JPH0418029A - Ｈｉｖ感染細胞を殺傷するリポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療剤ま
たは発症予防剤に関する。さらに詳しくは、本発明はヒ
ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染した細胞を選択的
に殺傷するリポソームに関する。

従来の技術および問題点 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はヒト免疫不全ウィ
ルス（ＨＩＶ）の感染により引き起こされるウィルス感
染症てあり、日和見感染症や日和見腫瘍などを伴うこと
を特徴とする免疫不全症である。

ＡＩＤＳの原因ウィルスであるＨＩＶはＲＮＡを遺伝子
とするレトロウィルスの一種であり、ヒトヘルパーＴリ
ンパ球なと表面にヒトのＣＤ４抗原を持つ細胞に感染す
る。ヒ１−ＣＤ４はヒト白血球の分化抗原の一種てあり
、ＨＩＶの外被糖蛋白質ｇｐ１２０に対し親和性を有し
ている。ＨＩＶはこのＣＤ４を受容体として細胞内へ侵
入する。

宿主細胞内に侵入したＨＩＶは自身の逆転写酵素を用い
て遺伝子ＲＮＡを鋳型として対応するＤＮＡを合成する
。合成されたＤＮＡは宿主細胞の染色体中に組み込まれ
プロウィルスとなり感染か成立する。プロウィルスの状
態から、ひとたびＨＩＶの複製か開始されると感染細胞
はＨＩＶの産生細胞となり、複製されたＨＩＶによる感
染の拡大か繰り返される。

ＡＩＤＳの治療剤としては、これまでにアシドチミジン
（ＡＺＴ）のみか実用化されているにすぎない。ＡＺＴ
は抗ＨＩＶ作用を持つヌクレオントアナログである。そ
の作用は、ＨＩＶの遺伝子ＲＮＡか逆転写によりＤＮＡ
に複製される過程を阻害することによる感染阻止作用で
ある（　ＩＪｉ　ｔｓｕｙａ、　１．ｅｔ　ａｌ、、Ｒ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、８４゜２０３３〜２０３７．１９８７）。従ってＡＺ
Ｔは、ＨＴＶの宿主細胞への感染の最初の段階を阻止す
ることはできても、ひとたび感染か成立して、プロウィ
ルスの形でＨＩＶゲノムを持つようになった持続感染細
胞におけるＨＩＶの複製は阻止することかできない。（
Ｎａｋａｓｈｉｍａ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ。

ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ、、　３０．９３３〜
９３７．１９８６）　、またＡＺＴには骨髄（造血組織
）に対する副作用か強いという問題かある。このように
、ＡＺＴは抗ＨＩＶ作用を持ち、臨床における効果も認
められているものの、その効果は十分でなく、また副作
用の問題かある。従ってより効果的なＡＩＤＳの治療及
び発症予防には、ＨＩＶの複製の場である持続感染細胞
を殺傷、破壊して、ＨＩＶか複製されないようにするこ
とか必要である。

ＨＩＶ感染細胞を選択的に傷害する薬剤または組成物と
しては、ジフテリア毒素フラグメントＡを封入したリポ
ソーム製剤か知られている（　ｒｋｕｔａ、　Ｋ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、
７８．１１５９〜１１６３、１９８７および特開昭６３
−２９０８２４）。また、ｇｐ１２０に親和性を有する
分子に毒素あるいは毒素フラグメン］・を直接させた薬
剤も知られている。

このようなものとしては、可溶性のＣＤ４分子にヒマ種
子毒素のＡ鎖を結合させたＣＤ４−ヒマ種子毒素Ａ鎖結
合物（Ｔｉ１１．Ｍ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ。

２４２、１１６６〜１１６８．１９８８）、　ＣＤ　４
とンユートモナス外毒素へとの組換え融合蛋白質（Ｃｈ
ａｕｄｈａｒｙ、　Ｖ、に、　ｅＩａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、３３５．３６９〜３７２．１９８８）およびｇｐ
１２０に対するモノクローナル抗体にヒマ種子毒素Ａ鎖
を結合させたイムノトキシン（Ｍａｔｓｕｓｈ目ａ、　
　Ｓ、　　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｔｉ−ｇｐ１２０　ｉ
ｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ　ａｇａｉｎｓｔ　　ＨＩ　　Ｖ
　　１ｎｆｅｃｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓ、、　　Ｆｏｕｒ
ｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅ
ｎｅｃｅ　ｏｎ　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ、　Ｓｔｏｃｋｈｏｌ
ｍ、　Ｂｏ。

ｋ　１．　ｐ、２３４．＋９８８）などがあげられる。

ＨＩＶ感染細胞の細胞股上にはＨＩＶの外被糖蛋白質ｇ
ｐ】２０か発現されており、ＣＤ４あるいは抗ｇｐ１２
０モノクローナル抗体に毒素または毒素フラグメントを
結合させたこれらの薬剤は、ＨＩＶ感染細胞に選択的に
結合して殺傷するものと考えられている。

以上、上記したようにＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷す
る方法かいくつか明らかにされているものの、いずれも
安全性および生体内での安定性の点から、必ずしも満足
てきるものではない。

一方、最近、脂質成分のみから成るある組成のリポソー
ムかウィルス感染細胞を選択的に殺傷することか明らか
にされた（特願平１−３２２２１７）。

該発明のリポソームは、相転移温度か３７℃未満である
フォスファチジルコリンと酸性リン脂質とコレステロー
ルとを最も好ましくは５二ｌ：２（モル比）の組成とす
るリポソームであって、ＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷
することか示されている。しかしなから、選択性をさら
に高めることかできればより効果的である。

