JPH04148676A - 灌流培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はホロファイバーを利用して細胞を灌流培養する
新しい方法、より詳しくは細胞培養用媒質として高分子
栄養を供給でき、且つ培養細胞環境の経時的悪化をでき
るだけ防止して、長期間に亘る高密度細胞培養を可能と
し、更に目的生産物をより高収率で製造可能とする改良
された灌流培養方法に関する。

従来の技術 従来より、動物細胞、微生物細胞、植物細胞等の各種細
胞を高密度で大量に培養する方法の一つとしてホロファ
イバー（中空糸）を培養槽として利用した灌流培養方法
が知られている。

この方法は、ホロファイバーの壁が半透膜として選択的
透過性を有することを利用して、適当なカラムに充填さ
れた多数本の束状ホロファイバー（キャピラリー）の外
表面上に細胞を設置し、該キャピラリーの内側空間（Ｉ
ｎｎｅｒ　ＣａｐｉｌｌａｒｙＳｐａｃｅ・ＩＣ８）に
栄養素等の細胞培養用媒質を潅流させることによって、
上記栄養素等をキャピラリー壁を経て細胞に送り、逆に
細胞が存在するキャピラリー外側空間（Ｅｘｔｒａ　Ｃ
ａｐｉｌｌａｒｙ　５ｐａｃｅ。

ＥＣ８）に産生される細胞生産物を固壁を経て上記ＩＣ
８を流れる潅流液中に流出させようとするものである。

上記方法は、細胞の生体外培養に適した微小環境を保持
し得、また細胞を三次元的に所謂有機体状構造に成長さ
せ得る点より、優れたものであるが、潅流液中に存在さ
せて細胞に供給すべき栄養素等は、上記キャピラリーの
半透膜を通過できる大きさ、即ち分画分子量以下に限定
され、従ってそれ以上の高分子物質を連続的に供給する
ことはできないという致命的欠点があった。

また、上記方法では細胞が存在するＥＣ８に、培養細胞
が産生じた老廃物や死細胞等が経時的に蓄積し、更に死
細胞の分解等により蛋白分解酵素等の細胞増殖阻止因子
や目的生産物の分解因子等も上記ＥＣ８に経時的に蓄積
され、之等が培養細胞環境を比較的速やかに悪化させる
と共に、培養細胞の高密度化を達成し得ない不利があり
、長期に亘る細胞培養を不可能としたり、目的生産物の
収率の向上をはかり得ない不利もあった。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、上記従来のホロファイバーを用いた細
胞の灌流培養方法に見られる欠点を解消し、殊にホロフ
ァイバーの分画分子量よりも大きい分子量をもつ栄養素
やその他の細胞培養用試薬等を常時供給できると共に、
増殖細胞の産生ずる乳酸やアンモニウムイオン等の老廃
物は可及的速やかに細胞存在空間より排出させ、かくし
て新鮮な培養環境を常時維持して迅速且つ円滑な細胞の
増殖を行なわせ、最終到達細胞密度を向上させ、また細
胞増殖維持期間の長期化をはかり、ひいては目的生産物
の収量及び収率の向上を計ることにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは上記目的より鋭意研究を重ねた結果、従来
のホロファイバー灌流培養方法において、細胞存在空間
（Ｅ　ＣＳ）側より細胞非存在空間（ＩＣ８）側に培養
用媒質を流す方法を想到し、この方法によれば、上記目
的が悉く達成されることを見出し、ここに本発明を完成
するに至った。

即ち、本発明によればホロファイバーを利用して細胞を
灌流培養するに当り、該ホロファイバーの細胞存在空間
（Ｅ　ＣＳ）側より細胞非存在空間（ＩＣ８）側へ細胞
培養用媒質を流すことを特徴とする灌流培養方法、並び
に灌流培養期間中の任意の時期に、細胞存在空間（Ｅ　
ＣＳ）に蓄積される老廃物、死細胞、生細胞の増殖阻止
因子及び目的生産物の分解因子の少なくとも１種を、上
記ＥＣ３外に強制的に排出する上記灌流培養方法が提供
される。

