JPH04135500A - 遺伝子検出方法 - Google Patents
遺伝子検出方法Info
- Publication number
- JPH04135500A JPH04135500A JP25901490A JP25901490A JPH04135500A JP H04135500 A JPH04135500 A JP H04135500A JP 25901490 A JP25901490 A JP 25901490A JP 25901490 A JP25901490 A JP 25901490A JP H04135500 A JPH04135500 A JP H04135500A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dna
- solution
- pcr
- deoxyribonucleoside triphosphate
- Prior art date
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- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
（産業上の利用分野）
この発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を特異
的に検出する遺伝子検出方法に関する。
的に検出する遺伝子検出方法に関する。
（従来の技術）
遺伝子（ＤＮＡ）にコードされた遺伝情報はメツセンジ
ャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質として表現され
、これらのタンパク質の働きにより生成した様々な化合
物の集合体として生物が存在する。このような遺伝子の
総数はヒトで５〜ｌＯ万といわれているが、その中に何
らかの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生じるこ
とがある。
ャーＲＮＡを介して酵素等のタンパク質として表現され
、これらのタンパク質の働きにより生成した様々な化合
物の集合体として生物が存在する。このような遺伝子の
総数はヒトで５〜ｌＯ万といわれているが、その中に何
らかの異常や変化（例えば、欠損、重複等）が生じるこ
とがある。
その場合には、生成するタンパク質の特性、種類、量な
どが変化し、その結果、生体系のバランスが崩れて疾病
を引き起こす。したがって、逆に、病因となっている遺
伝子を検出することにより、疾病の同定や予防が可能と
なる。近年の遺伝子工学の進歩に伴い、このような遺伝
子そのものに基づく診断（遺伝子診断と呼ばれている）
が可能になってきた。
どが変化し、その結果、生体系のバランスが崩れて疾病
を引き起こす。したがって、逆に、病因となっている遺
伝子を検出することにより、疾病の同定や予防が可能と
なる。近年の遺伝子工学の進歩に伴い、このような遺伝
子そのものに基づく診断（遺伝子診断と呼ばれている）
が可能になってきた。
遺伝子発現の機構を考えると、生化学的レベルでのほと
んどの変化に先行して遺伝子上での変化が生じているこ
とが推定される。したがって、遺伝子診断により、病気
という表現型での変化に先立つ（すなわち、発症前や病
気の潜伏期あるいは極めて初期の）診断や予測が可能と
なる。
んどの変化に先行して遺伝子上での変化が生じているこ
とが推定される。したがって、遺伝子診断により、病気
という表現型での変化に先立つ（すなわち、発症前や病
気の潜伏期あるいは極めて初期の）診断や予測が可能と
なる。
また、生体内の細胞の遺伝子は全て同一であるので、遺
伝性の疾患に関しては分析の対象となる臓器や組織は特
定されない。特に、胎児に関しては、妊婦から羊水を採
取して羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで
診断することができ、非常に重要な診断方法である。
伝性の疾患に関しては分析の対象となる臓器や組織は特
定されない。特に、胎児に関しては、妊婦から羊水を採
取して羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで
診断することができ、非常に重要な診断方法である。
一般に、遺伝子診断は次のように行なわれる。
まず、試料から遺伝子を抽出し、必要があれば適当な制
限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動にかけ
、その後サザンプロットを行なう。
限酵素で切断する。次に、この遺伝子を電気泳動にかけ
、その後サザンプロットを行なう。
次いで、目的とする遺伝子に対応する遺伝子プローブ（
通常は、放射性同位元素で標識されている）をハイブリ
ダイズさせた後、ａ（温でオートラジオグラフィーにか
けてＸ線フィルム上でｌ」的とする遺伝子の有無を確認
する。
通常は、放射性同位元素で標識されている）をハイブリ
ダイズさせた後、ａ（温でオートラジオグラフィーにか
けてＸ線フィルム上でｌ」的とする遺伝子の有無を確認
する。
（発明が解決しようとする課題）
しかしながら、この方法では、放射性同位元素を使用す
ることから検出を行なう場所が限定され、かつ試薬の取
扱いにも十分注意しなければならない。この点を改善す
るために、放射性同位元素に代わる安全なラベル剤の開
発も試みられている。
ることから検出を行なう場所が限定され、かつ試薬の取
扱いにも十分注意しなければならない。この点を改善す
るために、放射性同位元素に代わる安全なラベル剤の開
発も試みられている。
すでに、アビジン−ビオチン結合を利用するもの、酵素