問題解決の手段 本発明者らは、安全にＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷す
る方法を種々検討して、転移温度か３７℃未満のフォス
ファチジルコリンと酸性リン脂質とコレステロールとか
ら成るリポソームに、ヒトＣＤ４の６８番目から９４番
目までのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列よりなり、抗
ＨＩＶ活性をイｆするペプチドまたはその修飾ペプチド
を導入したリポソームか）（ＩＶ感染細胞に対し強い殺
傷活性と高い選択性を示すことを見出し、さらに検討を
重ねて本発明を完成するに至った。以下本発明について
詳細に説明する。

ヒトＣＤ　４　　（Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
１１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−１
１ｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓ　ｐ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−ｒ　ｌ　ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ以下、単
にＣＤ４と略す）は分子量約６万ダルトンの糖蛋白質で
、その１次構造は公知である（　Ｍａｄｄｏｎ、　Ｐ、
　Ｊ　。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．４２．９３〜１０４．１９
８５）　。ＣＤ　４分子のうちＨＩＶ外被蛋白質を相互
作用を示す領域の特定が合成ペプチドを用いた検討て行
われ、Ｎ末端より６８番目のアミノ酸から９４番目のア
ミノ酸までの２７個のアミノ酸から成る領域か関与して
いる可能性か示唆されている（Ｈａｙａｓｈｉ、Ｙ、　
ｅｔａｌ、、Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、、　１０５．１
２９〜１３５．１９８９；大本浩司ら、エイズ研究会第
３回学術集会（松江）、抄録集ｐ、７９．１９８９；お
よび大木洗用ら、第３７回日本ウィルス学会総会（（大
阪）演説抄録ｐ、　８３．１９８９）。

また、この６８番目から９４番目までのアミノ酸鎖と同
し配列を有するベプチ１−化合物（以下、ＣＤ４　（６
８〜９４）、！：略す）か、ＨＩｖの感染を阻止する活
性を有していることか明らかにされている（特願平１−
１７２０５３　　’）。ＣＤ４（６８〜９４）ペプチド
は、Ｎ末端より１９番目のアミノ酸残基としてシスティ
ン残基を有するか、このシスティン残基をヘンシル基（
Ｂｚｌ）で修飾したもの（以下、ＣＤ４　（６８〜９４
　’）　Ｂｚｌ　と略す）、あるいはアセタミドメチル
基（Ａｃｍ）で修飾したもの（以下、ＣＤ４　（６８〜
９４）　Ａｃｍと略す）についてもＨＩＶ感染を阻止す
る活性を有していることが明らかにされている（特願平
１−１７２０５３）。本発明において１よ、ヒトＣＤ４
の６８番目から９４番目までのアミノ酸配列と同じアミ
ノ酸配列より成り、抗ＨＩＶ活性を有するペプチドまた
はその修飾ペプチドとして、上記したペプチドのいずれ
も用いることかできるが、特に好適なものとしてはＣＤ
４（６８〜９４）ペプチド、ＣＤ４（６８〜９４）Ｂｚ
ｌペプチド、ＣＤ４　（６８〜９４）　Ａｃｍペプチド
をあげることかてきる。　ＣＤ４（６８〜９４）ペプチ
ド、ＣＤ４　（６８〜９４）　Ｂｚｌペプチド、および
ＣＤ４　（６８〜９４）　Ａｃｍペプチドは特願平１−
１７２０５３に記載されている方法で調製することかで
きる。該調製方法は、ＣＤ４分子をコードしているＤＮ
Ａ塩基配列（Ｍａｄｄｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｃｅ１ｌ、４２．９３〜１０４．１９８５）によ
り決定されているアミノ酸配列に基づき、ＣＤ４分子の
部分ペプチドの合成を行うものである。合成にはＦＩＴ
ｌｏｃアミノ酸を使用した固相合成法（Ｓｈｅｐｐａｒ
ｄ、　Ｒ，Ｃ。

ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、
、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１６５〜１
６６、１９８５）を用いることかできる。即ち、まずそ
れぞれのペプチドのＣ末端に相当する９−フルオレニル
メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸ペンタフ
ルオロフェニル（Ｐｆｐ）エステルをジメチルホルムア
ミド中で４−ジメチルアミノピリジン存在下、ｐ−アル
コキシベンジルアルコール樹脂に結合させ、次いで結合
すべき別のＦｍｏｃ−アミノ酸Ｐｆｐエステルを縮合反
応により結合させる。各アミノ酸のカップリング反応終
了後、ペプチドの結合した樹脂を２０％ピペリジン・ジ
メチルホルムアミド混液て処理してＮ末端Ｆｍｏｃ基を
除去し、次いてｎ−クレゾール存在下、室温にてトリフ
ルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）−チオアニソールを作用させ
て脱保護をすると同時に、目的とするペプチドを樹脂よ
り回収する。

また更に、合成の第２の方法として、第三ブチルオキシ
力ルホニル（Ｂｏｃ）−アミノ酸を使用した固相合成法
（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｊ、　Ａｍ、
　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、８５．２１４９〜２１５４．
１９６３）を用いることもてきる。

これらの方法において、アミノ酸側鎖を修飾する場合は
修飾アミノ酸の形で、脱保護条件に安定なものをペプチ
ド中に導入する。

また、他の化学合成法や、当該ペプチドに対応するＤＮ
Ａを得て、これを適当なベクターに挿入し、動物細胞や
微生物で発現させて目的とするペプチドを得ても良く、
また、でき上ったペプチドを得た後に、適当な化学修飾
を加えても良い。

