JPH0414957B2 - - Google Patents
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- JPH0414957B2 JPH0414957B2 JP61120358A JP12035886A JPH0414957B2 JP H0414957 B2 JPH0414957 B2 JP H0414957B2 JP 61120358 A JP61120358 A JP 61120358A JP 12035886 A JP12035886 A JP 12035886A JP H0414957 B2 JPH0414957 B2 JP H0414957B2
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- sarcosine
- mol
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
産業上の利用分野
本発明は従来公知のサルコシン−オキシダーゼ
に比較して改良された安定性（保存性）、特に界
面活性剤含有分析試薬中での改良された安定性を
有する新規サルコシンオキシダーゼに関する。 従来技術 サルコシンオキシダーゼ（E.C.1.5.3.1）は特に
サルコシン、クレアチン及びクレアチニンの酵素
的測定に使用可能である。特に、血清、血漿又は
尿中のクレアチニンの酵素的測定は臨床診断学に
おいて重要である。クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ（E.C.3.5.2.10）、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ（E.C.3.5.3.3）及びサルコシンオキシダー
ゼにより触媒される反応を組合せることにより、
簡単な方法で比色測定されるH2O2がクレアチニ
ンから１：１の科学量論比で最終的に形成され
る；特に好適であるのはこの比色測定のために多
数の色原体システム、例えば“トリンダー
（Trinder）タイプ”〔ベルグマイヤー
（Bergmeyer）、“メトーデン・デル・エンチイマ
テイツシエン・アナリユーゼ（Methoden der
enzymatischen Analyse）”第４改訂版、第１巻
（1983年）、第197頁参照〕のものがあり、この方
法においてはペルオキシダーゼの存在下に４−ア
ミノアンチピリン及びフエノール性又はアニリン
性カツプラーからH2O2により酸化的に色素が得
られ、この色素の量（もしくは強度）は生じた
H2O2量に対して直線関係にある。 サルコシンオキシダーゼ反応に困るクレアチニ
ン検出法は公知酵素的クレアチニンテスト
〔Bergmeyer、“Methoden derenzymatischen
Analyse”、第３改訂版、第巻（1974年）、第
1834頁、タンガネリ（Tanganelli）等著、クリ
ニカル、ケミストリー（Clin.Chem.）第28巻、
1983年、第1464頁〕に対して明らかに高い検出感
度（それぞれ使用したカツプラーの種類による）
という利点を有しており、このことは診断学上の
判定範囲における低い血清クレアチニン濃度（44
〜97マイクロモル／）のために、まさに分析精
確さに関して非常に重要である。更に、使用され
る中性、水性媒体中での色原体の安定性はUVテ
ストの指示薬NADHの安定性より良好である。
今日なお最も使用されている慣用法、ヤフエ
（Jaff′e）によるクレアチニン測定法（ホツペ・
セイラーズ・ツアイトシユリフト・フユル・フイ
ジオローギツシエ・ケミー（Hoppe−Seylar′s
Z.Physiol.Chem.）第10巻、1886年、第391頁）に
比較して、この方法は、更に著しく高い特異性及
びこれによる改良された診断学的証言力を提供
し；更には腐蝕性の強アルカリ試薬との反応も回
避される。 例えば、クレアチニン測定のためにサルコシン
オキシダーゼの使用は、これが調合済試薬中で０
〜25℃で少なくとも数日間十分に貯蔵安定であ
り、更に測定の実施の際に高めた温度（30〜37
℃）においても必要な最低反応時間にわたつて著
しい活性損失が生じないという前提を有する。臨
床化学においてはしばしば試料として濁つた、ト
リグリセリド濃度血清が得られるので、酸素分析
試薬が更にいわゆる澄明化システムを含有してい
るのが有利であり、該システムは多くの場合リパ
ーゼと非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチル
化アルキル−又はアルアルキルアルコール）及び
溶解助剤としてのコール酸ナトリウムのような胆
汁酸の塩との組合わせからなり、これは強く脂肪
血の試料にも妨害のない視覚測定を可能とする。 クレアチニン測定をこのような混濁試料中で実
施するためには、サルコシンオキシダーゼが前記
貯蔵もしくは反応条件において界面活性剤による
変性又は不活性化に対して十分抵抗性である必要
がある。 更に、サルコシンオキシダーゼが好適な酵素特
性、例えばサルコシンに関する低いミハエリス定
