JPH0414310B2 - - Google Patents
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- JPH0414310B2 JPH0414310B2 JP21492884A JP21492884A JPH0414310B2 JP H0414310 B2 JPH0414310 B2 JP H0414310B2 JP 21492884 A JP21492884 A JP 21492884A JP 21492884 A JP21492884 A JP 21492884A JP H0414310 B2 JPH0414310 B2 JP H0414310B2
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- endotoxin
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
(ハ) 考案の目的
（産業上の利用分野）
この発明は、エンドトキシンの定量法に関す
る。さらに詳しくは発熱性物質（パイロジエン）
の原因物質の一つであるエンドトキシンの定量法
に関する。 （従来の技術） 注射剤及び医療用具の製造工程等で予期せずし
て混入する発熱性物質（パイロジエン）は、多く
の場合エンドトキシン（リポ多糖類）であると考
えられており、臨床面でもエンドトキシン血症の
問題、エンドトキシン汚染を原因とする注射事
故、手術事故の問題も比較的多く、エンドトキシ
ン検出の必要性が増してきている。 現在、エンドトキシンの検出法として、リムラ
ステスト・ゲル化法と発色性合成基質法が使われ
ており、両方法ともカブトガニの血球成分（リム
ラス・アメーボサイト・ライセート）を利用した
ものである。これらの方法は、カブトガニの血球
中に存在する前凝固性酵素（Proclotting
Enzyme）をエンドトキシンが活性化し、活性化
酵素（Clotting Enzyme）とするもので、ゲル化
法ではカブトガニ血球中に存在している凝固性蛋
白（Coagulogen）に前記活性化酵素が作用して、
３種類のペプチドＡ、Ｂ、Ｃを生成する。ペプチ
ドＡとＢはＳ−Ｓ結合するが、この際に肉眼で見
える“ゲル”を形成するので、これを指標として
エンドトキシンの陽性・陰性を判定するという半
定量的方法である。 もう一方の発色性合成基質法は、ゲル化法と原
理は同じであるが、上記凝固性蛋白に代つて発色
性の合成基質を用いる方法である。この合成基質
には、種々の物質が検討されているが、例えば有
効な基質部分オリゴペプチドにパラニトロアニリ
ン（PNA）を結合させたものが現在市販されて
いる。この基質にエンドトキシンにより活性化さ
れた酵素が作用するとパラニトロアニリンを遊離
して、反応液は黄色となる。遊離パラニトロアニ
リンと添加エンドトキシン量は比例するので、黄
色を吸光度（OD405nｍ）で測定してエンドトキ
シン量を定量することが出来る。 （発明が解決しようとする問題点） しかしながら、以上２つの検出法において、ゲ
ル化法は簡便で検出感度が高いが、定量性に欠け
るという問題点があり、発色性合成基質法ではエ
ンドトキシンの定量が可能であり、検出感度も高
いが、手間がかかりかつダイナミツクレンジが狭
いという問題点があつた。 この発明は、上記問題点を解決すべくなされた
ものであり、簡便で検出感度が高くかつダイナミ
ツクレンジの広いエンドトキシンの定量法を提供
しようとするものである。 本発明者らは、鋭意研究の結果、まず前記ゲル
化法におけるゲル成長過程の状態が、ゲル層の光
散乱光量を電気的に検出して得られる電気信号の
変化から簡便に知りうることを見出した。そして
さらに研究の結果、この光散乱光量の変化には第
１図に示すごとき一定のパターンが認められる点
を見出し、これに基づいてエンドトキシンの定量
を行なう点に想着し、この発明に到達した。 (ロ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、検体にリムラス・
アメーボサイト・ライセート試薬を反応させてゲ
ル化を起こさせ、その光散乱光量を測定してゲル