ＣＤ４（６８〜９４）ペプチド、ＣＤ４　　（６８〜９
４　）　Ｂｚｌペプチド、あるいはＣＤ４（６８〜９４
　）　Ａｃｍペプチドをリポソームに結合させる方法と
しては、抗体結合リポソームの製造で公知となった方法
（たとえばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、　１４９．１１１〜１１９．１９８７に記載されて
いる方法）を用いることかてきる。該製造においては、
チオール基を導入されたペプチドと、チオール基と反応
し得る結合基を有するリン脂質とを反応させることによ
り、ペプチド−リン脂質結合物を調製し、このペプチド
−リン脂質結合物にリポソーム膜成分として必要な残り
の脂質（相転移温度か３７℃未満のフォスファチジルコ
リンと酸性リン脂質とコレステロール）を加えてリポソ
ームを構成させる。

該製造の別の方法としては、チオール基と反応し得る結
合基を有するリン脂質と相転移温度か３７℃未満のフォ
スファチジルコリンと酸性リン脂質とコレステロールと
を膜成分としてリポソームを調製しておき、このものと
、チオール基を導入されたペプチドとを反応、結合させ
ることにより、本発明のリポソームを製造することもて
きる。

ペプチドにチオール基を導入する方法としてはＮ−サク
シニミンルビリジルシチオプロビオネート（Ｎ−ｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　　ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐ
ｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）等の二官能性の蛋白
質修飾剤をペプチドに結合させ、これを還元する方法か
あげられる。別の方法としては、ＣＤ４　（６８−９４
）ペプチドの場合、ペプチド中のシスティン残基由来の
チオール基を利用することも可能である。

一方、チオール基と反応し得る結合基を有するリン脂質
としては、フオスファチシルエタノールアミン（ＰＥ）
と５ＰＤＰまたはＮ−サクソニミジル　４−（パラマレ
イミドフェニル）ブチレート　（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍ
ｉｄｙｌ　　４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙ
ｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）等とを反応させて得られるピリ
シルジチオプロビオニルフォスファチジルエタノールア
ミン（ｐｙｒ　ｉｄｙ　Ｉｄ　ｉ　ｔｈ　１ｏｐｒｏｐ
　１ｏｎｙ　Ｉｐｈｏｓｐｈａ　ｔ　ｉｄｙ　ｌｅ　ｔ
ｈａｎｏ　ｌａｍｉｎｅ　　（ＰＤＰ−ＰＥ））または
４−（パラマレイミドフェニル）プチリルフオスファチ
ジルエタノールアミン（４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ
ｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ
ｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）　　（Ｍ　Ｐ　Ｂ　−Ｐ
　Ｅ　）　）等をあげることかできる。上記で用いるフ
オスファチンルエタノールアミンとしては、動物起源の
フオスファチンルエタノールアミン、およびアンル基を
ラウロイル基、ミリストイル基、バルミトイル基、ステ
アロイル基、オレオイル基なとに置換しｔこフオスファ
チシルエタノールアミンかあげられるか、特に好ましく
は動物起源のフオスファチソルエタノールアミンかあげ
られる。

リポソーム膜に結合させるペプチドの数は、リポソーム
１個に理論的には、ペプチドか約８０００個まで可能で
あるか、ＨＩＶ感染細胞段傷剤としては、４０〜１２０
個か望ましい。

本発明のリポソームは、上記のようなヒトＣＤ４の６８
番目から９４番目までのアミノ察配列とと同しアミノ酸
配列より成り、抗ＨＩＶ活性を有するペプチドまたはそ
の修飾ペプチドを結合したリン脂質と相転移温度か３７
℃未満のフォスファチンルコリンと酸性リン脂質とコレ
ステロールとを膜成分とするリポソームである。相転移
温度はゲル−液晶相転移温度のことをさす。リン脂質の
二重膜は相転移温度以下では固い膜となるゲル状態て、
相転移温度以上ではやわらかい膜となる液晶状態をとる
。リン脂質の脂肪酸の種類により異なった相転移温度を
示す。

リポソームは内部に水層を有する脂質２重層から成る閉
鎖小胞体であり、その脂質２分子膜構造は生体膜に極め
て近似していることか知られている。リポソームは通常
の細胞膜中に存在する脂質なと天然の材料から調製する
ことかできるため、生体との適合性か高く、毒性や抗原
性をほとんと示さないという利点を有している。リポソ
ームは形態的にはマルチラメラベシクル（以下、ＭＬＶ
と略する）とユニラメラベシクル（以下、ＵＬＶと略す
る）に分類され、ＵＬＶはさらにラージユニラメラベシ
クル（以下、ＬＵＶと略する）とスモールユニラメラベ
シクル（以下、ＳＵＶと略する）に分類されるか、本発
明のリポソームはこれらのいずれの形態でも用いること
かてきる。

本発明のリポソームの製造に用いられる相転移温度か３
７℃未満のフすスファチジルコリンとしては、動植物起
源のレシチン（たとえば卵黄レシチン、大豆レシチン）
や、アシル基をラウロイル基、ミリストイル基、オレオ
イル基などに置換しｔこフォスファチジルコリンかあげ
られるか、特に好ましくはシミリストイルフォスファチ
ジルコリン（ＤＭＰＣ，相転移温度２３℃）かあげられ
る。

また酸性リン脂質としては、動物起源のフォスファチジ
ルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファ
チジルイノシトール、フォスファチシン酸、および半合
成によりアシル基をラウロイル基、ミリストイル基、バ
ルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基などとし
たフォスファチンルセリン、フォスファチジルグリセロ
ール、フオスファチジルイノシトール、フォスファチジ
ン酸なとかあけられるか、特に好ましくは動物起源のフ
オスファチジルセリンがあげられる。

