JPH04136749A - コレステロールセンサ - Google Patents
コレステロールセンサInfo
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- JPH04136749A JPH04136749A JP2257192A JP25719290A JPH04136749A JP H04136749 A JPH04136749 A JP H04136749A JP 2257192 A JP2257192 A JP 2257192A JP 25719290 A JP25719290 A JP 25719290A JP H04136749 A JPH04136749 A JP H04136749A
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- Japan
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- cholesterol
- electrode
- bpg
- enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、コレステロールセンサとして用いられる＃素
固定の積層膜被覆電極に係り、特に溶存コレステロール
を電極表面の酵素で分解し、この酵素反応により消費す
る酸素の還元反応を金属錯体（メソーテトラ（ｏ−アミ
ノフェニル）コバルトポルフィリンまたはそのポリマー
により行わせ、そのときの電流変化によりコレステロー
ル濃度を測定する積層膜被覆電極に関する。
固定の積層膜被覆電極に係り、特に溶存コレステロール
を電極表面の酵素で分解し、この酵素反応により消費す
る酸素の還元反応を金属錯体（メソーテトラ（ｏ−アミ
ノフェニル）コバルトポルフィリンまたはそのポリマー
により行わせ、そのときの電流変化によりコレステロー
ル濃度を測定する積層膜被覆電極に関する。
血液中のコレステロール濃度はグルコース濃度（血糖値
）とともに、糖尿病検査、成人病の診断で重要な診断項
目となってきている。
）とともに、糖尿病検査、成人病の診断で重要な診断項
目となってきている。
従来、このコレステロール濃度の測定は、酵素を用いた
比色法またはクラーク電極法により行われていた。
比色法またはクラーク電極法により行われていた。
比色法は、臨床化学分析装置に利用されてふり、酵素と
発色色素を用い、酵素反応による色の変化を光学的に検
出してコレステロール濃度を測定するものである。酵素
としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）やカタラーゼ（
ＣＡＴ）が用いられている。
発色色素を用い、酵素反応による色の変化を光学的に検
出してコレステロール濃度を測定するものである。酵素
としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）やカタラーゼ（
ＣＡＴ）が用いられている。
方、クラーク電極法は、遊離コレステロールの濃度を、
コレステロールオキシダーゼ（分解酵素）含有コラーゲ
ン膜とクラーク電極とを組み合わせた酵素電極により測
定するものである。
コレステロールオキシダーゼ（分解酵素）含有コラーゲ
ン膜とクラーク電極とを組み合わせた酵素電極により測
定するものである。
上述の従来の方法には、それぞれ次のような問題があっ
た。まず、比色法は前処理などの繁雑な操作と時間を要
し、血清中に含まれるエステル型コレステロールや多く
の妨害物質が共存するなどの問題を有する。たとえばペ
ルオキシダーゼによる比色法では還元性物質の影響を著
しく受ける。
た。まず、比色法は前処理などの繁雑な操作と時間を要
し、血清中に含まれるエステル型コレステロールや多く
の妨害物質が共存するなどの問題を有する。たとえばペ
ルオキシダーゼによる比色法では還元性物質の影響を著
しく受ける。
また、カタラーゼによる比色法では、反応時間が長くか
かりすぎ、検体盲検の原因となる。さらに両比色法では
、溶血によりビリルビンが検体中に混入し測定妨害の原
因となる。
かりすぎ、検体盲検の原因となる。さらに両比色法では
、溶血によりビリルビンが検体中に混入し測定妨害の原
因となる。
一方、クラーク電極法では電極自体が内部電解液を必要
とするので、この電解液が漏れ出し、そのため汚染しや
すく、また小型化が困難であるという問題があった。
とするので、この電解液が漏れ出し、そのため汚染しや
すく、また小型化が困難であるという問題があった。
また、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ。
）酵素固定化学修飾電極（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅ
ｎｚｙｍｅＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｃｌｉｆｉｅｄ
