JPH04152894A - エンドセリン―３あるいはエンドセリン―３前駆体に対するモノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエンドセリン−３およびエンドセリン−３の前
駆体、例えばビッグエンドセリン−３に結合特異性を有
する点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳しくは、
抗原抗体反応に基づくエンドセリン−３およびエンドセ
リン−３の前駆体、例えばビッグエンドセリン−３の測
定法の開発、あるいはエンドセリン−３が関与する疾患
の診断、予後治療に有用な抗体に関する。

〔従来の技術〕

エンドセリン−１は血管内皮細胞の培養上清中に見出さ
れた２１個のアミノ酸からなるペプチドであり、極めて
強力かつ持続的な血管平滑筋収縮活性ならびに血圧上昇
活性を有する。また、エンドセリン−１のｃＤＮＡの解
析から、その生合成過程の中間体として、アミノ酸約４
０個からなるビッグエンドセリン−１（エンドセリン−
１前駆体）の存在も想定されている。これまでにエンド
セリン−１およびビッグエンドセリン−１に対するモノ
クローナル抗体が作製され、高感度な酵素免疫測定法が
開発されたことによりエンドセリン−１の生理的役割・
病態との関連の解明に向けて幅広い研究を展開すること
が可能となった。既に、中和活性能を有するモノクロー
ナル抗体を特異的アンタゴニストとして用いることによ
り、エンドセリン−１が虚血性疾患と深い関わりを有す
ることが明らかにされ、さらに該測定法を用いて血漿エ
ンドセリン−ルベルと病態との関連について詳細な研究
が進められている。

一方、染色体ＤＮＡの解析から、新たにエンドセリン−
２およびニンドセリンー３の配列が見出され、エンドセ
リンが遺伝子ファミリーを形成していることが明らかに
された。特にエンドセリン−３は、エンドセリン−１、
エンドセリン−２とは、以下の例に示すように２１アミ
ノ酸残基中６残基（アンダーライン参照）が異なってお
り、その平滑筋収縮、血圧上昇活性もエンドセリン−１
、エンドセリン−２と比較してかなり微弱であることが
報告されている。

エンドセリン−１（ブタ、ヒト。エンドセリン−αと呼
ぶこともあった。） Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｍ
ｅｔＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　ＰｈｅＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌｅ　
Ｉ　ｌｅ　Ｔｒｐエンドセリン−２（ヒト） Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ工」正Ｌ　ｅ
　ｕＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　ＰｈｅＣｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌｅ　
Ｉｌｅ　Ｔｒｐエンドセリン−３（ラット、ヒト。γと
呼ぶこともあった。） Ｃｙｓ工ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｂｅ　Ｔｈｒ工ｌ」旦■Ａｓ
ｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ工１工Ｃ
ｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌｅ　Ｉ　ｌｅ　
Ｔｒｐまた、エンドセリン−３のｃＤＮＡの解析から、
エンドセリン−３の前駆体構造が明らかにされ（特願平
１−２５３７９７）　、エンドセリン−３が下記の配列
を有するビッグエンドセリン−３を直接の前駆体として
合成されることが示唆された。

Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌ
ｙｓＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　ＴｙｒＣｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｉ
　　ｌｅ　　Ｉ　　Ｌｅ　　Ｔｒｐｌ　　１ｅ　　Ａｓ
ｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈ
ｒＶａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　
　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＴｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　Ｘ（Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨま
たはＮＨ２ ＝Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｙ　ｓ−ＯＨ ＝５−０Ｈ＝Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒ このように、構造および薬理作用の研究結果は、エンド
セリン−３がエンドセリン−１、−２とは異なるリセプ
ターシステムを形成していることを強く示唆しており、
その生理的役割に深い関心が寄せられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述したように、エンドセリン−３の生理的役割に対す
る関心が高まっているにもかかわらず、これまで、エン
ドセリン−３の発現部位、血漿レベル等、基本的な生理
的情報はほとんで得られていない。この主たる原因とし
て、これまでエンドセリン−３あるいはエンドセリン−
３前駆体を特異的に認識するモノクローナル抗体が作製
されておらず、さらにエンドセリン−３あるいはエンド
セリン−３前駆体を特異的かつ高感度に測定する免疫学
的測定法が開発されていないことが挙げられる。これら
の免疫学的手法は、エンドセリン−３の研究、特に代謝
経路、分泌機構、リセプターシステム、病態との関連等
に関する研究を総合的に行う上で最も有効な手段の一つ
と考えられ、該手法の確立が各界から切望されていた。

〔課題を解決す゛るための手段〕

本発明者等は、エンドセリン−３あるいはエンドセリン
−３前駆体である、例えばビッグエンドセリン−３に結
合特異性を有するモノクローナル抗体を作製し、該抗体
を用いてエンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン
−３を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開
発した。さらに該抗体特有の薬理作用、すなわち、該抗
体が種々の動物の平滑筋のエンドセリン−３による収縮
を抑制することを見出した。これらの知見は、該抗体を
エンドセリン−３の特異的アンタゴニストとして使用し
得ることを示しており、該抗体が工ンドセリンー３と因
果的に、または症候的に関連する各種疾患の予防あるい
は治療薬となり得ることを示している。

すなわち、本発明はエンドセリン−３あるいはエンドセ
リン−３前駆体に結合性を有するモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞、
および該抗体を用いた競合法あるいはサンドインチ法に
よるエンドセリン−３およびエンドセリン−３前駆体で
ある１例えばビッグエンドセリン−３の免疫測定法に関
する。

エンドセリン−３のサンドイツチ法においては、１次反
応および２次反応に用いられる抗体はそれぞれポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよいが
、好ましくはその一方がエンドセリン−３とは反応する
が、エンドセリン−３のＣ端部とは反応しない抗エンド
セリン−３モノクローナル抗体であって、他方がエンド
セリン−３のＣ端部と反応する抗エンドセリン−３ポリ
クローナルもしくはモノクローナル抗体が用いられる。

この後者のエンドセリン−３のＣ端部と反応する抗エン
ドセリン−３ポリクローナルもしくはモノクローナル抗
体は、上記のエンドセリン−１０２とのアミノ酸配列の
比較から判るように、エンドセリン−１または−２のＣ
端部と反応する抗体と同一のものを含み、これについて
は特願平１−４６５６０号で言及している。

また、ビッグエンドセリン−３のサンドイツチ法におい
ても、好ましくは、１次反応および２次反応に用いられ
る抗体の一方が、ビッグエンドセリン−３とは反応する
が、エンドセリン−３とは反応しないモノクローナル抗
体であって、他方がエンドセリン−３と反応するモノク
ローナル抗体が用いられる。さらに、ビッグエンドセリ
ン−３とは反応するが、エンドセリン−３とは反応しな
いモノクローナル抗体において、特に好ましくは、ビッ
グエンドセリン−３のＣ端部分の構造に対し、広い特異
性を有する抗体、例えばＣ末端がＡｒｇ−Ｇｌｙの配列
でも、Ａｒｇ−ＮＨ，の配列でも、同程度に反応する抗
体が用いられる。

本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原の
エンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン−３とキ
ャリアー蛋白との複合体をつくり。

このものを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物から
目的とする抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行うこ
とによる。

本発明のモノクローナル抗体の調製に当っては、上記免
疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫２〜５日
後に肺臓あるいはリンパ節を採取。

それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ
、安定的に力価の高い抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択し、モノクローナルなハイブリドーマを得ることに
よる。

免疫抗原としては、天然精製標品１合成標品等いずれも
使用でき、先に述べたエンドセリン−３、ビッグエンド
セリン−３、およびビッグエンドセリン−３の一部分が
用いられる。また免疫抗原として、エンドセリン−３の
構造を含む化合物、あるいはエンドセリン−３の一部分
の構造を含む化合物が用いられる場合もある。

本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の
公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法
のいずれによってもよい。例えば同相法によりエンドセ
リン−３を合成する場合、メリーフィールドの固相ペプ
チド合成方法〔ジャーナルオブジアメリカンケミカルソ
サイエテイ（Ｊ、Ａａ＋、　Ｃｈｅｉ、　Ｓｏｃ、）、
８５，２１４９（１９６３）］を用いるのが好ましい。

不溶性樹脂として当該技術分野で知られたもののいずれ
であってもよく、例えばクロロメチル化されたスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体、フェナシルアセティツク
メチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体の
ようなポリスチレン型樹脂、ポリジメチルアクリルアミ
ド樹脂のようなポリアミド型樹脂が挙げられる。

Ｃ末端のＮ−保護ア逃ノ酸を不溶性樹脂に結合させた後
、エンドセリン−３のＣ末端側から保護アミノ酸を常法
に従って順次結合し、次いでフッ化水素で処理した後、
ジスルフィド結合を形成させ目的とするエンドセリン−
３を合成することができる。Ｎ−保護アミノ酸としては
、α−アミノ基はすべてＢｏｃ基で保護し、セリンおよ
びスレオ二ンの水酸基はＢｚｌ基で、グルタミン酸、ア
スパラギン酸のω−カルボン酸は○Ｂｚｌ基、リジンの
Ｅ−アミノ基はＣＱ−Ｚ基、システィンのチオール基は
Ａｃｍ基、Ｍ　ｅ　Ｂ　ｚ　１基、チロシンの水酸基は
Ｂｒ−Ｚ基、ヒスチジンのイミダゾール基およびアルギ
ニンのグアニド基はＴｏｓ基、トリプトファンのインド
ール基はＣＨＯ基で保護するのが好ましい。

液相法による合成の手段としては、たとえば「ザペプチ
ズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ　、第１巻（１９
６６年）　、　５ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｂｋｅ
著、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、あるいは″ペプチド
合成”、東屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）に記載
された方法、たとえばアジド法、クロライド法、Ｗａ無
水物法、混合無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウ
ッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール
法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（例、ＨＯＮＢ
、ＨＯＢｔ、ＨＯ８ｕ）法などがあげられる。

唾乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリ
アー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白の種類
およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアー
にカプリングさせて免疫したハプテンに対して抗体が効
率よく出来れば、どの様なものをどの様な比率でカプリ
ングさせてもよいが１例えば、牛血清アルブミンや牛サ
イログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１
対し０．１〜２０、好ましくは１〜５の割合でカプルさ
せる方法が用いられる。

また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビトや
カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合に
用いられる。

縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可
能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与
されるが、なかでも皮下注射が好ましい。投与に際して
抗体産生能を高めるため、完全フロインドアジュバント
や不完全フロインドアジュバントを投与してもよい。投
与は通常２〜６週毎に１回ずつ行われる。

用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、
イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニ
ワトリがあげられる。

抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水（
好ましくは血液）などから採取される。例えば、免疫原
がエンドセリン−３あるいはその部分ペプチドである場
合、抗血清中の抗エンドセリン−３抗体価の測定は１例
えば後記の標識化エンドセリン−３と抗血清とを反応さ
せたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定すること
によりなされる。抗体の分離精製は免疫グロブリンの分
離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿
法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による
吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過払、抗原抗体結合物ある
いは活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結合を解
離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。

このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主たる成分
とし、ＩｇＭ、ＩｇＡ等、他の免疫グロブリンも含む。

一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫
された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に肺臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させることにより、抗エンドセリン−３抗体
および抗エンドセリン−３前駆体抗体産生ハイブリドー
マを調製することができる。融合操作は既知の方法、た
とえばケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャ（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　、　２５６．４９５　（１９７５））に従
い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが
、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては
たとえばＮ５−１、Ｐ３Ｕ１、Ｓ　Ｐ　２１０などがあ
げられるが、特にＰ３ｔＪ１が好ましく用いられる。用
いられる抗体産生細胞（肺臓細胞）数と骨髄細胞数との
好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ　
（好ましくはＰ　Ｅ　Ｇ　１０００〜ＰＥ　Ｇ　６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０−３７℃で１〜１０分間インキユベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

抗エンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマあるいは抗
ビッグエンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、たとえばエ
ンドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいはビ
ッグエンドセリン−３の部分ペプチドを吸着させた固相
（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロティンＡを加え、固相に結合した
抗エンドセリン−３モノクローナル抗体を検出するＥ　
Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍ
ｎ＋ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）法、抗免疫グ
ロブリン抗体またはプロティンＡを吸着させた同相にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、ＨＲＰで標識したエン
ドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいはビッ
グエンドセリン−３の部分ペプチドを加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出するＥＩ　Ａ　（Ｅｎｚ
ｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法などがあげられる
。

ハイブリトーマの選別、育種は通常ＨＡＴ　（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０
〜２０％牛脂児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰ　
Ｍ　Ｉ　１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上
清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様に
して測定できる。

