JPH04183400A - 合成基質を用いた血液凝固活性測定用試薬及びそれを用いた測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、外因系血液凝固反応測定用試薬及びそれを用
いた外因系血液凝固反応の活性測定法に関する。本発明
の試薬を用いることにより、外因系血液凝固反応の活性
を汎用の測定機器を利用して簡便に測定することが可能
であり、医学的治療や臨床検査の分野において益すると
ころ大なるものである。

〔従来の技術〕

血液凝固反応には血管外の組織中の凝固因子（組織トロ
ンボプラスチン）の関与する外因系の血液凝固反応と、
血漿中の凝固因子のみの反応からなる内因系の血液凝固
反応との２種類の反応系がある。

その一方の外因系の血液凝固反応は、血栓の予防治療薬
投与患者への投薬量、肝機能障害の診断などのモニター
として重要である。

その外因系の血液凝固反応系は、血液凝固第７、第１０
、第５、第２因子により構成される。通常血管内の血液
ではそれら凝固因子は不活性な状態にある。出血などの
ため、血液が組織トロンボプラスチンと接触することに
より、まず第７因子が活性化され、その活性化された第
７因子が第１０因子を活性化し、活性化された第１０因
子は第５因子を補酵素とし、リン′脂質相上で第２因子
を活性化する。活性化された第２因子は第１因子に働き
かけ、反応後の第１因子はゲル化して血液を凝固させる
。以上の反応は、第７因子の活性化から第１因子のゲル
化まですべてカルシウムイオンの存在を必要とする。そ
れら諸因子のうち、不活性な第２因子はプロトロンビン
、活性化された第２因子はトロンビン、不活性な第１因
子はフィブリノーゲン、トロンビンの働きによって変化
し凝血性を得た第１因子はフィブリンという呼称を用い
て示されることが多い。

これまで外因系血液凝固反応は、−船釣にいわゆる［ク
イック試験ｊ（Ａ、Ｊ、Ｑｕｉｃｋ著、Ａｓ、　Ｊ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、第１１８巻、２６０ページ、１９３７
年参照）及びその改良形、あるいはその変形による方法
で測定されてきた。

ここでいう「クイック試験」とはその要点をいえば、動
物組織から抽出された組織トロンボプラスチンとカルシ
ウムイオンを含有する試薬液に血液・血漿を加えて動物
の体温およびその近くの温度でインキュベートし、それ
により起こる血液凝固反応の反応活性を試薬液と血漿の
混和からその混和物の凝固の確認されるまでの時間で測
定する試験法一般を指す。

上記の「クイック試験」の試薬には、スクリーニング用
に通常用いられるプロトロンビン時間測定試薬（ＰＴ試
薬）、ウシ咬着血漿を含み血液凝固第２、第７、第１０
因子の活性を測定するトロンボテスト、ヘパブラスチン
テストなどがあり、それらはいずれも基本的には血漿中
のフィブリノーゲンが、試薬に含まれる組織トロンボプ
ラスチンの働きにより生成されたトロンビンによってフ
ィブリン（繊維素）に転することよりなる凝固現象を利
用している。

上記の外因系血液凝固反応測定用試薬を用いる場合には
、その測定において、凝固反応の目視確認に技能上の熟
練を要する、あるいは測定法にしたがったそれ独自の測
定機器を必要とし、しかもそれが大量測定に不向きであ
るという欠点を有する。

ＰＴ試薬については、バラニトロアニリドや５−アミノ
−２−ニトロ安息香酸あるいはそれらの誘導体など発色
性の化合物を分解生成物とするペプチド性トロンビン基
質を用いて、トロンビンによる分解反応の結果解離され
たそれら分解生成物の吸光反応の測定をもつてフィブリ
ン生成による凝固確認に代えるものもある。この方法に
よれば、試料血漿中のフィブリノーゲン濃度に測定値が
依存すること無く外因系血液凝固反応系の活性を測定で
き、機器を用いて測定を自動化することへの道も開ける
。

