JPH04149101A

JPH04149101A - 移植器官潅流保存液および移植器官潅流保存法

Info

Publication number: JPH04149101A
Application number: JP27042390A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Suzuki; 鈴木　一比好
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-10-11
Filing date: 1990-10-11
Publication date: 1992-05-22
Anticipated expiration: 2014-10-04
Also published as: JP2956998B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、移植器官の保存に使用される灌流保存液に関
するものである。

（従来の技術および問題点）腎臓移植が初めて臨床で行われてから３０年あまりかた
ち、この間手術手技の向上、移植患者の適応基準の検討
、免疫学的検査の進歩ならびに免疫抑制剤の開発などに
より、移植成績は著しく向上し、欧米では既に移植が一
般的な医療として定着している。現在では、腎臓のみな
らず、心臓、肝臓、膵臓などの移植も広く行われるよう
になってきている。この臓器移植成績の向上には、臓器
保存法の進歩が太き（寄与している。特に近年、急激な
移植症例数の増加により臓器の供給が不足しており、ま
た移植後、臓器の機能不全が起こった場合、再移植が極
めて難しくなっている。そのため、移植臓器の機能を低
下させずに長時間の保存が可能な方法の確立が強く求め
られている。

現在、臨床的に用いられている臓器保存法は、低温浸漬
法（Ｌａｎｃｅｔ　２１２＋９〜１２２２（１９６９）
：ｌと低温灌流保存法［Ｌａｎｃｅｔ　２５３６　（１
９６７））に大別される。

近年、死体腎移植が広範に普及するに伴い、臓器を長期
間保存可能な低温灌流保存法が重要性をましてきており
、この保存法に使用される潮流液の開発、改良が盛んに
行われている。

低温灌流保存法の目的は、臓器をより生理的な条件に近
づけて保存することにある。すなわち、低温灌流保存法
とは、組織を低温下（一般には１０℃以下）におくこと
により代謝を抑制し、灌流によって必要な酸素および栄
養素を補助し、代謝産物を除去する方法であるといえる
。

ここで、一般に血液そのものを灌流液として使用すると
、粘性の増加、赤血球破壊による遊離ヘモグロビンの組
織沈着、血小板、脂質、フィブリノーゲンによる血栓形
成などがおこることが知られている。

ベルツァらは、血漿を凍結融解し、フィブリノーゲンを
てきるだけ除いた低温沈澱血漿（Ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐ
ｉｔａｔｅｄ　ｐｒａｓｍａ）を灌流液として用い、犬
の腎臓を７２時間保存することに成功した。［Ｌａｎｃ
ｅｔ　２．５３６．　　（１，９６７）］　さらに、ト
レドーベレイラ等は、シリカゲルで処理した低温沈澱血
漿中に残存するフィブリノ−ケン、β−リポプロティン
を完全に除去し、更に不溶性脂質画分であるトリグリセ
ライドの量を１７３まで減少させた灌流液を開発した。

しかしながら、これらの低温沈澱血漿は、不溶性脂質画
分が完全に除去されていないため、灌流中に脂質栓塞が
生じる危険性があること、また血漿中に含まれる肝炎ウ
ィルスの不活性操作（加熱処理）ができないため、肝炎
ウィルス感染の危険性を伴うという欠点を有するもので
あった。

これらの欠点を補うものとして、ゲルトマンらは、クレ
ブス−リンゲル液に６％濃度に人アルブミンを加えた灌
流液を用い、大賢を低温において９６時間灌流し、自家
移植を行い、８０％以上の成着率を得ることに成功した
。（Ｇｒｕｎｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ；Ｔｒａｎｓｐｌ、
、１７２９９〜３０５　（１９７４））しかしながら、
このような灌流液を用いた低温灌流保存法には、以下の
ような問題がある。