抗エンドセリン−３モノクローナル抗体あるいは抗ビッ
グエンドセリン−３抗体の分離精製は上記のポリクロー
ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製
法に従って行われる。

エンドセリン−３の一部領域と反応する抗エンドセリン
−３ポリクローナル抗体は、その一部類域に相当するペ
プチド（部分ペプチド）をハプテンとして免疫し上記の
方法で調製することもできるが、エンドセリン−３をハ
プテンとして用いて調製された抗エンドセリン−３ポリ
クローナル抗体から、その一部類域に相当するペプチド
を結合したカラムによるアフィニティクロマトグラフィ
を用いて調製することもできる。

また、ビッグエンドセリン−３の一部領域と反応する抗
ビッグエンドセリン−３ポリクローナル抗体は、その一
部類域に相当するペプチドをノ）ブテンとして免疫し上
記の方法で調製することもできるが、ビッグエンドセリ
ン−３をハプテンとして用いて調製された抗ビッグエン
ドセリン−３ポリクローナル抗体から、その一部類域に
相当するペプチドを結合したカラムによるアフイニテイ
クロマトグラフィを用いて調製することもできる。

また、エンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン−
３の一部領域と反応するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマおよび、エンドセリン−３あるいはビッ
グエンドセリン−３とは反応するがその一部領域とは反
応しないモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
の選別はたとえばその一部領域に相当するペプチドとハ
イブリドーマが産生ずる抗体との結合性を測定すること
により行うことができる。

特にエンドセリン−３Ｃ端ペプチドＣｙｓＨｉｓ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｐ　Ｉ　ｌｅ　Ｉ　ｌｅ　Ｔｒｐ　　以外を認
識するモノクローナル体のスクリーニングには。

該ペプチドに対する抗体の標識体を用いるサンドイッチ
型ＥＩＡを用いるのが好ましい。すなわち、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロティンＡを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、エンドセリン−３を加え
、さらにＨＲＰで１ｍした抗エンドセリン−３Ｃ端ペプ
チド抗体を反応させたのち、固相上の醒素活性を測定す
るＥＩＡ法である。

上記で得られた抗エンドセリン−３および抗ビッグエン
ドセリン−３モノクローナル抗体を用いて、エンドセリ
ン−３の測定ないし組織染色等を行ない得る。エンドセ
リン−３およびビッグエンドセリン−３の測定法には通
常、以下に述へる競合法が用いられるが、後述するサン
ドインチ法を用いるのが好ましい。

競合法においては、本発明で得られた抗エンドセリン−
３あるいは抗ビッグエンドセリン−３抗体と、被検液お
よび標識化エンドセリン−３あるいは標識化ビッグエン
ドセリン−３あるいはその部分ペプチドとを競合的に反
応させたのち、抗体に結合した標識剤の割合を測定する
ことにより、被検液中のエンドセリン−３、ビッグエン
ドセリン−３，あるいはビッグエンドセリン−３の部分
ペプチドを定量する。

該エンドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるい
はビッグエンドセリン−３の部分ペプチドの標識剤ある
いは後記の抗体の標識剤としては、放射性同位元素、酵
素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位
元素としては、例えば１ｚｓＩ、１３１１，３Ｈ２１４
Ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなも
のが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グル
コシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダ
ーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フ
ルオレスカミン、フルオレラセンイソチオシアネートな
どが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導
体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそ九ぞ乳半げら九
る。さらに、抗体あるいはエンドセリン−３、ビッグエ
ンドセリン−３、あるいはビッグエンドセリン−３の部
分ペプチドと標識剤との結合にビオチン−アビジン系を
用いることもできる。

上記の標識剤の活性の測定に当っては、例えばエンドセ
リン−３の測定の場合、抗体に結合した標識化エンドセ
リン−３と遊離の標識化エンドセリン−３とを分離（以
後Ｂ／Ｆ分離と略す）する必要があるが、標識剤として
酵素を用いた場合には、このための試薬に不溶化した抗
エンドセリン−３抗体に対する抗体あるいは不溶化した
プロティンＡ等の活性吸着剤が有利に用いられる。例え
ば、抗ＩｇＧ抗体（抗エンドセリン−３抗体に対する抗
体に相当）を固相として用い、これと反応性のある上記
抗体を介して標識化エンドセリン−３を固相にある抗Ｉ
ｇＧ抗体に結合させ、該固相上の標識剤を測定すること
によって行なうことができる。標識剤として酵素を用い
た場合には、不溶化担体上の酵素活性の測定には通常の
比色法あるいは蛍光法が用いられる。標識剤にラジオア
イソトープ等、非蛋白性物質を用いた場合には、Ｂ／Ｆ
分離に上記の試薬以外にも不溶化しない抗エンドセリン
−３に対する抗体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末
、ポリエチレングリコール等の試薬が用いられる。いず
れの方法においても上清中あるいは沈降物中の標識剤の
活性を測定する。

上記の不溶化に当っては、物理的吸着を用いてもよく、
また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するの
に用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体とし
ては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不
溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリ
コン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。

競合法においては、例えばエンドセリン−３の測定の場
合、抗エンドセリン−３抗体、被検液、標識化エンドセ
リン−３，およびＢ／Ｆ分離用試薬は、どのような順序
に反応させることも可能であり、また全部あるいは一部
を同時に反応させてもよいが、少なくとも標識化エンド
セリン−３は、被検液と抗エンドセリン−３抗体との反
応と同時に、あるいは反応後に遅れて反応系に加えられ
ることが好ましい。

ただし硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチレ
ングリコール等のＢ／Ｆ分離試薬は主として反応系の最
後に用いられる。

一方、サンドインチ法においては不溶化した抗エンドセ
リン−３あるいはビッグエンドセリン−３抗体に被検液
を接触（反応）させ（１次反応）、さらに標識化抗エン
ドセリン−３あるい！まビッグエンドセリン−３抗体を
反応させ（２次反応）だのち、不溶化担体上のｍｉ剤の
活性を測定することにより被検液中のエンドセリン−３
あるいはビッグエンドセリン−３量を定量することがで
きる。

１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をず
らして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は
前記のそれらに準じることができる。

２次反応に用いられる抗エンドセリン−３抗体あるいは
抗ビッグエンドセリン−３抗体としては、１次反応に用
いられる抗エンドセリン−３抗体あるいは抗ビッグエン
ドセリン−３抗体とはエンドセリン−３あるいはビッグ
エンドセリン−３の該抗体と結合する部位が相異なる抗
体が好ましく用いられる。たとえばエンドセリン−３の
測定の場合、１次反応で用いられる抗体がエンドセリン
−３のＣ端部との結合能を有する場合、２次反応では、
好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結合する抗エン
ドセリン−３抗体が用いられ、また１次反応で用いられ
る抗体がエンドセリン−３のＮ端部との結合能を有する
場合、２次反応では、好ましくはＮ端部以外（例、Ｃ端
部）と結合する抗エンドセリン−３抗体が用いられる。

１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれぞれポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体であっても
よいが、例えばエンドセリン−３の測定の場合、好まし
くはその一方がエンドセリン−３とは反応するが、エン
ドセリン−３のＣ端部とは反応しない抗エンドセリン−
３モノクローナル抗体であって、他方がエンドセリン−
３のＣ端部と反応する抗エンドセリン−３ポリクローナ
ルもしくはモノクローナル抗体が用いられる。

サンドインチ法によるエンドセリン−３の免疫学的測定
法において特に好ましくは、エンドセリン−３のＣ端ペ
プチド、すなわちＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ−
１１ｅ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｒｐと反応する抗エンドセリ
ン−３ポリクローナル抗体および、エンドセリン−３と
は反応するが、上記エンドセリン−３のＣ端ペプチドと
は反応しない抗エンドセリン−３モノクローナル抗体が
用いられる。

サンドインチ法による免疫測定法においては、固相用抗
体および標識用抗体いずれもいかなるクラス、サブクラ
スのものでもよく、また、抗体活性が保持されているな
ら、それらからＦｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦ（
ａｂ’）２画分、Ｆａｂ′両分あるいはＦａｂ画分でも
よい。

サンドインチ法による免疫測定法において、モノクロー
ナル抗体を用いる場合、固相用抗体あるいは標識用抗体
に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、
測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混
合物を用いてもよい。

また、本発明で得られた抗体を用いる免疫測定法は、エ
ンドセリン−３が関与する疾患の診断および予後管理に
使用し得る。

被検試料としては、血漿、血清、尿、脳を髄液、腹水、
胸水、羊水等の体液や、痰１便などが使用し得る。これ
らの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液で希釈ある
いは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料とし得る。試
料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒としてはどのよ
うな緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよいが、好まし
くはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩水、酢酸緩
衝液、アセトン、クロロホルム−メタノールあるいは、
界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられる。

また、濃縮は、試料を直接減圧下、あるいは常圧、窒素
気流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あるい
は逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗エンドセリ
ン−３抗体結合担体に添加したのち、適当な溶出条件で
溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流下濃縮しても良
い。濃縮用担体として特に好ましくは、逆相クロマトグ
ラフィー用担体のＣ２，Ｃ８あるいはＣ１８カートリッ
ジが用いられる。濃縮物はイムノアッセイ用緩衝液に溶
解後、イムノアッセイの試料とする。

さらに、本発明で得られた抗エンドセリン−３および抗
ビッグエンドセリン−３抗体はエンドセリン−３および
ビッグエンドセリン−３の免疫組織染色法等にも用いる
事ができる。その方法は、例えば標識化抗エンドセリン
−３あるいは標識化ビソグエントセリンー３抗体を用い
る直接法、抗エンドセリン−３抗体あるいはビッグエン
ドセリン−３抗体および該抗体に対する抗体の標識化さ
れたものを用いる間接法等に準することができる。

また、さらに本発明で得られた抗エンドセリン−３抗体
のうちエンドセリン−３の血管収縮能を中和し得る抗体
は、エンドセリン−３の特異的アンタゴニストとして使
用し得る。

抗エンドセリン−３抗体の中からエンドセリン−３の作
用を特異的に抑制する抗体をスクリーニングする方法と
しては、エンドセリン−３の薬理作用を検出するいかな
る方法を用いることも可能であり１例えば、エンドセリ
ン−３のブタ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ヒ
ト等、各種血管平滑筋収縮活性を指標とする生体外の測
定系、あるいはエンドセリン−３の上記動物の血圧上昇
活性または血圧下降活性を指標とする生体の測定系が挙
げられる。

得られたエンドセリン−３の作用を特異的に抑制する抗
体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭいかなるクラスのものでも
よく、またそれらからＦｃ’　あるいはＦｃ領域を除去
したＦａｂ’あるいはＦａｂ画分あるいはその重合体で
もよい。また、エンドセリン−３の作用を特異的に抑制
及し得るモノクローナル抗体の可変遺伝子部と、ヒトイ
ムノグロブリン定常遺伝子部とを融合させ、組み換え体
として発現させたキメラ抗体を用いることもできる。

〔実施例〕

以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるべきものではない。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル抗
体ＡＥＴ−３０ａを産生ずるハイブリドーマ細胞ＡＥＴ
−３０は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ
○　５０１９３として平成１年７月７日から寄託されて
いる。また、該ハイブリドーマは通商産業省工業技術院
微生物工業研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２５２３としてブダペスト条約に基き平成１年７月
２０日から寄託され、ＦＲＩに保管されている。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル抗
体ｂＥＴ−３１ａを産生するハイブリトーマ細胞ｂＥＴ
−３１は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ
○　５０２４７として平成２年５月２４日から寄託され
ている。また、該ハイブリドーマは通商産業省工業技術
院微生物工業研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２９４９としてブダペスト条約に基き平成２年６
月１２日から寄託され、ＦＲＩに保管されている。

後述の実施例で用いられているマウスモノクローナル抗
体ｂＥＴ−２３ａを産生するハイブリドーマ細胞ｂＥＴ
−２３は財団法人発酵研究所（１ＦＯ）に受託番号ＩＦ
○　５０２４６として平成２年５月２４日から寄託され
ている。また、該ハイブリドーマは通商産業省工業技術
院微生物工業研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２９４８としてブダペスト条約に基き平成２年６
月１２日から寄託され、ＦＲＩに保管されている。

■、＃素標識化抗エンドセリン−３０端ペプタイト抗体
の作製 ■−１，ペプタイドの合成 ｉ　）　Ｈ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ
−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＨ（エンドセリン−３のＣ端部）
の合成 りｏｃ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｈ−Ｔｒｐ−
ＯＢｚｌ−ｐＴｓＯＨ８４ｇをＤＭＦｌｏｏｍＱに溶解
し、ＴＥＡ２５ｍ１２で中和ののちＢｏｃ−１１ｅ−０
１１１／２８２０４８．９ｇ　、ＨＯＮＢ　４０．１２
ｇ　。

