JPH04173097A - 菌体量の計測方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、菌体量の計測方法に関し、詳しくは、醗酵槽
やバイオリアクターのような培養装置内の菌体量を濁度
としてオンラインで計測する方法に関する。

〔従来の技術〕

醗酵槽やバイオリアクターのような培養装置内の菌体量
の計測は、従来は、培養装置内から培養液を一定量サン
プリングし、これを加熱乾燥させて乾燥重量を得て菌体
濃度を知る、いわゆる乾燥法が一般的であり、さらに進
んで、サンプリングした培養液を適当に水や緩衝液等の
希釈剤で希釈し、その濁度を濁度計により測定し、あら
かじめ作成しである濁度と菌体濃度の検量線により菌体
量を得る方法が広くとられてきた。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のような培養装置内の菌体量の計測は、微生物を用
いて有用物質を生産する場合に、非常に重要な意味を持
つものであり、その菌体量も時間と共に変化するもので
あるから、その醗酵・培養系を正常に、かつ効率よく行
わしめるためには、オンラインで菌体量を計測すること
が望ましい。

ところが上記従来の乾燥法は、結果を得るのに長時間を
要し、また、上記濁度計による方法も、オンラインでの
計測は不可能である。一方、近年、レーザー光源を用い
、醗酵槽内に装着してオンラインで濁度を計測し、菌体
量を得る装置が市販されているが、きわめて高価であり
、簡便に用いることはできない。

このような背景から本発明者は、醗酵槽内の菌体量を濁
度により計測するとともに、オンラインにより、しかも
安値に実施し得る方法を開発すべく鋭意研究を重ねた。

濁度によって菌体量を計測する上で一番問題となる点は
、濁度を測定するために用いる濁度計にある。即ち、通
常市販されている濁度計は、測定できる濁度に上限かあ
り、これを超える濁度の場合は、適当に希釈しなくては
計測することができない。これを高濃度まで計測しよう
とすると、前述のようにレーザー光源等を用いなくては
ならず、そのため、装置は複雑となり、かなり高価とな
る。

従って、ザンブリングされた培養液（サンプル）の濁度
が高い場合には、サンプルを適当な濁度範囲になるよう
に希釈することが必須条件となり、しかもオンラインで
行うためには、連続的にサンプルを希釈しつつ測定を行
う必要がある。本発明は、かかる知見に基づいて成され
たものである。

〔課題を解決するための手段〕 即ち、本発明の菌体量の測定方法は、培養装置より一定
量のサンプルを抜き出し、該サンプルを、水、生理的食
塩水等の希釈剤で希釈しつつ濁度を測定し、該濁度によ
り菌体量を計測することを特徴とするものである。

〔実施例〕

以下、本発明を、図面に基づいてさらに詳細に説明する
。

まず、第１図は、本発明方法を実施するのに適した計測
装置の一例を示すものである。

醗酵槽または培養槽等の培養装置１は、サンプリング管
２及び該サンプリング管２に連設したチューブ２ａに設
けられた培養液サンプリング用ポンプ３を介して希釈測
定装置４に連通している。

該希釈測定装置４は、循環経路５を有しており、該循環
経路５の底部管路５ａに、循環ポンプ６が設けられると
ともに、該循環ポンプ６の下流側の立上り管路５ｂには
、希釈された培養液の濁度を測定する濁度計７か設けら
れている。該濁度計７は、立上り管路５ｂに接続するガ
ラス等の透明体で形成されたフローセルフａと、該フロ
ーセルフａを挟んで対峙する光源ランプ７ｂ及び受光器
７Ｃとを有している。前記循環経路５の底部管路５ａに
は、測定終了後の希釈液及び洗浄液を排出するための排
出バルブ８が、また循環経路５の上部には、余剰希釈液
の排出口５Ｃが設けられている。

さらに、希釈測定装置４には、希釈水または生理的食塩
水などの希釈剤を注入するための希釈剤注入ポンプ９を
有する管路１０が接続されている。

次に上記計測装置を用いて菌体量の計測を行う手順を説
明する。

まず、菌体量の測定を行う以前に、希釈測定装置Ｅ４の
経路を十分に洗浄した空の状態とする。次に前記培養液
サンプリング用ポンプ３を作動させて、培養装置１内の
培養液をサンプリング管２から希釈測定装置４に注入す
る。注入された培養液量■。は、該ポンプ３の流速Ｆ、
と作動時間ｔ。