本発明方法において、用いられるホロファイバーとして
は、従来よりこの種細胞の灌流培養に用いられている各
種のものをいずれも使用できる。

その例としては、例えばセルロース、セルロースエステ
ル類、ポリサルフォン、ポリアクリロニトリル、ポリメ
タクリル酸メチル、ポリアミド、ポリベンズイミダゾー
ル１、シリコーンポリカーボネート、ガラス等を素材と
して、溶融紡糸法、乾式紡糸法、湿式紡糸法等により製
造される中空糸を例示できる。之等は通常直径１肛以下
の毛管で、中空糸の壁が半透膜として機能する性質を共
通して有している。上記の内でも特にダウ・ケミカル社
製の酢酸セルロース膜（内径：１８０〜２００μｍ１外
径＝２３０〜２５０μｍ１分画分子量：約３００００）
やアミコン社製のポリサルフォン膜（内径：約２００　
μｍ、外径：約３５０μｍ。

分画分子量：約１００００．約３００００、約５０００
０）は好適である。また上記ホロファイバーは、これを
コラーゲン、フィブロネクチン（Ｆ　Ｎ）等の細胞保持
に適した基質で被覆したものであってもよく、これは特
に接着依存性細胞の培養に適している。

本発明方法は、基本的には以下の如くして実施される。

即ち、上記ホロファイバーの複数本を束にして適当なカ
ラムに充填して細胞培養槽を形成させ、まず上記カラム
内のホロファイバー外表面上に培養用細胞を設置すると
共にこの細胞存在空間（Ｅ　ＣＳ）に細胞培養用媒質を
導入させる。該媒質は上記細胞存在空間（Ｅ　ＣＳ）に
て細胞に連続的に供給されると共に、ホロファイバーの
壁を通過して内部空間（細胞非存在空間、ＩＣ８）に至
り、該■Ｃ８を経てカラム外へ連続的に排出される。乳
酸やアンモニウムイオン等、更にプロテアーゼ等の細胞
生成物は、上記媒質の排出に伴われてホロファイバー壁
を通過し細胞非存在空間（ＩＣ８）を経て、カラム外に
排出される。尚、本発明方法は上記と逆の構成、即ちホ
ロファイバーの内部空間に細胞を存在させてここに細胞
培養用媒質を連続的に供給し、ホロファイバー壁を経て
外部空間に排出させる構成を採ることもできる。

上記本発明方法において用いられる、細胞培養用媒質と
しては、培養すべき細胞の種類に応じて適宜決定でき、
之等はいずれも細胞培養に要求される各種の栄養素を含
むものであればよく、その具体例としては、例えばＭＥ
Ｍ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｆ−
１２培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ウェイマウス （Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ）　Ｍ　Ｂ培地、ウィリアムス
（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　）　Ｅ培地等を例示テキル。

殊に本発明方法は、上記の構成、即ち細胞培養用媒質を
細胞存在空間（Ｅ　ＣＳ）よりホロファイバー壁を経て
細胞非存在空間（ＩＣ８）に潅流させる構成を採用した
ことに基づいて、特に細胞培養用媒質として高分子物質
をも利用でき、之等を常に連続的に細胞に供給させ得る
利点がある。該高分子物質としては、使用するホロファ
イバーの分画分子量よりも分子量の大きい物質、例えば
トランスフェリン（分画分子量二８００００）、血清ア
ルブミン（同：６９０００）、α−サイクロデキストリ
ン（α−ＣＤ、血清グロブリンのＣｏｈｎの分画■（ト
ランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロブリン
等の複合体）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ、同１０３００
０）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、同３００００）
、神経成長因子（ＮＧＦ、２６０００）、フィブロネク
チン（Ｆ　Ｎ、同２２００００〜２５００００）、イン
ターロイキン２　（ＩＬ−２、同１３０００〜１４００
０）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ、同３００
００）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ８Ｆ
、同６００００〜８５０００）、顆粒球・マクロファー
ジコロニ刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ、同２００００）等を
例示できる。