開始時間を求め、既知濃度のエンドトキシンのゲ
ル開始時間と比較して、検体中のエンドトキシン
濃度を定量することを特徴とするエンドトキシン
の定量法が提供される。 この発明における「ゲル開始時間」とは、ゲル
化反応における光散乱光量の変化を示す第１図の
ごときグラフにおける、テスト開始点（Ａ；リム
ラス・アメーボサイト・ライセート試薬添加時）
から横軸に平行に引いた外挿線と、ゲル化開始点
Ｂとゲル化終了点Ｄの間の最大傾斜線との交点Ｃ
を設定した際のＡ−Ｃ間の時間を意味する。 この発明の最も特徴とする点は、上記で定義さ
れる「ゲル開始時間」が、検体中のエンドトキシ
ン濃度に最も相関関係があることを見出した点に
ある。 このようにして設定したゲル開始時間を、まず
種々の既知濃度のエンドトキシンについて求め、
それを指標とし、それと未知濃度のエンドトキシ
ンを含む検体について求めたゲル開始時間とを比
較すれば、検体中の未知濃度のエンドトキシン濃
度を定量することができる。 この発明に用いるリムラス・アメーボサイト・
ライセート試薬としては、従来のエンドトキシン
検出用のリムラス・アメーボサイト・ライセート
をエンドトキシンフリーの蒸留水に溶解したもの
をそのまま用いることができる。またこの発明の
対象とする検体は、液状のものはそのまま又は希
釈した被検液として反応に供せられ、液状以外の
ものは、適宜エンドトキシンフリーの蒸留水に溶
解又は抽出した被検液として反応に供せられる。 かかる検体又は被検液とリムラス・アメーボサ
イト・ライセート試薬の反応は、エンドトキシン
フリーのガラス製反応容器中、これらを混合する
ことにより行なわれる。通常、37℃前後の温度下
で放置して反応させるのが適しており、また混合
液のPHは６〜８となるように設定するのが適して
いる。 この発明における光散乱光量の変化は、適当な
光散乱光量測定装置を用いて測定でき、この装置
は専用機を用いてもよく、また汎用フオトメータ
ー用いてその場で構成してもよい。ただし、少な
くとも前記反応容器をそのまま測定セルとして測
光位置に設定でき、かつ測定部が37℃前後に恒温
化され更に光散乱光量を連続的に出力できるよう
構成されていることを要する。更に反応容器とし
ては、試薬量ができるだけ少なくてすむようにな
るべく少容量のものが好ましい。このような観点
から、最も好ましい光散乱光量測定装置として光
散乱光検知式のいわゆる血液凝固分析装置を用い
ることができ、その例としては、コアグ・スタツ
ト（国際試薬株式会社製）が挙げられる。 なお、かような光散乱光量測定装置に、マイク
ロプロセツサを用いたゲル開始時間自動演算器及
びエンドトキシン濃度換算器とリンクすれば、自
動測定が可能となる。かような自動演算は、出力
変化の最大変化率を求める比較アルゴリズムと計
算式のから容易にプログラム設定することがで
き、濃度換算は検量線からのフアクター計算及び
データ入力により容易にプログラム設定すること
ができる。 また第５図に示した様に、総ゲル生成量は反応
液中の凝固性蛋白濃度に比例することも見出し
た。このことから１回の試薬に要する試薬の量を
減らすことも可能であり、コスト的にも有効な方
法であることがわかる。 （実施例） 以下、実施例で本発明を詳説するが、これによ
つてこの発明は限定されるものではない。 実施例 １ （エンドトキシン濃度とゲル開始時間との相
関） ゲル開始時間とエンドトキシン濃度との相関関
係を求めるために、エンドトキシンに標準リポポ
リサツカライド（E.coli UKT−Ｂ）を使用して
各エンドトキシン濃度におけるゲル開始時間を測
定した。 まず、リムラス・アメーボサイト・ライセート
（カブトガニ血球抽出物凍結乾燥品：和光純薬工
業KK製）にエンドトキシンフリーの水５mlを無
菌的に加え静かに振り混ぜ完全に溶解し、リムラ
ス・アメーボサイト・ライセート試薬とした。次
いで光散乱光量測定装置（コアグスタツト）用試
験管を250℃、２時間で乾燥熱滅菌しておき、該
試験管に上記試薬を0.2ml注入し、その中へ各既
知濃度のエンドトキシン含有液0.2mlをそれぞれ
添加し、光散乱光量測定装置（コアグ・スタツ