とて決まる。次いて希釈剤注入ポンプ９を作動させ、希
釈剤、例えば水または生理食塩水（約０゜９％Ｎａｃ　
Ｉ　）を希釈測定装置４に注入する。この時の希釈剤注
入ポンプ９の流速をＦ２とし、希釈測定装置４の循環経
路５内が満水となるまで注入したときの所要時間をｔｌ
とすれば、希釈剤の注入量は流速Ｆ２と時間ｔ、とて決
まる。ここまでが回分希釈となる。

次いで濁度計７でフローセルモ 釈液の濁度を計測しながら、循環ポンプ６を作動させて
希釈液を循環経路５内で循環させるとともに、循環経路
５内が満水となった後も、希釈剤注入ポンプ９を用いて
希釈剤を注入し続ける。この希釈剤の注入により余剰と
なる循環液は排水口５Ｃより排出される。この間は連続
希釈となる。

そして、希釈剤注入ポンプ９からの希釈剤の注入と共に
希釈液の濁度が次第に低下していくので、希釈液の濁度
が濁度計７で計測可能な範囲に入ったら、適当な時点て
希釈剤注入ポンプ９を停止し、希釈剤の注入を終える。

この時点までの希釈剤注入ポンプ９の作動時間をｔ２と
する。循環ポンプ６による循環及び攪拌作用により希釈
液の濁度が全体で略一定となり、濁度計７の読みが安定
したら、該濁度計７により希釈液の濁度を計測する。

ここで、あらかじめ本装置を用いて求めておいた第２図
に示すような濁度と菌体量の関係図を用いて、この時点
の希釈液の菌体量Ｘ１を求め、さらに後述する式（ＩＩ
Ｉ）を用いてサンプリングされた培養液中の菌体量Ｘ、
を求める。

１回の計測操作が終了したら、排出バルブ８を開いて希
釈測定装置４内の希釈液を全て排出する。

次いで、排出バルブ８を閉めて希釈剤注入ポンプ９を作
動させ、希釈剤または水を注入し、希釈測定装置４内を
満水として循環ポンプ６を作動させ、水を約３０秒間循
環させて希釈測定装置４内を洗浄し、再び排水バルブ８
を開いて排出する。このような洗浄操作を必要に応じて
、例えば２回繰返す。

次の測定時間になったら、まず培養液サンプリング用ポ
ンプ３を作動させ、サンプリング管２から該ポンプ３を
経て希釈測定装置４に至るまでに停滞している前回サン
プリング時の培養液を全て希釈測定装置４に入れて、前
述の洗浄操作を必要回数行い、しかる後、次の測定操作
に入る。

次に、上記濁度測定操作で得られた希釈液の濁度からサ
ンプル中の菌体量、即ち培養装置内の菌体量を得る手段
を説明する。まず、上記操作において、サンプル中の菌
体量を算出するために必要なデータをまとめると次の様
になる。