之等の高分子物質の本発明方法への利用は、例えば次の
如き利点を有する。即ち、トランスフェリンは殆どの動
物培養細胞の生存、増殖、分化に不可欠であり、栄養物
質としての鉄を１分子当り２原子結合（Ｋ８．＝１０　
〜ＩＯＭ）Ｌ、更にリセプタ−（Ｔ　ｆ　Ｒ）との結合
を介して細胞に鉄を効率よく与える働きがある。血清ア
ルブミンは培養細胞に対して、必須脂肪酸である長鎖不
飽和脂肪酸（オレイン酸、リノール酸等）の担体として
脂肪酸の細胞への供給を制御して、細胞の増殖に促進的
に働く。ｒ　Ｌ−２は、該ＩＬ−２に対するレセプター
を細胞膜表面に有する各種の細胞、例えばＮＫ細胞、Ｔ
細胞性白血病細胞、Ｔ細胞等の増殖を誘導する。ＨＧ　
Ｆはインシュリン及びＥＧＦ　（表皮細胞増殖因子）の
共存下で成熟肝細胞の増殖を促進する。

上記本発明方法により培養される細胞としては、特に限
定されるものではないが、例えば代表的にはヒト繊維芽
細胞、平滑筋細胞、グリア細胞、３Ｔ３細胞、ＮＫ細胞
、Ｔ細胞等を例示できる。

以下、本発明方法を添付図面を用いて説明する。

第１図乃至第３図は本発明方法の実施に適した装置の概
略図であり、第１図は循環培養系（Ｃ１ｏｓｅｄ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ）を、第２図はＩＣ８循環培養＋新鮮培地供
給系（ＩＣ５Ｏｖｅｒｆｌｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）を、
第３図はＩＣ８及びＥＣ８循環培養＋新鮮培地供給＋培
養産物回収系（ＩＣＳ　＆　ＥＣ５ＯｖｅｒｆｌｏｗＣ
ｕｌｔｕｒｅ　）をそれぞれ示す。

各図において（１）は循環ポンプを、（２）はガス交換
器を、（３）はＤｏセンサ（導入側）を、（４）はＤｏ
センサ（排出側）を、（５）はｐＨセンサ（導入側）を
、（６）はｐＨセンサ（排出側）を、（７）はリザーブ
タンクを、（８）は新鮮培養タンクを、（９）は消費培
養液タンクを、（１０）は生産物回収タンクを、（１１
）はホロファイバー培養槽（カラム）をそれぞれ示す。

上記図に示した装置の利用による本発明方法における灌
流培養の条件、培養方法、培養環境の制御等は、利用す
る細胞等に応じて適宜決定でき、特に限定されるもので
はないが、例えば後記する実施例に示した抗体産生細胞
の培養を例にとり詳述すれば以下の如くである。