ＥＩｅｃｔｒａｄｅ、 ＩＢＣ旺）を用いたコレス
テロールセンサが開発されているが、このセンサでは、
酵素反応によって生じる過酸化水素（）ｌ＝０２）を酸
化することによってコレステロール濃度を測定する原理
を利用している。そのため、このセンサでは、アスコル
ビン酸（ビタミンＣ）や尿酸などの血清中に存在する妨
害物質の影響を受は易いという問題があった。
ｎｚｙｍｅＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｃｌｉｆｉｅｄ
ＥＩｅｃｔｒａｄｅ、 ＩＢＣ旺）を用いたコレス
テロールセンサが開発されているが、このセンサでは、
酵素反応によって生じる過酸化水素（）ｌ＝０２）を酸
化することによってコレステロール濃度を測定する原理
を利用している。そのため、このセンサでは、アスコル
ビン酸（ビタミンＣ）や尿酸などの血清中に存在する妨
害物質の影響を受は易いという問題があった。
さらに、酵素反応で消費される酸素（０２）の量よりコ
レステロール濃度を被検液中で直接測定するようにした
酵素膜被覆白金電極があるが、このセンサは妨害物質の
影響を受けないものの、白金電極表面が汚染しやすく、
またＨ＋イオンにより影響を受けやすい。
レステロール濃度を被検液中で直接測定するようにした
酵素膜被覆白金電極があるが、このセンサは妨害物質の
影響を受けないものの、白金電極表面が汚染しやすく、
またＨ＋イオンにより影響を受けやすい。
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたもので、その目
的は、血清中の妨害物質やＨ゛イオン影響を受けること
なく、コレステロール濃度の測定を精度良く行うことが
できるとともに小型化が容易な積層膜被覆電極を提供す
ることにある。
的は、血清中の妨害物質やＨ゛イオン影響を受けること
なく、コレステロール濃度の測定を精度良く行うことが
できるとともに小型化が容易な積層膜被覆電極を提供す
ることにある。
本発明による積層膜被覆電極は、導電性基体上に金属錯
体を含む酸化還元応答膜を形成し、その上に直接コレス
テロールオキシダーゼが固定化された酵素固定化膜を被
覆させたものであり、全固体積層膜型電極であるため、
小型化が容易になる。
体を含む酸化還元応答膜を形成し、その上に直接コレス
テロールオキシダーゼが固定化された酵素固定化膜を被
覆させたものであり、全固体積層膜型電極であるため、
小型化が容易になる。
金属錯体としては、具体的には、コバルトイオン（ＣＯ
Ｉｆｆ）にメソーテトラ（ｏ−アミノフェニル）ポルフ
ィリン（配位化合物）が配位結合しテするメソーテトラ
（ｏ−アミノフェニル）コバルトポルフィリン（以下、
Ｃｏ−ＴＡＰＰと略す）またはそのポリマー（以下、ポ
リ （Ｃｏ−ＴＡＰＰ） と略す）が用いられる。酸
化還元応答膜はこの金属錯体中のコバルトイオンのｃｏ
ｌｌＫからＣｏ”への還元反応により導電性基体に一定
電位を発生させるものである。
Ｉｆｆ）にメソーテトラ（ｏ−アミノフェニル）ポルフ
ィリン（配位化合物）が配位結合しテするメソーテトラ
（ｏ−アミノフェニル）コバルトポルフィリン（以下、
Ｃｏ−ＴＡＰＰと略す）またはそのポリマー（以下、ポ
リ （Ｃｏ−ＴＡＰＰ） と略す）が用いられる。酸
化還元応答膜はこの金属錯体中のコバルトイオンのｃｏ
ｌｌＫからＣｏ”への還元反応により導電性基体に一定
電位を発生させるものである。
導電性基体としては、ＢＰＧ （ベーサル・プレーン・
ピロリティック・グラファイト）等の導電性炭素材料や
金、白金、パラジウム等の貴金属を用いることができる
が、Ｈ゛イオン影響を受けにくいＢＰＧが最も好ましい
。
ピロリティック・グラファイト）等の導電性炭素材料や
金、白金、パラジウム等の貴金属を用いることができる
が、Ｈ゛イオン影響を受けにくいＢＰＧが最も好ましい
。
本発明の積層膜被覆電極においては、酵素固定化膜中の
コレステロールオキシダーゼと検体中のコレステロール
とにより酵素反応が生じ、この酵素反応によって酸素（
水系中の溶存酸素）が消費される。一方、酸化還元応答
膜中では、金属錯体、具体的にはＣｏ−ＴＡＰＰにおけ
るＣｏＸ１１ がＣｏ”へ還元反応する。このときに生
じる電流値が酵素反応により消費される酸素量、すなわ
ちコレステロールの酵素反応量に比例するので、その電
流値を計測することによりコレステロールの濃度を測定
することができる。なお、この電流値の計測は、本発明
の積層膜被覆電極を作用極とするとともに基準極（ＳＳ
ＣＥ）との間を定電位としてアンペロメトリック法（電
流法）により行うことができる。
コレステロールオキシダーゼと検体中のコレステロール
とにより酵素反応が生じ、この酵素反応によって酸素（
水系中の溶存酸素）が消費される。一方、酸化還元応答
膜中では、金属錯体、具体的にはＣｏ−ＴＡＰＰにおけ
るＣｏＸ１１ がＣｏ”へ還元反応する。このときに生
じる電流値が酵素反応により消費される酸素量、すなわ