数及び高い最高反応率を有していることが必要で
ある、それというのもこの特性により酵素的サル
コシン−、クレアチン−及びアレアチニン測定に
おける反応時間が主に決定されるからである。例
えばクレアチニンの酵素的測定は高温（37℃）に
おいても、かつ界面活性剤及び溶解助剤の存在に
おいても実施可能であるべきなので、好適な酵素
特性はまさにこれらの不利な環境条件において重
要なのである。 相応する実験は、公知サルコシンオキシダーゼ
がこのような界面活性剤含有分析試薬中で要求を
満たす貯蔵安定性及び／又は高めた反応温度にお
ける安定性を示さないということを示した。 発明が解決しようとする問題点 従つて、サルコシンオキシダーゼに対する要求
はサルコシンオキシダーゼが前記特性、特に安定
性基準を満たすことである。 問題点を解決するための手段 該課題は本発明においてストレプトマイセタツ
エー（Streptomycetaceae）科のカイニア
（Chainia）属及びストレプトマイセス
（Streptomyces）属からのサルコシンオキシダー
ゼを使用することにより解決する。 このH2O2形成酵素は界面活性剤の存在で燐酸
カリウム0.15モル／、PH7.9中で25℃において、
２日後に出発時活性の少なくとも40％を示す。界
面活性剤含有媒体中37℃で、該酵素はサルコシン
に関してKM−値２〜４ミリモル／を有する。
これに対し、公知で、該測定に十分に安定なサル
コシンオキシダーゼのKM−値はこの条件におい
て約16〜20ミリモル／である。 本発明による酵素はストレプトマイセタツエー
科のすべての属（The Prokryotos、第巻、
1981年、第2028頁）、例えばカイニア・プルプロ
ゲナ（Chainia Purpurogena）DSM43156、カイ
ニア・オクラツエー（Chainia ochraceae）
DSM43155、ストレプトマイセス・フロツクルス
（Streptomyces flocculus）DSM40327、ストレ
プトフエルテイシリウム・スペシーズ
（Streptoverticilliun sp.）DSM40237及びキタサ
トア・プルプレア（Kitasatoa purpurea）
DSM43362において見い出される。 本発明の酸素は４つの異なる下位単位
（Untereinheit）からなる。分子量は約170KDで
ある。 該酵素は６〜９のPH範囲及び40℃を下まわる温
度で安定である。50℃においては15分間で不活性
化する。反応の最適な温度は約37℃であり、PH最
適値はPH8.0である。高い基質特異性は基質類似
物質の非常にわずかな変換において明らかであ
る；こうして例えばＮ，Ｎ−ジメチルグリシンで
の変換率はサルコシン特異性反応のわずかに１％
である。 種々の不利な試薬で25℃で測定したサルコシン
に関するKM−値（燐酸塩緩衝液；TES−緩衝液）
は２〜３ミリモル／である、Vnaxは約6U／mg
蛋白質である。次の第１表は本発明による酵素の
種々の製剤に関して、25℃及び37℃で測定したサ
ルコシンのKM値を示す。比較のためには公知バ
シラス（Bacillus）酵素に関する相応する値を示
した。
に比較して改良された安定性（保存性）、特に界
面活性剤含有分析試薬中での改良された安定性を
有する新規サルコシンオキシダーゼに関する。 従来技術 サルコシンオキシダーゼ（E.C.1.5.3.1）は特に
サルコシン、クレアチン及びクレアチニンの酵素
的測定に使用可能である。特に、血清、血漿又は
尿中のクレアチニンの酵素的測定は臨床診断学に
おいて重要である。クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ（E.C.3.5.2.10）、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ（E.C.3.5.3.3）及びサルコシンオキシダー
ゼにより触媒される反応を組合せることにより、
簡単な方法で比色測定されるH2O2がクレアチニ
ンから１：１の科学量論比で最終的に形成され
る；特に好適であるのはこの比色測定のために多
数の色原体システム、例えば“トリンダー
（Trinder）タイプ”〔ベルグマイヤー
（Bergmeyer）、“メトーデン・デル・エンチイマ
テイツシエン・アナリユーゼ（Methoden der
enzymatischen Analyse）”第４改訂版、第１巻
（1983年）、第197頁参照〕のものがあり、この方
法においてはペルオキシダーゼの存在下に４−ア
ミノアンチピリン及びフエノール性又はアニリン
性カツプラーからH2O2により酸化的に色素が得
られ、この色素の量（もしくは強度）は生じた
H2O2量に対して直線関係にある。 サルコシンオキシダーゼ反応に困るクレアチニ
ン検出法は公知酵素的クレアチニンテスト
〔Bergmeyer、“Methoden derenzymatischen
Analyse”、第３改訂版、第巻（1974年）、第
1834頁、タンガネリ（Tanganelli）等著、クリ
ニカル、ケミストリー（Clin.Chem.）第28巻、