相転移温度か３７℃未満のフォスファチジルコリンと酸
性リン脂質とコレステロールとを膜成分とするリポソー
ムがウィルス感染細胞を選択的に１２４１１することが
知られている（特願平１−３２２２１７）か、このリポ
ソーム膜組成に、ヒトＣＤ４の６８８番目ら９４番目ま
でのアミノ酸配列と同しアミノ酸配列より成り、抗ＨＩ
Ｖ活性を有するペプチドまたはその修飾ペプチドを結合
したリンＩｌ’ｆ’ｆ質を０．１〜１０モル％加えた本
発明のリポソームは、ＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷す
る活性か非常に優れたものである。

細胞にリポソームか接触した場合に起こる相互作用とし
て、細胞とリポソームとの間て膜構成成分の交換、移行
などが起こることか知られている（Ｍａｓｈｉｎｏ、に
、ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９４．８
２１〜８３１゜］９８３およびＨｕｅｓｔｊｓ、Ｗ、Ｈ
，ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６１、１６２７４〜１６２７８．１９８６）。

一方、ＨＴＶか持続感染した細胞では、細胞膜の組成か
ウィルスの外被組成に対応して感染前とは異なっている
ことか知られている。最近の報告によれば、感染細胞の
細胞膜表面にはウィルスの外被糖蛋白質（ｇｐ１２０．
ｇｐ４１）か産生されているだけでなく、細胞膜の脂質
組成そのものもＨＩＶの外被組成に対応してリン脂質の
割合が減少し、コレステロールの比率が増加するなとの
変化を生していることか示されている（　Ｌｙｎｎ、　
Ｗ、　Ｓ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、＋６３．４３〜５
１．１９８８）。従って、ヒｌ−ＣＤ　４の６８８番目
ら９４番目までのアミノ酸配列と同しアミノ酸配列より
成り、抗ＨＩＶ活性を有するペプチドまたはその修飾ペ
プチドを導入した本発明のリポソームは、ＨＩＶ感染細
胞に選択的に接触し、膜構成成分の交換、移行などを介
して細胞に損傷を与え、細胞の正常な機能を損わせ死滅
に至らしめるものと推測される。

上記した本発明のリポソームの製造に必要なリポソーム
膜構成成分から、リポソームを製造する方法自体は公知
の技術が用いられる。該製造法としては、 （１）　　リポソーム膜構成成分を溶媒中で混合した後
、溶媒を蒸発除去して薄膜とし、これに緩衝液を加えて
十分に水和させ、ＭＬＶのリポソームを得る方法、 （２）　ＭＬＶをメンブランフィルタ−により濾過する
ことにより粒径をそろえたリポソームを得る方法、 （３１ＭＬＶを超音波処理あるいは高圧噴射乳化機によ
る処理によりＳＵＶのリポソームを得る方法、なとかあ
げられる。本発明のリポソームの製造にはこれらのいず
れの方法も用いることかできる。

上記（１１〜（３）項で用いられる緩衝液としては、リ
ポソームの製造に用いることのできるものであればいず
れでもよく、その例としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩
衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液なとかあけられる。緩衝
液のｐＨとしては６〜８の中性付近のｐＨが好ましく、
また緩衝液の濃度としては５〜５０ｍＭ程度か好ましい
。上記緩衝液はまた食塩、ショ糖なとの添加により等張
出したものを用いてもよい。また、緩衝液に代えて生理
食塩水を用いてもよい。

本発明のリポソームは、内部水層に薬物を保持させるこ
ともできる。このような薬物としては、細胞の蛋白合成
を阻害する毒素（たとえばジフテリア毒素フラグメント
Ａ）や、ＡＺＴなとの抗ＨＩＶ剤があげられる。ＨＩＶ
感染細胞のあるものは貧食作用を有する（たとえばＨＩ
Ｖに感染したマクロファージ）ので、本発明のリポソー
ムの内部水層に細胞の蛋白合成を阻害する毒素を保持さ
せたリポソームは、そのような細胞の殺傷に効果的と考
えられる。

本発明のリポソームはＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷、
破壊することかできるのでＡＩＤＳの治療剤または発症
予防剤として用いられる。本発明のリポソームは脂質成
分およびヒトのＣＤ４と同しアミノ酸配列のＣＤ４ペプ
チドから成るもので、安全に投与することかできる。Ａ
ＩＤＳ患者、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）患者、ある
いは無症候性のＨＩＶ感染者への本発明のリポソームの
投与は、適宜の量を注射または点滴により静脈内投与と
して行われる。ＨＩＶ感染細胞は主として血中に存在す
るので、これらの細胞に本発明のリポソームを作用させ
ることは容易であると考えられる。このように本発明の
リポソームは、ＡＩＤＳの治療あるいは発症予防におい
て優れた効果を発揮する。

発明の効果 本発明のリポソームはＨＩＶ感染細胞を選択的に殺傷す
ることにより、ＡＩＤＳの治療あるいは発症予防におい
て優れた効果を発揮する。また非感染正常細胞に対して
は毒性を示さないので長期に渡って安全に投与しうる優
れたＡＩＤＳ治療剤および発症予防剤である。