ちコレステロールの酵素反応量に比例するので、その電
流値を計測することによりコレステロールの濃度を測定
することができる。なお、この電流値の計測は、本発明
の積層膜被覆電極を作用極とするとともに基準極（ＳＳ
ＣＥ）との間を定電位としてアンペロメトリック法（電
流法）により行うことができる。
また、本発明の積層膜被覆電極では、導電性基体（ＢＰ
Ｇ）上のコバルト金属錯体のＣ０Ｉｒ１ のＣ０ｘＸへ
の還元反応は、未被覆導電性基体（ＢＰＧ）の還元電位
よりも約＋３００１ＴＩＶ （対飽和塩化ナトリウムカ
ロメル電極（以下、５ＳＣＥと略す））はど正電位側（
酸化側）ヘシフトする。このことから、ポリＣｏ−ＴＡ
ＰＰ膜中のＣｏ”” ’ ”ＴＡＰＰサイトを介して溶
存酸素が触媒還元していることがわかる。したがって、
水系中のコレステロール濃度測定が水の分解反応に影響
を受けずに観測することができる。
Ｇ）上のコバルト金属錯体のＣ０Ｉｒ１ のＣ０ｘＸへ
の還元反応は、未被覆導電性基体（ＢＰＧ）の還元電位
よりも約＋３００１ＴＩＶ （対飽和塩化ナトリウムカ
ロメル電極（以下、５ＳＣＥと略す））はど正電位側（
酸化側）ヘシフトする。このことから、ポリＣｏ−ＴＡ
ＰＰ膜中のＣｏ”” ’ ”ＴＡＰＰサイトを介して溶
存酸素が触媒還元していることがわかる。したがって、
水系中のコレステロール濃度測定が水の分解反応に影響
を受けずに観測することができる。
さらに、本発明の積層膜被覆電極では、コレステロール
濃度を酵素（コレステロールオキシダーゼ）反応時の酸
素消費量から求するが、このとき酸化還元応答膜中のＣ
ｏ”’ のＣＯ１！への還元反応による電流値を、基準
極（ＳＳＣＥ）との間を定電位としてアンペロメトリッ
ク法により計測する構成としているので、ポテンシトメ
トリック（電位）法と違ってアスコルビン酸、尿酸、尿
素等のような、Ｈ゛イオン発生し被検液中のｐｔｌ１度
を変化させる妨害物質（酸化物質）の影響を受けずに測
定することができる。
濃度を酵素（コレステロールオキシダーゼ）反応時の酸
素消費量から求するが、このとき酸化還元応答膜中のＣ
ｏ”’ のＣＯ１！への還元反応による電流値を、基準
極（ＳＳＣＥ）との間を定電位としてアンペロメトリッ
ク法により計測する構成としているので、ポテンシトメ
トリック（電位）法と違ってアスコルビン酸、尿酸、尿
素等のような、Ｈ゛イオン発生し被検液中のｐｔｌ１度
を変化させる妨害物質（酸化物質）の影響を受けずに測
定することができる。
第２図は金属錯体としてＣｏ−ＴＡＰＰを用いた場合の
本発明の積層膜被覆電極とコレステロールとの反応状態
を概略的に示すものである。すなわち、検体中のコレス
テロールはコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＸ）に
より次式のように分解される。
本発明の積層膜被覆電極とコレステロールとの反応状態
を概略的に示すものである。すなわち、検体中のコレス
テロールはコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＸ）に
より次式のように分解される。
コレステロール＋２８２０ ＋ ０□
次いで、コレステロールオキシダーゼ固定化膜を透過し
てきた酵素反応後の酸素が内部の酸化還元応答膜（ポリ
（Ｃｏ−ＴＡＰＰ） ）により触媒還元され、次式のよ
うな反応を生じる。
てきた酵素反応後の酸素が内部の酸化還元応答膜（ポリ
（Ｃｏ−ＴＡＰＰ） ）により触媒還元され、次式のよ
うな反応を生じる。
２Ｃｏ ”” ＴＡＰＰ ＋ ２８ ” ＋ ０２→２
ＣＯ”ＴＡＰＰ ＋ Ｈ，０□・・・（２）したがって
、（１）式のコレステロールとコレステロールオキシダ
ーゼとの反応による間の酸素消費量を（２）式のＣｏｌ
１１ からＣｏＩ２へ還元反応するときの電流ピークよ
り求めることができる。
ＣＯ”ＴＡＰＰ ＋ Ｈ，０□・・・（２）したがって
、（１）式のコレステロールとコレステロールオキシダ
ーゼとの反応による間の酸素消費量を（２）式のＣｏｌ
１１ からＣｏＩ２へ還元反応するときの電流ピークよ
り求めることができる。
本発明の積層膜被覆電極による濃度の検出可能な領域は
実験から０〜２００■／ｄ１（０〜５ｍＭ ）である。
実験から０〜２００■／ｄ１（０〜５ｍＭ ）である。
人間の血清中における遊離コレステロール濃度は３５〜
７２■／Ｊであり、本電極を用いて十分測定することが
できる。
７２■／Ｊであり、本電極を用いて十分測定することが
できる。
以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。
る。
（実施例１）
第１図は本発明の一実施例に係る積層膜被覆電極の断面
構造を表わすものである。図中、ｌは電極となる円柱状
のＢＰＧ基体（断面積２．５Ｘ１０−３ｃｒｌ） １
であり、このＢＰＧ基体１の一方の端面にはポ’Ｊ
（Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）からなる酸化還元応答膜２が形