すなわち、細胞はＡＴＰを消費しなからＮａポンプを動
かし形態を保っている。しかし、組織が低温状態になる
と血管内皮のＡＴＰａｓｅの活性が低下するため、エネ
ルギーが供給されず、Ｎａポンプが働かなくなり、細胞
は洋種をおこす。保存器官が延長するに従い、血管内皮
およびその周辺の洋種は顕著になり、移植後、微少循環
障害を引き起こすと考えられている。［Ｊａｃｂｓｅｎ
　Ｉ＾、　Ｐｅｇｇ　ＤＥ：Ｋｉｃｌｎｃｙ、　Ｉｎ＋
Ｏｒｇａｎ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｒ
ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｋａｒｏｗ　ＡＭ、Ｐｅ
ｇｇ　ＤＥ（ｅｄｓ）、　ｐ５５６〜５５８．Ｍａｒｃ
ｅｌ　　Ｄｅｋｋｅｒ　　Ｉｎｃ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ
、１９８］）一方、完全フッ素化有機化合物（パーフル
オロカーボン化合物）は、非常に良く酸素を溶解する液
体で、乳剤の型において酸素運搬体として作用する。こ
のパーフルオロカーボン乳剤を用いて、ナカヤらは、家
兎腎を室温で９時間灌流し、腎の生存力を生化学的手法
で検討した。（Ｐｒｏｃｅｅｄ　ｉ　ｎｇｏｆ　Ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｂｌｏｏｄ、　Ｋｙｏ
ｔｏ　１９７５．１８７〜２０１）また、ベルコウイツ
らは、アルブミンて安定化したパーフルオロカーボン乳
剤で腎を灌流し、移植後の成績について検討した。その
結果、腎の生着率はほぼ１００％と良好な結果を得たと
報告している。［Ｊ、　Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、２０５９５
〜６００　（１９７６））しかしながら、このパーフル
オロカーボン乳剤を灌流液として応用した場合において
は、灌流液に十分に酸素を溶解させるために、メンブラ
ンタイプあるいはバブリングタイプ等のオキンシエネタ
ーにより灌流液中の酸素分圧を十分高（維持しながら循
環させなければならず装置が複雑化することが避けられ
ない。また、サウザードらは、大賢の低温灌流実験で、
灌流液の酸素分圧を高くすると、血管内皮細胞中のミト
コンドリアの機能が低下することを報告している。（Ｓ
ｏｕｔｈａｒｄ　ＪＨｅｔａｌｏＴｏｘｉｃｉｔｙ　ｏ
ｆ　ｏｘｙｇｅｎ　ｔｏ　ｍ１ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　
ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃａｌ　ｐｅｒｆｕｓｅｄ　ｃａ
ｎｉｎｅ　ｋｉｄｎｅｙｓ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ
ｉｏｎ　２９：４５９．１９８０）従って、パーフルオ
ロカーボン乳剤を灌流液として応用した場合には、過度
の酸素化による障害と、灌流圧による血管の障害が起こ
る危険性を有するものであった。

（発明が解決しようとする課題）従って、本発明は、低温灌流保存法に見られるＡＴＰａ
ｓｅ活性の低下、パーフルオロカーボン乳剤を応用した
場合における血管障害等の危険性を有さす、しかも、灌
流によって必要な酸素や栄養を十分に補助することが可
能である新規な灌流保存液を提供することを目的とする
。

（課題を解決するための手段）従って、上記課題を解決する本発明は、内部にヘモグロ
ビンを封入したリポソームを含有してなり、ヘモグロビ
ン濃度が７〜１５重量％に調整されたことを特徴とする
移植器官灌流保存液である。

前記保存液は、膠質浸透圧が２５〜３５ｍｍＨｇに調整
されていることが好ましい。

また、前記保存液を灌流させるにあたっては、３５〜３
８℃の温度下で行うことが好ましい。

以下、本発明の詳細な説明する。

しかして本発明に係る移植器官灌流保存液（以下、単に
保存液という。）は、内部にヘモグロビンを封入したリ
ポソームを含有してなることを特徴とするものである。

内部にヘモグロビンを内包したリポソーム（以下、ヘモ
グロビン内包リポソームという）およびその製造方法は
、既に、特開昭５２−１．５１７５８号、同５８−１．
８３６２５号、同６１−３７７３５号、同６２−１．７
８５２１号、同６３−２０９７４６号、同６３−２１１
．２３０号、同６３２７５５２２号、同６４−６１．４
２６号、同６４７５４１８号、特開平１−１．８０２４
５号公報に開示されている。