や蛍光物質を使用するものなどが提案されているが、い
ずれも感度の点で放射性同位元素に劣り、さらに遺伝子
の検出までに少なくとも ２〜３日を要し、測定操作も
がなり複雑である。
や蛍光物質を使用するものなどが提案されているが、い
ずれも感度の点で放射性同位元素に劣り、さらに遺伝子
の検出までに少なくとも ２〜３日を要し、測定操作も
がなり複雑である。
したがって、この発明は、簡便に短時間で結果を得るこ
とができる、安全がっ高感度の遺伝子検出方法を提供す
ることを目的とする。
とができる、安全がっ高感度の遺伝子検出方法を提供す
ることを目的とする。
（課題を解決するための手段）
この発明による遺伝子検出方法は、
（ａ）試料ＤＮＡ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有す
る溶液を調製する工程と、（ｂ）該溶液を用いて、前記
デオキシリボヌクレオシド酸リン酸の消費を伴うポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション操作を行なう工程と、
（ｅ）前記工程（ｂ）終了後の溶液に核酸凝集剤を添加
する工程と、 （ｄ）溶液中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の含
有量をｉ’１１１１定する二り程とを具備することを特
徴とする。
ーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有す
る溶液を調製する工程と、（ｂ）該溶液を用いて、前記
デオキシリボヌクレオシド酸リン酸の消費を伴うポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション操作を行なう工程と、
（ｅ）前記工程（ｂ）終了後の溶液に核酸凝集剤を添加
する工程と、 （ｄ）溶液中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の含
有量をｉ’１１１１定する二り程とを具備することを特
徴とする。
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ： Ｐ
ＣＲ）法は、１９８５年にサイキらにより開発された、
特定の遺伝子配列のみを醇累を用いて増幅する方法であ
る（Ｓａｊｋｔ ｅｌ、ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 、
２３０．１３５０（１，９８５））。その反応原理を第
１図を用いて説明する。ＰＣＲ法においては、まず、試
料ＤＮＡＩを熱変成させて、−水路ＤＮＡ２に解離し、
次いで冷却してセンスおよびアンチセンスストランドの
両方に対してプライマー３のアニーリングを行なう。こ
のプライマーは目的とするＤＮＡ配列の上流側２０塩是
程度のＤＮＡ配列を有するものである。その後、ＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させて両路のプライマーの下流側に
相補鎖を合成させる。
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ： Ｐ
ＣＲ）法は、１９８５年にサイキらにより開発された、
特定の遺伝子配列のみを醇累を用いて増幅する方法であ
る（Ｓａｊｋｔ ｅｌ、ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 、
２３０．１３５０（１，９８５））。その反応原理を第
１図を用いて説明する。ＰＣＲ法においては、まず、試
料ＤＮＡＩを熱変成させて、−水路ＤＮＡ２に解離し、
次いで冷却してセンスおよびアンチセンスストランドの
両方に対してプライマー３のアニーリングを行なう。こ
のプライマーは目的とするＤＮＡ配列の上流側２０塩是
程度のＤＮＡ配列を有するものである。その後、ＤＮＡ
ポリメラーゼを作用させて両路のプライマーの下流側に
相補鎖を合成させる。
これにより、試料ＤＮＡと同一の塩基配列を有する二本
鎖ＤＮＡ４が２本形成される。この合成された二本鎖Ｄ
ＮＡを基にして、同様の方法をさらに繰り返すことによ
り、目的とするＤＮＡを大量に増幅させることができる
。
鎖ＤＮＡ４が２本形成される。この合成された二本鎖Ｄ
ＮＡを基にして、同様の方法をさらに繰り返すことによ
り、目的とするＤＮＡを大量に増幅させることができる
。
この発明の遺伝子検出方法は、前述のように、このＰＣ
Ｒ法を利用して行なうものである。
Ｒ法を利用して行なうものである。
ＰＣＲ法に供される反応溶液には、試料ＤＮＡ。
プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸が含まれる。ここて、溶液中
に含まれる試料ＤＮＡは、予め制限酵素等で処理したも
のであってもよい。また、プライマーは、前述のように
目的とするＤＮＡ配列の上流側２０塩基程度のＤＮＡ配
列を有するものであり、公知の方法によって合成するこ
とができる。プライマーは、センス側およびアンチセン
ス側の２種類が必要であり、各々過剰量が添加される。
リボヌクレオシド三リン酸が含まれる。ここて、溶液中
に含まれる試料ＤＮＡは、予め制限酵素等で処理したも
のであってもよい。また、プライマーは、前述のように
目的とするＤＮＡ配列の上流側２０塩基程度のＤＮＡ配
列を有するものであり、公知の方法によって合成するこ
とができる。プライマーは、センス側およびアンチセン
ス側の２種類が必要であり、各々過剰量が添加される。
さらに、デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、ＤＮＡ