ＤＣＣ４６，２０ｇより調製のＢｏｃ−１１ｅ−ＯＮＢ
を加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物にジエ
チルエーテル４００ｍ　Ｑと酢酸エチル２０ｍＱを加え
溶解し、０．５Ｎ　　ＨＣＱ、５％−Ｎ　ａ　ＨＣＯ３
水で洗い、水洗ののち無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒
を留去し、残留物に石油エーテルを加え結晶をろ取した
。収量　８３．１ｇ　（９０，９％）［α］　　１８−
１９．７’　　（ｃ　＝０．９９　ＭｅＯＨ）元素分析
：　Ｃ２，Ｈ，、Ｎ、○、とじて計算値：　Ｃ、６８，
６２；Ｈ，７，３５；Ｎ、　Ｌ２ｇ実測値：　Ｃ，６８
，６９：Ｈ，７，３５：Ｎ、　８．１６Ｂｏａ−１１ｅ
−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｔ
ｒｐ−ＯＢｚｌ　　５３゜３ｇをジオキサン１２０ｍ　
Ｑに溶解し、水冷下に７．１Ｎ−ＨＣＱ−ジオキサン１
６０ｍ　Ｑを加え、９０分間撹拌した。溶媒を減圧留去
し、残留物にジエチルエーテルを加え、析出物をろ取し
た。これをアセトニトリル１５０ｍ　ＱとＤ　Ｍ　Ｆ　
２５０ｍ　Ｑの混合溶媒に溶解し、水冷下、Ｔ　Ｅ　Ａ
　１４．６ｍ　Ｑで中和し析出するＴＥＡ−ＨＣＱをろ
去した。ろ液にＢｏａ−１１ｅ−０〜８４５．３３ｇを
加え一晩撹拌した。溶媒を留去し残留物をＣＨＣＱ　、
　Ｉ　Ｑに溶解し、０．５Ｎ−ＨＣＱ、５％−ＮａＨＣ
Ｏ，、水で洗い、無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減
圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加え析出物を結
晶としてろ取したのちアセトニトリルとジエチルエーテ
ルで洗い乾燥した。

収量　５４．９５ｇ　（８４，３％） （αｌ　１１′−１２，０＠（ｃ＝０．９８．　ＣＨＣ
Ｑ、）元素分析：Ｃ３ｓＨ４Ｉ、Ｎ４０Ｇとしての計算
値：　Ｃ，６７，７２；　Ｈ，７，７９；　Ｎ、　９．
０３実測値：　Ｃ，６７，７２；　Ｈ，７，９１；　Ｎ
、　８．８７Ｂｏｃ−Ａｓｐ−（ＯＢｚｌ）−１１ｅ−
１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｉｌ
ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　４９．７　ｇを水冷下に１０％
−１，２一エタンジチオール含有ＴＦＡ２５０ｍＱに溶
解し、室温下に１５分間放置した。溶媒を留去し、残留
物に４Ｎ−ＨＣＱ−ジオキサン２０ｍ　Ｑを加えよくか
きまぜたのち、ジエチルエーテルを加え、析出物をろ取
した。これをＤＭＦ２５０ｍＱに溶解し、水冷下にＴ　
Ｅ　Ａ１１．１ｍ　Ｑで中和したのち、析出するＴＥＡ
−ＨＣＱをろ去した。ろ液にＢｏｃ−Ａｓｐ−（ＯＢｚ
ｌ）−０Ｈ３１，Ｏｇ　、ＨＯＮＢ　２０．６ｇ　、Ｄ
　ＣＣ２３，８ｇより調製のＢｏｃ−Ａｓｐ−（ＯＢｚ
ｌ）−ＯＮＢを加え一晩攪拌した。

溶媒を減圧留去し、残留物に酢酸エチル８００ｍ　Ｑを
加え溶解し、１０％クエン酸水、５％−ＮａＨＣＯ３、
水で洗い、無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧留去
し、残留物にジエチルエーテルを加え析出物を結晶とし
てろ取し、アセトニトリルから再結晶した。

収量　５４．０ｇ　（８１，７％） （α）　”−１３，７°　（ｃ　＝　１．０４．　　Ｃ
ＨＣＱ　、）元素分析：　Ｃ，ＧＨ，、Ｎ、○、として
の計算値：　Ｃ，６６，８９：　Ｈ，７，２０：　Ｎ、
　８．４８実測値：　Ｃ，６６，６９：　Ｈ，？、２３
：　Ｎ、　８．３１Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ
）−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏｃ−
Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚ
ｌ　４８．Ｏｇを水冷下に１０％−１，２−エタンジチ
オール含有Ｔ　Ｆ　Ａ　２１０ｍ　Ｑに溶解し、室温下
に１５分間放置した。溶媒を留去し、残留物に４Ｎ−Ｈ
ＣＱ−ジオキサン１４．５ｍ　Ｑを加えよくかきまぜた
のち、ジエチルエーテルを加え、析出物をろ取した。こ
れをＤＭＦ３００ｍＱに溶解し、氷冷下Ｔ　Ｅ　Ａ４２
ｍ　Ｑで中和したのち、析出するＴＥＡ−ＨＣＱをろ去
し、ろ液にＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＮＢ　２７．３ｇを加え
、−晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物にＣＨＣｎ
　、　６００ｍ　Ｑを加えて溶解し、１０％−クエン酸
水、５％−Ｎ　ａ　ＨＣＯ２、水で洗い無水Ｍ　ｇ　Ｓ
　Ｏ４で乾燥した。残留物に石油エーテルを加え析出物
をろ取し、含水アセトニトリルより再結晶した。収量　
５３．１％（９７，５％）（α）　”−２０，６”　（
ｃ＝１．０２．　ＣＨＣＱ、）元素分析：　Ｃ，２Ｈ７
゜ＮＧＯ，。・１／２Ｈ２０としての計算値：　Ｃ，６
５，８７；　Ｈ，７，５５；　Ｎ、　８．８６実測値：
　Ｃ，６６，０８；　Ｈ，７，５８：　Ｎ、　８．７８
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ
−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂ。

ｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）−１１ｅ４１ｅ−Ｔ
ｒｐ−ＯＢｚｌ　４６，５ｇを水冷下に１０％−１，２
−エタンジチオール含有ＴＦＡ２２０ｍＱに溶解し、室
温下１５分間放置した。溶媒を減圧留去し、残留物にジ
エチルエーテルを加えろ取した。これをＤＭＦ２５ｍＱ
に溶解し、ＴＥＡ２０ｍＱを加えよくかきまぜたのち、
ジエチルエーテル５００ｍ　Ｑを加え析出物を粉末とし
てろ取した。これをＤＭＦ２００ｍ１２に溶解し、Ｂｏ
ｃ−Ｈｉｓ　（Ｔ。

５）−０）１２２．３ｇ、　１（ＯＮＢ　１１．７ｇ、
ＤＣＣ１３，５ｇより調製したＢｏｃ−）１ｉｓ　（Ｔ
ｏｓ）−ＯＮＢを加え、−晩攪拌した。溶媒を留去し、
残留物にアセトニトリルを加え、粉末をろ取した。

収量　４５．９ｇ　（８６，２％） 〔ａ）１ｓ１６．６°　（ｃ＝１．ｏ、ＤＭＦ）元素分
析：　ＣＳ　８　Ｈ７ｔ　Ｎ　ｑｏ、１・２．５Ｈ２０
としての計算値：　Ｃ，６２，１３；　Ｈ，７，３７：
　Ｎ、　１１．２４実測値：　Ｃ，６２，２５；　Ｈ，
７，０２；　Ｎ、　１１．０３Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＢ
ｚｌ）−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ
−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　：　Ｂｏａ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−
ＯＢｚｌ　１７．２ｇを水冷下、１０％−１，２−エタ
ンジチオール含有ＴＦＡ８８ｍＱに溶解し、室温下１５
分間放置した。溶媒を減圧留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取したのちＤＭＦ２５ＩＩＩＱに溶解
した。これにＴＥＡ２５ｍＱを加えよく撹拌したのち、
エーテル５００ｍ　Ｑを加え析出物を粉末としてろ取し
た。これをＤＭＦ４０ｍＱに溶解し、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　
（ＭｅＢｚｌ）　−ＯＨ５，７２ｇ　、　）ＩＯＮＢ　
３．４８ｇ　、Ｄ　ＣＣ４゜００ｇより調製したＢｏｃ
−Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ）−ＯＮＢを加え、−晩撹拌した
。溶媒を留去し、残留物にアセトニトリルを加え、析出
物を粉末としてろ取し、さらに熱アセトニトリル中で洗
い、室温に冷却後粉末をろ取した。

収量　１５．０ｇ　（７２，９％） 〔α〕Ｉｌ；１ｌ−２３，３°（ｃ＝　１．０２．　Ｄ
　Ｍ　Ｆ　）元素分析：　ＣＧ、Ｈ９，Ｎ、。０，２Ｓ
−３Ｈ２０としての計算値：　Ｃ，６１，９６；、Ｈ，
７，２３；　Ｎ、　１０．４７；Ｓ、２．４０ 実測値：　Ｃ，６２，２４：　Ｈ，６，９０；　Ｎ、　
１０．４９；Ｓ、２．５３ Ｈ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−１１ｅ
−Ｔｒｐ−ＯＨ：　Ｂｏａ−Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ）−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）（ｌｅ−１１ｅ−
Ｔｒｐ−ＯＢｚｌｌｏｏｍｇを水冷下、１０％−１，２
−エタンジチオール含有ＴＦＡ　　１ｍＭに溶解し、室
温下１５分間放置後、溶媒を減圧留去した。残留物にエ
ーテルを加え粉末としてろ取、乾燥したのち、ｍ−クレ
ゾール０．５ｍ　ｍと共にＨＦ　５　ｍ　Ｑで０℃、１
時間処理した。ＨＦを減圧留去し、残留物にジエチルエ
ーテルを加え、析出物を粉末としてろ過し、水洗した。

これを６０％酢酸に溶解し、同゛溶媒で充填したセフ７
デツクスＬＨ−２０（２，５Ｘ９０ａｎ）　（７）カラ
ムに付し１６０ｍ　２〜１８０ｍ　ｍの区分を集め凍結
乾燥した。

収量　２３■（３２，８％） アミノ酸分析値；　Ａｓｐ　１．（１（１）、　Ｃｙｓ
　Ｏ，８０（１）。

１１ｅ　２．１３（２）、　　Ｌｅｕ　　Ｏ，９９（１
）。

Ｈｉｓ　１．０７（１）、　　Ｔｒｐ　Ｏ，６７（１）
。

平均回収率　９０．５％ ｉｉ　）　Ｈ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１
ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＨ（エンドセリン−３Ｃ端部に
類似、溶解性大）の合成りｏａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ（ＯＢｚｌ）−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＯＢｚｌ　
５３８■を水冷下、２０％−１，２−エタンジオチール
含有ＴＦＡ　　５ｍΩに溶解し、室温下１５分放置後、
ＰＴｓＯＨ−Ｈ２０９５■を加え溶解したのち、溶媒を
減圧留去した。残留物をＤＭＦ５ｍＱに溶解し、水冷下
、１０％−ＴＥＡ含有ＤＭＦ　０．７５　ｍ　Ｑを加え
中和した。これにＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｎｏ□）−０Ｈ６０
ｍｇ、ＨＯＮＢ５０■、ＷＳＣＤ　−ＨＣＱ　５０■を
加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物に水を加
え沈殿をろ取した。

これを乾燥ののち熱アセトニトリル１０ｍρにＳ濁し、
室温に冷却後、析出物をろ取した。

収量　０．５ｇ　（７８，３％） このうち１０２■をアニソール０．２ｍ　Ｑ、１０２−
エタンジチオール０．２ｍＭと共にＨＦで○℃６０分間
処理し、ＨＦを減圧留去した。残留物をジエチルエーテ
ルで洗ったのち、５０％−酢酸６　ｍ　Ｑに溶解し、同
し溶媒で充填したセファデックスＧ−２５（２，５Ｘ９
０Ｃ１１）　（７１カラムニ付し展開り、１００−１３
７ｍ　Ｑの区分を集め凍結乾燥した。

収量　２０■（２６，３％） アミノ酸分析値：　Ａｓｐ　Ｏ，９８（１）、　Ｉｌｅ
　１．９５（２）。

Ｌｅｕ　１．Ｏｆ＋）、　Ｈｉｓ　□、９５（１）。

Ａｒｇ　Ｏ，９８（１）、　Ｔｒｐ　０．７２（１）。

平均回収率　８９．７％ １−２　　免疫原の作製 上記Ｉ−１（ｉ）で得られたポリペブタイドＣｙｓ　Ｈ
ｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐと牛血
清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）との縮合物を以下に
述べるマレイミド架橋法により作製し、免疫原とした。