1983年、第1464頁〕に対して明らかに高い検出感
度（それぞれ使用したカツプラーの種類による）
という利点を有しており、このことは診断学上の
判定範囲における低い血清クレアチニン濃度（44
〜97マイクロモル／）のために、まさに分析精
確さに関して非常に重要である。更に、使用され
る中性、水性媒体中での色原体の安定性はUVテ
ストの指示薬NADHの安定性より良好である。
今日なお最も使用されている慣用法、ヤフエ
（Jaff′e）によるクレアチニン測定法（ホツペ・
セイラーズ・ツアイトシユリフト・フユル・フイ
ジオローギツシエ・ケミー（Hoppe−Seylar′s
Z.Physiol.Chem.）第10巻、1886年、第391頁）に
比較して、この方法は、更に著しく高い特異性及
びこれによる改良された診断学的証言力を提供
し；更には腐蝕性の強アルカリ試薬との反応も回
避される。 例えば、クレアチニン測定のためにサルコシン
オキシダーゼの使用は、これが調合済試薬中で０
〜25℃で少なくとも数日間十分に貯蔵安定であ
り、更に測定の実施の際に高めた温度（30〜37
℃）においても必要な最低反応時間にわたつて著
しい活性損失が生じないという前提を有する。臨
床化学においてはしばしば試料として濁つた、ト
リグリセリド濃度血清が得られるので、酸素分析
試薬が更にいわゆる澄明化システムを含有してい
るのが有利であり、該システムは多くの場合リパ
ーゼと非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチル
化アルキル−又はアルアルキルアルコール）及び
溶解助剤としてのコール酸ナトリウムのような胆
汁酸の塩との組合わせからなり、これは強く脂肪
血の試料にも妨害のない視覚測定を可能とする。 クレアチニン測定をこのような混濁試料中で実
施するためには、サルコシンオキシダーゼが前記
貯蔵もしくは反応条件において界面活性剤による
変性又は不活性化に対して十分抵抗性である必要
がある。 更に、サルコシンオキシダーゼが好適な酵素特
性、例えばサルコシンに関する低いミハエリス定
数及び高い最高反応率を有していることが必要で
ある、それというのもこの特性により酵素的サル
コシン−、クレアチン−及びアレアチニン測定に
おける反応時間が主に決定されるからである。例
えばクレアチニンの酵素的測定は高温（37℃）に
おいても、かつ界面活性剤及び溶解助剤の存在に
おいても実施可能であるべきなので、好適な酵素
特性はまさにこれらの不利な環境条件において重
要なのである。 相応する実験は、公知サルコシンオキシダーゼ
がこのような界面活性剤含有分析試薬中で要求を
満たす貯蔵安定性及び／又は高めた反応温度にお
ける安定性を示さないということを示した。 発明が解決しようとする問題点 従つて、サルコシンオキシダーゼに対する要求
はサルコシンオキシダーゼが前記特性、特に安定
性基準を満たすことである。 問題点を解決するための手段 該課題は本発明においてストレプトマイセタツ
エー（Streptomycetaceae）科のカイニア
（Chainia）属及びストレプトマイセス
（Streptomyces）属からのサルコシンオキシダー
ゼを使用することにより解決する。 このH2O2形成酵素は界面活性剤の存在で燐酸
カリウム0.15モル／、PH7.9中で25℃において、
２日後に出発時活性の少なくとも40％を示す。界
面活性剤含有媒体中37℃で、該酵素はサルコシン
に関してKM−値２〜４ミリモル／を有する。
これに対し、公知で、該測定に十分に安定なサル
コシンオキシダーゼのKM−値はこの条件におい
て約16〜20ミリモル／である。 本発明による酵素はストレプトマイセタツエー
科のすべての属（The Prokryotos、第巻、
1981年、第2028頁）、例えばカイニア・プルプロ
ゲナ（Chainia Purpurogena）DSM43156、カイ
ニア・オクラツエー（Chainia ochraceae）
DSM43155、ストレプトマイセス・フロツクルス
（Streptomyces flocculus）DSM40327、ストレ
プトフエルテイシリウム・スペシーズ
（Streptoverticilliun sp.）DSM40237及びキタサ
トア・プルプレア（Kitasatoa purpurea）
DSM43362において見い出される。 本発明の酸素は４つの異なる下位単位
（Untereinheit）からなる。分子量は約170KDで
ある。 該酵素は６〜９のPH範囲及び40℃を下まわる温
度で安定である。50℃においては15分間で不活性
化する。反応の最適な温度は約37℃であり、PH最
適値はPH8.0である。高い基質特異性は基質類似
物質の非常にわずかな変換において明らかであ
る；こうして例えばＮ，Ｎ−ジメチルグリシンで
の変換率はサルコシン特異性反応のわずかに１％
である。 種々の不利な試薬で25℃で測定したサルコシン
に関するKM−値（燐酸塩緩衝液；TES−緩衝液）
は２〜３ミリモル／である、Vnaxは約6U／mg
蛋白質である。次の第１表は本発明による酵素の
種々の製剤に関して、25℃及び37℃で測定したサ
