JPH04144695A - 分泌蛋白質のリフォールディング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、組換えＤＮＡ技術により分泌生産される異種
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフオールディングによる製法に
関するものである。

［従来の技術］ 今日、組換えＤＮＡ技術により微生物を宿主として異種
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。

組換えによる蛋白質の生産法は、菌体内に蓄積させる方
法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別さ
れる。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にとも
ないそれらはインクルージヨンボディと言われる封入体
の形で菌体内に蓄積する（参考文献１）。後者では、菌
体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に分
泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生産
された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有利
である。しかしながら両者とも、特に前者において、蛋
白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正し
い立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の不
活性化が大きな問題である（参考文献２）。この不活性
化の原因として最も一般的で最大のものとして認められ
ていることは、蛋白分子内でシスティン残基間における
正しいＳ−５架橋（ジスルフィド結合）が形成されない
ために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構造が
望ましくない蛋白が生産されることである（参考文献３
）。

従来、このような不活性蛋白は精製時に不純物として廃
棄されるか、もしくは煩雑で効率の悪い方法によるＳ−
３結合の再構成処理、いわゆるリフォールディングによ
って活性型に変換されていた。

これまで行われていたリフオールディング方法を簡単に
述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは部
分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生産
系では菌体の破砕処理ならびにインクルージヨンボディ
ーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてより
煩雑である。

次に、変性側および還元剤により蛋白質分子内の誤った
Ｓ−３結合の開裂を行い、還元剤、酸化剤および変成剤
を組合せて添加し最適条件下にて正常な蛋白質の生成に
向けてＳ−８結合の再構成を行う。さらに変性側、還元
剤および酸化剤を除去するためのカラムクロマト等の処
理がなされる（参考文献４）。

具体例を述べると、Ａｎｆｉｎｓｅｎによる精製された
ランのりボヌクレアーゼを用いたりフォルディング実験
に代表されるように、間違ったＳ−３結合をもつ精製し
た蛋白質溶液にチオール化合物を添加することにより、
正しい構造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは
、蛋白質のＳ−８結合がチオール化合物により還元され
、次に空気酸化によりＳ−８結合の再構成が行われ、自
由エネルギー減少の法則に従い間違った構造が正しい安
定な構造にもどったと考えられる（参考文献６）。しか
しながら、リフォールディングに要する時間が非常に長
くかかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため
処理後に再度精製のための操作が必要であること等の理
由により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産へ
の応用は難しいものであった。

このように、従来の蛋白質のリフオールディングには数
段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操作
途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールディ
ングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋白
の収率はさほど高いとはいえない状況であった（参考文
献５）。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は組換えＤＮＡ技術により分泌生産される異種蛋
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なりフォルディング法を提供する
ことを目的とする。

丁課題を解決するための手段］ 以上のような点に鑑み本発明者らは検討を重ねた結果、
驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては分泌
されたタンパク質の精製もしくは部分精製をすることな
しに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を直接
還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見出し
本発明に到達した。

すなわち、本発明は岨換えＤＮＡ技術により分泌生産さ
れた異種蛋白質のＳ−８結合の誤った架橋を正しいＳ−
３結合に再架橋させる蛋白質のリフオールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中に
、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後に
酸化させる一連の処理により正しいＳ−Ｓ結合に再架橋
させることを特徴とするリフオールディング法である。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明の対象とする蛋白質は組換えＤＮＡ技術により分
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。

本発明の使用する還元剤としては、たとえばメルカプト
エタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シス
ティン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールアミ
ン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使用
量はとくに制限はないが、通常１〜１００ｍＭである。

還元の条件も特に制限はないが、１０〜５０°Ｃ好まし
くは２０〜４０°Ｃで数分から１時間である。

還元剤の添加は培養上清を回収し、その回収した上清へ
添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中の
培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における酸
化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよい
が、好ましくは培養上清または培養液に通気することに
より行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常は
溶存酸素濃度が１０％以上の条件にて１０〜５０°Ｃ好
ましくは２０〜４０°Ｃで数分から１時間である。

組換えＤＮＡ技術による物質生産では、ＤＮＡ配列に従
って新しく合成されたポリペプチド鎖が、正確に折りた
たまれて天然型と同し機能を持つ三次構造をとることが
必要である。そして、ポリペプチド鎖が折りたたまれて
三次構造を形づくるにあたってアミノ酸配列によって規
定される情報は蛋白質内でのアミノ酸どうしの相互作用
によって最終的に熱力学的に安定な構造をとるための情
報である。天然の蛋白質内で熱力学的に安定な構造をと
るためには、ファンデルワールス力、ねじれ力、静電力
、水素結合、疎水性結合、そしてジスルフィド結合が関
与し、これらのエネルギーの総和が最小になるようにα
−へリソクス、β−シト、ターンなどの二次構造が三次
元的に折りたたまれ、最も安定な構造をもつ。そのため
には分子内あるいは分子間相互作用のうち唯一共有結合
であるジスルフィド結合すなわちＳ−３結合が重要であ
ることは明らかである。