ト：国際試薬株式会社製）にて、ゲル化時の光散
乱光量の変化を測定し、記録計に出力し、出力さ
れたデータをもとにしてゲル開始時間を求めた。
実験は２回行ない、その結果を第１表に示した。
る。さらに詳しくは発熱性物質（パイロジエン）
の原因物質の一つであるエンドトキシンの定量法
に関する。 （従来の技術） 注射剤及び医療用具の製造工程等で予期せずし
て混入する発熱性物質（パイロジエン）は、多く
の場合エンドトキシン（リポ多糖類）であると考
えられており、臨床面でもエンドトキシン血症の
問題、エンドトキシン汚染を原因とする注射事
故、手術事故の問題も比較的多く、エンドトキシ
ン検出の必要性が増してきている。 現在、エンドトキシンの検出法として、リムラ
ステスト・ゲル化法と発色性合成基質法が使われ
ており、両方法ともカブトガニの血球成分（リム
ラス・アメーボサイト・ライセート）を利用した
ものである。これらの方法は、カブトガニの血球
中に存在する前凝固性酵素（Proclotting
Enzyme）をエンドトキシンが活性化し、活性化
酵素（Clotting Enzyme）とするもので、ゲル化
法ではカブトガニ血球中に存在している凝固性蛋
白（Coagulogen）に前記活性化酵素が作用して、
３種類のペプチドＡ、Ｂ、Ｃを生成する。ペプチ
ドＡとＢはＳ−Ｓ結合するが、この際に肉眼で見
える“ゲル”を形成するので、これを指標として
エンドトキシンの陽性・陰性を判定するという半
定量的方法である。 もう一方の発色性合成基質法は、ゲル化法と原
理は同じであるが、上記凝固性蛋白に代つて発色
性の合成基質を用いる方法である。この合成基質
には、種々の物質が検討されているが、例えば有
効な基質部分オリゴペプチドにパラニトロアニリ
ン（PNA）を結合させたものが現在市販されて
いる。この基質にエンドトキシンにより活性化さ
れた酵素が作用するとパラニトロアニリンを遊離
して、反応液は黄色となる。遊離パラニトロアニ
リンと添加エンドトキシン量は比例するので、黄
色を吸光度（OD405nｍ）で測定してエンドトキ
シン量を定量することが出来る。 （発明が解決しようとする問題点） しかしながら、以上２つの検出法において、ゲ
ル化法は簡便で検出感度が高いが、定量性に欠け
るという問題点があり、発色性合成基質法ではエ
ンドトキシンの定量が可能であり、検出感度も高
いが、手間がかかりかつダイナミツクレンジが狭
いという問題点があつた。 この発明は、上記問題点を解決すべくなされた
ものであり、簡便で検出感度が高くかつダイナミ
ツクレンジの広いエンドトキシンの定量法を提供
しようとするものである。 本発明者らは、鋭意研究の結果、まず前記ゲル
化法におけるゲル成長過程の状態が、ゲル層の光
散乱光量を電気的に検出して得られる電気信号の
変化から簡便に知りうることを見出した。そして
さらに研究の結果、この光散乱光量の変化には第
１図に示すごとき一定のパターンが認められる点
を見出し、これに基づいてエンドトキシンの定量
を行なう点に想着し、この発明に到達した。 (ロ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、検体にリムラス・
アメーボサイト・ライセート試薬を反応させてゲ
ル化を起こさせ、その光散乱光量を測定してゲル
開始時間を求め、既知濃度のエンドトキシンのゲ
ル開始時間と比較して、検体中のエンドトキシン
濃度を定量することを特徴とするエンドトキシン
の定量法が提供される。 この発明における「ゲル開始時間」とは、ゲル
化反応における光散乱光量の変化を示す第１図の
ごときグラフにおける、テスト開始点（Ａ；リム
ラス・アメーボサイト・ライセート試薬添加時）
から横軸に平行に引いた外挿線と、ゲル化開始点
Ｂとゲル化終了点Ｄの間の最大傾斜線との交点Ｃ
を設定した際のＡ−Ｃ間の時間を意味する。 この発明の最も特徴とする点は、上記で定義さ
れる「ゲル開始時間」が、検体中のエンドトキシ
ン濃度に最も相関関係があることを見出した点に
ある。 このようにして設定したゲル開始時間を、まず
種々の既知濃度のエンドトキシンについて求め、
それを指標とし、それと未知濃度のエンドトキシ
ンを含む検体について求めたゲル開始時間とを比