以下、ヘモグロビン内包リポソームについて説明する。

リポソーム膜を形成する脂質は特に制限はなく、リポソ
ームを形成するものであれば天然または合成の脂質が使
用可能である。特にリン脂質が好適に使用され、その例
としては、ホスファチンルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン、スフィンゴミエリン、ホスファチノルコ
リン等に代表されるリン脂質で卵黄、大豆その他の天然
材料に由来するもの、または有機化学的な合成手段によ
り得られるものを単独でまたは混合して主成分とするこ
とができる。さらに膜安定化剤としてコレステロール、
コレスタノール等のステロール類や、梨型物質としてホ
スファチシン酸、ンセチルホスフェート、高級脂肪酸等
を添加してもよい。

本発明の保存液においては、そのヘモグロビン濃度が７
〜１５％に調整されてなることが必要である。このよう
な値に調整することにより、組織を常温下におくことに
より代謝が活発になっても、これを補うに十分な酸素を
補助することができる。

ヘモグロビンを酸素運搬物質として使用しこれを移植組
織灌流保存液に応用する試みとしては、ヘモグロビンに
ポリオキンエチレンを結合させた安定化ヘモグロビンが
知られている。［岩崎　敏活、山川　孝、着下　雄二・
人工臓器　１７（２）、７０４〜７０７　（１９８８）
］前述したように、本発明の保存液においては、ヘモグロ
ビンがリポソーム内にカプセル化されてなるため、膠質
浸透圧はヘモグロビン濃度の影響を受けない。従って、
ヘモグロビン濃度を７〜１５％まで高めることにより、
常温下においても十分に必要とされる酸素を供給するこ
とが可能になる。また、灌流中のメトヘモグロビンの生
成も効率的に抑えられる。

こねに対し、ポリオキンエチレン結合ヘモグロビンを主
成分とする保存液を適用した場合には、ヘモグロビンが
カプセル化されていないため、組織が許容する膠質浸透
圧を維持するためには、ヘモグロビン濃度は６重量％程
麿が限界であり、常温下で灌流を行うには酸素運搬能が
不十分であるという問題があった。また、この保存液を
常温下で灌流させた場合には、メトヘモグロビン生成が
顕著である（２４時間で２０％）ことが指摘されており
、従って、この保存液を用いて灌流を行う場合には、組
織をある程度低温下（２０℃）において、代謝を抑制す
る必要があるものであった。

リポソーム内部に取り込まれるヘモグロビン溶液の濃度
および粘度は、特に限定されるものではないが、粘度は
１０〜３．０００ｃｐ　（４℃）、ヘモグロビン濃度は
３０〜６０％（Ｗ　／　Ｗ　）が望ましい。膠質浸透圧
が、生体血液の正常な膠質浸透圧に比べて極端に低すぎ
る場合には、血管外の細胞が浮秤を起こす虞れがあり、
また高すぎる場合には、血管外の細胞が脱水状態になる
虞れがある。本発明の保存液は、膠質浸透圧調整剤を添
加する等し、て浸透圧調整がなされたものであること、
具体的には２５〜３５　ｍｍ１１ｇに調整されたちので
あることが望まれる。

このような膠質浸透圧調整剤としては、アルブミン、グ
ロブリン等の天然血漿由来の蛋白質、あるいはアカシア
ゴム、修飾セラチン、ポリビニルピロリドン、デキスト
ラン、ポリエチレンクリコル、カルホキツメチルセルロ
ース、ヒトロキノエチルデンブノ等のノ＼工的な水溶性
高分子化合物が挙げられる。

保存液の粘度としては、ずり速度が３３３　ｓｅｃ、温
度が３７℃において、天然血液と同等かそれ以下の粘度
、すなわち４．５ｃｐ以下に調整されてなることが望ま
しい。

また、本発明のノ＼工血液においては、電解質組成は、
リンゲル液、乳酸リンケル液あるいはコリンズ液等の電
解質溶液を用いて天然血液とほぼ同様の組成に調整され
てなることが好ましい。

次に本発明の保存液の製造方法について説明する。

ヘモグロヒン内包リポソームを製造するには、公知の方
法が用いられ得るが、好ましくは、リポソーム膜形成脂
質を凍結乾燥した均一混合粉末に蒸留水を添加し、５０
〜８０°Ｃに加温して脂質を水和させ、該水和物にヘモ
グロビン水溶液を加え、５〜１０℃で高速撹拌機を用い
て混合物中の懸濁粒子の平均粒径が１．８０〜３００ｎ
ｍとなるまで撹拌することにより達成される。