遺伝子組換え操作により微生物に異種遺伝子由来の蛋白
質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、目
的産物の精製過程における処理操作および経済性から有
利であることは明らかである。しかしながら分泌生産系
を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条件
下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、ア
ミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と同
様であるにもかかわらず活性を持たず、またＨＰＬＣ分
析において活性型と異なる分離溶出のパタンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびＨＰＬ（ｊ８出パターンを調べた
。その結果、このものの活性回復が認められ、ＨＰＬＣ
分離溶出パターンも天然の活性型蛋白と同様となること
を見いだした。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌
生産時に、正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、−
次構造は正しいがＳ−３結合のかけ違いにより活性を持
たない蛋白質が生し、さらにこれらの不活性型蛋白はチ
オール化合物の添加および再酸化により容易に活性型ヘ
リフォールディングされることを示すものである。

そこで本発明者らは、チオール化合物による蛋白質のリ
フオールディング作用を、分泌生産系において生じるＳ
−３結合のかけ違いにより不活性型となった蛋白質のリ
フオールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分泌
生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接チ
オール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質の
りフォルディング法の検討を行った。

その結果、培養液あるいは培養上清への通気を実質上停
止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよう
な条件下にてチオール化合物を直接培養液あるいは培養
上清に添加し、蛋白質の誤ったＳ−３結合の開裂のため
しばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化により
リフォールディングを行う一連の操作により、Ｓ−８結
合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有する
蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明におけるリ
フォールディング法は、従来行われていたリフオールデ
ィング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのため
経済的でもある。

また、分泌生産された蛋白質を対象としているため分泌
生産のだめの宿王菌株は、一般に利用されている大腸菌
、枯草菌、酵母を問わない。

本発明者らは、すでにトロンビンの阻害側であるヒルジ
ン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形質
転換された枯草菌菌株を造成している（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−１００２８）。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは
、分子内に３組のＳＳ結合ををするものであるが、高通
気条件下の高率発現、分泌においては誤った架橋による
不活性型のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。

しかしこのような培養条件下においても、本発明のリフ
オールディング法を適用することにより目的とする活性
型ヒルジンの生産量を飛躍的に増大させることに成功し
た。また増大した量は、本発明の処理以前に存在する不
活性型のものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的
に行われることが見いだされた。このことは本発明の再
架橋法により不活性型のものが、はぼ１００％の転換率
で活性型に変換されることを示すものである。

：実施例： 以下本発明を具体例で説明するが、本発明はこの例によ
り何ら限定されるものではない。

実施例１ （培養上清への還元剤添加によるリフォールディング） ヒルジン分泌枯草菌株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００２８）
を、２倍濃度のＬＢ培地（０，２％グルコス）を用い３
０°Ｃで一夜振曇培養し、０Ｄ６６０が５〜６の培養液
を得る。この培養液から高速遠心分離により画体を除き
、培養上清を回収する。

本培養上清を均等に分注し、各々にメルカプトエタノー
ルを終濃度にして０〜５０ｍＭになるように直接添加し
、軽く撹拌した後室温にて１０分間静置した。次に３０
°Ｃにて３０分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理
を行った後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定
量した（参考文献７）。結果を第１表に示す。なお、コ
ントロールには無処理の培養上清を用いた。また、第１
表に示されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオス
ライト−ル、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度
により効果の差があるものの、まったく代替えすること
が可能であった。

第１表 濃度　（ｍ門）（ｍｇ／ｌ） ４９゜ 実施例２ （培養液中への還元剤の直接添加によるリフオルディン
グ） 溶存酸素センサーを装備した３０！容ジャーファーメン
タ−（丸菱ハイオエンジ■社製ＭＳＪし３Ｗ型）に２１
Ｂ培地（０，４％グルコース）を２０ｆｆ仕込み、前培
養したヒルジン分泌枯草菌株（ＥＦＲＭ　　Ｐ−１００
２８）を植菌し、空気量４ｆ／ｍｉｎ、回転数２５Ｏｒ
ｐｍにて３０°Ｃて培養を行う。１７〜１８時間培養後
０Ｄ６６０が７〜８の時点て、通気を停止する。しばら
く後熔存酸素濃度がＯになったところで直ちに終濃度１
．５ｍＭまでメルカプトエタノールをジャー中に直接添
加する。５分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を継
続する。さらに培養開始後２２時間において同様の操作
を行った。第２表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。