即ち、Ｂ５Ａ２０ａ＋ｇを１．４ｍＭの０．１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ７，０に溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリロキシ）サクシニミド（以下Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓと略
す）　２．６１１Ｉｇを含むＤＭＦ溶液１００μＱ　ト
混合し、室温で４０分反応させた。反応後、あらがしめ
、２゜５ｍＭのＥＤＴＡを含む、０．１　Ｍリンａ緩衝
液、ｐＨ６，５で平衡化したセファデックスＧ−２５カ
ラムで分画した。次にマレイミド基の導入されたＢ５Ａ
３．４■を含む該溶出画分１．２ｍＱと、９０％ジメチ
ルスルホキシドを含む水溶液１．２ｍＭに溶解あるいは
分散させたポリペプチドＣｙｓ　Ｈ□５Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　ＩＩｅＩｌｅ　Ｔｒｐ　１．８ｍ＜とを４℃で３日間
反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃、２日間
透析した。

１−３　　免疫 上記？−２で得た免疫原６０（ｌμｇを含む生理食塩水
４５０μＱに５５０μＱの完全フロインドアジュバント
（Ｆｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ
）を加えてよく混和し乳剤を作成し、ウサギの皮下約２
０ケ所に接種した。６週間後に、不完全フロインドアジ
ュバントを用い、同様の操作で乳剤を作りウサギの皮下
に接種した。この操作を以後１ケ月おきに４回行ない、
追加免疫の７日後、ウサギから血液を部分採取し常法に
より抗血清を得た。

Ｉ−４アフィニティ固相の作製 ポリペブタイドＡｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐを直接ＣＮＢｒ活性化セファロース
４Ｂに結合させ、アフィニティ固相とした。

即ち、　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉ
ｌｅ　Ｔｒｐ　１．５　ｍｇを１０ｍ　Ａの０．５Ｍ食
塩を含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解させ、１ｇ
のＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂと室温３時間反応
させた。次に、未反応の活性基を０．１Ｍ）−リス−塩
酸緩衝液−ｐＨ８で処理したのち、ＰＢＳに分散させ、
４℃で保存した。

Ｉ−５アフィニティ固相による抗エンドセリン−３Ｃ端
ペプタイド抗体の精製 上記１−３記載ウサギ抗血清１６ｍΩから、硫安塩析法
により抗体を部分精製した。すなわち、抗血清１０ｍ　
ＱにＰ　Ｂ　Ｓ　１０ｍ　Ｑを加え、さらに１６．５ｍ
Ｑの飽和硫安を徐々に撹拌しながら加えた（最終４５％
）。３０分間放置したのち、１２，０ＯＯＸ　ｇで２０
分間遠心し、沈殿をＰＢ６１０ｍＱに溶解させた。

次に、同様に飽和硫安を最終３０％飽和になるように加
えたのち遠心した。沈殿を、　０．１５Ｍ食塩を含む０
．ＯＩＭホウ酸緩衝液、ＰＨ８（以下ＢＢＳと略す）、
１０ｍＱに溶解させたのち０．０１Ｍ食塩を含む０．０
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８（緩衝液Ｂ）に対し。

４℃、２日間透析した。抗体画分をＢＢＳに透析した後
、上記１−４記載のアフイニテイ同相を充填したカラム
（１０ｎａφＸ４０ｍ）に付した。ＢＢＳで十分に洗浄
したのち特異抗体を、０．５Ｍ食塩を含む０１１Ｍ酢酸
緩衝液、　Ｐ）Ｉ　４．５で溶比し、さらに０．１Ｍ食
塩を含む０．０５Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ２，０
で溶出した。

溶出液は中和したのち、ＢＢＳに対し透析した。

特異抗体はｐＨ２で溶出した両分に認められ、該両分か
ら１８■の特異抗体が得られた。

Ｉ　−６西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化
抗エンドセリン−３０端ペプタ イド抗体の作製 上記１−５記載のアフイニテイ精製抗Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　
Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ抗体より石川
らの方法〔ジャーナルオブアプライドバイオケミストリ
イ（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ）、、６　：　
５６−６３（１９８４））に従ってＦ　ａｂ’　−ＨＲ
Ｐ　ｊｌＡ１１！体を作製した。

即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ　Ｈ４，５に溶解した特
異抗体６．４＋ｎｇ　にペプシン（シグマ社、２回結晶
）１６０μｇを加え、３７℃、１６時間反応させたのち
。

ＢＢＳで平衡化したスーパーロース１２カラムを用いる
ＦＰＬＣ（ファルマシア社製）でＦ（ａｂ’）２両分を
精製した。該両分を０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５で透析
したのち、最終２０ｍ　Ｍのβ−メルカプトエチルアミ
ンを加え、３７℃で９０分放置した。反応液を２．５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ６，０
で平衡化したスーパーロース１２カラムを用いるＦＰＬ
Ｃで分離し、Ｆ　ａｂ’画分を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ５ｍｇを０．９１１
Ｑの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７に溶解させ、５０μ
ＱのＤ　Ｍ　Ｆに溶解させたＧＭＢ　５１．０５　ｍｇ
を加えて室温４０分反応させた。

反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液０．１
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８）で分離し、得られたマレ
イミド化ペルオキシダーゼ３．５■と上記Ｆ　ａｂ’画
分０．８■とを混合し、コロジオンバック（エムニス機
器社）で約０．３ｍ　Ｑにまで濃縮したのち、４℃で１
６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ６，５を用いるウルトロゲルＡｃＡ４４カラム
（１０ｍｗ＋＋φＸ４０ｍｍ）に供し、Ｆ　ａｂ’−ペ
ルオキシダーゼ複合体画分を精製した。

■、モノクローナル抗エンドセリン−３抗体の作製 １１−１　　免疫原の作製 エンドセリン−３と牛チログロブリン（ＴＧ）とを以下
に述へるマレイミド架橋法により縮合させ、免疫原とし
た。

即ち、エンドセリン−３（ペプチド研究所より購入）　
２６５ｎｍｏｌｅを４５０μＭの０．１Ｍリン酸緩衝液
。

ｐＨ７，０（１０％のＤＭＦを含む）に溶解させ。

ＧＭＢ　Ｓ　　６　、６　μｎ＋ｏｌｅを含むＤＭＦ溶
液５０μＱと混合し、室温で３０分反応させた。

一方、ＴＧ　２０ｍｇ　（４０ｎｍｏｌｅ）を０．１５
Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、　ｐ　Ｈ６，８
，１，４ｍ　Ｑに溶解させ、Ｎ−サクシニミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下５ＰＤＰ
と略す）　２．５■（８，０μｍｏｌｅ）を含むＤ　Ｍ
　Ｆ溶液１００μＱを混合したのち室温４０分間反応さ
せた。反応後、ジチオスレイトール１２．４■（８０μ
ｍｏｌｅ）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４，５，０
，５ｍ　Ｑを加え、室温２０分反応させたのち、セファ
デックスＧ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入
されたＴＧ１２■（２４ｎ　ｍｏｌｅ）を得た。

次にマレイミド基導入エンドセリン−３１９０ｎｍｏｌ
ｅと、ＳＨ基導入Ｔ　Ｇ　５．９　ｎ　ｍｏｌｅとを混
合し。

４℃で２日間反応させたのち、生理食塩水に対し、４℃
、２日間透析した。

Ｉｆ−２免疫 ６〜８週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／Ｃ１１ｉ！！マウスに
上記■−１記載の免疫原１００μｇ／匹をアジュバント
とともに皮下免疫した。以後３週問おきに２〜３回追加
免疫を実施した。

ｎ−３ＨＲＰ４１ｍ化エンドセリン−３の作製エンドセ
リン−３８０ｎｍｏｌｅを４５０μＱの０．１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ７，０に溶解させ、ＧＭＢＳ２９５　μｇ
　（２，０ｐ　ｍｏｌｅ）を含むＤＭＦ溶液５０μ１２
と混合し、室温で３０分反応させた。反応後、セファデ
ックスＧ−１５カラムで分画を行ないマレイミド基の導
入されたポリペプチド６０　ｎＩｎｏｌｅを得た。

一方、ＨＲＰ　ｌｏｎｇ　（２５０ｎ　ｌ！ｏｌｅ）を
０．１５Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６
，８，１，４ｍ１２に溶解させ、Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　１．
１７ｍｇ（３，７５μｍｏｌｅ）を含むＤＭＦ溶液１０
０μＱを混合したのち室温４０分間反応させた。反応後
、ジチオスレイトール１２．４ｍｇ（８０ｐ　ｍｏｌｅ
）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ　Ｈ４，５，０，５ｍ
ｇを加え、室温２０分反応させたのち、セファデックス
Ｇ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入された酵
素６■（１５０ｎ　ｍｏｌｅ）を得た。

次に、マレイミド基導入エンドセリン−３５０ｎ　ｍｏ
ｌｅとＳＲ基導入ペルオキシダーゼ２０　ｎ　ｍｏｌｅ
とを混合し、４℃、１６時間反応させた。反応後、ウル
トロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラ
ムで分画し、ペルオキシダーゼｓ減化エンドセリン−３
を得た。

１１−４　　細胞融合 比較的高い抗体価を示したマウスに対して２４０μｇの
免疫原を生理食塩水０．２５ｍ　Ｑに溶解させたものを
静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終
免疫３日後のマウスから肺臓を摘出し、ステンレスメツ
シュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセン
シャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、肺臓細胞浮遊
液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃ
マウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ　６３．Ａｇ８．　
Ｕｌ　　（Ｐ２Ｈ４）を用いた〔カレント　トビツクス
インマイクロバイオロジーアンドイムノロジー、８１．
１　（１９７８））。細胞融合は、原注〔ネイチャー、
２５６゜４９５（１９７５））に準じて行なった。即ち
、肺臓細胞およびＰ２Ｈ４をそれぞれ血清を含有しない
ＭＥＭで３度洗浄し、肺臓細胞とＰ３Ｈ１数の比率を５
：１になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を
行なって細胞を沈殿させた。上清を充分に除去した後、
沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）　６０００　（コツホライト社製）を０゜３＋ｎ
Ｑ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なっ
た。融合後細胞に毎分２ｍＱの割合でＭＥＭを添加し１
合計１２ｍ　ＱのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間
遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛脂
児血清を含有するＧＩＴメディウム（和光純薬）（ＧＩ
Ｔ−１０Ｆｃｓ）にＰ２Ｈ４が１ｍｇ当り２Ｘ１０’個
になるように浮遊し。

２４穴マルチデイシユ（リンプロ社製）に１ウ工ル１ｍ
Ｑずっ１２０ウエルに播種した。播種後、細胞を３７°
Ｃで５％炭酸ガスフラン器中培養した。２４時間後ＨＡ
Ｔ　（ヒポキサンチンＩ×１０″″４Ｍ、アミノブリテ
リン４Ｘ１０″″７Ｍ、チミジン１．６　Ｘ　１０−３
Ｍ　）を含んだＧＩＴ−１０ＦＣ５培地（ＨＡＴ培地）
を１ウェル当り１ｍｇずつ添加することにより、ＨＡＴ
選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３．
６．９日後に旧液を１ｒｎＱ捨てたあと、１ｒｒ＋Ｑの
ＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリド
ーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養
液が黄変したとき（約ｌＸｌ０’セル／　ｍ　Ｑ　）、
上滑を採取し、後述するＥＩＡ法で、抗体価を測定した
。

ｎ−５ハイブリドーマのスクリーニングハイブリドーマ
培養上滑中の抗体価を以下の２種の方法により測定した
。いずれの方法にも抗マウスイムノグロブリン抗体結合
マイクロプレートを用いた。該プレートは、まず抗マウ
スイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）
を２０μｇ／履Ｑ含むＯ，１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６
溶液を９６ウエルマイクロプレートに１００μＱずつ分
注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをＰＢ
Ｓで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐた
め２５％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳ
を３００μΩずつ分注し、少なくとも４℃で２４時間処
理した。

１　）　ＨＲＰ　４１　脆化エンドセリン−３を用いる
ＥＩＡ法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ　（１０％ブロックエース、２ｍｇ／ｍＱ
　ＢｓＡ、０．４Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＱ、２ｍＭＥＤＴＡ
および０．１％ＮａＮ、を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
、　ｐＨ７，０）　５０μＱおよびハイブリドーマ培養
上清５０μΩを加え、室温４時間反応させた。反応後、
ＰＢＳで洗浄したのち、上記１１−３で作製したＨＲＰ
ｓ識化エンドセリン−３〔１％ＢＳＡを含む０．０２Ｍ
　ＩＪ　ン酸緩衝液、ｐＨ７（バフ７７−Ａ）　テｌ。