次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。な
お本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例 実施例１．ＣＤ４　（６８〜９４）ペプチドの調製Ｆｍ
ｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−０Ｐｆｐ（Ｉｍｍｏｌ）を
、触媒としてＤＭＡＰ　（４−ジメチルアミノピリジン
）（０，２ｍｍｏりを用い、ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）中、ｐ−ａｌｋｏｘｙ　ｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏ
ｈｏｌ　ｒｅｓｉｎ　　（０，２ｍｍｏｌ）（０，３５
ｍｅｑ　ＯＨ／ｇ、ポリスチレン−１％ジヒニルベンゼ
ンコボリマー　（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｉ％Ｄｉｖ
ｉｎｙｌ　ｂｅｎｚｅｎｅ　Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）　、
国産化学制）上にエステル結合により導入した。

使用したＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体（ミリジエン製）の
側鎖の保護は、Ａｓｐ　（ＯＢｕ’　）、Ｇｌｕ（ＯＢ
ｕ’　）、Ｔｈｒ（Ｂｕ’　　）　　、５ｅｒ（Ｂｕ’
　　）　　、Ｔｙｒ（Ｂｕ’　　）　　、Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）で、ペプチド鎖伸長時の各縮合
反応はすへてｐｒｐ（ペンタフロオルフェニル）活性エ
ステル体（２，５ｅｑ）を用い、触媒としてＨＯＢＴ（
＋−ハイトロキンベンゾトリアゾール）　０．２　ｍｍ
ｏｌの存在下ＤＭＦ中で行った。それぞれのｐｍｏｃ基
の除去は、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いた。

更にそれぞれのカップリング反応は、ニンヒドリンでモ
ニターした。

すへてのカップリング反応終了後、Ｎ末端に残ったＦｍ
ｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦにより除去し、Ｎ末
端アミノ基をフリーとし、その後、すへての他の保護基
の除去と、樹脂がらペブチ１〜を切り出すために、ＴＦ
Ａ−チオアニソールでｍ−クレゾール存在下で室温３時
間処理し、グラスフィルターで濾過し、樹脂を除き、濾
液を室温で濃縮し、これにエーテルを加え粉末を得た。

それを、集め、適当な緩衝液に溶解し、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　　Ｇ−２５（ファルマシア社製）にかけ、０．５　
Ｎ酢酸て溶出させ、脱塩、精製を行った。ゲル濾過後の
ペプチドは更にＨＰＬＣで精製した。

ＨＰＬＣによる精製分取は、０．１％ＴＦＡ中、アセト
ニトリル１０−６０％の濃度勾配てＮｕｃｌｅ。

ｓｉｌ　　１００−５Ｃ１８（４，ＯＸ１５０ｍｍ）カ
ラム（Ｍ　ナーゲル社製）を流速１ｍｔ’／分て流し、
２１０．２６０ｎｍにおける紫外吸収でモニターした。

目的とするＣＤ４（６８〜９４）ペプチドは保持時間１
６．８分て溶出した。得られたＣＤ４　（６８〜９４）
ペプチドのアミノ酸分析の結果は、理論値と一致した。

実施例２．ＣＤ４　（６８〜９４）Ｂｚｌペプチドの調
製 Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−フェニルアセタミドメチ
ル樹脂（０、５ｍｍｏｌ　５ｃａｌｅ、アプライド　バ
イオ　システムズ社製）をペプチドＣ末端アミノ酸であ
るグルタミン酸の出発原料として使用した。樹脂上にお
けるペプチド鎖の逐次延長合成には、アプライドバイオ
システムズ社製Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ（Ｐｒｏｇｒａｍ
　ｖｅｒｓｉｏｎｌ、　４０）ペプチド自動合成機を使
用した。ペプチド鎖延長に使用したＢｏｃアミノ酸誘導
体（ペプチド研究断裂）の側鎖の保護は、Ａｓｐ（Ｏｃ
Ｈｅｘ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、
５ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（Ｄｒ−Ｚ）　、Ｌｙｓ　（
ＣＩ　−Ｚ）　、　Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）で、ペプチド鎖の
延長時における各縮合反応はすへてＤＣＣ（ジシクロへ
キシルカルボジイミド）を用いてジクロロメタン−ジメ
チルホルムアミド混合液中で相当するＢｏｃ−アミノ酸
の対称無水物（２，０ｅｑ）を合成し、ジメチルホルム
アミド中で行った。それぞれのＢｏｃ基の除去は、５０
％ＴＦＡ（）リフルオロ酢ａ！＞−ジクロロメタン溶液
を用いた。

全てのアミノ酸縮合反応終了後、システィン残基のＢＺ
Ｉを除く、Ｎ末端のＢｏｃ基並びにすべての保護基を氷
冷下１０％アニソール／無水ＨＦ（フッ化水素）（−５
℃，３０分）処理により除去すると共に、樹脂からペプ
チドの切り出しを行い、ＨＦを減圧下に留去した後、エ
ーテルにて残渣を洗浄し、ＴＦＡにてペプチドを溶解し
、グラスフィルターで樹脂を除き、濾液を減圧濃縮し、
残渣に乾燥エーテルを加えて粉末を得た。得られた粗生
成物ペプチドは、分取用逆相ＨＰＬＣにて実施例１と同
様に精製された。

実施例３．　　ＣＤ４　（６８〜９４）　　Ａｃｍペプ
チドの調製 実施例２において、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）の代わりにＣｙｓ
（Ａｃｍ）を用いて、その他の方法は実施例２と同し方
法でペプチドの合成と精製を行うことにより、ＣＤ４（
６８〜９４　）　Ａｃｍペプチドを得た。