成されるとともに、この酸化還元応答膜２上に酵素固定
化膜３が被覆形成されている。酵素固定化膜３には酵素
としてコレステロールオキシダーゼが固定化されている
。ＢＰＧ基体１の他方の端面には銀ペースト４を介して
銅のリード線５の一端部が接続されている。リード線５
は絶縁性チューブ７で被覆されている。リード線５の接
続部を含むＢＰＧ基体１は熱収縮チューブ８で被覆され
、この熱収縮チューブ８とＢＰＧ基体１との間は熱硬化
エポキシ接着剤６により固定されている。
構造を表わすものである。図中、ｌは電極となる円柱状
のＢＰＧ基体（断面積２．５Ｘ１０−３ｃｒｌ） １
であり、このＢＰＧ基体１の一方の端面にはポ’Ｊ
（Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）からなる酸化還元応答膜２が形
成されるとともに、この酸化還元応答膜２上に酵素固定
化膜３が被覆形成されている。酵素固定化膜３には酵素
としてコレステロールオキシダーゼが固定化されている
。ＢＰＧ基体１の他方の端面には銀ペースト４を介して
銅のリード線５の一端部が接続されている。リード線５
は絶縁性チューブ７で被覆されている。リード線５の接
続部を含むＢＰＧ基体１は熱収縮チューブ８で被覆され
、この熱収縮チューブ８とＢＰＧ基体１との間は熱硬化
エポキシ接着剤６により固定されている。
次に、上記構成の積層膜被覆電極の製造方法について説
明する。
明する。
（１）酸化還元応答膜の形成
まず、ＢＰＧ基体１上に酸化還元応答膜２としてのポリ
（Ｃｏ−ＴＡＰＰ）膜を次のように形成した。
（Ｃｏ−ＴＡＰＰ）膜を次のように形成した。
すなわち、円柱状のＢＰＧ基体１を作成し、その一端に
銀ペースト４によりリード線５の一端部を接続させ、続
いてその周囲を熱収縮チコーブ８で覆った。このＢＰＧ
基体１と、熱収縮チューブ８との間を熱硬化エポキシ接
着剤６で固め、これを真空下５０〜６０℃で、７０分間
乾燥させ、さらに１４０℃、３０分間焼成してＢＰＧ電
極を作成した。
銀ペースト４によりリード線５の一端部を接続させ、続
いてその周囲を熱収縮チコーブ８で覆った。このＢＰＧ
基体１と、熱収縮チューブ８との間を熱硬化エポキシ接
着剤６で固め、これを真空下５０〜６０℃で、７０分間
乾燥させ、さらに１４０℃、３０分間焼成してＢＰＧ電
極を作成した。
このＢＰＧ電極を作用極として、参照電極には飽和塩化
ナトリウムカロメル電極（ＳＳＣＥ）、対極には白金線
の３電極を用い、下記の電解溶液が入った３電極式ガラ
スセル中で下記の条件で電界重合を行い、ＢＰＧ電極上
にポリ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜を被覆形成した。
ナトリウムカロメル電極（ＳＳＣＥ）、対極には白金線
の３電極を用い、下記の電解溶液が入った３電極式ガラ
スセル中で下記の条件で電界重合を行い、ＢＰＧ電極上
にポリ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜を被覆形成した。
溶液＝２、ＯｍＭ Ｃｏ−ＴＡＰＰ
ｏ 、 ２ Ｍ ＣＦ ３ Ｃｏ ○Ｎ
ａ （） リフルオロ酢酸ナトリウム） 十ＣＦ ３ Ｃ０ＯＨ（） リ フ ルオロ酢酸） （ｐＨ＝１．０） 電位掃引範囲は０〜１．７Ｖ（対５ＳＣＥ）、掃引速度
５０ｍＶ／Ｓで、３回の電位掃引を行った。そのときの
サイクリックポルタモグラムを第３図に示す。これによ
り酸化重合反応による電流が約０．８Ｖ（対５ＳＣＥ）
より観察される。また、ＢＰＧ電極の表面には濃青色の
有機金属膜が生成していることが確認できた。
ａ （） リフルオロ酢酸ナトリウム） 十ＣＦ ３ Ｃ０ＯＨ（） リ フ ルオロ酢酸） （ｐＨ＝１．０） 電位掃引範囲は０〜１．７Ｖ（対５ＳＣＥ）、掃引速度
５０ｍＶ／Ｓで、３回の電位掃引を行った。そのときの
サイクリックポルタモグラムを第３図に示す。これによ
り酸化重合反応による電流が約０．８Ｖ（対５ＳＣＥ）
より観察される。また、ＢＰＧ電極の表面には濃青色の
有機金属膜が生成していることが確認できた。
（２）酵素固定化膜の形成
上述のポリＣｏ −ＴＡＰＰ ＠被覆ＢＰＧ電極を水洗
いし、乾燥させた後、この電極表面にグルタルアルデヒ
ド架橋法を用いてコレステロールオキシダーゼ固定化ア
ルブミン膜を被覆した。すなわち、ポリＣｏ−ＴＡＰＰ
膜上に、２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液（０
，６μＩ）と酵素溶液（１゜０μｌ）とを混ぜて滴下し
、酵素固定化を行った。
いし、乾燥させた後、この電極表面にグルタルアルデヒ
ド架橋法を用いてコレステロールオキシダーゼ固定化ア
ルブミン膜を被覆した。すなわち、ポリＣｏ−ＴＡＰＰ
膜上に、２５％グルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液（０
，６μＩ）と酵素溶液（１゜０μｌ）とを混ぜて滴下し