Ｏ倍希釈〕１００μＱを加え、４℃で１６時間反応させ
た。反応後ＰＢＳで洗浄したのち、同相上の酵素活性を
測定するため０．２％オルソフェニレンジアミン、０．
０２％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ
５，５を１００μΩずつ分注し、室温で１０分間反応さ
せた。４規定硫酸１００μΩを加え、反応を停止させた
のち４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−３
２，コロナ社製）で測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全
１２０ウエルの上清を調べたところ、Ｎｏ。

５およびＮｏ、９３のウェルに強い抗体価が検出された
。

ｎ）ＨＲＰ標識化エンドセリン−３Ｃ端ペプチド抗体を
用いるＥＩＡ法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ５０μＱ、ハイブリドーマ培養上清５０μ
Ｑ、および６　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｑのエンドセリン−３
を含むバッファーＥ溶液５０μＱを加え、室温で４時間
反応させた。プレートをＰＢＳで洗浄したのち、上記１
−６で作製したＨＲＰ標識化エンドセリン−３０端ペプ
チド抗体〔バッファーＣ（１％ＢＳＡ、０．４Ｍ　Ｎ　
ａ　ＣＱ、２ｍＭＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７，２）で３００倍に希釈〕１００μＱを加え
、４℃で１６時間反応させた。次に、プレートをＰＢＳ
で洗浄したのち、固相上の８素活性を上記Ｕ−５（ｉ）
記載の方法により測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全
１２０ウエルの上清を調べたところ、Ｎ　ｏ　。

９３のウェルに強い抗体価が検出された。

１１−６　　クローニング 抗体活性が陽性を示したＮｏ、５およびＮｏ。

９３のウェルの各ハイブリドーマを限界希釈法によるク
ローニングに付した。即ちハイブリドーマが１．５個／
　ｍ　ＱになるようＲＰＭ１１６４０−２０ＦＣ８に浮
遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウ
ェル当り０．２ｍ　Ｑずつ分注した。分注する際、フィ
ーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェ
ル当り５Ｘ１０’個になるよつに加えた。約１週間後に
は細胞の増殖が認められるようになり、上清中の抗体価
を上記１１−５記載のＥＩＡ法により調べたところ、Ｎ
ｏ、５ハイブリドーマでは４１クローン中８クローンが
、またＮｏ、９３のハイブリドーマでは４１クローン中
７クローンが抗体を産生じていた。

これらのクローンのうち、Ｎｏ、９３−１８より得られ
たクローンＡＥＴ−３０およびその産生ずるモノクロー
ナル抗体ＡＥＴ−３０ａに注目し、以下の実験を実施し
た。

ｎ−７大量のモノクローナル抗体の調製ミネラルオイル
０．５ｍ　Ｑを腹腔内投与されたマウス、あるいは未処
置マウス（Ｂ　Ａ　Ｌ’Ｂ　／’Ｃ）にハイブリドーマ
ＡＥＴ−３０１〜３Ｘ１０’セル／匹を腹腔内注射した
のち、１０〜３０日後に抗体含有腹水を採取した。

■−８モノクローナル抗体の精製 上記Ｕ−７調製腹水よりプロティン−Ａカラムによりモ
ノクローナル抗体を精製した。

即ち腹水８ｍＱを等量の結合緩衝液（３，５Ｍ　ＮａＣ
Ｑ、０．０５％ＮａＮ３を含む１．５Ｍグリシン、ｐＨ
９，０）で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡
化したプロティン−Ａ−セファロース（ファルマシア製
）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０，０５％Ｎ
　ａ　Ｎ　）を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３，
０）で溶出した。以上の操作により、４０■の特異抗体
を得た。

１１−９　　モノクローナル抗体のクラス・サブクラス
の決定 上記ｎ−８精製モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＱ含む
０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６溶液を９６ウエルマイ
クロプレートに１００μαずつ分注し、４℃で２４時間
放置した。上記ｎ−５で述べた方法に従って、ウェルの
余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイ
ソタイプタイピングキット（Ｍｏｕｓｅ−ＴｙｐｅｒＴ
ＭＳｕｂ−Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔバイオラット社
製）を用いるエンサイムーリンクトイムノソーベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってクラス、サブクラスを調
べた。その結果ＡＥＴ−３０ａはＩｇＧ１．　　にクラ
スに属することが分かった。

■、競合法−ＥＩＡ 上記ｌｌ−５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合
マイクロプレートに、バッファーＣで７５倍に希釈した
ＡＥＴ−３０含有培養上清５０μＱ、およびエンドセリ
ン−１標準液５０μＱあるいはエンドセリン−３標準液
５０μＱを加え、室温で１時間反応させたのち、上記ｌ
ｌ−３記載ＨＲＰ標識化エンドセリン−３（バッファー
Ａで１００倍希釈）を加え、４℃で１６時間反応させた
。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち同相上の酵素活性をｌ
ｌ−５（ｉ）記載の方法により測定した。結果を第１図
に示す。図中、−・−がエンドセリン−３の標準曲線を
、また−〇−がエンドセリン−１の標準曲線を示す。

第１図の結果から、ＡＥＴ−３０ａがエンドセリン−３
と反応し、エンドセリン−１と反応しないことが分った
。

■、サンドイッチ法−ＥＩＡ 精製したモノクローナル抗体ＡＥＴ　−３０ａ　　２０
ｕ　ｇ　／　ｍ　Ｑを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９
，６溶液を９６ウエルマイクロプレートにｌＯＯμＱず
つ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰の結
合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（雪印乳
業社製、大日本製薬社販売）３００μＱを加え不活化し
た。

以上のように調製したプレートにバッファーＥで希釈し
たエンドセリン−３、エンドセリン−１０エンドセリン
−２（ヒト）、ビッグエンドセリン−１（ヒト）、ビッ
グエンドセリン−１（ブタ）およびビッグエンドセリン
−３（２２−４２）　（ヒト）標準液１００μＱを加え
、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、
上記１−６で作製したＨＲＰ標識化エンドセリン−３Ｃ
端ペプタイド抗体（バッファーＣで３００倍希釈）１０
０μＱを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗
浄したのち、上記■−５（ｉ　）記載の方法により固相
上の酵素活性を測定した。結果を第２図に示す。図中、
−・−がエンドセリン−３の、また−ム一がエンドセリ
ン−１の、−■−がエンドセリン−２（ヒト）の、−０
−がビッグエンドセリン−１（ヒト）の、−八−がビッ
グエンドセリン−１（ブタ）、および−ローがビッグエ
ンドセリン−３（ヒト）の標準曲線を示す。

第２図の結果から、この測定法がエンドセリン−３に特
異的であり、エンドセリン−３４×１０−１７モル／ウ
ェルを、他のエンドセリンとはほとんど反応することな
く（交差反応性、０．１％以下）、検出し得ることが分
った。

■、モノクローナル抗ビッグエンドセリン−３０端ペプ
タイト抗体の作製 ■−１６ペプタイドの合成 （１）ビッグエンドセリン−３（ｂｉｇ　ＥＴ−３）（
２２−４２）；Ｈ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｇ　１ｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａ　ｓｎ−Ｔｙｒ−Ａ　
ｒｇ−Ｇ　１ｙ−５ｅ　ｒ−Ｐｈｅ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１
ｙ−ＯＨの合成 市販の　Ｒｏｅ−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂（アブ
ライドバイオシステムズ社製）　０．７７ｇ　（０，５
ｎ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド　
バイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成
した。

樹脂上のＢｏａ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチ
レンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Ｂｏａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、　
Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｇｌｙ、　Ｂｏ
ｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｎ、　Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂ
ｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ。

Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏｃ−１１ｅをｂｉ
ｇ　ＥＴ−３（２２−４２）のアミノ酸配列通り順にＨ
ＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。

さらにＤＣＣまたは、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同
じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ
基は無水酢酸でアセチル化し、保護されたｂｉｇ　ＥＴ
−３（２２−４２）−０ＣＨ２−ＰＡＭ樹脂０．８８　
ｇを得た。

この樹脂０．３５　ｇをｐ−クレゾール０゜７０ｇ共存
下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、６０分間処理した後、
フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌ
で２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５耐で抽出し
た。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍｌで洗浄した
。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、セファ
デックスＬＨ−２０（２ｘ９０ａｎ）のカラムに付し、
５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め濃縮し０．１
％トリフルオロ酢酸水１００ｍ１に溶解し、ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳ　　ＡＭ１２０　５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ７
ｃ＋＋）に付け、０．１％トリフルオロ酢酸水と５０％
アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間
での直線型濃度勾配で溶出した。

主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末７６■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　１．９７（２）、　Ｔｈｒ　１．７６（２）、
　Ｓｅｔ　１．６８（２）、　Ｇｌｕ　２゜０４（２）
、　Ｇｌｙ　３，００（３）、　Ｖａｌ　１．００（１
）、　Ｐｒｏ　１．９０（２）。

１１ｅ　０．９５（１）、　Ｌｅｕ　Ｏ，９９（１）、
　Ｔｙｒ　Ｏ，９５（１）、　Ｐｈｅ　１００２（１）
、　Ａｒｇ　２，２７（２）質量分析による（Ｍ　＋　
Ｈ）　　２３５６．１６ＨＰＬＣ溶出時間　　１７．０
１分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１
２ＯＡ）溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水
）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ
ル） を用いＡ液からＢ液へ直線型１度勾配溶比（５０分）流
速　：　　　１．０ｍｌ／分 （２）　　ｂｉｇ　ＥＴ−３（１−４２）；Ｈ−Ｃｙｓ
−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｔｙ　ｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ　−Ａ　ｓｐ−Ｉ
　ｌｅｏ　Ｉ　ｌｅ−Ｔｒｐ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈ
　ｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−ＯＨの合成 市販の　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂（アプ
ライドバイオシステムズ社製）　０．７８ｇ　（０，５
ｎ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド　
バイオシステムズ社裏モデル４３０Ａ）を使用し１合成
した。

樹脂上のＢｏａ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチ
レンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Ｂｏａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、　
Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏ
ｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｎ、　Ｂｏａ
−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂ
ｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、Ｂｏｃ−
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏａ−１１ｅ、　Ｂｏｃ−Ｔ
ｒｐ（ＣＨＯ）、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏ
ｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、　Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ
）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）をｂｉｇ　ＥＴ−３（
１−４２）のアミノ酸配列通り順に）１０Ｂｔ／ＤＣＣ
で活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたは、ＨＯＢｔ／
ＤＣＣで活性化した同しアミノ酸誘導体で再度縮合をし
た後、未反応のアミン基は無水酢酸でアセチル化し、保
護されたｂｉｇ−ＥＴ−３（１−４２）−０ＣＨ，−Ｐ
Ａ呵樹脂を得た。これをＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミ
ド２０ｍ１に懸濁し、チオフェノール２ｍｌを加え、室
温で２時間ゆるやかに攪拌した後グラスフィルター上に
樹脂を濾過し、　Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミドとジ
クロロメタンで洗浄の後乾燥し１．００ｇの樹脂を得た
。

この樹脂０．３９ｇをｐ−クレゾール０．７４ｇ、１０
４−ブタンジチオール１．０ｍｌ共存下無水フッ化水素
１０１１１１で○℃、６０分間処理した後、フッ化水素
を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄
した後、残渣をトリフルオロ酢酸４ｍｌで抽出した。不
溶物を濾去し、トリフルオロ酢酸２ｍｌで２回洗浄した
。これを４トウレア水溶液７５０ｍ１にそそぎ、水冷下
にｐＨ８゜２５に調節し、緩やかに空気を吹き込みなが
ら一晩攪拌した。Ｅｌ１ｍａｎテストが陰性になったこ
とを確認した後、全溶液をＹＭＣ−ＯＤＳ　　ＡＭ１２
Ｏ５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ７ａ１１）に付け、０
．１％トリフルオロ酢酸水と５０％アセトニトリル（０
，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配
で溶出した。主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末１
６■を得た。同じカラムを用い、２０−５０％のあいだ
での直線型濃度勾配の溶出で再クロマト精製し目的物６
，３■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　３．８４（４）、　Ｔｈｒ　３．３１（４）、
　Ｓｅｒ　２．０２（２）、　Ｇｌｕ　３゜０４（３）
、　Ｐｒｏ　２．２２（２）、　Ｇｌｙ　３．３１（３
）、　Ｃｙｓ　１．２０（２）。