しかし、それら合成基質を用いた試薬についても、組織
トロンボプラスチンによる分解作用のため基質が試薬の
保存中に分解を受けている恐れがある。また、分解生成
物の吸光域が試料血漿や組織トロンボプラスチンの吸光
域と重複することから血漿の希釈を必要とするなど測定
上の困難と欠点が大きい。加えて、試料血漿と試薬液の
混和からトロンビンの働きが現れるまでの時間を計測す
るというＰＴ試薬の測定原理はそのままであるため、測
定法にしたがったそれ独自の測定機器を必要とし、それ
が大量測定に不向きであるという欠点は克服されていな
い。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、合成基質を用いて保存安定性が優れた
、かつ汎用の機器による測定が可能な外因系血液凝固反
応測定用試薬及びそれを用いた測定法を提供することで
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは鋭意研究を重ね、トロンビン基質Ｈ−Ｄ−
フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボ
キシ−４−ヒドロキシアニリドが組織トロンボプラスチ
ンによる分解作用を受けにくいことを発見し、この知見
をもとにその基質を用いた外因系血液凝固反応測定用試
薬の開発を検討した結果、トロンボテストと良好な相関
性を有し、汎用の分光光度計及び臨床自動分析装置によ
る測定が可能な試薬をえられることを見出し本発明を完
成した。

すなわち本発明は、合成基質、組織トロンボプラスチン
及びカルシウム塩を主成分として含む外因系血液凝固反
応の測定用試薬において、合成基質にＨ−Ｄ−フェニル
アラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４
−ヒドロキシアニリドまたはその塩を用いることを特徴
とする外因系血液凝固反応測定用試薬である。

また本発明は、血漿試料を上記の外因系血液凝固反応測
定用試薬に加えてインキュベートし、血漿試料の血液凝
固反応系が該試薬中の組織トロンボプラスチンによって
活性化されて生成するトロンビンと該試薬中の合成基質
との酵素反応により生じる５−アミノサリチル酸を測定
して、血漿試料の外因系血液凝固反応の活性を測定する
ことを特徴とする外因系血液凝固反応活性の測定法であ
る。

本発明においては、合成基質としてＨ−Ｄ−フェニルア
ラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−
ヒドロキシアニリドまたはその塩を用いる。

この合成基質は下記式 で表わされ、トロンビン測定用基質として公知のもので
あり（特公平１−４３５５９）、通常のペプチド合成法
を利用することによって合成できる。

合成基質の塩は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ギ酸塩、酢
酸塩、プロピオン酸塩など様々の水溶性の無機酸と有機
酸との塩を用いることが可能であるが、その中でも特に
２塩酸塩の形態を採るものを用いることが好ましい。

本発明の試薬中での合成基質の濃度は、０．１μｈ〜２
０ｔｈＭの範囲で使用可能である。

用いられる組織トロンボプラスチンは、望む任意の源か
ら抽出されたものが使用可能であり、好ましくは一般に
用いられているウサギ、ウシ、サル、ヒトの脳、肺、胎
盤由来のものである。

一般に、組織トロンボプラスチンの量は小さすぎると血
液凝固反応を開始させることができず、大きすぎると過
剰量となってやはり反応阻害を引き起こす。

本発明の試薬における組織トロンボプラスチンの添加量
は、トロンビン生成に要求される最小量からトロンビン
生成を抑制しない量まで変化できる。ウシ脳アセトンパ
ウダーから、その１９倍重量の生理食塩水を用いて常法
により抽出された組織トロンボプラスチンの懸濁液にお
いては、その懸濁液が本発明の試薬中に０．６〜３．５
％含まれることが好ましいことがわかったが、組織トロ
ンボプラスチンの試薬中の含有量は、前述の濃度からさ
らに広く変化できる。

組織トロンボプラスチン及び合成基質と共存させるカル
シウム塩は、ハロゲン化塩、蟻酸塩、酢酸塩などすべて
の易溶性塩が可能であるが、その中でも特に好ましいの
は塩化カルシウムである。

その濃度範囲は、１〜１０ｍＭが好ましい。

本発明の試薬のＰＲを安定させるために用いる緩衝剤は
、トリス、ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル
）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、グリ
シルグリシン、ＥＰＰＳ　（４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、イミダゾ
ール、バルビツール酸などが使用可能である。

本発明の試薬のｐｔｔは７．３〜８，５、好ましくは７
．８〜８．２に設定され、その際の緩衝剤の濃度は、ト
リスの場合３０ｍＭ〜１５０ｍＭが適当である。

本発明の試薬の性質を向上させるための補助的に加える
調整用添加剤としては、合成基質の溶解性と検量線の直
線性向上のためにポリエチレングリコール、ポリビニル
ピロリドンのような水和性の高分子化合物、その中でも
とくにポリエチレングリコール６０００を添加すること
が有効である。