ルコシンのKM値を示す。比較のためには公知バ
シラス（Bacillus）酵素に関する相応する値を示
した。
【表】
不利な試薬ａ（／）
燐酸カリウム0.15モルもしくはTES／KOH0.1
モル、PH7.9；２，４，６−トリブロム−３−ヒ
ドロキシ安息香酸8.6ミリモル、４−アミノアン
チピリン0.8ミリモル、K4（Fe（CN）6）10マイク
ロモル、コール酸ナトリウム５ミリモル、ルテン
ソル（Lutensol）ON50 0.5％、NaN30.2％、テ
イトリプレツクス（Titriplex）0.5ミリモル、
リパーゼ2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アル
コルビン酸オキシダーゼ10000U。 本発明による酵素は界面活性剤含有媒体中37℃
ですぐれた安定性においてきわだつており、この
安定性は粗抽出液上澄においても又精製酵素にお
いても示される。本発明による酵素の安定性を公
知サルコシンオキシダーゼに比較して次の第２表
に示す。
モル、PH7.9；２，４，６−トリブロム−３−ヒ
ドロキシ安息香酸8.6ミリモル、４−アミノアン
チピリン0.8ミリモル、K4（Fe（CN）6）10マイク
ロモル、コール酸ナトリウム５ミリモル、ルテン
ソル（Lutensol）ON50 0.5％、NaN30.2％、テ
イトリプレツクス（Titriplex）0.5ミリモル、
リパーゼ2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アル
コルビン酸オキシダーゼ10000U。 本発明による酵素は界面活性剤含有媒体中37℃
ですぐれた安定性においてきわだつており、この
安定性は粗抽出液上澄においても又精製酵素にお
いても示される。本発明による酵素の安定性を公
知サルコシンオキシダーゼに比較して次の第２表
に示す。
【表】
【表】
不利な試薬ｂ（／）：
燐酸カリウムPH7.9 0.15モル：２，４，６−ト
リブロム−３−ヒドロキシ安息香酸8.6ミリモル、
４−アミノアンチピリン0.8ミリモル、K4（Fe
（CN）6）10マイクロモル、コール酸ナトリウム５
ミリモル、ルテンソルON50 0.5％、NaN30.2％、
テイトリプレツクス0.5ミリモル、リパーゼ
2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アスコルビン
酸オキシダーゼ10000U、クレアチニナーゼ
25000U、クレアチナーゼ12000U、サルコシンオ
キシダーゼ＞100U。 バシラス（Bacillus）からの酵素のみが比較可
能な安定性を示し、すべての他の酵素は実施にお
いて完全に不十分な安定性を有するということを
前記表は示している。 次の第３表中には本発明による酵素及びバシラ
ス・スペシーズ酵素の25℃における長期安定性を
示す。
リブロム−３−ヒドロキシ安息香酸8.6ミリモル、
４−アミノアンチピリン0.8ミリモル、K4（Fe
（CN）6）10マイクロモル、コール酸ナトリウム５
ミリモル、ルテンソルON50 0.5％、NaN30.2％、
テイトリプレツクス0.5ミリモル、リパーゼ
2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アスコルビン
酸オキシダーゼ10000U、クレアチニナーゼ
25000U、クレアチナーゼ12000U、サルコシンオ
キシダーゼ＞100U。 バシラス（Bacillus）からの酵素のみが比較可
能な安定性を示し、すべての他の酵素は実施にお
いて完全に不十分な安定性を有するということを
前記表は示している。 次の第３表中には本発明による酵素及びバシラ
ス・スペシーズ酵素の25℃における長期安定性を
示す。
【表】
【表】
不利な試薬ｃ：
不利な試薬ｂと同じ組成であるが、色原体染色
システムを添加せず、燐酸カリウムPH7.9 0.15モ
ルと共にTES／KOH0.1モル使用した。 前記の値は、本発明の酵素が長期安定性におい
て従来公知の最高なサルコシンオキシダーゼ酵素
より著しくすぐれていることを示す。このことは
長期安定性と相関関係のある貯蔵安定性に関して
特に重要である。 従つて、本発明による酵素はその低いミハエリ
ス定数のゆえにサルコシン、クレアチン又はクレ
アチニンの酵素的測定の著しく迅速な実施を可能
とし、０℃〜25℃で格段に改良された貯蔵安定性
であり、かつ37℃においてサルコシン−、クレア
チン−又はクレアチニン測定における恒温保持時
間にわたつて公知サルコシンオキシダーゼの多く
のものより著しく安定である。 実施例 次に実施例につき本発明を更に詳細に説明す
る。 例 １ カイニア・プルプロゲナDSM43156の培養 生物を振盪フラスコ中次の組成の複合媒体中で培
養した： 酵母抽出液５ｇ、ペプトン（蛋白消化処理）３
ｇ、NaCl2ｇ、MgSO4×7H2O0.24ｇ、CaCl2×
7H2O0.014ｇ、グルコース２ｇ、サルコシン10
ｇ、H2O1、PH7.0。28℃で培養した培地は30時
間後に約400U／の活性を提供する。 例 ２ カイニアからのサルコシンオキシダーゼE.