、酵素固定化を行った。
酵素溶液は以下の組成のものを用いた。
コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＸ）（和光純薬■
製）５０ｍｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ） （コダック■製）１５重量％ リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０） ０．０５Ｍ酵素
を固定化した後、このＢＰＧ電極を０． １Ｍリン酸緩
衝溶液（ｐＨ＝７．０）（但し、５０ｍ ｇ ／ １の
トリトンＸ−１００（界面活性剤）、２０■／ｄ１のア
ジ化ナトリウム（防腐剤）を含む〕中に３０分間浸漬し
、上記酵素固定化膜中の過剰グルタルアルデヒドを除去
した。このようにして第３図に概略構成を示した積層膜
被覆電極が得られた。
製）５０ｍｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ） （コダック■製）１５重量％ リン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０） ０．０５Ｍ酵素
を固定化した後、このＢＰＧ電極を０． １Ｍリン酸緩
衝溶液（ｐＨ＝７．０）（但し、５０ｍ ｇ ／ １の
トリトンＸ−１００（界面活性剤）、２０■／ｄ１のア
ジ化ナトリウム（防腐剤）を含む〕中に３０分間浸漬し
、上記酵素固定化膜中の過剰グルタルアルデヒドを除去
した。このようにして第３図に概略構成を示した積層膜
被覆電極が得られた。
次に、この積層膜被覆電極により以下の実験を行った。
実験例１
１．６９ｍＭコレステロールが５０ｍＭリン酸緩衝溶液
（ｐＨ＝７．０）中に滴下混入されたときのサイクリッ
クポルタモグラムを第４図のＡに示す。但し、溶存酸素
系中での実験である。電位掃引は掃引速度１００ｍＶ／
Ｓで行った。なお、Ｂは５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ
＝７．０）中におけるサイクリックポルタモグラムを示
すものである。第４図においてコレステロール溶液の滴
下に伴う酸素還元電流の減少が観測される。このことは
、本発明の積層膜被覆電極がコレステロールセンサとし
て作動していることを示している。
（ｐＨ＝７．０）中に滴下混入されたときのサイクリッ
クポルタモグラムを第４図のＡに示す。但し、溶存酸素
系中での実験である。電位掃引は掃引速度１００ｍＶ／
Ｓで行った。なお、Ｂは５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ
＝７．０）中におけるサイクリックポルタモグラムを示
すものである。第４図においてコレステロール溶液の滴
下に伴う酸素還元電流の減少が観測される。このことは
、本発明の積層膜被覆電極がコレステロールセンサとし
て作動していることを示している。
実験例２
第５図は５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７゜０）中に
おいて、ポ！Ｊ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜が形成され
ていないＢＰＧ基体およびポ！Ｉ （Ｃｏ −ＴＡＰ
Ｐ ）膜が形成されたＢＰＧ基体のそれぞれで得られた
典型的サイクリックポルタモグラムを示す。ここに、Ａ
、Ｂはそれぞれポ！Ｊ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜が形
成されていないＢＰＧ基体の場合、またＣＳＤはそれぞ
れポ！Ｉ （Ｃｏ−ＴＡＰＰ）膜被覆ＢＰＧ基体の場合
を示している。また、ＡＳＣはそれぞれ窒素溶存系、Ｂ
ＳＤはそれぞれ酸素溶存系での結果を示している。その
結果、ボ’Ｊ Ｃｏ−ＴＡＰＰ膜をＢＰＧ電極上に電解
重合で直接被覆させることにより、酸素還元電位は未被
覆ＢＰＧのそれよりも約３００ｍｖだけ正電位側ヘシフ
トし、そのときの電位は一〇。
おいて、ポ！Ｊ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜が形成され
ていないＢＰＧ基体およびポ！Ｉ （Ｃｏ −ＴＡＰ
Ｐ ）膜が形成されたＢＰＧ基体のそれぞれで得られた
典型的サイクリックポルタモグラムを示す。ここに、Ａ
、Ｂはそれぞれポ！Ｊ （Ｃｏ −ＴＡＰＰ ）膜が形
成されていないＢＰＧ基体の場合、またＣＳＤはそれぞ
れポ！Ｉ （Ｃｏ−ＴＡＰＰ）膜被覆ＢＰＧ基体の場合
を示している。また、ＡＳＣはそれぞれ窒素溶存系、Ｂ
ＳＤはそれぞれ酸素溶存系での結果を示している。その
結果、ボ’Ｊ Ｃｏ−ＴＡＰＰ膜をＢＰＧ電極上に電解
重合で直接被覆させることにより、酸素還元電位は未被
覆ＢＰＧのそれよりも約３００ｍｖだけ正電位側ヘシフ
トし、そのときの電位は一〇。
４５Ｖ（対５ＳＣＥ）であることがわかった。また、酸