その濃度は０．２〜１５％、好ましくは１〜１０％であ
る。

このほか調整用添加剤として、イオン強度調節のために
塩化ナトリウムを、本発明の試薬の保存性を向上させる
ためにヘマセルを、ヘパリン抑制剤としてプロタミン塩
またはアルドリッチ社よりポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅ
ｎ）の名称で市販されるカチオン性ポリマーを、また本
発明の試薬を凍結乾燥品とするときには安定化剤として
デキストランを加えることも可能である。

このほか測定感度を向上させるため、反応加速剤として
動物血より分離精製した血液凝固第５因子を加えても良
い。

本発明の試薬を長期保存するには、凍結乾燥品とするこ
とが好ましい。

本発明の試薬の形態は、合成基質と組織トロンボプラス
チンを共存させるほうが保存上も測定上も取扱いに便利
であるが、このことは合成基質と組織トロンボプラスチ
ンを別々にして、反応時に混合する試薬構成とすること
を妨げるものではない。

本発明の試薬による外因系血液凝固反応の活性の測定は
通常次のように実施する。

ガラス以外の材質、好ましくは合成樹脂製の透明試験管
を用い、試料の血漿を本発明の測定用試薬に加えて素早
く撹拌し３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで４〜６
分インキュベートする。この反応過程で血漿の血液凝固
反応系が活性化され、生成されたトロンビンにより合成
基質が分解されて５−アミノサリチル酸が解離される。

次にその反応液に停止呈色試薬を加えて上記の温度で呈
色反応が安定になるまでインキユベートし、分光光度計
にて６００〜７００ｎ−で吸光度を測定する。この反応
過程で解離された５−アミノサリチル酸が発色性物質に
転化される。

尚、本発明においては、血漿の血液凝固反応系が活性化
されて生成するトロンビンと合成基質との酵素反応の測
定はエンドポイント法が通常採用される。

上記操作にしたがって市販の標準血漿とその生理食塩水
による希釈血漿について吸光度を求め、標準血漿のそれ
を外因系凝固反応活性１００％とし、希釈血漿の活性は
希釈倍数の逆敞のパーセンテージとして２点検量線を作
成する。

被検者検体の血漿の外因系凝固反応活性は、上記操作に
したがって得た吸光度を上記検量線に当てはめて求める
。

上記の呈色反応のための停止呈色試薬は、チモールある
いはペンタシアノアミンフェロエートを主成分とするも
のを用いることが好ましい。

チモールを主成分とする停止呈色試薬の試薬組成は以下
のようなものが可能である。

チモールの濃度は５０〜２００ｍＭに設定しうる。

発色反応に必要な酸化削としてチモールに共存させるメ
タ遇ヨウ素酸ナトリウムについては、５〜１５ｍＭ添加
することが好ましい。

ペンタシアノアミンフェロエートを主成分とする停止呈
色試薬の試薬組成は以下のようなものが可能である。

ペンタシアノアミンフェロエートの濃度は０．５％〜２
％に設定しうる。この試薬には、ＳＤＳのような界面活
性剤、あるいはクエン酸塩のような安定化剤を加えるこ
とも可能である。

停止呈色試薬のｐＨはいずれも１１以上に設定するのが
好ましい。とくにペンタシアノアミンフェロエートを用
いた試薬についてはそのｐＨを安定化させるために緩衝
域がｐｔｌｉｏ以上に及ぶ緩衝剤を添加することも可能
である。また、チモールを用いる試薬は、チモール溶液
とメタ過ヨウ素酸溶液の２液系とするのが好ましく、ペ
ンタシアノアミンフェロエートを用いた試薬は、凍結乾
燥品として保存することが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明の試薬及びそれを用いた測定法は以下の諸点の長
所を有する。

まず、用いられる合成基質は、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニ
ル−し−ピベコリルーし一アルギニルーパラニトロアニ
リド・２塩酸塩（特開昭５５−１２４０７１）など既知
の合成基質と比較したとき、組織トロンボプラスチンに
よる分解作用を受けにくい。このため、本発明の試薬中
で合成基質と組織トロンボプラスチンとを共存させて保
存することが可能であり、このことが原因のブランクア
ップと誤差の発生の心配がない。加えて、トロンビンに
対する反応性、基質特異性、水あるいは緩衝液に対する
溶解性も高い。