C.1.5.3.1の単離 カイニア・プルプロゲナDSM43156の湿潤物質
2.9Kg（培地95から得られた）を20ミリモル／
燐酸塩緩衝液、PH8.0、15と共に懸濁し、リ
ゾチーム４ｇを用いて25℃で４時間溶解した。該
溶解懸濁液と、核酸と外来蛋白質との十分な分離
が達せられる量で10％ポリエチレンイミン（ポリ
−min Ｇ−20−）溶液（BASF）を添加した。 サルコシンオキシダーゼ（上澄液中に存在）を
わずかに塩基性のアニオン交換体（DEAE−セフ
アデツクス）に結合させ、引き続き上昇する塩傾
斜溶液で溶離する。溶離液を硫酸アンモニウムで
濃度0.6モル／に調節し、該酵素をフエニル−
セフアロースに結合し、降下する硫酸アンモニウ
ム傾斜溶液（前記燐酸塩緩衝液）でクロマトグラ
フイーにかけた。4U／mgを越える蛋白質を含有
する溶離液を固体硫酸アンモニウムと共に2.4モ
ル／までの濃度にした。沈澱を0.1モル／燐
酸塩緩衝液で取り込み、サルコシンオキシダーゼ
をモレキユラーシーブ通過（セフアクリル
（Sephacryl）−Ｓ−2003、フアルマシア
（pharmacia））により更に精製した。 精製した酵素は5.5U／mg蛋白質の特異活性を
有する。 例 ３ クレアチニン測定のためのサルコシンオキシダ
ーゼの使用 (a) 試薬（試料空値試薬） 燐酸カリウム（PH7.9）（又はTES／KOHPH7.9
0.1モル／） 150ミリモル／ ４−アミノアンチピリン 0.8ミリモル／ ２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ−安
息香酸 8.6ミリモル／ K4（Fe（CN）6） 10マイクロモル／ コール酸ナトリウム ５ミリモル／ ルテンソル ON50 0.5％（ｗ／ｖ） クレアチンアミジノヒドロラーゼ 12U／ml 例２によるサルコシンオキシダーゼ 6.5U／ml ペルオキシダーゼ 2U／ml リパーゼ 2U／ml アスコルビン酸オキシダーゼ 10U／ml (b) 試薬（試料試薬）： 試薬＋クレアチニンアミドヒドロラーゼ
25U／ml (c) 試験法／測定配合物： 波長546nｍ；温度＝25℃（又は37℃）；層厚
＝１cm、空気に対して測定
システムを添加せず、燐酸カリウムPH7.9 0.15モ
ルと共にTES／KOH0.1モル使用した。 前記の値は、本発明の酵素が長期安定性におい
て従来公知の最高なサルコシンオキシダーゼ酵素
より著しくすぐれていることを示す。このことは
長期安定性と相関関係のある貯蔵安定性に関して
特に重要である。 従つて、本発明による酵素はその低いミハエリ
ス定数のゆえにサルコシン、クレアチン又はクレ
アチニンの酵素的測定の著しく迅速な実施を可能
とし、０℃〜25℃で格段に改良された貯蔵安定性
であり、かつ37℃においてサルコシン−、クレア
チン−又はクレアチニン測定における恒温保持時
間にわたつて公知サルコシンオキシダーゼの多く
のものより著しく安定である。 実施例 次に実施例につき本発明を更に詳細に説明す
る。 例 １ カイニア・プルプロゲナDSM43156の培養 生物を振盪フラスコ中次の組成の複合媒体中で培
養した： 酵母抽出液５ｇ、ペプトン（蛋白消化処理）３
ｇ、NaCl2ｇ、MgSO4×7H2O0.24ｇ、CaCl2×
7H2O0.014ｇ、グルコース２ｇ、サルコシン10
ｇ、H2O1、PH7.0。28℃で培養した培地は30時
間後に約400U／の活性を提供する。 例 ２ カイニアからのサルコシンオキシダーゼE.