ＣＤ４　（６８〜９４）ペプチド８■を２　ｍｌの５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。これに、エタ
ノールに溶解した６０ｍＭ５ＰＤＰを１７２μｌ添加し
、密栓後室温にて２時間ゆるやかに攪拌を行った。次に
、この溶液にジチオスライトール１６．７■を加え、再
び密栓して室温にて１．５時間ゆるやかに攪拌を行った
。次にこの溶液を、あらかじめ５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−１５
（ファルマシア社製）１６ｍｌを充填したカラムの上端
に重層し、同じ緩衝液て溶出させることによりゲル濾過
Ｆｉｔ製を行った。ゲル濾過溶出液を逆相ＨＰＬＣて分
析し、チオール基の導入されたＣＤ４（６８〜９４）ペ
プチドのゲル濾過溶出画分を集め、７．２■の精製品を
得た。得られた精製品のチオール基の含有量を２．２′
−ジチオピリジンを用いる方法（Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ、
Ｄ、Ｒ，＆　Ｍｕｒｒａｙ、Ｊ、Ｆ、Ｊｒ、、　　Ａｒ
ｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　、＋１９．旧
〜４９．１９６７）で定量した。ＣＤ４　　（６８〜９
４）ペプチド１分子当たり３．０個のチオール基を保持
していた。

（逆相ＨＰＬＣの条件） カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　　ＡＭ−３０３（５μ、　
　１００人）、４．６ｘ２５０ｓ＋ｍ（山村化学制）溶
出液、Ａ液、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０゜１％含
有する水 Ｂ液：　ＴＦＡを０．１％含有するアセトニトリルグラ
ジェント：０％Ｂ→７ｏ％Ｂ、３５分間のリニアグラジ
ェント 流速：１−７分 温度・室温 検出＋２１０１ｍにおける紫外吸収 このＨＰＬＣ条件て、ＣＤ４（６８〜９４）ペプチドは
、２３．６分に溶出し、チオール基の導入されたＣＤ４
（６８〜９４）ペプチドは約２８分に溶出した。

実施例４において、ＣＤ４（６８〜９４）ペプチド８■
の代わりにＣＤ４（６８〜９４）Ｂｚｌペプチド８■を
用いて、その他の方法は実施例４と同じ方法で操作を行
うことにより、１分子当たり２゜０個のチオール基が導
入されたＣＤ４（６８〜９４）Ｂｚｌペプチドを７．０
■得た。

実施例４において、ＣＤ４（６８〜９４）ペプチド８■
の代わりにＣＤ４　（６８〜９４）Ａｃｍペプチド８■
を用いて、その他の方法は実施例４と同じ方法で操作を
行うことにより、１分子当たり２１個のチオール基か導
入されたＣＤ４（６８〜９４）Ａｃｍペプチドを７．１
■得た。

実施例７ マーチンら（Ｍａｒｊｉｎ、Ｆ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、翻、　４２２９〜４２３８
．１９８１）の方法に従い、牛脳由来フオスファチジル
エタノールアミン（ＰＥ、　　シグマ社製）５０■とＮ
−サクシニミシルビリシルンチオプロビオネート（ＳＰ
ＤＰ、ピアス社製）３１．３■から４６．２■のビリジ
ルジチオブロピオニルフオスファチジルエタノールアミ
ン（ＦＤＰ−ＰＥ）を調製した。このＦＤＰ’−ＰＥの
１．９■をバイヤルにとり、実施例４て得られたチオー
ル基の導入されたＣＤ４（６８〜９４）ペプチド０．９
■を含む５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　　
ｌ　ｍ（！を加え、さらにアセトニトリルＩ　ｍｌを加
えて全量を溶解させた。バイヤル中の空気を窒素で置換
した後密栓し、４℃て１６時間ゆるやかに攪拌を行い、
ＣＤ４（６８〜９４）ペプチドをリン脂質に結合させた
。次に、この溶液をなすフラスコに移し、ロータリーエ
バポレーターを用いて液を蒸発留去した。これに、ジミ
リストイルフオスファチジルコリン（ＤＭＰＣ，日本油
脂製）１７．７■と牛脳由来フォスファチジルセリン（
ＰＳ、　　シグマ社製）４．０■とコレステロール（Ｃ
Ｈ，和光紬薬製）４．０■、およびクロロホルム−メタ
ノール（９：ｌ、容量比）５ｍｊ’を加え、溶解混合し
た。これをロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減
圧上蒸発させ、フラスコの内側に脂質の薄膜を形成させ
た。これに３００ｍＭショ糖含ＷＩＯｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，２）３．５　ｍｌを加え、フラスコ内の空気
を窒素で置換した後、３０℃に１時間保って十分に水和
させた後ポルテックスミキサーにより１０分間攪拌して
白濁液を得た。得られた白濁液を孔径１μｍのポリカー
ボネートのメンブランフィルタ−にュクリポアー社製）
に１０回通した後、さらに孔径２００ｎｍのポリカーボ
ネートのメンブランフィルタ−にュクリポアー社製）に
１０回通した。この液をＢｉｏ　−Ｇｅｌ　Ａ　５０ｍ
（バイオラッド社製）を充填したカラムを用いてゲル濾
過精製を行い、ＣＤ４（６８〜９４）ペプチドの結合し
た本発明のリポソームを得た。

得られたリポソームの５４０ｎｍの波長における濁度（
ＯＤｓ＋ａ）は０．８＋、平均粒径は１７３０ｍ（光散
乱法による測定）であった。また、リポソームに結合し
たＣＤ４（６８〜９４）ペブチ１〜の量を逆相ＨＰＬＣ
により定量した。逆相ＨＰＬＣの条件は実施例４に記載
した条件と同一である。

