JPH04142441A - 細胞の分取方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔概要〕 培養しである生体細胞の分取方法に関し、簡便な方法で
分取することを目的とし、底面が開放されている耐熱容
器の該開放部に、孔径の異なるナイロンメツシュを接着
して滅菌処理が可能な複数種の篩を作り、該篩を孔径の
小より大の順で多段に重ねた状態で、細胞懸濁液を上部
より注いで濾過することにより、大きさの異なる細胞を
対応する孔径のメツシュにより捕獲し分離することを特
徴として細胞の分取方法を構成する。

〔産業上の利用分野〕

本発明は生体細胞の分取方法に関する。

生命工学の発展に伴い、生体の一部を取り出して無菌容
器に入れ、長期間に亙って培養し、この細胞について研
究を行うことは医学および生物学の分野で通常行われて
いる。

ニーで、細胞の培養方法には生体より直接に取り出した
細胞を培養する初代培養と、株細胞を植え継いでゆ（継
代培養法とがあるが、初代培養では必要とする生体の組
織に酵素処理あるいは機械的処理を施して細胞を分離す
ることが行われている。

然し、このようにして得られる分離体は雑多な細胞から
なっている。

例えば、鶏の小脳を取り出して酵素処理を施すと、種々
の神経細胞の他にダリア細胞、繊維芽細胞などが単離し
てくる。

そのため、バラバラになった細胞集団から必要な細胞を
分取することが必要となる。

〔従来の技術〕

バラバラに分離している細胞集団から任意の細胞を分離
する装置としては、色素や蛍光抗体などで細胞をマーク
した後、レーザ光の照射を行い、散乱光や蛍光などを目
安として細胞の分離を行うフローサイトメトリが知られ
ている。

然し、この方法は装置が大掛かりで高価であり、また操
作方法も容易ではない。

一方、発明者等はシャーレ表面への細胞の接着性の違い
を利用して神経細胞と繊維芽細胞とを分離し、併置培養
する方法を提案している。

然し、この方法は総ての細胞の分離には拡張できないこ
とから、簡単に細胞を分取できる方法の開発が必要であ
った。

〔発明が解決しようとする課題〕 酵素処理を行うか、あるいは震盪などの機械的な処理を
行うことにより生体細胞を単離して細胞集団を作り、こ
の雑多の集団の中から必要な細胞を分取することは医学
や生物学の研究では必要である。

そのため、各種の分取法があるが、高価であったり、細
胞分取性に特殊性があったりして、普遍的には適用でき
ない。

そこで、簡便な方法を開発することが課題である。

〔課題を解決するための手段〕

上記の課題は底面が開放されている耐熱容器の開放部に
、孔径の異なるナイロンメツシュを接着して滅菌処理が
可能な複数種の篩を作り、この篩を孔径の小より大の順
で多段に重ねた状態で、細胞懸濁液を上部より注いで濾
過することにより、大きさの異なる細胞を対応する孔径
のメツシュにより捕獲し分離することで細胞の分取方法
を構成することにより解決することができる。

〔作用〕

生体を構成している各種の細胞は生体中において雑多の
形状をしているが、酵素処理あるいは震盪などの機械的
な処理を行って分離した細胞は直径が数ｌＯμｍの球状
をなしている。

発明者はこの点に着目し、孔の大きさの異なるナイロン
メツシュを多段に組むことにより、大きさの異なる雑多
の細胞の集団から一回の操作でメツシュ毎に細胞を分取
するものである。

第１図は本発明に係る細胞分取器とその使用法を示す断
面図である。

すなわち、底が開放されている複数の耐熱容器ｌを用意
し、この開放部に接着剤を用いて孔径の異なるナイロン
メツシュ２をそれぞれ接着固定して滅菌可能な篩３を作
る。

そして、これをメツシュの小な篩３を下にし、順次、メ
ツシュの大きな篩３を積み重ねて、本発明に係る細胞分
取器を構成するものである。

そして、上部よりバラバラになっている各種の細胞４を
含む懸濁液を注ぐことにより、細胞の大きさに見合った
篩３に分取するものである。

そして、分取が終わった後は第２図に示すように、個々
の篩３を逆さまにし、培養液５を注ぐことにより細胞４
を容器６に分取するものである。

この方法を行う場合、上部の篩ヰには単離が充分に行わ
れなかった細胞塊も付着するが、このような細胞塊につ
いては再び酵素処理あるいは震盪処理を行って単離させ
、再び分取器に注いで分離すればよい。