C.1.5.3.1の単離 カイニア・プルプロゲナDSM43156の湿潤物質
2.9Kg（培地95から得られた）を20ミリモル／
燐酸塩緩衝液、PH8.0、15と共に懸濁し、リ
ゾチーム４ｇを用いて25℃で４時間溶解した。該
溶解懸濁液と、核酸と外来蛋白質との十分な分離
が達せられる量で10％ポリエチレンイミン（ポリ
−min Ｇ−20−）溶液（BASF）を添加した。 サルコシンオキシダーゼ（上澄液中に存在）を
わずかに塩基性のアニオン交換体（DEAE−セフ
アデツクス）に結合させ、引き続き上昇する塩傾
斜溶液で溶離する。溶離液を硫酸アンモニウムで
濃度0.6モル／に調節し、該酵素をフエニル−
セフアロースに結合し、降下する硫酸アンモニウ
ム傾斜溶液（前記燐酸塩緩衝液）でクロマトグラ
フイーにかけた。4U／mgを越える蛋白質を含有
する溶離液を固体硫酸アンモニウムと共に2.4モ
ル／までの濃度にした。沈澱を0.1モル／燐
酸塩緩衝液で取り込み、サルコシンオキシダーゼ
をモレキユラーシーブ通過（セフアクリル
（Sephacryl）−Ｓ−2003、フアルマシア
（pharmacia））により更に精製した。 精製した酵素は5.5U／mg蛋白質の特異活性を
有する。 例 ３ クレアチニン測定のためのサルコシンオキシダ
ーゼの使用 (a) 試薬（試料空値試薬） 燐酸カリウム（PH7.9）（又はTES／KOHPH7.9
0.1モル／） 150ミリモル／ ４−アミノアンチピリン 0.8ミリモル／ ２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ−安
息香酸 8.6ミリモル／ K4（Fe（CN）6） 10マイクロモル／ コール酸ナトリウム ５ミリモル／ ルテンソル ON50 0.5％（ｗ／ｖ） クレアチンアミジノヒドロラーゼ 12U／ml 例２によるサルコシンオキシダーゼ 6.5U／ml ペルオキシダーゼ 2U／ml リパーゼ 2U／ml アスコルビン酸オキシダーゼ 10U／ml (b) 試薬（試料試薬）： 試薬＋クレアチニンアミドヒドロラーゼ
25U／ml (c) 試験法／測定配合物： 波長546nｍ；温度＝25℃（又は37℃）；層厚
＝１cm、空気に対して測定
【表】
25℃又は37℃で20分間恒温保持、次いで吸光度
Ｅ 〜Ｅ 測定。 Ｅ＝（Ｅ −Ｅ ）−（Ｅ −Ｅ ）。 試料中のクレアチニン濃度の評価： 一緒に実施した水性スタンダード（２mg／dl）
に関して評価。このためにスタンダードを測定配
合物中に試料と同様に添加する。 例 ４ カイニア・オクラツエー（Chainia Ochra−
ceae、DSM 43155）の培養 生物を振盪フラスコ中次の組成の複合培地中で培
養した： 酵母抽出液 5.00ｇ／ ペプトン（蛋白消化処理） 3.00ｇ／ Nacl 2.00ｇ／ NgSO4×7H2O 0.24ｇ／ CaCl2×7H2O 0.014ｇ／ グルコース 2.00ｇ／ サルコシン 10.00ｇ／ PH7.0 28℃で培養した培地は30時間後に約200U／
のサルコシンオキシダーゼ活性を供給した。 例 ５ カイニア・オクラツエーからのサルコシンオキ
シダーゼの単離 培地81（200U／；例６により培養）から
の湿潤物質カイニア・オクラツエー（DSM
43155）2.6Kgを20ｍmol／燐酸塩緩衝液、PH
8.0、14と共に懸濁し、リゾチーム3.8ｇを用い
て35℃で４時間溶解した。その後、例２に記載し
たように、マイナスのポリエチレンイミン沈澱及
びDEAE−セフアデツクスクロマトグラフイーを
実施した。この溶離液を硫酸アンモニウムで
3.0mol／、PH8.0にした。沈澱したサルコシン
オキシダーゼを遠心分離し、燐酸塩緩衝液（20ｍ
mol／、PH8.0）中に取り込む。部分的に精製
した酵素は蛋白質2.1U／mgの比活性を有した。 例 ６ ストレプトマイセス・フロツクルス（Stre−
putomyces flucculus）DSM 40327の培養 生成を振盪フラスコ中次の組成の複合培地中で培
養した： 酵母抽出液 5.00ｇ／ ペプトン（蛋白消化処理） 3.00ｇ／ Nacl 2.00ｇ／ NgSO4×7H2O 0.24ｇ／ CaCl2×7H2O 0.014ｇ／ グルコース 2.00ｇ／ サルコシン 10.00ｇ／ PH7.0 28℃で培養した培地は30時間後に約30U／の
サルコシンオキシダーゼ活性を示した。 例 ７ ストレプトマイセス・フロツクルスからのサル
コシンオキサシダーゼの単離 培地98（30U／；例８により培養）からの
湿潤物質ストレプトマイセス・フロツクルス
（DSM 40327）3.1Kgを例７の方法と同様にして
溶解し、この酵素をポリエチレンイミン沈澱、
DEAE−セフアデツクスクロマトグラフイー及び
硫酸アンモニウム沈澱により富化させた。部部的
に精製した酵素は蛋白質約0.53U／mgの比活性を
有した。
Ｅ 〜Ｅ 測定。 Ｅ＝（Ｅ −Ｅ ）−（Ｅ −Ｅ ）。 試料中のクレアチニン濃度の評価： 一緒に実施した水性スタンダード（２mg／dl）
に関して評価。このためにスタンダードを測定配
合物中に試料と同様に添加する。 例 ４ カイニア・オクラツエー（Chainia Ochra−
ceae、DSM 43155）の培養 生物を振盪フラスコ中次の組成の複合培地中で培
養した： 酵母抽出液 5.00ｇ／ ペプトン（蛋白消化処理） 3.00ｇ／ Nacl 2.00ｇ／ NgSO4×7H2O 0.24ｇ／ CaCl2×7H2O 0.014ｇ／ グルコース 2.00ｇ／ サルコシン 10.00ｇ／ PH7.0 28℃で培養した培地は30時間後に約200U／
のサルコシンオキシダーゼ活性を供給した。 例 ５ カイニア・オクラツエーからのサルコシンオキ