即ち、培養温度としては一般に３７℃を採用でき、これ
は培養期間中一定とすることができる。

培養循環流量は約２０１１／分［培養初期からり。

（導入側）　−ＤＯ（排出側）＞５０１１１ｍＨｇとな
るまでの間］とすればよく、ＤＯ（導入側）　−Ｄ。

（排出側）＞５０ｍｍＨｇとなる度に循環流量を１０ｘ
ｌ！／分ずつ増加させるのが望ましい。培地交換は１時
間毎に上記第１図に示す循環培養系（Ｃ１ｏｓｅｄ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ）と第２図に示すＩＣ３循環培養＋新鮮培
地供給系（ＩＣ５Ｏｖｅｒｆｌｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）
とを交互に行ない、該ＩＣ８循環培養＋新鮮培地供給系
において培地交換量を順次増大させるのが望ましい。ｐ
Ｈ制御は、ＰＩＤコントローラーの設定値をｐＨ＝７．
２として該コントローラーにて制御するのがよい。尚、
培養中期においてガス交換器への送気ＣＯ２量（ＰＩＤ
コントローラーによる演算値）が０（ゼロ）になってか
ら後は、細胞の成育並びに物質代謝の危険水域であるｐ
）ｌ＝６．８以下にはならないように維持するが、培地
中の積算ＮａＨＣＯ３量が基準培地の３倍濃度になるよ
うであれば、ＮａＨＣＯｓ添加によるｐＨ維持をやめて
、−時的にポンプ循環流量を上げて全培養液を交換する
のが望ましい。また、Ｄｏ制御はＰＩＤコントローラー
の設定値をＤＯ＝１５０ｍｍＨｇとし、該コントローラ
ーにて制御し、培地循環流量の変更によりＤｏ（排出側
）〉１００ｍｍＨｇを維持させるのがよい。

上記温度制御は潅流回路全体をＨＥＰＡフィルターを使
用したクリーンな循環恒温槽中に置くことによって回路
中の培養液温度が一定に維持され得る。

上記ｐＨ制御はｐＨセンサー（導入側）の検出器として
ホロファイバー型のガス交換器に通気するＮ２　０２　
　ＣＯ２の３種混合ガス中のＣＯ２組成比率を専用のＰ
ＩＤコントローラーによって逐次決定送気することによ
り実施できる。更に回路中の新鮮培養タンク（８）を、
複数個並列に接続して、その少なくとも一つよりｐＨ緩
衝液、例えば培地の５００倍濃のＮａＨＣＯ３−ＰＢＳ
溶液を、ｐＨが随時添加することで培養の進行に伴われ
るｐＨの低下を防ぐことができる。

上記Ｄｏ制御はＤｏ（導入側）の検出器としてホロファ
イバー型のガス交換器に通気するＮ２−Ｏ２ＣＯ２の３
種混合ガス中の０２組成比率を専用のＰＩＤコントロー
ラーによって逐次決定送気することにより実施できる。

また培地循環流量の制御は培地循環ポンプ（これはべり
スタリックポンプやシリンジポンプやベローズポンプ等
であってもよい）の駆動モーターの回転をコントロール
することによって変化させ得る。

上記各図に示した装置の利用による本発明方法につき更
に詳述すれば、各図に示す装置は、ホロファイバーの外
側空間を細胞存在空間とし、該空間へ培養中連続的に培
養用媒質を供給する回路と、上記空間から供給された培
養用媒質をホロファイバーの内側空間へ連続的に排出し
続けるための回路とを主構成回路としている。

また本発明方法の実施に適した装置は、第２図に示すよ
うに、新鮮な培養用媒質を貯蔵したタンク（８）より、
上記主構成回路に新鮮な培養用媒質を供給し且つ老廃物
を含む使用済みの媒質を上記主回路からリザーブタンク
（７）を経て消費培養液タンク（９）に排出する副構成
回路（以下「回路構成（１）」という）を含んでいても
よく、更に第３図に示すように、上記主回路における細
胞存在空間から細胞非存在空間に至る培養用媒質の主要
な流れ以外に、培養の進行につれて細胞存在空間中に蓄
積されるおそれのある老廃物や死細胞、更に分解死細胞
より漏出される蛋白質分解酵素（プロテアーゼ等）の生
細胞の増殖阻害因子や目的産生物の分解因子等を定期的
にカラム外へ強制排出するための副構成回路（以下これ
を「回路構成（３）」という）を供えていてもよい。

上記各図に示す装置を用いた本発明方法は、例えばまず
予め培養回路の構成部品を、高圧蒸気滅菌（オートクレ
ーブ使用）、エチレンオキサイドガス滅菌、放射線滅菌
等の適当な滅菌操作により滅菌した後、クリーンベンチ
等の無菌環境下に回路全体を組み立て、以下の培養潅流
回路の初期化を行ない、次に細胞の播種及び培養を実施
する。