素還元電流ピークの値も増加することがわかった。
素還元電流ピークの値も増加することがわかった。
実験例３
第６図に、実施例２の積層膜被覆電極の典型的な電流−
時間応答曲線を示す。ここに、電流値１．２、・・・１
８はそれぞれ５０ｍＭリン声緩衝液（ｐＨ＝７．Ｏ）中
のコレステロール濃度が０．１０．２０、・・・１５０
．１６１．１８８．２００■／ｄＩ！の場合に相当して
いる。なお、図の矢印はコレステロールの注入ポイント
を示している。この結果によれば、コレステロール量の
注入量を増加させるに伴い、還元電流値は減少する。な
お、この電流値は、一定電位（−０，５５Ｖ対５ＳＣＥ
）での電解反応における酸素還元電流より測定した。
時間応答曲線を示す。ここに、電流値１．２、・・・１
８はそれぞれ５０ｍＭリン声緩衝液（ｐＨ＝７．Ｏ）中
のコレステロール濃度が０．１０．２０、・・・１５０
．１６１．１８８．２００■／ｄＩ！の場合に相当して
いる。なお、図の矢印はコレステロールの注入ポイント
を示している。この結果によれば、コレステロール量の
注入量を増加させるに伴い、還元電流値は減少する。な
お、この電流値は、一定電位（−０，５５Ｖ対５ＳＣＥ
）での電解反応における酸素還元電流より測定した。
また、第７図にコレステロール濃度（■／＃） −飽和
酸素還元電流値（ｍ＾）の関係を示す。その結果、コレ
ステロール濃度０〜２００■／ｄ１までの広い範囲に渡
ってほぼ直線の関係を示すことがわかった。
酸素還元電流値（ｍ＾）の関係を示す。その結果、コレ
ステロール濃度０〜２００■／ｄ１までの広い範囲に渡
ってほぼ直線の関係を示すことがわかった。
実験例４
実施例１の積層膜被覆電極の第１回測定（実験例３）よ
り１０日後に、電流応答速度と電流値との関係を検討し
た。その結果を第８図に示す。実験例３と同程度の電流
応答では、コレステロール濃度は、実験例３では２００
■／ｄ！！であるのに対して、１０日後においては最大
１００■／ｄ！！となり、実験例３のときより感度が約
半分に低下した。
り１０日後に、電流応答速度と電流値との関係を検討し
た。その結果を第８図に示す。実験例３と同程度の電流
応答では、コレステロール濃度は、実験例３では２００
■／ｄ！！であるのに対して、１０日後においては最大
１００■／ｄ！！となり、実験例３のときより感度が約
半分に低下した。
しかし、この期間が経過してもコレステロール濃度の測
定は可能であることが確かめられた。
定は可能であることが確かめられた。
（実施例２）
コレステロールオキシダーゼの固定化量を各々Ｏｍｇ／
ｃｕｔ、 ２５ ｍｇ／ｃｕｔ、 ５０ ｍｇ／ｃｎ！
（Ｂ Ｐ Ｇ電極面積２．５ Ｘｌ０−３ｃｏりと変
えた以外は実施例１と同様にして積層膜被覆電極を作製
した。
ｃｕｔ、 ２５ ｍｇ／ｃｕｔ、 ５０ ｍｇ／ｃｎ！
（Ｂ Ｐ Ｇ電極面積２．５ Ｘｌ０−３ｃｏりと変
えた以外は実施例１と同様にして積層膜被覆電極を作製
した。
実験例５．６
実施例１および実施例２の各々の積層膜被覆電極を用い
、実験例２と同じ方法でコレステロール濃度と酸素還元
電流値との関係を調べた。その結果を第９図に示す。こ
こに、Ｏはコレステロールオキシダーゼの固定化量が５
０■／ｃｆｆｌの場合、△は同じく２５■／Ｃｌ１１の
場合、口は同じくＯ■／ＣＩｌ＋の場合をそれぞれ示し
ている。この結果によれば、コレステロールオキシダー
ゼの固定化量が４■／ｃｆｆｌの酵素反応による酸素の
電流ピークの減少量は１３．５ｎＡ、また固定化量が８
■／ｃｒＩの場合のそれは２５．５ｎＡ（但し、コレス
テロール濃度Ｏ〜１００■／ｄ！りであり、酵素固定化
量が大きい８■／７の方が高感度応答を示し、固定化量
を２倍にすることにより電流感度は１．８９倍となる。
、実験例２と同じ方法でコレステロール濃度と酸素還元
電流値との関係を調べた。その結果を第９図に示す。こ
こに、Ｏはコレステロールオキシダーゼの固定化量が５
０■／ｃｆｆｌの場合、△は同じく２５■／Ｃｌ１１の
場合、口は同じくＯ■／ＣＩｌ＋の場合をそれぞれ示し
ている。この結果によれば、コレステロールオキシダー
ゼの固定化量が４■／ｃｆｆｌの酵素反応による酸素の
電流ピークの減少量は１３．５ｎＡ、また固定化量が８
■／ｃｒＩの場合のそれは２５．５ｎＡ（但し、コレス
テロール濃度Ｏ〜１００■／ｄ！りであり、酵素固定化
量が大きい８■／７の方が高感度応答を示し、固定化量
を２倍にすることにより電流感度は１．８９倍となる。
なお、コレステロールオキシダーゼの固定化量が０■／
ｃａｔ（酸素無添加）では、酸素還元電流は変化しない
ことが確かめられた。
ｃａｔ（酸素無添加）では、酸素還元電流は変化しない
ことが確かめられた。
実験例７（妨害物質の影響の検討）
実施例１の積層膜被覆電極を用いて最初、濃度５５．６
■／ｄｌのコレステロールを滴下したところ還元電流値
が減少した。次いで、０．０５ｍＭアスコルビン酸、０
．３２ｍＭ尿酸、２．５９ｍＭ尿素を含むコレステロー
ル溶液を滴下した。なお、このときのコレステロール濃