シダーゼの単離 培地81（200U／；例６により培養）から
の湿潤物質カイニア・オクラツエー（DSM
43155）2.6Kgを20ｍmol／燐酸塩緩衝液、PH
8.0、14と共に懸濁し、リゾチーム3.8ｇを用い
て35℃で４時間溶解した。その後、例２に記載し
たように、マイナスのポリエチレンイミン沈澱及
びDEAE−セフアデツクスクロマトグラフイーを
実施した。この溶離液を硫酸アンモニウムで
3.0mol／、PH8.0にした。沈澱したサルコシン
オキシダーゼを遠心分離し、燐酸塩緩衝液（20ｍ
mol／、PH8.0）中に取り込む。部分的に精製
した酵素は蛋白質2.1U／mgの比活性を有した。 例 ６ ストレプトマイセス・フロツクルス（Stre−
putomyces flucculus）DSM 40327の培養 生成を振盪フラスコ中次の組成の複合培地中で培
養した： 酵母抽出液 5.00ｇ／ ペプトン（蛋白消化処理） 3.00ｇ／ Nacl 2.00ｇ／ NgSO4×7H2O 0.24ｇ／ CaCl2×7H2O 0.014ｇ／ グルコース 2.00ｇ／ サルコシン 10.00ｇ／ PH7.0 28℃で培養した培地は30時間後に約30U／の
サルコシンオキシダーゼ活性を示した。 例 ７ ストレプトマイセス・フロツクルスからのサル
コシンオキサシダーゼの単離 培地98（30U／；例８により培養）からの
湿潤物質ストレプトマイセス・フロツクルス
（DSM 40327）3.1Kgを例７の方法と同様にして
溶解し、この酵素をポリエチレンイミン沈澱、
DEAE−セフアデツクスクロマトグラフイー及び
硫酸アンモニウム沈澱により富化させた。部部的
に精製した酵素は蛋白質約0.53U／mgの比活性を
有した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセタツエー科のカイニア属及
びストレプトマイセス属の菌株から得られ、界面
活性剤の存在で燐酸カリウム0.15モル／、PH
7.9中25℃で２日後なお開始時活性の少なくとも
40％の活性を有し、分子量は約170KDであり、
40℃を下まわる温度で安定なPH範囲はPH６〜９で
あり、最適温度は約37℃であり、PH最適値は約PH
8.0であり、かつ不利な試薬ａ：燐酸カリウム
0.15モルもしくはTES／KOH0.1モル、PH7.9、
２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息香
酸8.6ミリモル、４−アミノアンチピリン0.8ミリ
モル、K4（Fe（CN）6）10マイクロモル、コール酸
ナトリウム５ミリモル、ルテンソルON50 0.5％、
NaN30.2％、テイトリプレツクス0.5ミリモル、
リパーゼ2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アス
コルビン酸オキシダーゼ10000U中でのサルコシ
ンに関するKM−値範囲２〜４ミリモル／であ
るH2O2−形成サルコシンオキシダーゼ。 ２ ストレプトマイセタツエー科のカイニア属及
びストレプトマイセス属の菌株から得られ、界面
活性剤の存在で燐酸カリウム0.15モル／、PH
7.9中25℃で２日後なお開始時活性の少なくとも
40％の活性を有し、分子量は約170KDであり、
40℃を下まわる温度で安定なPH範囲はPH６〜９で
あり、最適温度は約37℃であり、PH最適値は約PH
8.0であり、かつ不利な試薬ａ：燐酸カリウム
0.15モルもしくはTES／KOH0.1モル、PH7.9、
２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息香
酸8.6ミリモル、４−アミノアンチピリン0.8ミリ
モル、K4（Fe（CH）6）10マイクロモル、コール酸
ナトリウム５ミリモル、ルテンソルON50 0.5％、
NaN30.2％、テイトリプレツクス0.5ミリモル、
リパーゼ2000U、ペルオキシダーゼ2000U、アス
コルビン酸オキシダーゼ10000U中でのサルコシ
ンに関するKM−値範囲２〜４ミリモル／であ
るH2O2−形成サルコシンオキシダーゼを取得す
るために、処理にみあうだけのサルコシンオキシ
ダーゼ含量のストレプトマイセタツエー科のカイ
ニア属及びストレプトマイセス属の菌株を培養
し、バイオマスから該酵素を取得することを特徴
とするH2O2−形成サルコシンオキシダーゼの取
得法。 ３ ストレプトマイセタツエー科のカイニア属及
びストレプトマイセス属の菌株から得られ、界面
活性剤の存在で燐酸カリウム0.15モル／、PH
7.9中25℃で２日後なお開始時活性の少なくとも
40％の活性を有し、分子量は約170KDであり、
40℃を下まわる温度で安定なPH範囲はPH６〜９で
あり、最適温度は約37℃であり、PH最適値は約PH
8.0であり、かつ不利な試薬ａ：燐酸カリウム
0.15モルもしくはTES／KOH0.1モル、PH7.9、
２，４，６−トリブロム−３−ヒドロキシ安息香
酸、8.6ミリモル、４−アミノアンチピリン0.8ミ
リモル、K4（Fe（CN）6）10マイクロモル、コール
酸ナトリウム５ミリモル、ルテンソルON50 0.5
％、NaN30.2％、テイトリプレツクス0.5ミリ
モル、リパーゼ2000U、ペルオキシダーゼ
2000U、アスコルビン酸オキシダーゼ10000U中
でのサルコシンに関するKM−値範囲２〜４ミリ
モル／であるH2O2−形成サルコシンオキシダ
ーゼを使用することを特徴とするサルコシン、ク
レアチン又はクレアチニンの測定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3519218.6 | 1985-05-29 | ||