較すれば、検体中の未知濃度のエンドトキシン濃
度を定量することができる。 この発明に用いるリムラス・アメーボサイト・
ライセート試薬としては、従来のエンドトキシン
検出用のリムラス・アメーボサイト・ライセート
をエンドトキシンフリーの蒸留水に溶解したもの
をそのまま用いることができる。またこの発明の
対象とする検体は、液状のものはそのまま又は希
釈した被検液として反応に供せられ、液状以外の
ものは、適宜エンドトキシンフリーの蒸留水に溶
解又は抽出した被検液として反応に供せられる。 かかる検体又は被検液とリムラス・アメーボサ
イト・ライセート試薬の反応は、エンドトキシン
フリーのガラス製反応容器中、これらを混合する
ことにより行なわれる。通常、37℃前後の温度下
で放置して反応させるのが適しており、また混合
液のPHは６〜８となるように設定するのが適して
いる。 この発明における光散乱光量の変化は、適当な
光散乱光量測定装置を用いて測定でき、この装置
は専用機を用いてもよく、また汎用フオトメータ
ー用いてその場で構成してもよい。ただし、少な
くとも前記反応容器をそのまま測定セルとして測
光位置に設定でき、かつ測定部が37℃前後に恒温
化され更に光散乱光量を連続的に出力できるよう
構成されていることを要する。更に反応容器とし
ては、試薬量ができるだけ少なくてすむようにな
るべく少容量のものが好ましい。このような観点
から、最も好ましい光散乱光量測定装置として光
散乱光検知式のいわゆる血液凝固分析装置を用い
ることができ、その例としては、コアグ・スタツ
ト（国際試薬株式会社製）が挙げられる。 なお、かような光散乱光量測定装置に、マイク
ロプロセツサを用いたゲル開始時間自動演算器及
びエンドトキシン濃度換算器とリンクすれば、自
動測定が可能となる。かような自動演算は、出力
変化の最大変化率を求める比較アルゴリズムと計
算式のから容易にプログラム設定することがで
き、濃度換算は検量線からのフアクター計算及び
データ入力により容易にプログラム設定すること
ができる。 また第５図に示した様に、総ゲル生成量は反応
液中の凝固性蛋白濃度に比例することも見出し
た。このことから１回の試薬に要する試薬の量を
減らすことも可能であり、コスト的にも有効な方
法であることがわかる。 （実施例） 以下、実施例で本発明を詳説するが、これによ
つてこの発明は限定されるものではない。 実施例 １ （エンドトキシン濃度とゲル開始時間との相
関） ゲル開始時間とエンドトキシン濃度との相関関
係を求めるために、エンドトキシンに標準リポポ
リサツカライド（E.coli UKT−Ｂ）を使用して
各エンドトキシン濃度におけるゲル開始時間を測
定した。 まず、リムラス・アメーボサイト・ライセート
（カブトガニ血球抽出物凍結乾燥品：和光純薬工
業KK製）にエンドトキシンフリーの水５mlを無
菌的に加え静かに振り混ぜ完全に溶解し、リムラ
ス・アメーボサイト・ライセート試薬とした。次
いで光散乱光量測定装置（コアグスタツト）用試
験管を250℃、２時間で乾燥熱滅菌しておき、該
試験管に上記試薬を0.2ml注入し、その中へ各既
知濃度のエンドトキシン含有液0.2mlをそれぞれ
添加し、光散乱光量測定装置（コアグ・スタツ
ト：国際試薬株式会社製）にて、ゲル化時の光散
乱光量の変化を測定し、記録計に出力し、出力さ
れたデータをもとにしてゲル開始時間を求めた。
実験は２回行ない、その結果を第１表に示した。
【表】
この結果をもとにして第２図に示す検量線を作
成した。縦軸は対数目盛で表示したゲル開始時間
（分）、横軸は同じく対数目盛で表示したエンドト
キシン濃度（ｎｇ／ml）である。なお、グラフの
○・は第１回目を、△・は第２回目の実験結果を示
す。 また、第１表中第１回目の測定データの中でエ
ンドトキシン濃度が100、１、0.02nｇ／mlのもの
の散乱光量とゲル開始時間との関係を求めた記録
計のチヤートを例として第３図ａ，ｂ及びｃに示
した（図中、縦軸は散乱光量を電圧出力ｍＶで表
示したもの、横軸は時間を示す）。 実施例 ２ エンドトキシン既知濃度の液の代わりに姫路市
の上水道水を用いた以外は実施例１と同じ方法で