リポソーム膜形成脂質とへモグロヒン水溶液の混合・撹
拌は、撹拌型細胞破砕機（ワーリングブレンダー）を用
いて懸濁粒子の外径が１８０〜３００ｎｍになるまで撹
拌することによって実施される。撹拌は、回転数１０．
０００〜２０．００Ｏｒｐｍで６〜１０分間行うことが
望ましい。

このようにして得られたリポソーム懸濁液は、常法に従
って洗浄・濃縮される。

洗浄・濃縮されたリポソーム懸濁液には、膠質浸透圧が
２５〜３５　＋＋＋＋ｎＦ１ｇ、ヘモグロビン濃度が７
〜１５％となるように膠質浸透圧調整剤および電解質溶
液が添加・混合され、本発明の保存液とされる。なお、
膠質浸透圧調整剤は、原料粉末の形状で、リポソームの
水懸濁液中に添加・溶解してもよい。

次に本発明の保存液を用いた移植器官保存法について説
明する。

すなわち、臓器提供者より提供された移植臓器ま、修正
コリンズ液あるいは乳酸リンゲル液により洗浄された後
、市販の灌流保存装置を用いて本発明の保存液に接続さ
れ、３５〜３８℃にて所定時間（概ね、２４〜７２時間
）灌流を行いながら保持される。この際の循環速度は、
通常、１０〜２００＋ｒ＋ｆ／ｇ（腎）７時間とされる
。灌流保存を終えた後は、修正リンゲル液あるいは乳酸
リンゲル液により洗浄され、移植に供される。

次に実施例および比較例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

〔実施例〕

■ヘモグロヒン内包すポソーム艷濁液の作成水素添加率
９０％の精製大豆ホスファチジルコノン、コレステロー
ル、ミリスチン酸、ビタミンＥの均一凍結乾燥粉末〔プ
レソーム　日本精化髭製’Ｊ　　１０８ｇに等量の蒸留
水を加えて、６００Ｃ６０分の水和処理を行った。得ら
れた水和脂質にヘモグロビン濃度５０％（Ｗ／Ｗ）の赤
血球膜除去ヘモグロビン溶液６０ｍｊを加え、５°Ｃに
冷却しながら高速撹拌機〔アシホモミキサー・特殊機化
工業上製〕を用いて、１．０．０００ｒｐｍ、６０分の
撹拌処理を行、った。

得られたリポソーム懸濁液を生理食塩水で・１０倍に希
釈して、０４５μフイルターを用いて除菌および粒子径
制御を行った、濾液を血漿分離器で処理し、リポソーム
に取り込まれなかったヘモグロビンおよび微小粒子を除
去した。濾液にヘモグロビンが検出されなくなるまで生
理食塩水を追加して、循環洗浄を繰り返し、最終的にヘ
モグロビン濃度が５％となるまで濃縮した。得られたリ
ポソームＶ濁液の容量は１２００ｍ＋？であった。

■修正リンゲル液の調整Ｎａ　Ｃ１６，５１ｇｅｆＳＭｇＳＯｎ　０．４　ｇ／
ｆ。

ＫＣｌ０．８　ｇ＃５ＮａＨＣＯ３０，２４ｇ＃、Ｎａ
　２ＨＰ　０４０．１４　ＦＺ／ｌ、グルコース６．０
ｇ＃の割合で蒸留水に溶解し、電解質組成が、Ｎａ＝１
１２、Ｋ−１１、Ｍｇ＝７、Ｃｒ＝１１８、Ｈｃｏ＝３
、ＨＰＯ４＝２．５Ｏ４＝７、グルコース＝３３（各単
位はｍ　Ｅ　ｑ　／ｌ’）である溶液を調整した。■市
販のヒドロキンエヂルデンブン（サリンヘス　杏林製薬
闘製〕を■で得られた溶液に溶解せしめ、さらにこ第１
に■て得られた修正リンケル液を添加して、ヘモグロビ
ン濃度１５％、ヒトロキノエチルデンブン濃度６％（Ｗ
／Ｖ　）に調整し、灌流液（実施例）を作成した。