ポリメラーゼによる相補鎖の合成の際に、その原料とし
て使用されるものであり、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ、Ｐ、ｄＣ
ＴＰおよびｄＴＴＰの４種類を含有する。耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、通常、Ｔａｑポリメラーゼが使
用される。
ポリメラーゼによる相補鎖の合成の際に、その原料とし
て使用されるものであり、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ、Ｐ、ｄＣ
ＴＰおよびｄＴＴＰの４種類を含有する。耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、通常、Ｔａｑポリメラーゼが使
用される。
ＰＣＲを実施するために必要な前記操作を行なった後の
反応溶液には、核酸を溶液中から除去するために核酸凝
集剤を添加する。核酸凝集剤としては、エタノール、フ
ェノール等の通常使用されるものを用いることができる
。
反応溶液には、核酸を溶液中から除去するために核酸凝
集剤を添加する。核酸凝集剤としては、エタノール、フ
ェノール等の通常使用されるものを用いることができる
。
最後に、核酸を除去した後の溶液中に含有されるデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸の量をＸ＋１定する。溶液
中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の含量は、例え
ば、 １９０〜３００ ｎｒｎの波長範囲における紫外
線吸収を利用することにより測定することかできる。
シリボヌクレオシド三リン酸の量をＸ＋１定する。溶液
中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の含量は、例え
ば、 １９０〜３００ ｎｒｎの波長範囲における紫外
線吸収を利用することにより測定することかできる。
（作用）
前述のように、ＰＣＲ法を用いると、１−１的とするＤ
ＮＡ配列を大量に増幅することが可能である。
ＮＡ配列を大量に増幅することが可能である。
この発明の遺伝子検出方法は、このＰＣＲ法を利用して
おり、試料ＤＮＡに検出しようとする遺伝ｒ配列か含ま
れる場合には、その遺伝ｒ配列か大量に増幅される。し
たがって、ＰＣＲが起こったかどうかを判定することよ
り、試料ＤＮＡ中に検出しようとする遺伝子配列が存在
するかどうかを判断することができる。ところで、ＰＣ
ＲによりＤＮＡが増幅される際には、ＤＮＡの原料とな
るデオキシリボヌクレオシド三リン酸が大量に消費され
る。この発明の方法は、この点に首「１し、ＰＣＨに必
要な操作の前後におけるデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸の含量を測定して比較することにより、ＰＣＲが起
こったかどうか、すなわち、検出しようとする遺伝子配
列か存在するかどうかを判定する。
おり、試料ＤＮＡに検出しようとする遺伝ｒ配列か含ま
れる場合には、その遺伝ｒ配列か大量に増幅される。し
たがって、ＰＣＲが起こったかどうかを判定することよ
り、試料ＤＮＡ中に検出しようとする遺伝子配列が存在
するかどうかを判断することができる。ところで、ＰＣ
ＲによりＤＮＡが増幅される際には、ＤＮＡの原料とな
るデオキシリボヌクレオシド三リン酸が大量に消費され
る。この発明の方法は、この点に首「１し、ＰＣＨに必
要な操作の前後におけるデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸の含量を測定して比較することにより、ＰＣＲが起
こったかどうか、すなわち、検出しようとする遺伝子配
列か存在するかどうかを判定する。
（実施例）
以下、この発明の詳細な説明する。
実施例］ ヒト血液中の肝炎ウィルス（ＨＢ Ｖ）遺伝
子の検出 肝炎患者および正常人から採取した血液試料を用いて、
ＨＢＶ遺伝子の検出を以下の通りに行なった。
子の検出 肝炎患者および正常人から採取した血液試料を用いて、
ＨＢＶ遺伝子の検出を以下の通りに行なった。
ます、常法に従い、血液試料から試料ＤＮＡを抽出し、
抽出した試料り、ＮＡを制限酵素！’ｓｌｌを用いて処
理した。制限酵素処理までの方法は、例えば、「臨床検
査Ｊ 、ｖｏｌＪ２、Ｎｏ、４．４０１頁（１９８８）
に記載されている。
抽出した試料り、ＮＡを制限酵素！’ｓｌｌを用いて処
理した。制限酵素処理までの方法は、例えば、「臨床検
査Ｊ 、ｖｏｌＪ２、Ｎｏ、４．４０１頁（１９８８）
に記載されている。
次に、試料ＤＮＡを、ＤＮＡシンセサイザ“ＰＣＲ−Ｍ
ＡＴＥ” （アプライド・バイオシステムズ社製）に入
れ、添ト１のマニュアルに従ってＰＣＲを行なった。反
応時間は １時間とした。また、耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。
ＡＴＥ” （アプライド・バイオシステムズ社製）に入
れ、添ト１のマニュアルに従ってＰＣＲを行なった。反
応時間は １時間とした。また、耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。
反応終了後、核酸凝集剤として反応液と等量のエタノー
ルを添加し、波長２５８ｎｍにおける吸光度をｄ１ζｊ
定した。この際、吸光度のΔｌｌｌ定にはＵＶ２８０（
島津製作所製）を用いた。この測定結果を、ＰＣＲを行
なう前に予めホリ定した結果と比較した。
ルを添加し、波長２５８ｎｍにおける吸光度をｄ１ζｊ