なお、レンズペーパを数枚重ねて濾過するか、或いは孔
径の決まったナイロンメツシュを用いて細胞の均質な集
団を選り分けることは従来より行われている。

然し、このような手段は酵素処理あるいは震盪などの機
械的な処理でもバラバラに分離していない未消化の組織
を除去することが主体であって、細胞をその大きさによ
り積極的に分類して分取することは行われていなかった
。

〔実施例〕

底部が開放しである直径が３Ｏｎ＋ｍの耐熱ガラスの底
部にそれぞれ孔径が２０．４０．６２．８２．９４．１
４８μｍのナイロンメツシュよりなる細胞分別用フィル
タ（共進理工社製）をエポキシ系接着剤を用いて接着し
て６種類の篩を作った。

そしてオートクレーブに入れ１２１　℃、２０分の条件
で滅菌した。

次に、生体として受精後１４日経過した鶏胚の後根神経
節を用いた。

すなわち、鶏胚より無菌的に後根神経節を摘出し、コラ
ゲナーゼ酵素（１ｍｇ／ｍｌ　）を加えて３７℃で３０
分間処理すると神経細胞を含む細胞集団が遊離された。

この細胞集団より、遠心分離器によりコラゲナーゼ液を
除いた後、イーグルの最少培地中に再懸濁させ、これを
第１図に示すような細胞分離器に注いで濾過した。

次に、各段の篩を逆さにして第２図に示す方法で培養液
５（イーグルの最少培地）を注ぎ、フィルタに捕獲され
ている細胞を分取した。

そして、分取した細胞液を光学穎微鏡で形態を観察した
。

なお、孔サイズが６２．８２．９４および１４８μｍの
メツシュには単離が充分に行われなかった細胞塊と細胞
外組織の破片が分取できた。

この細胞塊については更に酵素処理を行い、単離細胞を
得ることができた。

なお、２度目以降の酵素処理は細胞塊が捕獲されている
ナイロンメツシュについて行えばよく、ナイロンメツシ
ュ部分のみを酵素液に浸漬して行うことで高価な酵素液
の節約になる。

また、２度目以降の酵素処理を他の酵素例えばトリプシ
ン、ディスパー七などを用いて行う場合でも、酵素液に
ナイロンメツシュを浸漬するだけで簡便に行うことがで
きた。

なお、この場合、単離細胞の多（は４０μｍと２０μｍ
のメツシュ上に捕獲された。

次に、４０μｍと２０μｍのメツシュより得た細胞を１
０％牛血清、ｌμｇ／１００　ｒｎ！の神経成長因子を
含むイーグル最少培地に再懸濁して２４時間培養し、神
経細胞と繊維芽細胞は特異な形態をとるのを利用して細
胞数を計数したところ孔径が４０μｍのフィルタに多く
の神経細胞が捕獲されていることが判った。

〔発明の効果〕

本発明の実施により一回の操作で単離している細胞集団
を大きさにより分取することができる。

また、単離が不十分な細胞についても、酵素処理か機械
的処理を行った後、再び、本発明の方法を用いることに
より分取が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞分取器とその使用法を示す断面図、第２図
は細胞回収方法の概念図、 である。 図において、 ｌは耐熱容器、　　　　　　２はナイロンメツシュ、３
は篩、　　　　　　　　　４は細胞、６は容器、 である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 底面が開放されている耐熱容器の該開放部に、孔径の異
   なるナイロンメッシュを接着して滅菌処理が可能な複数
   種の篩を作り、該篩を孔径の小より大の順で多段に重ね
   た状態で、細胞懸濁液を上部より注いで濾過することに
   より、大きさの異なる細胞を対応する孔径のメッシュに
   より捕獲し分離することを特徴とする細胞の分取方法。