Ｖａｌ　１．７７（２）、　Ｉｌｅ　１．８３（３）、
　Ｌｅｕ　２．００（２）、　Ｔｙｒ　４゜６４（５）
、　Ｐｈｅ　１．９２（２）、　Ｌｙｓ　１．７８（２
）、　Ｈｉｓ　Ｏ，８８（１）。

Ａｒｇ　２．１２（２） 質量分析による（Ｍ　＋　Ｈ）　　４９７９．４８ＨＰ
ＬＣ溶出時間　　２１．００分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１
２ＯＡ）溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水
）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ
ル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流
速　：　　１．Ｏｍｌ／分 （３）　　ｂｉｇ　ＥＴ−３（２２−４１）−ＮＯ３：
Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ
−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ−ＮＯ３の合成 市販の　ｐ−メチルＢＯＡ樹脂（アプライド　バイオシ
ステムズ社製）　０．６０ｇ　（０，５ｎ　ｍｏｌｅ）
を用い、ペプチド合成機（アプライド　バイオシステム
ズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成した。

樹脂にＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで
導入した後、樹脂上の８０ｃ基を５０％トリフルオロ酢
ｗ！／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた。

このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、　Ｂｏａ−５ｅｒ（
Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（’Ｔ
ｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ａ
ｓｎ、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ。

Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　ＢｏＣ−Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｇｉｎ、　Ｂｏａ−Ｇｌｕ（Ｏ
Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−１１ｅをＭｇ　ＥＴ−３（２２−
４１）−ＮＯ３のアミノ酸配列通り順に）Ｉ０８ｔ／Ｄ
ＣＣで活性化し縮合した。

さらにＤＣＣまたは、　ＨＯＢｔ／［）ＣＣで活性化し
た同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のア
ミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護されたｂｉｇＥ
Ｔ−３（２２−４１）−Ｂｌ（Ａ樹脂１．９６ｇを得た
。

この樹脂０．２３ｇをｐ−クレゾール０．４０　ｇ共存
下無水フッ化水素５ｍｌで０℃、　６０分間処理した後
、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍ
ｌで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍｌで抽
出した。不溶物を濾去し、　５０％−酢酸水５ｍｌで洗
浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、
セファデックスＬＨ−２０（２ｘ９０ω）のカラムに付
し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め濃縮し０
．１％トリフルオロ酢酸水１００ｍ１に溶解し、ＹＭＣ
−ＯＤＳ　　ＡＭ１２Ｏ５−５０樹脂カラム（２，６ｘ
７■）に付け、ｏ、１％トリフルオロ酢酸水と５０％ア
セトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間で
の直線型濃度勾配で溶出した。

主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末５６■を得た。

アミノ酸配列通 Ａｓｐ　　１．９７（２）、　　Ｔｈｒ　１．８８（２
）、　Ｓｅｒ　１．７５（２）、　　Ｇｌｕ　　２゜０
５（２）、　Ｇｌｙ　３．００（３）、　Ｖａｔ　１．
００（１）、　Ｐｒｏ　１．９３（２）。

１１ｅ　０．９５（１）、　　Ｌｅｕ　Ｏ，９［１）、
　　Ｔｙｒ　Ｏ，９５（１）、　　Ｐｈｅ　ｌ。

０２（１）、　　Ａｒｇ　２．１８（２）質量分析によ
る（Ｍ　＋　Ｈど２２９８．１９ＨＰＬＣ溶出時間　　
１７．０１分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−〇Ｄ　Ｓ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５
１２ＯＡ）溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸
水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニト
リル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流
速　：　　１．ｏ＋＋＋１／分 （４）　　ｂｉｇ　ＥＴ−３（１−４１）−ＮＯ３；Ｈ
−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａ　１−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−
Ｉ　ｌｅ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−　Ｐ
ｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔ
ｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＯ
３の合市販の　ｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド　バ
イオシステムズ社製）　０．６０ｇ　（０，５ｎ　ｍａ
ｉｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライド　バイオシ
ステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成した。

樹脂にＢｏａ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ　）を）ｌＯＢｔ／Ｄ
ＣＣで導入した後、樹脂上のＢｏａ基を５０％トリフル
オロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ
た後、このアミノ基に、Ｂｏａ−Ｐｈｅ、　Ｂｏａ−５
ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂ。

ｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）
、　Ｂｏｃ−Ａｓｎ、　Ｂｏａ−Ｌｅｕ。

Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂ。

ｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏｃ−１１ｅ、　Ｂｏｃ
−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、
　Ｂｏａ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、　Ｂｏａ−Ｃｙｓ（Ｍｅ
Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）をｂｉｇ　Ｅ
Ｔ−３（１−４１）−ＮＯ３のアミノ酸配列通り順にＨ
ＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまた
は、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体
で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でア
セチル化し、保護されたｂｉｇ−ＥＴ−３（１−４１）
−ＢＨＡ樹脂を得た。これをＮ、Ｎ’−ジメチルホルム
アミド２０耐に懸濁し、チオフェノール２ｍｌを加え、
室温で２時間ゆるやかに撹拌した後グラスフィルター上
に樹脂を濾過し、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミドとジ
クロロメタンで洗浄の後乾燥し１．３４ｇの樹脂を得た
。

この樹脂０．７４　ｇをｐ−クレゾール１．０ｇ、１０
４−ブタンジチオール１．０＋ｌｌ共存下無水フツ化水
素１０Ｉｌｌで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素
を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍｌで２回洗浄
した後、残渣をトリフルオロ酢酸６履ｌで抽出した。不
溶物を濾去し、トリフルオロ酢酸２ｍｌで２回洗浄した
。これを４トウレア水溶液１０００鳳１にそそぎ、水冷
下にｐＨ８，０に調節し、緩やかに空気を吹き込みなが
ら一晩撹拌した。Ｅｌ１ｍａｎテストが陰性になったこ
とを確認した後、全溶液をＹＭＣ−ＯＤＳ　　ＡＭ１２
Ｏ５−５０樹脂カラＡ　（２，６Ｘ７０ｍ）に付け、０
．１％トリフルオロ酢酸水と５０％アセトニトリル（０
，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配
で溶出した。主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末３
５■を得た。同じカラムを用い、２０−５０％のあいだ
での直線型濃度勾配の溶出で再クロマト精製を繰り返し
、目的物９．５■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　３．８９（４）、　Ｔｈｒ　３．８１（４）、
　Ｓｅｒ　１．９ｇ（２）、　Ｇｌｕ　３゜０４（３）
、　Ｐｒｏ　２．０９（２）、　Ｇｌｙ　３．３０（３
）、　Ｃｙｓ　１．６０（２）。

Ｖａｌ　１．７９（２）、　Ｉｌｅ　１．８３（３）、
　Ｌｅｕ　２．００（２）、　Ｔｙｒ　４゜７２（５）
、　Ｐｈｅ　１．９２（２）、　Ｌｙｓ　１．８８（２
）、　Ｈｉｓ　０．９１（１）。

Ａｒｇ　２．２０（２） 質量分析による（Ｍ　十Ｈ）　　４９２１．３１ＨＰＬ
Ｃ溶出時間　　２１．００分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１
２ＯＡ）溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水
）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ
ル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流
速　：　　１．ｏｍｌ／分 ■−２，免疫原の作製 上記Ｖ−１で得られたビッグエンドセリン−３Ｃ末端ペ
プタイドｌ１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇ　１　ｙ
−Ｌｅｕ−５ｅ　ｒ−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ　　と牛チログ
ロブリン（ＴＧ）とを以下に述べるマレイミド架橋法に
より縮合させ、免疫原とした。

即ち、ポリペブタイド１．２８μｍｏｌｅを３５０μｍ
の０゜１Ｍリン酸緩衝液、　ｐ　Ｈ７，０（１０％のＤ
ＭＦを含む）に溶解させ、Ｇ　Ｍ　Ｂ　５２５．６μｍ
ｏｌｅを含むＤＭＦ溶液１００μｍと混合し、室温で３
０分反応させた。

一方、Ｔ　Ｇ’３０ｍｇ（６０ｎ　ｍｏｌｅ）を０．１
５Ｍ食塩を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８，
１，４ｍ　ｌに溶解させ、Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　３．７ｇｇ
（１２，０ｔｔ　ｍｏｌｅ）を含むＤＭＦ溶液を混合し
たのち室温４０分間反応させた。反応後。

ジチオスレイトール１８．６ｍｇ（１２０ｐ　ｍｏｌｅ
）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４，５，０，５ｍ　
ｌを加え、室温２０分反応させた後、セファデックスＧ
−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入されたＴ０
１８Ｂ（３６ｎ　ｍｏｌｅ）　　を得た６ 次にマレイミド基導入ポリペブタイド９２０　ｎ　ｓ。

ｌｅと、ＳＨ基導入ＴＧ２９　ｎ　＠ｏｌｅとを混合し
、４℃で２日間１応させたのち、生理食塩水に対し、４
℃、２日間透析した。

■−３，免疫 ６〜８週令のＢＡＬＢ／　ｃ　Ｒマウスに上記Ｖ−２記
載の免疫原１５μｇ／匹（ビッグエンドセリン−３０端
ペプタイドとして）をアジュバントとともに皮下免疫し
た。以後３週問おきに２回追加免疫を実施した。

Ｖ−４，ＨＲＰ標識化ビッグエンドセリン−３０端ペプ
タイドの作製 ビッグエンドセリン−３０端ペブタイド３３００ｍｏｌ
ｅを５００μｍの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０に
溶解させ、ＧＭＢ　５２．７８ｇ　（９，９ｐ　ｍｏｌ
ｅ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で６０分
反応させた。

反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画を行ない
マレイミド基の導入されたポリペプチド２００ｎ　ｍｏ
ｌｅを得た。

一方、ＨＲＰ　　１０＋ｓｇ　（２５０ｎ　ｍｏｌｅ）
を用いて、■−３記載の方法によりＳＨ基の導入された
酵素６＠ｇ（１５０ｎ　ｍｏｌｅ）を得た。

次に、マレイミド基導入ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペ
プチド２００　ｎ　ｍｏｌｅとＳＨ基導入ペルオキシダ
ーゼ５０　ｎ　ｍｏｌｅとを混合し、４℃、１６時間反
応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（Ｌ　Ｋ　
Ｂ　−ファルマシア社製）カラムで分画し、ペルオキシ
ダーゼ標識化ビッグエンドセリン−３６端ペプチドを得
た。

■−５，細胞融合 Ｖ−３記載の、ビッグエンドセリン−３０端ペプチドを
免疫中のマウスを用いて、ｌｌ−４記載の方法により細
胞融合を実施し、ハイブリドーマを得た。

■−６．ハイブリドーマのスクリーニングハイブリドー
マ培養上溝中の抗体価を以下の２種の方法により測定し
た。すなわち、抗マウスイムノグロブリン抗体又はビッ
グエンドセリン−３０端ペプタイド結合マイクロプレー
トを用いた。

該プレートは、まず抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｉ
ｇＧ画分、カッベル社１り又はビッグエンドセリン−３
Ｃ端ペプタイドを２０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝
液、ｐＨ９，６溶液を９６ウエルマイクロプレートに１
００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。

次にプレートをＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの余剰の
結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業
社製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、少なくと
も４℃で２４時間処理した。

１）ＨＲＰ標識化ビッグエンドセリン−３０端ペプタイ
ドを用いるＥＩＡ法 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ　（１０％ブロックエース、２ｍ／ｍｌ　
　ＢＳＡ、０．４Ｍ　ＮａＣ１，２＊ｅＭＥＤＴＡおよ
び０．１％ＮａＮ、を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，０）５０μｌおよびハイブリドーマ培養上清５０
μｍを加え。

室温４時間反応させた０反応後、上記Ｖ−４で作製した
ＨＲＰＩＩ！！化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイ
ド［バッファーＣで４００倍希釈］１００μｌを加え、
４℃で１６時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄したの
ち、固相上の酵素活性をＴｌ−５（ｉ）に記載の方法に
より測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全
１２０ウエルの上清を調べたところ、Ｎｎ４４およびＮ
ｎ７７のウェルに強い抗体価が検出された。

■）ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチド結合マイクロ
プレートを用いるＥＬＩＳＡ法ビッグエンドセリン−３
Ｃ端ペプタイト結合マイクロプレートにバッファーＥ５
０μｍ、ハイブリドーマ上清１００μｌを加え、室温４
時間反応させた０反応後ＰＢＳで洗浄したのち、ＨＲＰ
＆？識抗マウスイムノグロブリン抗体［バッファーＣで
１００００倍希釈］１００μｌを加え、４℃で１６時間
反応させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄したのち。

固相上の酵素活性を上記Ｖ−６（ｉ）記載の方法により
測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全
１２０ウエルの上清を調べたところ、Ｎα７７のウェル
に強い抗体価が検出された。