| DE19853519218 DE3519218A1 (de) | 1985-05-29 | 1985-05-29 | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280271A JPS61280271A (ja) | 1986-12-10 |
| JPH0414957B2 true JPH0414957B2 (ja) | 1992-03-16 |
Family
ID=6271899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61120358A Granted JPS61280271A (ja) | 1985-05-29 | 1986-05-27 | Ｈ↓２ｏ↓２−形成サルコシンオキシダーゼ、その取得法及びサルコシン、クレアチン又はクレアチニンの測定法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4743549A (ja) |
| EP (1) | EP0205967B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61280271A (ja) |
| KR (1) | KR890004091B1 (ja) |
| AT (1) | ATE63944T1 (ja) |
| AU (1) | AU561098B2 (ja) |
| CA (1) | CA1277269C (ja) |
| DE (2) | DE3519218A1 (ja) |
| ES (1) | ES8800345A1 (ja) |
| FI (1) | FI91645C (ja) |
| SU (1) | SU1582993A3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| FI89273C (fi) * | 1986-08-28 | 1993-09-10 | Union Carbide Canada Ltd | Blandning foer avisning och foerhindrande av isbildning pao flygmaskiner |
| JP2588707B2 (ja) * | 1987-02-27 | 1997-03-12 | 小林製薬株式会社 | サルコシン・オキシダーゼの製造法 |
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| US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
| EP3415910A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-19 | Prevention Medicals s.r.o. | A method of quantitative determination of sarcosine in a biological sample using anti-arcosine antibodies and peroxidase-active gold nanoparticles or quantum dots |
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|---|---|---|---|---|
| JPS6029473B2 (ja) * | 1977-10-04 | 1985-07-10 | 東洋醸造株式会社 | ザルコシン・オキシダ−ゼの製法 |
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| DE3326888A1 (de) * | 1983-07-26 | 1985-02-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Sarcosin-oxidase |
| JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
-
1985
- 1985-05-29 DE DE19853519218 patent/DE3519218A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-04-28 ZA ZA863143A patent/ZA863143B/xx unknown
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- 1986-05-27 JP JP61120358A patent/JPS61280271A/ja active Granted
- 1986-05-27 EP EP86107203A patent/EP0205967B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-27 DE DE8686107203T patent/DE3679455D1/de not_active Expired - Lifetime
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-
1988
- 1988-02-09 US US07/153,976 patent/US4845029A/en not_active Expired - Lifetime
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