リポソームサンプルは、オクチルグルコシ１〜を終濃度
５０ｍＭとなるように加えて可溶化した後、ノチオスラ
イトールを終濃度５０ｍＭとなるように加え室温に２時
間保って、リン脂質−ＣＤ４　（６８〜９４）ペブチｌ
”間のジスルフィド結合を還元して、チオール基か結合
したＣＤ４（６８〜９４）ペプチドを遊離させた。この
液の１００μｌをＨＰＬＣに注入し、得られたチオール
基の結合したＣＤ４（６８〜９４）ペプチドのピーク面
積からリポソーム液中の該ペプチド量を求めた。

一方、リポソームサンプルを上記の方法で可溶化後、ジ
チオスライトールによる還元は行わずにＨＰＬＣに注入
した。これにより、リポソーム内部水層に遊離の形で封
入されている該ペプチドの量を求めた。これらの分析結
果から、リポソームに結合している該ペプチドの量を次
式により求めた。

リポソームに結合したＣＤ４（６８〜９４）ペプチドの
定量値は２６．１μｇ　／　ｍｅてあった（リポソーム
１個当たりのＣＤ４（６８〜９４）ペプチドの結合数は
！１４）。

次に、得られたリポソームのＨＩＶ感染細胞に対する殺
傷活性をｉｎ　ＶｉｔｒＯて調へた。ＨＩＶに持続感染
したヒトＴ細胞株（ＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−ＩＩＩｓ
　）　　（２，５ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｅｌｌｓ）を０．６７
　ｍｌの培地（１０％牛脂児血清含有ＲＰＭ　ｌ−１６
４０）に懸濁して細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊
液と、３００ｍＭショ糖含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）で適宜希釈することにより所定のＯＤ、、。

とじたリポソーム液０．３３　ｍｌとを混合し、３７℃
て１時間ゆっくり振とうして細胞とリポソームを接触さ
せた。その後４　ｍｌの培地（１０％牛脂児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０）を加え炭酸ガスインキュヘータ−（
３７℃，５％Ｃ０２）中にて３日間培養した。

３８後細胞をトリパンブルー染色法により染色して生細
胞数を測定した。リポソーム液の代わりに生理緩衝食塩
水（ＰＢＳ）を用いて同様に行った実験を対照実験とし
て、次の式により増殖阻止率を求めた。

増殖阻止率（％）＝ ＰＢＳ処理（対照）での３日後の生細胞数×１００ ＨＩＶを感染させていない非感染のＭＯＬＴ−４細胞に
ついても同様の実験を行い、ＨＩＶ感染細胞と非感染細
胞に対する選択性を見た。結果を第１図に示す。図中、
・□・はＨＩＶ感染細胞（ＭＯＬＴ−４／ＨＩ　ＬＶ−
ＩＩｌ、）１ｍ対する増殖阻止率を、○−Ｏは非感染細
胞（ＭＯＬＴ−４）に対する増殖阻止率を示す。本発明
のリポソームはＨＴＶ感染細胞に対し濃度依存的に強い
増殖抑制活性を示した。感染細胞の増殖を５０％抑制す
るリポソームＯＤ、、。は０．　ｌであり、ペプチドを
結合させていない場合（比較例）と比へ、７分の１の低
濃度て同等の増殖抑制効果を示すことか明らかとなった
。一方、非感染細胞に対しては、最も濃いリポソーム濃
度でも全く増殖抑制を示さなかった。このことから本発
明のリポソームはＨＩＶ感染細胞に対し特異的に強い傷
害作用をおよほすことか明らかとなった。

実施例８゜ 実施例７において、チオール基の導入されたＣＤ４（６
８〜９４）ペプチド０．９■を用いる代わりに、実施例
５て得られたチオール基の導入されたＣＤ４　（６８〜
９４）Ｂｚｌペプチド０．９■を用いて、その他の方法
は実施例７と同じ方法でリポソームの調製を行うことに
より、ＣＤ４（６８〜９４）Ｂｚｌペプチドの結合した
本発明のリポソームを得た。得られたリポソームのＯＤ
、４゜は０．８２、平均粒径は１７２ｎｍてあった。ま
たリポソームに結合したＣＤ４（６８〜９４）Ｂｚｌペ
プチドの定量値は９．３μｇ　／　ｍｅてあった（リポ
ソーム１個当たりのＣＤ４　（６８〜９４）　　Ｂｚｌ
ペプチドの結合数は４１）。このリポソームのＨＩＶ感
染細胞に対する傷害効果を実施例７と同様の方法で調べ
た。結果を第２図に示す。ＣＤ４　（６８〜９４）Ｂｚ
ｌペプチドを結合した本発明のリポソームはＯＤ　、、
。が０．１以上てほぼ完全にＨＩＶ感染細胞の増殖を抑
制した。また感染細胞の増殖を５０％抑制するリポソー
ムＯＤ、、。は０．０４で、ペプチドを結合させていな
い場合（比較例）と比へ、１７分の１の低濃度で同等の
増殖抑制効果を示すことか明らかとなった。一方、非感
染細胞に対しては、最も濃いリポソーム濃度でも全く増
殖を阻害しなかった。このことから、ＣＤ４（６８〜９
４）ＢＺＩペプチドを結合した本発明のリポソームは、
ＨＩＶ感染細胞に対し選択的に極めて強い殺傷活性を有
することか明らかとなった。