■−７，クローニング 抗体活性が陽性を示したＮα４４およびＮα７７のウェ
ルの各ハイブリドーマをＩＦ−６の項に従い、クロニン
グを行らた。約１週間後には細胞の増殖が詔められるよ
うになり、上清中の抗体価を上記■−６（ｉ）記載のＥ
ＩＡ法により調べたところ。

＆４４ハイブリドーマでは７６クローン中２クローンが
、またＮα７７のハイブリドーマでは７６クローン中７
５クローンが抗体を産生じていた。

これらのクローンのうち、＆　７７−３０より得られた
クローンｂＥＴ−３１およびその産生するモノクローナ
ル抗体ｂＥＴ−３１ａ、　＆４４−５２より得られたク
ローンｂＥＴ−２３およびその産生ずるモノクローナル
抗体ｂＥＴ−２３ａに注目し、以下の実験を実施した。

■−８，大量のモノクローナル抗体の調製ミネラルオイ
ル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス、あるいは未処
置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にハイブリドーマｂＥＴ−３
１またはｂＥＴ−２３１〜３Ｘ１０＠セル／匹を腹腔的
注射したのち、１０〜１４日後に抗体含有腹水を採取し
た。

■−９．モノクローナル抗体の精製 上記Ｖ−８ｒ！４製腹水よりプロティン−Ａカラムによ
りモノクローナル抗体ｂＥＴ−３１ａおよびｂＥＴ−２
３ａをｌｌ−８の方法に従い精製した。　ｂＥＴ−３１
ａが３０■ｂＥＴ−２３ａが５０■の特異抗体を得た。

Ｖ−１０，モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの
決定 上記Ｖ−９精製モノクローナル抗体ｂＥＴ−３１ａおよ
びｂＥＴ−２３ａのクラス・サブクラスをｌｌ−９で述
べた方法に従い決定した。その結果、ｂＥＴ−３１ａお
よびｂＥＴ−２３ａはいずれもＩｇＧ１、にクラスに属
することが分かった。

■、ビッグエンドセリン−３に関する競合法−ＥＩＡ 上記ｖ−６記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートに、バッファーＣで１００倍に希釈した
ｂＥＴ−３１ａおよびｂＥＴ−２３ａ含有培養土清５０
μｌ、およびビッグエンドセリン−１，エンドセリン−
３，ビッグエンドセリン−３，ビッグエンドセリン−３
０端ペプタイド（２２−４２）、あるいはビッグエンド
セリン−３Ｃ端ペプタイド（２２−４１）−ＮＨ２標準
液５０μｍを加え、室温で１時間反応させたのち、上記
Ｖ−４記載ＨＲＰ標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペ
プタイド（バッファーＣで２００倍希釈）を加え、４℃
で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち
固相上の酵素活性をｌｌ−５（ｉ）記載の方法により測
定した。その結果を第３図（Ａ）、（Ｂ）に示す。図中
、−ム−がビッグエンドセリン−３を、−〇−がビッグ
エンドセリン−１を、−・−がエンドセリン−３を、−
ｍ−がビッグエンドセリン−３６端ペプチド（２２−４
２）を、また、−ローがビッグエンドセリン−３０端ペ
プチド（２２−４１）−Ｎｌ（、の標準曲線を示し、（
Ａ）がｂＥＴ−３１ａ、（Ｂ）がｂＥＴ−２３ａを用い
た競合法の結果を示す。

第３図の結果から、ｂＥＴ−３１ａおよびｂＥＴ−２３
ａはともに、ビッグエンドセリン−１およびエンドセリ
ン−３と反応しないことから、ビッグエンドセリン−３
に特異的な抗体であり、さらに、ビッグエンドセリン−
３０端ペプタイド（２２−４２）およびビッグエンドセ
リン−３０端ペプタイド（２２−４１）−ＮＨ２と同程
度に反応することから、ビッグエンドセリン−３のＣ端
部位に広い特異性を有することがわかった。

■、ビッグエンドセリン−３に関するサンドイッチ法−
ＥＩＡ ■−１、ＨＲＰＩＩＩｌｔ化モノクローナル抗体ｂＥＴ
−３１ａの作製 上記Ｖ−９記載の方法で精製したｂＥＴ−３１ａを■−
６記載の方法に従ってＦ　ａｂ’−ＨＲＰ　４１識体を
作製した。

即ち、０．１阿酢酸緩衝液、ｐ）１４．５に溶解したモ
ノクローナル抗体ｂＥＴ−３１ａ　１０．５■にペプシ
ン（シグマ社、２回結晶）　３．１７μｇを加え、３７
℃、１６時間反応させたのち、ＢＢＳで平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ４４カラムでＦ　（ａｂ’　）、画分を
精製した。該画分を０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５で透析
したのち、最終２０鱈のβ−メルカプトエチルアミンを
加え、３７℃で９０分放置した。反応液を２．５ｍＮ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、　ｐＨ６
，０で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで分離
し、Ｆ　ａｂ’画分を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ５■を０．９ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐ）１７に溶解させ、５０μｍ
のＤＭＦに溶解させたＧＭＢ８１．０５■を加えて室温
で４０分反応させた。

反応液をセファデックスＧ＝２５カラム（溶離液０．１
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８）で分離し、得られたマレ
イミド化ペルオキシダーゼ３．５■と上記Ｆ　ａｂ’画
分１．３ａＩｇとを混合し、コロジオンバック　（エム
ニス機器社）で約０．３ｍｌにまで濃縮したのち、４℃
で１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＦ１６．５を用いるクルトロゲルＡｃＡ４４
カラム（１０ｍｌφＸ４０ｍ）に供し、　Ｆａｂ’−ペ
ルオキシダーゼ複合体画分を精製した。

■−２．ＨＲＰ標識化モノクローナル抗体ｂＥＴ−２３
ａの作製 上記■−１記載の方法に従いモノクローナル抗体ｂＥＴ
−２３ａ１２．７＋ａｇを用いて、ＨＲＰＩＪ化ｂＥＴ
−２３ａを作製した。

■−３．サンドイッチ法ＥＩＡ ■で作製したＡＥＴ−３０ａ結合マイクロプレートにバ
ッファーＥで希釈したビッグエンドセリン−３、ビッグ
エンドセリン−１（ヒト）、エンドセリン−３、エンド
セリン−１およびエンドセリン−２（ヒト）標準液１０
０μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗
浄したのち、上記■−１、■−２で作製したＨＲＰ標識
化脆化Ｔ−３１ａまたはｂＥＴ−２３ａ（バッファーＣ
で２００倍希釈）１００μｍを加え、４℃で２４時間反
応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記Ｕ−５（ｉ）記
載の方法により固相上の酵素活性を測定した。ＨＲＰ標
識化脆化Ｔ−３１ａを用いた場合の結果を第４図に、Ｈ
ＲＰ標識化脆化Ｔ−２３ａを用いた場合の結果を第５図
に示す。図中、−ム−がビッグエンドセリン−３の、ま
た−〇−がビッグエンドセリン−１（ヒト）の、−・−
がエンドセリン−３の、−１−がエンドセリン−１の、
−ローがエンドセリン−２の標準曲線を示す。

第４図の結果から、ＨＲＰ４１識化ｂＥＴ−３１ａを用
いる測定法はビッグエンドセリン−３に特異的であり、
他のエンドセリンとはほとんど反応せず（交差反応性、
０．１％以下）、また測定感度は、６ＸＩＯ″″１７モ
ル／ウェルであることが分った。

同様に第５図の結果から、ＨＲＰ標識化脆化Ｔ−２３８
を用いる測定法は、ビッグエンドセリン−３に特異的で
あり、他のエンドセリンとはほとんど反応しない（交差
反応性、０．１％以下）ことが分った。また、測定感度
は、８　Ｘ　１０””’モル／ウェルであった。

■、羊水中のエンドセリン−３の定量 羊水（１ｍＱ）をモツプパックＣ−１８カートリツジで
濃縮・前処理したのち、エンドセリン−３を上記■記載
サンドイッチ法−ＥＩＡにより定量した。羊水の前処理
の方法をスキーム１に、測定結果を第１表に示した。第
１表の結果より、出産時の羊水中に４．２±３．９ｐ　
ｇ／ｍ　Ｑ　（ｍｅａｎ±ＳＤ、ｎ＝８、）のエンドセ
リン−３が存在することが分った。

■、羊水中のエンドセリン−３の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による検出第１表、Ｎｏ
、３の羊水Ｌ５ｍ　１２を上記■記載のモツプパックＣ
−１８カートリツジを用いて前処理したのち、チッ素気
流下で濃縮した。次に濃縮物を、後述する溶離液Ａ１０
０μＱに溶解したのち、ＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。分
離条件を以下に示す。

カラム：　ＯＤ　Ｓ　−，８０ＴＭ　（４，６ｎｎφＸ
２５０ｍ＋＋＋。

東ソー社Ｉｔり ｍ１ｌｌ液Ａ　：　０，０５％−トＩＪ　））Ｉｉミオ
酢ｍ　（Ｔ　ＦＡ）を含む５％アセトニトリル ｍ離液Ｂ　：　０．０５％ＴＦＡを含む６０％アセトニ
トリル 溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間の間に０〜４
０％に、次の２０分間に４０〜６５％に、さらに次の５
分間に６５〜１００％に、直線的に上昇させる。

流　速：１ｍＱＺ分 分　画：０．５ｍＱ／ｌｕｂｅ 溶出画分を減圧下、遠心濃縮乾固したのち、２５０μＱ
のバッファーＥに溶解させ、上記■記載のサンドイッチ
法−ＥＩＡに供した。結果を第６図に示す。羊水中のエ
ンドセリン−３の免疫活性は合成エンドセリン−３の溶
出位置に検出されたことから、該サンドイツチ法−ＥＩ
Ａがエンドセリン−３を検出していることが確認された
。

スキーム１ 羊水中のエンドセリンの抽出方式 セップパック（Ｓｅｐｐａｋ　）Ｃ−１８カートリツジ
の前処理−４％酢酸含有８６％エタノール５ｍＱ−メタ
ノール５ｍＱ −蒸留水５ｍＱ −４％酢酸５ｍＱ ３ｍＱの４％酢酸を用いる、羊水（１，０−５，０ｍ　
Ｑ　）の酸性化 カートリッジへの負荷 １０ｍΩの蒸留水での洗浄 ４％酢酸含有８６％エタノール４ｍＱでの溶出３５℃で
のチッ素ガス気流下での濃縮 ０．２５ｍｆｌのバッファーＥでの再構成↓ サンドイッチＥＩＡ １）ロスマレンエフ（Ｒｏｓｍａｌｅｎ　Ｆ）等、（１
９８７）クリニック　ヒミ力アクタ３３１−３４０ 第１表 羊水中のエンドセリン−３の定量 １　　　　　　　　　　　　４、３ ２　　　　　　　　　　　＜０．　５ ３　　　　　　　　　　　１３．３ ４　　　　　　　　　　　　２、６ ５　　　　　　　　　　　３、３ ６　　　　　　　　　　　　４、３ ７　　　　　　　　　　　　２、２ ８　　　　　　　　　　　３、２ ｍｅａｎ　±ＳＤ　　　　　４．２±３．９Ｓ　Ｄ　：
　５ｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　（標準偏差
）Ｘ、健常人および透析患者血漿中のエンドセリン−３
の定量 ヒト血漿（１ｉ）をスキーム１に示す方法により、濃縮
、前処理したのち、エンドセリン−３を上記■記載サン
ドイッチ法−ＥＩＡにより定量した。健常人１７名（男
性、３７．５±４．９才）および透析患者２４名（男性
、４６．０±７．０才）の血漿の測定結果を第７図に示
す。

この結果から、この測定法により血漿中のエンドセリン
−３が定量可能であること、および、透析患者でエンド
セリン−３の血漿レベルが増加することから、この測定
法が臨床上も有用であることが明らかにされた。

■、健常人および透析患者血漿中のエンドセリン−３免
疫活性のＲＰ−ＨＰＬＣによる検出健常人血漿、２０ｍ
１．あるいは透析患者血漿８０耐を同量のＰＢＳで希釈
したのち、　ＡＥＴ−３０の結合セファロース４Ｂカラ
ム（Ｉ−４記載の方法により、１．５■の抗体を１ｇの
ＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂに結合させたゲル１
．５＋ｓｌを含む）に１０ａ＋１／時間の速度で通した
。カラムを１５１１のＰＢＳで洗浄したのち、３ｍｌの
０．０５％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル溶液で溶
出し、窒素気流下濃縮した。濃縮物を０．０５％ＴＦＡ
および０．０５％ＣＨＡＰＳ　（３−［（３−コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ］１−プロパンスルホネ
ート）　　（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐ
ｙｌ）　ｄｉｍｅｔｈｙｌａＩＩｎ＋ｏｎｉｏ］　−１
−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｔｏｎａｔｅ）を含む５％アセ
トニトリル溶液で溶解したのち、■記載の溶出条件によ
り、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。