度は最初と同じとした。
■／ｄｌのコレステロールを滴下したところ還元電流値
が減少した。次いで、０．０５ｍＭアスコルビン酸、０
．３２ｍＭ尿酸、２．５９ｍＭ尿素を含むコレステロー
ル溶液を滴下した。なお、このときのコレステロール濃
度は最初と同じとした。
このときの電流量変化は観測されず、したがってこれら
妨害物質の影響を受けずにコレステロール濃度を測定で
きることがわかった。なお、これら酸化還元反応活性物
質はヒト血清中に含まれる濃度の平均値である。
妨害物質の影響を受けずにコレステロール濃度を測定で
きることがわかった。なお、これら酸化還元反応活性物
質はヒト血清中に含まれる濃度の平均値である。
実験例８
実施例１の積層膜被覆電極を用いて還元電流時間応答曲
線を検討した。第１０図にその結果を示す。ここに、図
において、１．２はそれぞれ濃度が０．１．４ｍＭのコ
レステロール溶液を滴下した場合の結果であり、また、
３．４はさらにそれぞれ１．４．２．８ｆｆ１Ｍの過酸
化水素を滴下した場合の結果を示す。すなわち、コレス
テロールと同濃度の過酸化水素を滴下した場合には還元
電流は変化しなかったが、２倍の濃度のコレステロール
および過酸化水素を滴下したところ還元電流値は増加し
た。この増加は過剰の過酸化水素による電流応答である
。ただし、実際の酵素反応による過酸化水素の生成量は
ごくわずかであった。
線を検討した。第１０図にその結果を示す。ここに、図
において、１．２はそれぞれ濃度が０．１．４ｍＭのコ
レステロール溶液を滴下した場合の結果であり、また、
３．４はさらにそれぞれ１．４．２．８ｆｆ１Ｍの過酸
化水素を滴下した場合の結果を示す。すなわち、コレス
テロールと同濃度の過酸化水素を滴下した場合には還元
電流は変化しなかったが、２倍の濃度のコレステロール
および過酸化水素を滴下したところ還元電流値は増加し
た。この増加は過剰の過酸化水素による電流応答である
。ただし、実際の酵素反応による過酸化水素の生成量は
ごくわずかであった。
以上説明したように請求項１〜３記載の積層膜被覆電極
によれば、酵素固定化膜と金属錯体を含む酸化還元応答
膜とからなる固体積層膜型としたので、小型化が容易で
ある。また、金属錯体中の金属の還元電流値をアンベロ
メ）ＩＪフック法より計測し、これにより酵素反応によ
る酸素消費量よりコレステロールの濃度を求めるため、
アスコルビン酸、尿酸、尿素等の妨害物質（酸化物質）
の影響を受けないで、安定した測定を行うことができる
。
によれば、酵素固定化膜と金属錯体を含む酸化還元応答
膜とからなる固体積層膜型としたので、小型化が容易で
ある。また、金属錯体中の金属の還元電流値をアンベロ
メ）ＩＪフック法より計測し、これにより酵素反応によ
る酸素消費量よりコレステロールの濃度を求めるため、
アスコルビン酸、尿酸、尿素等の妨害物質（酸化物質）
の影響を受けないで、安定した測定を行うことができる
。
特に、請求項２記載の積層膜被覆電極によれば、金属錯
体としてメソーテトラ（ｏ−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリンを用いるようにしたので、コバルト金属錯
体の還元反応は酸化側に３００＋ｎＶシフトし、よって
水系中の水の分解反応や水素イオンの影響を受は難く、
還元電流値を精度良く計測できる。
体としてメソーテトラ（ｏ−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリンを用いるようにしたので、コバルト金属錯
体の還元反応は酸化側に３００＋ｎＶシフトし、よって
水系中の水の分解反応や水素イオンの影響を受は難く、
還元電流値を精度良く計測できる。
図面は本発明の実施例を示すもので、第１図は実施例１
に係る積層膜被覆電極の縦断面図、第２図は本発明の積
層膜被覆電極とコレステロールとの反応状態を示す概略
構成図、第３図は実施例１において酸化還元応答膜形成
時のサイクリックポルタモグラムを示す図、第４図は実
験例１における積層膜被覆電極のサイクリックポルタッ
グラムを示す図、第５図は実験例２における積層膜被覆
電極のサイクリックポルタッグラムを示す図、第６図は
実験例３における電流−時間応答曲線を表わす図、第７
図は実験例３におけるコレステロール濃度と電流値との
関係を示す図、第８図は実験例４における電流−時間応
答曲線を示す図、第９図は実験例５．６におけるコレス
テロール濃度と電流応答値との関係を示す図、第１０図
は実験例８における電流−時間応答曲線を示す図である
。 １・・・・・・ＢＰＧ基体 ２・・・・・・酸化還元応答膜（Ｃｏ−ＴＡＰＰ膜）３
・・・・・・酵素固定化膜 出 願 人 代 理 人 テ ル モ 株 式 ％式％ 電位（Ｅｔ４ＳＳＣＥｌ ｔｆｆｉ（ＶｌｔＳＳＣＥ） ＋−一−−−一−−−−−−−−−− ０ｍＩｎ コレステロ−ｘ、１１ｇ （ｒｎｇ／（＋＋）第６図 と−一一一−−−−−−−−−−−−−−−一一コしス
テロールｊＪ！度 （’ｇ／ｄｌ）