■、：培養液のサンプリングｉ　　　　　　　［ｍｌ］
Ｆ１　：サンプリング液の流速　　　　　　　　　［ｍ
ｌ／ｓｅｅ　］Ｆ２　：希釈剤の流速　　　　　　　　
　　　　［ｍｌ／ｓｅｅ　］ｔｏ　：培養液サンプリン
グ用ポンプの作動時間［ｓｅｃ　］ｔ１　：回分希釈の
時間　　　　　　　　　　　［ｓｅｃ　］ｔ２　：連続
希釈の時間　　　　　　　　　　　［ｓｅｃ　］Ｄ　　
　：　希ネ８」虹ハｊＦ２　／（Ｆｚ　　・　ｔ　　１
　＋ｖ、）　　　［−コＸｏ　ｚ回分希釈終了時の菌体
濃度　　　　　　Ｅｇ／ｆ）　］Ｘ１　：希釈測定時の
菌体濃度　　　　　　　　Ｅｇ＃　］Ｘ１　：サンプリ
ング液の菌体濃度　　　　　　［ｇ／Ｆ　］ここで、 Ｖ　ｂ　”　Ｆ　＋　　°１０ 回分希釈：Ｘ＋　””　（（Ｆ２　’　ｔｌ　＋Ｖｂ　
）／Ｖｂ　ｌ　　’Ｘｏ　−（Ｔ）連続希釈：　ｄＸ／
ｄｔ−−Ｄ−Ｘ ｄＸ／Ｘ　−−Ｄ　−ｄ　ｔ Ｌｎ（Ｘ、／Ｘｏ　）−−Ｄ−ｔ２ ＸＯｘｘｌ　　−ｅ””　　　　　　　−（ＩＩ）１式
と■式より Ｘ＋　−（（Ｆ２　ｅｉ、＋Ｖ、）／Ｖｂｌ　　−（Ｘ
＋　　−ｅ””）・・・（ｍ） 従って、上記式■に、希釈剤の流速（Ｆ２　）。

回分希釈の時間（ｔｌ）、培養液のサンプリング量（Ｖ
ｂ　）　、連続希釈の時間（ｔ２）及び希釈測定時の菌
体濃度（Ｘ、）を代入ずれば、サンプリング液の菌体濃
度（Ｘ、）が得られる。

次に上記装置を用いて、本発明をエタノールを基質とし
たキャンディダブラシカエ（Ｃａｎｄｉｄａｂｒａｓｓ
ｌｃａｅ　）の高濃度培養に用いた実験結果を説明する
。

第　　１　　表 第１表に示した培地をＩＩ調製し、第１図に示す如き醗
酵槽１にとり、これにエタノール資化性酵母Ｃａｎｄｊ
ｄａ　ｂｒａｓｓｌｃａｅを植菌した後、３７℃で培養
しつつ、上記手順によりオンラインで菌体濃度を計測し
た。尚、この間、菌体量に応じてエタノールを適宜添加
しながら高濃度培養を行った。

第２表は、その結果を示すもので、試料ＳＩＯ〜Ｓ２０
について本発明方法で計測して得た菌体量（Ｃ１）と、
濁度計を用いた従来法、即ち培養液の一部をメスフラス
コを用いて希釈した後に濁度を測定し、該測定結果から
得た菌体量（Ｃ２）と、従来の乾燥法、即ち、培養液の
一部を１０５℃で乾燥させて重量を測定し、該測定結果
から得た菌体量（ＤＣＷ）とを示す。

第２表 第２表から明らかなように、従来法と比較して本発明方
法は、はとんど同様の結果を得ており、また菌濃度の巾
広い範囲にわたって正確に適応できることがわかる。

さらに第３図は、上記試料Ｓ　＋ｏ−５２０（３１３＋
ＳＩＴを除く）において、希釈剤注入ポンプ９における
希釈剤の流速（Ｆ２）を３５ｍｌ／ｓｉｎ　、　３０ｍ
ｌ／ｓｉｎ　、　　２５ｍｌ／ｓｉｎとし、連続希釈の
時間（ｔ２）を変えたときの濁度（ＯＤ）の変化を示す
ものであり、また第３表は、培養の同一時期（試料Ｓ＋
６相当）において、希釈時間ｉ２、即ち希釈剤注入ポン
プ９の作動時間を変えて希釈率を変化させた場合の測定
結果を示すものである。

第　　３　　表 第３図及び第３表から明らかなように、希釈時間を変え
て濁度の測定値が変化しても菌体濃度測定値（Ｘｌ）は
ほとんど変らず、どの様に希釈しても同様の結果を得ら
れることがわかる。

このように、本発明方法が濁度測定による菌濃度計測に
有効であることが明白であるが、本培養法では、微生物
の増殖、育成をうながすため、また内部の攪拌の目的を
もって空気、酸素、窒素等のガスを流入させている。こ
の場合、サンプリング管２にこれらガスを吸入し、その
為にサンプリング量■、が不正確となり、計測値がバラ
ツクことが考えられるが、この場合は、前記第１図に示
したように、サンプリング管２の先端２ｂを上方に開口
させたり、第４図及び第５図に示すように、サンプリン
グ管２の先端に気泡分離手段を設けることによって、こ
れらのガスの吸入を防ぐことができる。

