼ
Ａ　Ｃ−ＩＩ消化で得られた△Ｄｉ−４８の量を差し引
いて算出した。

実施例２ 本発明のキットを用いたヒト病態関節液中のヒアルロン
酸及びコンドロイチン硫酸のＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析例 ［試料の前処理とＧＡＧの分析法］ 関節液の場合、ＨＰＬＣの分析を妨害する成分の量が少
ないため、プロテアーゼによる消化、カラムによるＧＡ
Ｇの単離及び脱塩の操作は必要ない（第１表参照）。Ｈ
Ａ及びＯ８の消化と不飽和三糖の分離から行う。

ｌ）関節液 分析した関節液の概略は以下の通り。変形性膝関節症（
以下、ＯＡという）の関節液は２２名分で、女性が１６
名、男性が６名である。年齢は４５オ〜７９才（平均５
９．５才）である。慢性関節リウマチ（以下、ＲＡとい
う）の関節液は、１７名分で、女性が１４名、男性が３
名である。年齢は３６オ〜８０才（平均５８．１才）で
ある。外傷性膝関節症（以下、ＴＡという）の関節液は
、１４名分で、女性が１０名、男性が４名である。年齢
は１６オ〜７１才（平均３７．８才）である。

２）ＨＡ及びＣ８の消化と不飽和三糖の分離関節液を蒸
留水で１０倍に希釈した後、その２’００ｔＬＩ’にＩ
Ｕ／１ｎＩのＣＨａｓｅＡＢＣ液を５０７ｔ！’加え、
３７°Ｃで２時間消化した。消化液を分画分子量１０．
０００の遠心限外濾過チューブ（ウルトラフリーＣ３Ｇ
Ｃ：ミリポア社販売、商品名）で遠心限外濾過した。得
られた炉液のｌｏｄをＨＰＬＣに注入した。

３）ＨＰＬＣによる分析 アミノプロピル基を結合させたシリカゲル（ＹＭＣゲル
ＰＡ　　１２０Ａ　　Ｓ−５：山村化学販売、商品名）
を充填した内径４ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレススチ
ールカラムを使用し、試料および標準二糖として既知濃
度の△Ｄ　ｉ　−ＨＡ、△Ｄｉ−４Ｓ、さらに△Ｄｉ−
６５をそれぞれ６０分間の０〜１００ｍＭ　Ｎａ２５ｏ
４の直線的濃度勾配（流速度・０．５−／ｍ１ｎ）によ
り溶出した。溶出液に１％の２−シアノアセトアミドを
含む１００ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０
）を０．５ｍｆｆ／ｍｉｎの流速で混合した後、１３０
℃に加熱した容量５−１長さ１０ｍの反応チューブを通
過させ、励起波長３３１　ｎｍ、螢光波長３８３ｎｍで
不飽和三糖を検出した。

標準二糖の検出結果より検量線を作製し、該検量線から
試料中のそれぞれの三糖量な求めた。

ヒトＯＡ関節液とヒトＲＡ関節液のクロマトグラムをそ
れぞれ第３図と第４図に示す。ヒトＯＡ関節液では、△
Ｄｉ−４３に比べて△Ｄｉ−６３が多いのに対し、ＲＡ
関節液では△Ｄｉ−４５の方が多いことがクロマトグラ
ムから判断できる。関節液中の△Ｄｉ−ＨＡｆＪ度の分
析結果を第５図に示す。△Ｄ　１−ＨＡ濃度はＲＡ及び
ＴＡで、ＯＡに比べて有意に低かった。Ｃ８の△Ｄｉ−
６Ｓ濃度の分析結果を第６図に示す。△Ｄｉ−６Ｓ濃度
はＲＡでＯＡに比べて有意に低く、ＴＡで有意に高かっ
た。一方、Ｃ８の△Ｄｉ−４５濃度については、ＲＡ及
びＴＡでＯＡに比べて有意に高い濃度を示した。結果を
第７図に示す。△Ｄｉ−６Ｓと△Ｄ　１−４３の総量の
濃度については、ＲＡでＯＡに比べて有意に低く、逆に
ＴＡでＯＡに比べて有意に高かった。結果を第８図に示
す。△Ｄ　１−４Ｓと△Ｄｉ−６Ｓの比の結果を第９図
に示す。ＯＡ及びＴＡでは、比は約０．３前後であった
のに対し、ＲＡては１．０を越えていた。

（発明の効果） 本発明のキットとＨＰＬＣを用いることにより、実施例
１の記載のように体液または組織中のＧＡＧの分析を簡
単に行うことができる。

また実施例２のように本キットで関節液を前処理するこ
とにより、関節液中のＨＡ及びＣ８の量とＣ８の異性体
組成なＨＰＬＣを用いて簡単に分析することが可能であ
り、これらの結果が、ＯＡ、ＲＡ及びＴＡの病態鑑別の
指標の一つに成り得ることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ髄核中のＯ８とＫＳのクロ
マトグラムを示す。第３図及び第４図はそれぞれヒトＯ
Ａ関節液とヒトＲＡ関節液のクロマトグラムを示す。第
５図は△Ｄ　ｉ　−ＨＡの、第６図は△Ｄｉ−６５の、
第７図は△Ｄｉ−４３の、第８図は△Ｄｉ−６３十Ｄｉ
−４３の濃度の分析結果を示す。第９図は△Ｄｉ−４Ｓ
と△Ｄｉ−６Ｓの濃度の比を示す。 熔菰時間 溶 ヱ 時間 熔ヱ時聞 （分） 第 図 ５容 ヱ 時 聞 （修） Ｓ９−！Ｏ／Ｓヤー１０ （１ＬＬＩ／１０ＬＬｌｕ）Ｓシーｊ（ＩＶ■ ψ 寸 へ （１田ハＯｗｕ）ｖＨ−！０ ζｂ （ＩＬＵ／ｌ０ＬＬＩＬＩ）　５ｔｙ−！Ｏ＋９９−！
０ｖ（１田ハ０田’）Ｓ９−ｊ（ｌｖ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プロテアーゼ、グリコサミノグリカン単離用カラム、脱
   塩用カラム、グリコサミノグリカン特異的分解酵素、限
   外濾過膜及びグリコサミノグリカンの標準二糖からなる
   高速液体クロマトグラフィーによるグリコサミノグリカ
   ン分析用前処理キット。