結果を第８図に示す。健常人（Ａ）および透析患者（Ｂ
）いずれの免疫活性も、標準の合成エンドセリン−３の
溶出位置に検出されたことから、該サンドイッチ−ＥＩ
Ａが、血漿中のエンドセリン−３を検出していることが
確認され、その優れた特性が明らかとなった。

朋　モノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａの中和活性能の
検討 ブタ左冠状動脈より摘出した約２備のらせん状条片を、
混合ガス（９５％０２＋５％Ｃ０２）通気下にタレブス
ーヘンゼライト液（以下栄養液と略す）で満たされたマ
グヌス管内に懸垂した。３７℃で３時間放置したのち、
血管平滑筋の収縮により発生する張力をアイソメトリッ
クトランスデユーサ−（ポリグラフ、ＮＥＣ三栄社製）
により測定した。

試料として、あらかじめ２０倍ｍｏｌｅのＡＥＴ−３０
ａと３７℃、２０分間反応させたエンドセリン−３溶液
（最終エンドセリン−３濃度　ｌＸｌ０−’Ｍ）を添加
しても発生する張力は、同濃度のエンドセリン−３によ
り惹起される張力の７．０％（ｎ：５）であるのに対し
、対照抗体Ｈ２７２−１１（抗癌胎児性抗原）とエンド
セリン−３とを反応させた溶液（最終１×１０″″”Ｍ
）を添加した場合にはエンドセリン−３と同程度（１２
１％、ｎ＝５）の収縮による張力がＷＡ測さ九た。以上
のことから、ＡＥＴ−３０ａはエンドセリン−３の血管
平滑筋収縮活性を中和することが明らかとなった。

〔発明の効果〕

本発明のエンドセリン−３に対するモノクローナル抗体
は、極めて高い結合能を有し、かつエンドセリン−３の
血管平滑筋収縮活性を中和することができる。該モノク
ローナル抗体とエンドセリン−３のＣ端部を認識する抗
体とを用いるサンドインチ法による免疫学的測定法によ
り、エンドセリン−３を高感度にかつエンドセリン−１
あるいはエンドセリン−２あるいはビッグエンドセリン
−３と交差反応することなく定量することができる。ま
た該抗体は、エンドセリン−３と関連する各種疾患にお
いて、エンドセリン−３の強力なアンタゴニストとして
使用し得る。

また１本発明のビッグエンドセリン−３０端ペプチドに
対するモノクローナル抗体は、ビッグエンドセリン−３
Ｃ末端に対し、幅広い特異性を有することから、ビッグ
エンドセリン−３免疫活性の検出に有利であり、該モノ
クローナル抗体とエンドセリン−３に対するモノクロー
ナル抗体とを用いるサンドインチ法による免疫学的測定
法により、ビッグエンドセリン−３を高感度にかつ。

エンドセリン−１，−２、−３，およびビッグエンドセ
リン−１と交差反応することなく定量することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａを用いる競
合法−ＥＩＡにおけるエンドセリン−３およびエンドセ
リン−１の標準曲線を示す。 第２図はモノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａおよび抗エ
ンドセリン−３０端ペプタイド抗体を用いるサンドイッ
チ法−ＥＩＡにおけるエンドセリン−３（−・−）、エ
ンドセリン−１（−ム−）、エンドセリン−２（−■−
）、ヒトビッグエンドセリン−１（−〇−）、ブタビッ
グエンドセリン−１（−ロー）、およびビッグエンドセ
リン−３（−Δ−）の標準曲線を示す。 第３図（Ａ）はモノクローナル抗体ｂＥＴ−３１ａを用
いる競合法−ＥＩＡ、（Ｂ）はモノクローナル抗体ｂＥ
Ｔ−２３ａを用いる競合法−ＥＩＡ、各々におけるビッ
グエンドセリン−３（−ム−）、ビッグエンドセリン−
１（ヒト）（−〇−）、エンドセリン−３（−・−）、
ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチド（２２−４２）　
（−■−）、およびビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチ
ド（２２−４１）−ＮＨ２（−ロー）の標準曲線を示す
。 第４図はモノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａおよびモノ
クローナル抗体ｂＥＴ−３１ａを用いるサンドイッチ法
−ＥＩＡにおけるビッグエンドセリン−３（−ム−）ビ
ッグエンドセリン−１（ヒト）（−〇−）。 エンドセリン−３（−・−）、エンドセリン−１（−１
−）、およびエンドセリン−２（−ロー）の標準曲線を
示す。 第５図はモノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａおよびモノ
クローナル抗体ｂＥＴ−２３ａを用いるサンドイッチ法
−ＥＩＡにおけるビッグエンドセリン−３（−ム−）ビ
ッグエンドセリン−１（ヒト）（−〇−）、エンドセリ
ン−３（−・−）、エンドセリン−１（−■−）、およ
びエンドセリン−２（−口−）の標準曲線を示す。 第６図はセップパックＣ−１８カートリッジ処理後のヒ
ト羊水の逆相ＨＰＬＣによる分離および。 上記サンドインチ法−ＥＩＡによる検出結果を示す、矢
印は合成標準エンドセリンおよびビッグエンドセリンの
溶出位置を示す。 略号： ＥＴ−３，エンドセリン−３；（ａ）ヒトビッグエンド
セリン−１の酸化物；ｈｂｉｇ−ＥＴ−１、ヒトビッグ
エンドセリン−１：（ｂ）エンドセリン−１の酸化物；
　ｐ　ｂ　ｉ　ｇ−ＥＴ−１，ブタビッグエンドセリン
−１；ＥＴ−１，エンドセリン−１，およびＥＴ−２，
エンドセリン−２゜第７図は、健常人および透析患者血
漿中のエンドセリン−３濃度の測定結果を、また、第８
図は、健常人および透析患者血漿エンドセリン−３免疫
活性の逆相ＨＰＬＣによる分離および上記サンドインチ
法−ＥＩＡによる検出結果を示す。

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆
   体に結合性を有するモノクローナル抗体。
2. （２）エンドセリン−３が 【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列を有するものである、請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体。
3. （３）エンドセリン−３の前駆体が、エンドセリン−３
   Ｎ端部あるいはＣ端部に、１つ以上のアミノ酸が付加さ
   れたものである、請求項１記載のモノクローナル抗体。
4. （４）エンドセリン−３の前駆体が式１の配列を有する
   ポリペプチド、あるいは式２で表されるビッグエンドセ
   リン−３、もしくはその一部分である、請求項１または
   ３記載のモノクローナル抗体。 式１ 【遺伝子配列があります】 式２ 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＮＨ＿２）
5. （５）エンドセリン−３前駆体と結合性を有し、かつエ
   ンドセリン−３Ｃ端ペプチド、すなわち【遺伝子配列が
   あります】 で表わされるペプチドと反応しない、請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体。
6. （６）エンドセリン−３と結合性を有し、かつエンドセ
   リン−３Ｃ端ペプチド、すなわち 【遺伝子配列があります】 で表わされるペプチドと反応しない、請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体。
7. （７）エンドセリン−３前駆体と結合性を有し、一方、
   下記のアミノ酸配列を有する、 エンドセリン−１ 【遺伝子配列があります】 エンドセリン−２ 【遺伝子配列があります】 およびマウス・エンドセリン−２ 【遺伝子配列があります】 のいずれとも反応しない、請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。
8. （８）エンドセリン−３と結合性を有し、一方、下記の
   アミノ酸配列を有する、 エンドセリン−１ 【遺伝子配列があります】 エンドセリン−２ 【遺伝子配列があります】 およびマウス・エンドセリン−２ 【遺伝子配列があります】 のいずれとも反応しない、請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。
9. （９）ビッグエンドセリン−３（式２）あるいはその部
   分ペプチドと結合性を有し、かつエンドセリン−３と反
   応しない請求項１記載のモノクローナル抗体。
10. （１０）式３の配列を有するビッグエンドセリン−３Ｃ
    端ペプチドと反応する請求項９記載のモノクローナル抗
    体。 式３ 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＮＨ＿２）
11. （１１）ＡＥＴ−３０ａで標示される、請求項８記載の
    マウスモノクローナル抗体。
12. （１２）ｂＥＴ−３１ａで標示される、請求項１０記載
    のマウスモノクローナル抗体。
13. （１３）ｂＥＴ−２３ａで標示される、請求項１０記載
    のマウスモノクローナル抗体。
14. （１４）エンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前
    駆体に結合性を有するモノクローナル抗体を産生するハ
    イブリドーマ細胞。
15. （１５）ＡＥＴ−３０で標示される、請求項１４記載の
    ハイブリドーマ細胞。
16. （１６）ｂＥＴ−３１で標示される、請求項１４記載の
    ハイブリドーマ細胞。
17. （１７）ｂＥＴ−２３で標示される、請求項１４記載の
    ハイブリドーマ細胞。
18. （１８）エンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前
    駆体に対する抗体と、被検液および標識化エンドセリン
    −３あるいは標識化エンドセリン−３前駆体とを競合的
    に反応させ、該抗体に結合した標識化エンドセリン−３
    あるいは標識化エンドセリン−３前駆体の割合を測定す
    ることを特徴とする、被検液中のエンドセリン−３ある
    いはエンドセリン−３前駆体の定量法。
19. （１９）エンドセリン−３前駆体に対する抗体と、被検
    液および標識化ビッグエンドセリン−３あるいは標識化
    ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチドとを競合的に反応
    させ、該抗体に結合した標識化ビッグエンドセリン−３
    あるいは標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチドの
    割合を測定することを特徴とする、被検液中のエンドセ
    リン−３前駆体の定量法。
20. （２０）担体上に不溶化したエンドセリン−３あるいは
    エンドセリン−３前駆体に対する抗体に被検液を接触さ
    せた後、標識化されたエンドセリン−３あるいはエンド
    セリン−３前駆体に対する抗体を接触させ、不溶化担体
    上の標識剤の活性を測定することを特徴とする、被検液
    中のエンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆体
    の定量法。
21. （２１）担体上に不溶化したエンドセリン−３に対する
    抗体、および標識化されたエンドセリン−３に対する抗
    体の一方がエンドセリン−３Ｃ端ペプチドに結合性を有
    するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体で
    あり、他方がエンドセリン−３に結合性を有するが、上
    記エンドセリン−３のＣ端ペプチドとは反応しないモノ
    クローナル抗体である、請求項２０記載のエンドセリン
    −３の定量法。
22. （２２）担体上に不溶化したエンドセリン−３あるいは
    エンドセリン−３前駆体に対する抗体、および標識化さ
    れたエンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆体
    に対する抗体の一方がエンドセリン−３に結合性を有す
    るモノクローナル抗体であり、他方がエンドセリン−３
    前駆体に結合性を有するが、エンドセリン−３とは反応
    しないモノクローナル抗体である、請求項２０記載のエ
    ンドセリン−３前駆体の定量法。
23. （２３）担体上に不溶化したエンドセリン−３あるいは
    エンドセリン−３前駆体に対する抗体、および標識化さ
    れたエンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆体
    に対する抗体の一方が請求項８記載のモノクローナル抗
    体であり、他方が請求項１０記載のモノクローナル抗体
    である請求項２２記載のエンドセリン−３前駆体の定量
    法。
24. （２４）担体上に不溶化した抗エンドセリン−３モノク
    ローナル抗体ＡＥＴ−３０ａと標識化された抗エンドセ
    リン−３Ｃ端ペプチド（ＣｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｐＩｌ
    ｅＩｌｅＴｒｐ）抗体とを用いる、請求項２１記載のエ
    ンドセリン−３の定量法。
25. （２５）担体上に不溶化したエンドセリン−３あるいは
    エンドセリン−３前駆体に対する抗体、および標識化さ
    れたエンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆体
    に対する抗体の一方がＡＥＴ−３０ａであり、他方がｂ
    ＥＴ−３１ａあるいはｂＥＴ−２３ａである請求項２２
    記載のエンドセリン−３前駆体の定量法。
26. （２６）担体上に不溶化した抗エンドセリン−３モノク
    ローナル抗体ＡＥＴ−３０ａと標識化されたｂＥＴ−３
    １ａあるいはｂＥＴ−２３ａとを用いる請求項２５記載
    のエンドセリン−３前駆体の定量法。