まず第４図の気泡分離手段は、サンプリング管２の先端
に、筒状の気泡分離器１１を設けたものである。培養液
は、気泡分離器１１の下端側方部に設けた培養液流入口
１１ａから流入するが、この時、はとんどガスを伴わな
い。もし仮に気泡が流入したとしても、気泡分離器１１
の中で気泡は上昇し、気泡分離器１１上端部のガス出口
１１ｂより放出される。従って、気泡分離器１１の側方
下部に開口したサンプリング管２の中にガスが流入する
ことはほとんどない。

また第５図は、サンプリング管２の先端に、メツシュ構
造部１２ａを有する気泡分離器１２を装着したものであ
る。培養液は、気泡分離器１２先端のメツシュ構造部１
２ａを通過して気泡分離器１２中に入るが、この時ガス
はほとんど通過していない。もし仮にガスが流入したと
しても、気泡分離器１２中を上昇し、気泡分離器１２上
部のガス抜き孔１．２　ｂより放出され、サンプリング
管２に混入することはほとんどない。

尚、上記実施例及び実験例は、本発明方法を説明するた
めの一例であって、本発明方法はこれに限定されるもの
ではない。また、各ポンプや弁の開閉とともに、希釈液
の濁度の測定から各データに基づいてサンプル中の菌体
量を算出する演算を、コンピューター等を用いて行うこ
とにより、完全な自動制御運転も可能であり、設定され
た時間毎の菌体量の変化を容易に、かつ確実に得ること
ができる。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明方法によれば、従来非常に
困難であり、煩雑でしかも長時間を要していた菌体濃度
（菌体量）の測定をオンラインで、リアルタイムに、し
かも安価に行うことが可能であり、培養の管理制御に卓
越した効果を奏するものである。

また、実施例においては、酵母の培養を示したが、本発
明方法の菌体量の計測は、濁度の計測によるものである
から、醗酵分野においては他の微生物にも同様にして利
用することができ、さらに動植物の細胞培養にも応用す
ることが可能である。

さらに他の産業、例えば下水処理等における濁度のオン
ライン測定にも利用でき、そのうえ、濁度計を光度計に
代えることにより、食品工業等の色彩の濃度管理にも応
用が考えられる等、研究分野から生産現場までの広範な
利用が考えられ、この方面に重要な役割を果すことが期
待できる。

従って、本発明は、バイオインダストリーの分野に於い
て広範に利用てきることが期待されると同時に、食品工
業、医薬品製造、下水処理等の微生物を利用する各種工
業及び濁度や色度を計測する必要のある分野に有効に利
用することができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法を実施するための装置の概要を示す
系統図、第２図は菌体濃度と吸光度との関係を示す図、
第３図は希釈培養液の吸光度（濁度）と希釈時間の関係
を示す図、第４図及び第５図は、それぞれ培養液のサン
プリングにおける気泡分離器の例を示す概略図である。 １・・培養装Ｗ　　２・・・サンプリング管　　３・・
・培養液サンプリング用ポンプ　　４・・・希釈測定装
置　　５・・・循環経路　　５ｃ・・・排出口　　６・
・・循環ポンプ　　７・・・濁度計　　７ａ・・・フロ
ーセル７ｂ・・・光源ランプ　　７Ｃ・・・受光部　　
８・・・排出バルブ　　９・・・希釈剤注入ポンプ 特　許　出　願　人　　東京理化器械株式会社代理人　
　弁理士　　木　　戸　　傳一部間　　　　　　　　　
　　　　　　木　　　戸　　　−産量　　　　　　　　
　　　　　　　小　　　川　　　眞　　　−← 一 １．０　　　　　　　　　　　２．０ 菌体渫炭　（９／ｆＬ） 第４区 つ 第５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、培養装置より一定量のサンプルを抜き出し、該サン
   プルを、水、生理的食塩水等の希釈剤で希釈しつつ濁度
   を測定し、該濁度により菌体量を計測することを特徴と
   する菌体量の計測方法。