定した。この際、吸光度のΔｌｌｌ定にはＵＶ２８０（
島津製作所製）を用いた。この測定結果を、ＰＣＲを行
なう前に予めホリ定した結果と比較した。
第１表に、反応後と反応前との測定値の差を示す。
第 １ 表
表中、＃１〜７は肝炎患者より採取した試料であり、＃
８〜ＩＯは正常人から採取した試料である。
８〜ＩＯは正常人から採取した試料である。
この表から明らかなように、正常人由来の試料は吸光度
の減少がほとんど見られないのに対して、肝炎患者由来
の試料は吸光度の減少か大きい。すなわち、肝炎患者由
来の試料にのみＰＣＲが起こり、原料であるデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸が消費されたことを示している
。
の減少がほとんど見られないのに対して、肝炎患者由来
の試料は吸光度の減少か大きい。すなわち、肝炎患者由
来の試料にのみＰＣＲが起こり、原料であるデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸が消費されたことを示している
。
また、標準のＨＢＶ遺伝子を用いてこの発明の遺伝子検
出方法の検出感度を検定したところ、ＰＣＲを１時間行
なうことにより約ｏ、ｔ ｐｇの量のＤ’ Ｎ Ａを検
出することが可能であった。これは、放射性同位元素で
標識した遺伝子プローブを用いる従来の検出法と同等以
上の感度である。
出方法の検出感度を検定したところ、ＰＣＲを１時間行
なうことにより約ｏ、ｔ ｐｇの量のＤ’ Ｎ Ａを検
出することが可能であった。これは、放射性同位元素で
標識した遺伝子プローブを用いる従来の検出法と同等以
上の感度である。
上述のように、この発明の遺伝子検出方法は、目的とす
る遺伝子配列の存在を、ＰＣＲによる遺伝子の増幅に伴
う原料のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の減少の有
無によって確認する。デオキシリボヌクレオシド三リン
酸それ自体は、紫外部に固有の吸収を示すなど特有の性
質を備えている。したがって、標識剤を使用することな
く面接合有量を測定することが可能である。このため、
従来の標識したプローブ、特に放射性同位元素で標識し
たプローブを用いる検出法と異なり、安全に、かつ簡便
にａｌす定を行なうことが可能となる。
る遺伝子配列の存在を、ＰＣＲによる遺伝子の増幅に伴
う原料のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の減少の有
無によって確認する。デオキシリボヌクレオシド三リン
酸それ自体は、紫外部に固有の吸収を示すなど特有の性
質を備えている。したがって、標識剤を使用することな
く面接合有量を測定することが可能である。このため、
従来の標識したプローブ、特に放射性同位元素で標識し
たプローブを用いる検出法と異なり、安全に、かつ簡便
にａｌす定を行なうことが可能となる。
また、紫外部における吸光度を／Ｉｌｌ＋定する方法を
初めとして、デオキシリボヌクレオシド王リン酸の含有
量を直接測定することができるため、従来の方法と比較
して測定時間が著しく短縮される。
初めとして、デオキシリボヌクレオシド王リン酸の含有
量を直接測定することができるため、従来の方法と比較
して測定時間が著しく短縮される。
第１図は、ＰＣＲ法の反応原理を説明する図である。
１・・・試料ＤＮＡ、２・・・−水路ＤＮＡ、３・・・
プライマー ４・・・二本鎖ＤＮＡ０ 出願人代理人 弁理士 鈴江武彦
プライマー ４・・・二本鎖ＤＮＡ０ 出願人代理人 弁理士 鈴江武彦
Claims (1)
- （１）（ａ）試料ＤＮＡ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を
含有する溶液を調製する工程と、 （ｂ）該溶液を用いて、前記デオキシリボヌクレオシド
酸リン酸の消費を伴うポリメラーゼ・チェイン・リアク
ションを行なう工程と、 （ｃ）前記工程（ｂ）終了後の溶液に核酸凝集剤を添加
する工程と、 （ｄ）溶液中のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の含
有量を測定する工程と、 を具備する遺伝子検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25901490A JPH04135500A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25901490A JPH04135500A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04135500A true JPH04135500A (ja) | 1992-05-08 |
Family
ID=17328153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25901490A Pending JPH04135500A (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | 遺伝子検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04135500A (ja) |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP25901490A patent/JPH04135500A/ja active Pending
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