上記初期化は、例えば上記回路を３７℃に維持された恒
温槽（該恒温槽はより好ましくはＨＥＰＡフィルターを
使用した通風循環システムを伴うクリーン恒温槽である
のがよい）内に設置し、１０％ＦＢＳ　（牛胎児血清）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地等の適当な培地を培養潅
流回路中に循環させることにより実施できる。上記にお
いてガス交換器には、酸素ガス、炭酸ガス、窒素ガスの
３種のガスを供給できる。酸素ガス供給量はＤｏ調節計
により、炭酸ガスはｐＨ調節計により、それぞれＰＩＤ
制御出力により、それぞれ酸素ガス専用マスフロー調節
計、炭酸ガス専用マスフロー調節計で調節でき、また窒
素ガス供給量はコンピューターによる演算処理により、
全ガス供給量が所定の一定値になるよう決定され、窒素
ガス専用マスフロー調節計により調節できる。かくして
、ｐＨを７，２、Ｄｏ（導入側）を１５０ｍｍＨｇに維
持するようにガス供給を制御して４８時間培養液を潅流
させて、初期化を完了する。

上記初期化に引き続（細胞の播種は、例えば所定の細胞
密度、ＲＰＭＩ−８２２６株の場合は好ましくは４Ｘ１
０６個／　７Ａ’程度、に調節した細胞浮遊液５０１１
を針なしシリンジに取り、空になっているホロファイバ
ーの外側空間（もしくは内側空間）にポートより注入す
ることにより実施でき、これによりカラム当り約ｌＸ１
０Ｂ個のＲＰＭＩ−８２２６を細胞を播種させるのが適
当である。

更に上記で播種された細胞の培養は、例えば約１時間毎
に数回ホロファイバーの向きを変えてカラム内で細胞が
極在しないように調節した後、数時間培養液の循環速度
を１１１／分で培養液を前記主構成回路に循環させ、Ｄ
ｏ（導入側）とり。

（排出側）の差が播種時の差に比べて減少しないようで
あれば、培養用媒質の循環速度を２０ｚｌ！／分に上昇
させる。リザーブタンク（７）の容量を約２１とし、培
養開始４８時間後より、第１図に示す循環培養系（Ｃ１
ｏｓｅｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）と第２図ニ示すＩＣ３循環
培養＋新鮮培地供給系（ＩＣ５Ｏｖｅｒｆｌｏｗ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ）とを交互に切り替工且つ時間比率を調整す
ることによって、培養１週間まで、５００ｚｌ／日の交
換比率で、消費培養用媒質を新鮮培養液と連続的に交換
しながら培養を続ける。

播種７日より培養用媒質の交換比率を１０００ｘｉ１日
に上昇させると共に、２日毎に１回副構成回路２の機能
を使用して、細胞非存在空間側の培養液を１０Ｉｌずつ
回収する。ｐＨ値が６．８以下になると自動的にｐ）（
緩衝液（５％ＮａＨＣＯ３含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ
）＝培養液の５０倍濃度溶液を、第２図に示す構成回路
（１）以外の部分（以下これを「構成回路（２）」とい
う）を゛使用して、培養潅流回路中に１回当り６ｘｌ添
加する。但しこの添加操作は６時間以内に２回以上行な
ってはならないように自動的にセットする。

添加されたｐＨ緩衝液が潅流回路中で充分均一に拡散さ
れるまでに時間を必要とするので、ｐＨ緩衝液が添加さ
れてから２時間以降で且つ６時間以内に、灌流培養液の
ｐＨ値が６．８より低下するようであれば、改めて新鮮
培養液を１０００／／２時間の高速で消費培養液と交換
する。この時構成回路（２）を使用する。