得られた灌流液の膠質浸透圧は２８　ｍｍＨｇ、品質浸
透圧は２９０ｍ０５ｍ、粘度は３．２ｃｐ（すり速度３
８３５ｅｃ−’、温度３７°Ｃ）であった。

〔比較例　ポリオキノエチレン結合へモグロヒン含有灌流保存液〕

モノメトキンポリオキシエチレンコハク酸モノエステル
（平均分子量５０００）５ｑ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸
イミド０．２３ｑ、ジンクロヘキノルカルボンイミド０
４２ｇを、３　Ｑ　Ｑ　ｍ／（７）Ｎ、　Ｎジメチルホ
ルムアミドに溶解し、室温で一夜撹拌した。

生成したシンクロヘキンル尿素を濾過し、濾液に６ＱＱ
ｍｌのエチルエーテルを加え、生成したモノメトキシポ
リエチレンクリコールモノ　（ザクンイミンルサクノネ
ート）結晶を濾過し、エーテルで洗浄した後乾燥し、４
．ｆ３ｇの白色結晶を得た。

ピリドキサールリン酸結合へモクロヒン０．５９を１０
０ｍｎのホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８、５）に溶解した液に
、水冷下−ト記活性エステル０．５９を加えた。

水冷下４時間撹拌した後、分子量阻止３万の限外濾過膜
により限外濾過を繰り返し、未反応の活性エステルまた
はその分解物を除去することにより６％修飾へモクロビ
ン溶液（比較例）５ｍｉｌｌを得た。

得られた修飾へモグロヒン溶液の膠質浸透圧は２５　ｍ
ｍ１ｇ、品質浸透圧は２９　Ｑ　ｍ０５ｍ、粘度は３２
Ｃｐ　（すり速度３８３５ｅｃ−’、温度３７℃）であ
った。

［メトヘモグロヒン生成実験］ポロファイバー型人工柿キャビオックス■（テルモ社製
）２個を用い、一方へには純酸素を、もう一方のＢには
５．２％酸素（酸素分圧４０ｍｍＨｇ）を２００ｍ１！
／分の速さで流した。この系において、実施例および比
較例の清流保存液を３７℃において１．００ｍ１／分の
速さで灌流し、メトヘモグロビン比率を可視吸収により
経時的に測定した。その結果、比較例の灌流保存液を灌
流した例においては、２４時間で初期値に比べ２０％上
昇したのに対し、実施例の灌流保存液を灌流した場合に
おいては、初期値に比べ１２％しか上昇しなかった。

［移植腎灌流保存実験］実施例および比較例の灌流保存液を用いて移植腎灌流保
存実験を行った。実験は次の手順て行った。

体重１．０　ｋ　ｇの雑種成人１０匹にベントパルビタ
ールナトリウムを３０ｍｇ／ｋｇの割合で静注して麻酔
し、腹部正中線切開にて開腹して左腎臓を摘出した。摘
出した腎の尿管、動脈および静脈にカニユーレを挿入し
た後、カニユーレ内に玲修正コリンズ液を導入して洗浄
し、次いてカニユーレ内に実施例および比較例の灌流保
存液を導入して、３７℃において４８時間灌流を行った
。

保存を終えた後、再び修正コリンズ液を用いて洗浄し、
これを大腿部へ自家移植した。さらに、移植１週間目に
対側腎を摘出した。

その後、６０日間以上生存したものを生存と判定し、６
０日未満の死亡で腎機能不全を伴ったものは、腎保存不
良による死亡と判定した。その結果、実施例の灌流保存
液を用いた例においては、１０匹中９匹が生存したのに
対し、比較例の灌流保存液を用いた例においては１０匹
中４匹しか生存しなかった。

（発明の効果）以上、詳述したように、本発明の移植器官灌流保存液は
、内部にヘモグロビンを封入したリポソームを含有して
なり、ヘモグロビン濃度が７〜１５重量％に調整された
ことを特徴とするので、低温灌流保存法に見られるＡＴ
Ｐａｓｅ活性の低下、パーフルオロカーボン乳剤を応用
した場合における血管障害等の危険性を有さす、しかも
、灌流によって必要な酸素や栄養を十分に補助すること
が可能である効果を奏する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）内部にヘモグロビンを封入したリポソームを含有
してなり、ヘモグロビン濃度が７〜１５重量％に調整さ
れたことを特徴とする移植器官灌流保存液。
（２）膠質浸透圧が２５〜３５ｍｍＨｇに調整されてな
る請求項１記載の移植器官灌流保存液。
（３）請求項１または２に記載の移植器官灌流保存液を
３５〜３８℃の温度下で灌流させることを特徴とする移
植器官灌流保存法。