測定し、第４図のようなチヤートが得られた。こ
のチヤートを基にして、実施例１で述べた手法で
ゲル開始時間を求めたところ、8.4分という値が
得られた。第２図の検量線によりこの値から、こ
の水道水のエンドトキシン濃度は4.4nｇ／mlとい
うことがわかつた。これは、従来法による経験的
な数値の同程度のものであつた。 なお、コアグスタツトでの光散乱光量測定に液
量が0.3ml以上必要であるために、今回は試液0.2
ml、サンプル液0.2mlとしたが、試液0.1ml、サン
プル液0.2mlでもよく、また装置が変わればそれ
らの量を任意に選ぶことが可能である。 このようにして未知濃度のエンドトキシンを含
む検体のゲル開始時間を、前記で作成した検量線
と比較することにより、検体のエンドトキシン濃
度を容易に求めることができる。 (ハ) 発明の効果 この発明の方法によれば、簡便で検出感度の高
いゲル化法では困難であつたエンドトキシン濃度
の定量を正確・簡単に行うことができ、また発色
性合成基質法に比べてダイナミツクレンジが広い
等の優れたものとなる。 また、マイクロプロセツサを用いた自動化も容
易であるという効果も備えている。
成した。縦軸は対数目盛で表示したゲル開始時間
（分）、横軸は同じく対数目盛で表示したエンドト
キシン濃度（ｎｇ／ml）である。なお、グラフの
○・は第１回目を、△・は第２回目の実験結果を示
す。 また、第１表中第１回目の測定データの中でエ
ンドトキシン濃度が100、１、0.02nｇ／mlのもの
の散乱光量とゲル開始時間との関係を求めた記録
計のチヤートを例として第３図ａ，ｂ及びｃに示
した（図中、縦軸は散乱光量を電圧出力ｍＶで表
示したもの、横軸は時間を示す）。 実施例 ２ エンドトキシン既知濃度の液の代わりに姫路市
の上水道水を用いた以外は実施例１と同じ方法で
測定し、第４図のようなチヤートが得られた。こ
のチヤートを基にして、実施例１で述べた手法で
ゲル開始時間を求めたところ、8.4分という値が
得られた。第２図の検量線によりこの値から、こ
の水道水のエンドトキシン濃度は4.4nｇ／mlとい
うことがわかつた。これは、従来法による経験的
な数値の同程度のものであつた。 なお、コアグスタツトでの光散乱光量測定に液
量が0.3ml以上必要であるために、今回は試液0.2
ml、サンプル液0.2mlとしたが、試液0.1ml、サン
プル液0.2mlでもよく、また装置が変わればそれ
らの量を任意に選ぶことが可能である。 このようにして未知濃度のエンドトキシンを含
む検体のゲル開始時間を、前記で作成した検量線
と比較することにより、検体のエンドトキシン濃
度を容易に求めることができる。 (ハ) 発明の効果 この発明の方法によれば、簡便で検出感度の高
いゲル化法では困難であつたエンドトキシン濃度
の定量を正確・簡単に行うことができ、また発色
性合成基質法に比べてダイナミツクレンジが広い
等の優れたものとなる。 また、マイクロプロセツサを用いた自動化も容
易であるという効果も備えている。
第１図は、散乱光量と時間との関係からゲル開
始時間を求めるためのグラフ、第２図は、ゲル開
始時間のエンドトキシン濃度との相関関係を求め
た検量線、第３図ａ，ｂ及びｃは、本発明の実施
例１の第１図相当図、第４図は実施例２の第１図
相当図、第５図は、凝固性蛋白濃度とゲル生成量
との関係を示すグラフである。
始時間を求めるためのグラフ、第２図は、ゲル開
始時間のエンドトキシン濃度との相関関係を求め
た検量線、第３図ａ，ｂ及びｃは、本発明の実施
例１の第１図相当図、第４図は実施例２の第１図
相当図、第５図は、凝固性蛋白濃度とゲル生成量
との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- １ 検体にリムラス・アメーボサイト・ライセー
ト試薬を反応させてゲル化を起こさせ、その光散
乱光量を測定してゲル開始時間を求め、既知濃度
のエンドトキシンのゲル開始時間と比較して、検
体中のエンドトキシン濃度を定量することを特徴
とするエンドトキシンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21492884A JPS6193958A (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | エンドトキシンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21492884A JPS6193958A (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | エンドトキシンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6193958A JPS6193958A (ja) | 1986-05-12 |
| JPH0414310B2 true JPH0414310B2 (ja) | 1992-03-12 |
Family
ID=16663893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21492884A Granted JPS6193958A (ja) | 1984-10-13 | 1984-10-13 | エンドトキシンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6193958A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE452986T1 (de) | 2003-03-17 | 2010-01-15 | Charles River Lab Inc | Methoden und zusammensetzungen für den nachweis mikrobieller verunreinigungen |
| JP2008522640A (ja) | 2004-12-02 | 2008-07-03 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | グラム陽性菌夾雑物の検出および／または定量化のための方法ならびに組成物 |
| WO2006076617A2 (en) * | 2005-01-13 | 2006-07-20 | Charles River Laboratories, Inc. | Method for classifying a microorganism in a biological sample |
| US20100129260A1 (en) * | 2007-05-01 | 2010-05-27 | Yoshiaki Shirasawa | Gelation measuring apparatus and sample cell |
| EP2261642A4 (en) | 2008-03-19 | 2011-10-26 | Toru Obata | DEVICE FOR DETECTING HORIZONTAL FORMATION |
| JP5188311B2 (ja) | 2008-07-30 | 2013-04-24 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| JP5401115B2 (ja) * | 2009-02-13 | 2014-01-29 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| WO2014058757A2 (en) * | 2012-10-08 | 2014-04-17 | General Electric Company | Centripetal microfluidic platform for lal-reactive substances testing |
-
1984
- 1984-10-13 JP JP21492884A patent/JPS6193958A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6193958A (ja) | 1986-05-12 |
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