次いで１〜２日に１回、構成回路（２）を使用して、２
ｘｌの灌流培養液を回収し、グルコース濃度を測定し、
５０■／ｌ以下の場合は、上記と同様の培養液交換を実
施する。

培養１４日１より、新鮮培養液と消費培養液との交換比
率を２０００ｚ／／日に上昇させると共に、ＥＣ８側の
培養液を２日毎に２５１１づつ回収する。

かくして、本発明方法によれば、ホロファイバーの分画
分子量より大きい分子量をもつ高分子物質を常時培養細
胞に供給でき、増殖細胞によって産生された老廃物を培
養期間中常時強制排出でき、新鮮な培養環境を常時維持
でき、それ故、細胞培養維持期間を延長して、最大到達
細胞密度を向上させ得ると共に、長期間に亘って、高収
率で目的産生物の生産を可能とする。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

実施例　１ この例は下記ホロファイバー培養槽利用の培養装置（添
付図面参照）を用い、以下の基本条件下に、次の通り実
施された。

（１）対象細胞：ＲＰＭｒ−８２２６細胞（モノクロー
ナル抗体産生株） （２）　　目的産生物質：モノクローナル抗体（ＩｇＧ
　　Ｌ−λ鎖） （３）使用培養液：ＲＰＭＩ−１６４０培地十ＭＥＭ培
地（１：　１）　＋ １０％ＦＢＳ （４）検出法：ＩｇＧＬ−λ産生量の検出は、ＥＩＡ法
による。

（５）ホロファイバー培養槽： アミコン社製ヴイタファイバー■ （分画分子量＝３００００）ホロ ファイバー（ポリサルフォン製） 使用 （６）播種細胞数：ｌＸ１０Ｂ細胞 （播種密度＝４　Ｘ　１０６細胞／Ｉ）（７）培養日数
＝３４日 （８）細胞存在側空間体積：　２５ｃｍ３（ｘｉ）（９
）最終到達細胞数：５Ｘ１０９細胞（１０）　　生産物
量：４３０■（ｒｇＧ　　Ｌ−λ）即ち、予め培養回路
の構成部品を、高圧蒸気滅菌（オートクレーブ使用）、
エチレンオキサイドガス滅菌、放射線滅菌等の適当な滅
菌操作により滅菌した後、クリーンベンチ等の無菌環境
下に回路全体を組み立て、以下の培養潅流回路の初期化
を行ない、次に細胞の播種及び培養を実施した。

上記初期化は、例えば上記回路を３７℃に維持された恒
温槽（該恒温槽は好ましくはＨＥＰＡフィルターを使用
した通風循環システムを伴うクリーン恒温槽であるのが
よい）内に設置し、１０％ＦＢＳ　（牛胎児血清）を含
むＲＰＭＩ−１６４０＋ＭＥＭ　（１：　１）培地を、
培養潅流回路中に循環させることにより実施した。上記
においてガス交換器には、酸素ガス、炭酸ガス、窒素ガ
スの３種のガスを供給し、酸素ガス供給量はＤｏ調節計
により、炭酸ガスはｐＨ調節計により、それぞれＰＩＤ
制御出力により、それぞれ酸素ガス専用マスフロー調節
計、炭酸ガス専用マスフロー調節計で調節でき、また窒
素ガス供給量はコンピューターによる演算処理により、
全ガス供給量が所定の一定値になるように決定し、窒素
ガス専用マスフロー調節計により調節した。かくして、
ｐＨを７．２、Ｄｏ（導入側）を１５０ｍｍＨｇに維持
するようにガス供給を制御して４８時間培養液を潅流さ
せ、初期化を完了した。

上記に引き続く細胞の播種は、４Ｘ１０６個／１１程度
に調節したＲＰＭＩ−８２２６株の細胞浮遊液５０１１
を、針なしシリンジに取り、空になっているホロファイ
バーの外側空間にポートより注入して行ない、かくして
カラム当り約ｌＸ１０Ｂ個のＲＰＭＩ−８２２６を細胞
を播種した。