実施例９ 実施例７において、チオール基の導入されたＣＤ４（６
８〜９４）ペプチド０．９■を用いる代わりに、実施例
６て得られたチオール基の導入されたＣＤ４　（６８〜
９４）Ａｃｍペプチド０．９■を用いて、その他の方法
は実施例７と同じ方法でリポソームの調製を行うことに
より、ＣＤ４（６８〜９４　）　Ａｃｍペプチドの結合
した本発明のリポソームを得た。得られたリポソームの
ＯＤ、、。は０．９４、平均粒径は１７６ｎｍであった
。またリポソームに結合したＣＤ４　（６８〜９４）Ａ
ｃｍペプチドの定量値は１２．８μｇ　／　ｍｌであっ
た（リポソーム１個当たりのＣＤ４　（６８〜９４）　
Ａｃｍペプチドの結合数は４９）。このリポソームのＨ
ＩＶ感染細胞に対する傷害効果を実施例７と同様の方法
て調へた。結果を第３図に示す。ＣＤ４　（６８〜９４
）Ａｃｍペプチドを結合した本発明のリポソームはＨＩ
Ｖ感染細胞に対し濃度依存的に強い増殖抑制活性を示し
た。感染細胞の増殖を５０％抑制するリポソームＯＤ、
４゜は０．０５５で、ペプチドを結合させていない場合
（比較例）と比べ、１２分の１の低濃度で同等の増殖抑
制効果を示すことか明らかとなった。一方、非感染細胞
に対しては、最も濃いリポソーム濃度でもほとんど増殖
を抑制しなかった。このことから、ＣＤ４（６８〜９４
）　　Ａｃｍペプチドを結合した本発明のリポソームは
、ＨＩＶ感染細胞に対し選択的に強い駁傷活性を示すこ
とか明らかとなった。

比較例 実施例７において、ＣＤ４（６８〜９４）ペプチドは用
いずに、Ｆ　Ｄ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　３．８■とシミリスト
イルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）３５．４■と
フォスファチジルセリン（ＰＳ）８．０■とコレステロ
ール（ＣＨ）８．０■とをリポソーム膜成分として、そ
の他の方法は実施例７と同じ方法でリポソームの調製を
行うことにより、膜脂質組成かＤＭＰＣ−ＰＳ−ＣＨ−
ＰＤＰ−ＰＥ　（５：　１・２・０．４２モル比）であ
って、ペプチドの結合しないリポソームを得た。得られ
たリポソームのＯＤ　、、、は１．７３、平均粒径は１
６８ｎｍであった。このリポソームのＨＩＶ感染細胞に
対する傷害効果を実施例７と同様の方法で調べた。結果
を第４図に示す。リポソームのＯＤ　ｓ　＝。か０．５
以上の場合にＨＩＶ感染細胞に対する傷害効果か認めら
れた。感染細胞の増殖を５０％抑制するリポソーム０Ｄ
ｓ４゜は０，６７てあった。なお、非感染細胞に対して
は、はとんと増殖抑制を示さなかった。

【図面の簡単な説明】

第１．２．３．４図はそれぞれ実施例７，８゜９および
比較例で得られたリポソームのＨＩＶ感染細胞および非
感染細胞に対する増殖阻止率を示す。縦軸は、増殖阻止
率（％）を表し、横軸はリポソームのＯＤ、４．を表す
。各リポソームは図中に示されたＯＤＳ、。に希釈調製
後、各細胞に作用させ増殖阻止率を測定した。なお各図
中、・−・はＨＩＶ感染細胞（ＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ
−Ｉ［［、）に対する増殖阻止率、〇−〇は非感染細胞
（ＭＯＬＴ−４）に対する増殖阻止率を示す。 第１図 リポソーム　０Ｄ５４゜ 第２図 リポソーム　０Ｄ５４０ 第３図 ０．００５０．０１　　α０５０．１　　０．５１リポ
ソーム　ＯＤ５４０

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１） 【遺伝子配列があります】 （式中、第１９番目のシス テイン基は、ベンジル基、又はアセタミドメチル基で修
   飾されていてもよい。）で示されるアミノ酸鎖よりなり
   抗ＨＩＶ活性を有するペプチドを結合したリン脂質と相
   転移温度が３７℃未満であるフォスファチジルコリンと
   酸性リン脂質およびコレステロールを膜成分とするリポ
   ソームからなるＨＩＶ感染細胞殺傷剤
2. （２）相転移温度が３７℃未満であるフォスファチジル
   コリンが、ジミリストイルフォスファチジルコリンであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３項記
   載のＨＩＶ感染細胞殺傷剤
3. （３）酸性リン脂質がフォスファチジルセリンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３項記載の
   ＨＩＶ感染細胞殺傷剤
4. （４）ペプチドを結合したリン脂質の割合が０．１〜１
   ０モル％、相転移温度が３７℃未満であるフォスファチ
   ジルコリンの割合が６０〜８５モル％、酸性リン脂質の
   割合が５〜２０モル％、コレステロールの割合が１０〜
   ３５モル％とする脂質組成であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項から第３項記載のＨＩＶ感染細胞殺傷
   剤
5. （５）相転移温度が３７℃未満であるフォスファチジル
   コリンと酸性リン脂質とコレステロールとの成分比が５
   ：１：２（モル比）であるリポソーム膜中に、ペプチド
   を結合したリン脂質を０．１〜１０モル％含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項から第３項記載のＨＩＶ
   感染細胞殺傷剤
6. （６）特許請求の範囲第６項記載の脂質組成をもち、結
   合するペプチドの数が４０〜１２０であることを特徴と
   するＨＩＶ感染細胞殺傷剤
7. （７）特許請求の範囲第７項記載のリポソーム膜に４０
   〜１２０ペプチドが結合することを特徴とするＨＩＶ感
   染細胞殺傷剤
8. （８）特許請求の範囲第１項から第３項記載のＨＩＶ感
   染細胞殺傷剤を用いることを特徴としたＨＩＶ感染細胞
   の殺傷方法