に係る積層膜被覆電極の縦断面図、第２図は本発明の積
層膜被覆電極とコレステロールとの反応状態を示す概略
構成図、第３図は実施例１において酸化還元応答膜形成
時のサイクリックポルタモグラムを示す図、第４図は実
験例１における積層膜被覆電極のサイクリックポルタッ
グラムを示す図、第５図は実験例２における積層膜被覆
電極のサイクリックポルタッグラムを示す図、第６図は
実験例３における電流−時間応答曲線を表わす図、第７
図は実験例３におけるコレステロール濃度と電流値との
関係を示す図、第８図は実験例４における電流−時間応
答曲線を示す図、第９図は実験例５．６におけるコレス
テロール濃度と電流応答値との関係を示す図、第１０図
は実験例８における電流−時間応答曲線を示す図である
。 １・・・・・・ＢＰＧ基体 ２・・・・・・酸化還元応答膜（Ｃｏ−ＴＡＰＰ膜）３
・・・・・・酵素固定化膜 出 願 人 代 理 人 テ ル モ 株 式 ％式％ 電位（Ｅｔ４ＳＳＣＥｌ ｔｆｆｉ（ＶｌｔＳＳＣＥ） ＋−一−−−一−−−−−−−−−− ０ｍＩｎ コレステロ−ｘ、１１ｇ （ｒｎｇ／（＋＋）第６図 と−一一一−−−−−−−−−−−−−−−一一コしス
テロールｊＪ！度 （’ｇ／ｄｌ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、導電性基体と、 金属錯体を含み、前記導電性基体上に形成された酸化還
元応答膜と、 コレステロールオキシダーゼが固定化されるとともに前
記酸化還元応答膜を被覆する酵素固定化膜 とを備えたことを特徴とする積層膜被覆電極。 ２、前記金属錯体はメソーテトラ（ｏ−アミノフェニル
）コバルトポルフィリンまたはそのポリマーである請求
項１記載の積層膜被覆電極。 ３、前記導電性基体は導電性炭素材料により形成されて
なる請求項１または２記載の積層膜被覆電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2257192A JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2257192A JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04136749A true JPH04136749A (ja) | 1992-05-11 |
| JP3035572B2 JP3035572B2 (ja) | 2000-04-24 |
Family
ID=17302960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2257192A Expired - Lifetime JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3035572B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997027473A1 (en) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Canadian Bioconcepts, Inc. | Electrodes and metallo isoindole ringed compounds |
| JP2010012598A (ja) * | 2002-02-25 | 2010-01-21 | Hitachi Chem Co Ltd | マイクロ流体システム用支持ユニットの製造方法 |
| CN101713760B (zh) | 2009-08-22 | 2012-11-14 | 西北师范大学 | 对苯二酚的电化学检测方法 |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP2257192A patent/JP3035572B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997027473A1 (en) * | 1996-01-23 | 1997-07-31 | Canadian Bioconcepts, Inc. | Electrodes and metallo isoindole ringed compounds |
| JP2010012598A (ja) * | 2002-02-25 | 2010-01-21 | Hitachi Chem Co Ltd | マイクロ流体システム用支持ユニットの製造方法 |
| CN101713760B (zh) | 2009-08-22 | 2012-11-14 | 西北师范大学 | 对苯二酚的电化学检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3035572B2 (ja) | 2000-04-24 |
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