上記播種細胞の培養は、約１時間毎に数回ホロファイバ
ーの向きを変えてカラム内で細胞が極在しないように調
節後、数時間培養液の循環速度を１ｚｌ／分で培養液を
主構成回路に循環させ、Ｄ。

（導入側）とＤｏ（排出側）の差が播種時の差に比べて
減少しないようであれば、培養用媒質の循環速度を２０
Ｉｌ１分に上昇させて行なった。リザーブタンク（７）
の容量を約２１とし、培養開始４８時間後より第１図に
示す循環培養系（Ｃ１ｏｓｅｄＣｕｌｔｕｒｅ）と第２
図に示すＩＣ８循環培養十新鮮培地供給系（ＩＣ３Ｏｖ
ｅｒｆｌｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）とを交互に切り替え且
つ時間比率を調製することによって、培養１週間まで、
５００ｚ／／日の交換比率で、消費培養用媒質を新鮮培
養液と連続的に交換しながら培養を続けた。

播種７日より培養用媒質の交換比率を１０００ｘｉ１日
に上昇させると共に、２日毎に１回副構成回路２の機能
を使用して、細胞非存在空間側の培養液を１０Ｉｌずつ
回収した。ｐＨ値が６．８以下になると自動的にｐＨ緩
衝液（５％ＮａＨＣＯ３含有ＰＢＳ＝培養液の５０倍濃
度）溶液を構成回路２を使用して、培養潅流回路中に１
回当り６１／添加した。但しこの添加操作は６時間以内
に２回以上行なってはならないように自動的にセットし
た。

添加されたｐＨ緩衝液が潅流回路中で充分均一に拡散さ
れるまでに時間を必要とするので、ｐＨ緩衝液が添加さ
れてから２時間以降で且つ６時間以内に、灌流培養液の
ｐＨ値が６．８より低下するようであれば、改めて新鮮
培養液を１０００ｚ／／２時間の高速で消費培養液と交
換した。この時構成回路（２）を使用した。

次いで１〜２日に１回、構成回路（２）を使用して、２
１Ａ’の灌流培養液を回収し、グルコース濃度を測定し
、５０■／ｌ以下の場合は、上記と同様の培養液交換を
実施した。

培養１４日目より、新鮮培養液と消費培養液との交換比
率を２０００３Ｆ／／日に上昇させると共に、ＥＣ８側
の培養液を２日毎に２５ｙＪづつ回収した。

かくして、目的産生物質を得た。

上記に従う細胞培養結果を第４図に示す。

図において、横軸は培養時間（Ｈｒ）を、縦軸は目的１
ｇＧ　　Ｌ−λ産生量（■）［曲線（１）として図示す
るコ及び酸素消費量（０，Ｃ，Ｒ，）　　（μモル／分
）［曲線（２）として図示するコを示す。

また第４図には上記酸素消費量（０・Ｃ，Ｒ，）に基づ
く算出細胞数（推定、個）を、該酸素消費量の横に表示
した。

該図より、本発明方法によれば、細胞培養維持期間を延
長して、最大到達細胞密度を向上させ得ると共に、長期
間に亘って、高収率で目的産生物が生産できることが明
らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は、本発明方法の実施に適したホロフ
ァイバー灌流培養装置の一例を示す概略図であり、第４
図は本発明方法の実施による細胞培養の結果を示すグラ
フである。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ホロファイバーを利用して細胞を灌流培養するに
   当り、該ホロファイバーの細胞存在空間側より細胞非存
   在空間側へ細胞培養用媒質を流すことを特徴とする潅流
   培養方法。（２）灌流培養期間中の任意の時期に、細胞
   存在空間に蓄積される老廃物、死細胞、生細胞の増殖阻
   止因子及び目的生産物の分解因子の少なくとも１種を細
   胞存在空間外に強制的に排出する請求項１記載の方法。