第２表 ２２　　　　　　　　７８．Ｌ　　　　　　　１４０．
０実施例３ （リフォールディング処理を行った培養液のＨＰＬＣ検
定） 実施例２で得られるメルカプトエタノール処理を行う直
前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加えるこ
とによりｐＨを３に合わせ、生しる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、５０ｍＭ酢酸アンモニウム−ギ酸緩
衝１ａ（ｐＨ３，０）により平衡化したイオン交換樹脂
５Ｐ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ　　Ｍ　（ＩＢＦ社製）カラ
ムに添加する。次に同緩衝液にてカラムを洗浄した後、
５０ｍＭ酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝液（ｐＨ４，２）
により溶出されるヒルジン活性画分を集め部分精製を行
う。このようにして得られたヒルジン画分をＨＰＬＣに
供試しその溶出パターンを調べた。

用いたカラムは、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ　　Ｃ３（
Ｗａｔｅｒｓ社製）で、０．１％トリフルオロ酢酸と１
００％アセトニトリルの二液グラジェント系により溶出
を行った。メルカプトエタノール理を行う直前および処
理直後の培養液中に含まれるヒルジンの溶出パターンの
比較を第１図に示す。ここで、双方における２９分のリ
テンションタイムのピークが活性型ヒルジンのピークで
ある。処理前に認められる４０〜５０分のピークは、そ
れらを分取しアミノ酸組成分析およびＮ末端アミノ酸配
列の解析を行ったところ完全に活性型のヒルジンと一致
することがらＳ−３結合のかけ違いにより生したヒルジ
ンの不活性型分子種であることが判明した。さらにこれ
らの処理直前に見られた４０〜５０分のリテンションタ
イムのピクは、処理後には完全に消失していることが認
められた。さらに、処理後におけるヒルジンの活性の増
加分は、消失したピークの量と一致するものであった。

（参考文献−覧） １、門１ｔｒａｋｉ、Ａ　Ｅｔ　ａｔ、　　（１９８９
）　　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、、　７，６９０ ２、　Ｔｓｕｊｉ、Ｔ、　　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８
７）　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２３、安藤鋭部ら　（１９
７３）　　タンパク質化学３４３３　　共立出版 ４、池原森男ら　（１９８８）　　タンパク賞工学実験
７．１−ユアル　８３　　講談社すイエンティフィク ５、特開昭６２−５０１２６２ ６、　　Ａｎｆｉｎｓｅｎ、Ｃ，Ｂ　　（１９６４）　
　ｉｎ　’Ｎｅｗ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　　ｉｎ
　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　　５ｅｌａ、Ｍ、、ｅｄ、　　
４２　　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ７　、０ｇａｓａｗａｒａ、Ｎ、　　　（１９８５）　
　Ｇｅｎｅ、４０，１４５

【図面の簡単な説明】

第１図は、培養液中へのメルカプトエタノールの直接添
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のＨＰＬＣの溶出パター
ンを示したものである。図中の数字は、各ピークのリテ
ンションタイムを表わしている。記号Ａで示した不活性
なビクは、リフォールディング処理後には消失しており
記号Ｂで示される活性型のピークに変換されている。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えＤＮＡ技術により分泌生産された異種蛋白質
   のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を正しいＳ−Ｓ結合に再架橋
   させる蛋白質のリフオールディング法において、該蛋白
   質を含む培養液もしくは培養液上清中に、還元剤を添加
   し、誤った架橋を開裂させ、しかる後に酸化させる一連
   の処理により正しいＳ−Ｓ結合に再架橋させることを特
   徴とするリフオールディング法。 ２、還元剤がメルカプトエタノール、ジチオスライトー
   ル、グルタチオン、システイン、チオグリコール酸、メ
   ルカプトエタノールアミン、ジチオエリスリトールより
   任意に選ばれた一もしく二以上の組合せである請求項１
   に記載のリフオールディング法。 ３、還元剤の添加が、通気を停止した状態の培養中の培
   養液へ直接行われることを特徴とする請求項１または２
   に記載のリフオールディング法。 ４、還元剤により開裂されたＳ−Ｓ結合の酸化および還
   元剤の酸化が、培養槽への通気により行われることを特
   徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリフ
   オールディング法。 ５、分泌生産のための宿主菌株が、大腸菌、枯草菌また
   は酵母であることを特徴とする請求項１ないし４のいず
   れか１項に記載のリフオールディング法。 ６、分泌生産された異種蛋白質が、トロンビンの阻害剤
   であるヒルジンであることを特徴とする請求項１ないし
   ５のいずれか１項に記載のリフオールディング法。