次に、本発明の測定法では、吸光度測定域が６００〜７
００ｎｍと血漿の吸光域と異なるため血漿希釈の必要も
ない。加えて、フィブリンの析出を確認するものではな
いので検体として使用する血漿の量も少なくて済む。

更に、本発明では、凝固反応の活性化により生成するト
ロンビンと合成基質との酵素反応の測定法としてはいわ
ゆるエンドポイント法が通常採用されるので、従来の血
液学的検査においていずれかは必要不可欠とされた検査
上の特殊技能の熟練と専用の特殊な機器の代わりに、汎
用の分光光度計あるいは自動分析装置を用いて通常の生
化学的検査と同様に大量の検体を高速で測定することが
可能である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれによって限定されるものではない。

各実施例で吸光度を測定する際用いられる分光光度針は
、断りのない限り日立２２０Ａ型分光光度針である。

また、これ以後合成基質や化合物が略号で表記されたと
きその略号が指し示す物質は次のとおりである。

Ｐｈｅ壬フェニルアラニン Ｐｒｏ　＝プロリン Ａｒｇ　＝アルギニン ｃｘｙ＝グリシン Ｌｅｕ−ロイシン Ｐｉｐ＝ピペコリン ｐＮＡ　＝バラニトロアニリン ＣＮＡ　＝　３−カルボキシ−４−ニトロアニリンＭｃ
ＮＡ　−３−メトキシカルボニル−４−ニトロアニリン
ＣＩＡ　＝　３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリン
Ｔｏｓ＝）シル基 ＰｆｉＧ　＝ポリエチレングリコール 実施例Ｉ Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３
−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド２ｍＭを以下の
組成の緩衝液（ｐ［Ｉ８．１）に溶解させた。

トリス　　　　　　　　２５ｍＭ 塩化ナトリウム　　　５０ｍＭ 塩化カルシウム　　　　５ｍＭ ポリブレン　　　　０．２５−ｇ／！ 上記の合成基質液を０．３ｓｆ採り、オルソ・ダイアグ
ツステイク・システム社製の組織トロンボプラスチン製
剤、トロンボファックス０．１ｍｆを混合し、３７゛Ｃ
で１時間インキユヘートした。

インキュベート後、上記の反応液に２　ｔａｇのペンタ
シアノアミンフェロエート停止呈色試薬液を加え、さら
に１０分間３７°Ｃで呈色反応させ７００ｎｍでの吸光
度を測定した。

次に同様の撮作で、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリ
ル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニ
リド以外の合成基質について組織トロンボプラスチンと
の反応を測定した。

合成基質を含まない緩衝液についてもやはり同様の繰作
で測定し、それをブランクとして基質とトロンボプラス
チンとの反応液で得た吸光度との差を求めた。

結果を第１表に示す。

第１表 ただし、実施例と比較例１〜３は２塩酸塩を用いた。

この結果から本発明の試薬において用いられるＨ−Ｄ−
フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボ
キシ−４−ヒドロキシアニリドは組織トロンボプラスチ
ンによる分解作用を被りにくいことが分かる。

実施例２ 常法によりウサギ脳アセトンパウダーからその１９倍量
の生理食塩水を用いて抽出した組織トロンボプラスチン
液を、 ＨＥＰＥ３　　　　　　　　　２５ｍＭ塩化カルシウム
　　　　　５ｍＭ 塩化ナトリウム　　　　５０ｍＭ からなる組成の緩衝液（ｐＨ８，１）に１．５％となる
ように加えた。

これにさらに合成基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロ
リル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシア
ニリド（Ｅｌ−Ｄ−Ｐｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨＡ）
　・２塩酸塩、あるいはＨ−Ｄ−フェニルアラニルービ
ペコリルーアルギニルーバラニトロアニリド（Ｈ−Ｄ−
Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）　・２塩酸塩を溶解
し、それぞれについて３７°Ｃで１日インキュベートし
て、組織トロンボプラスチンの基質分解作用を比較した
。

Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ＾は８２５μＭ
となるように溶解し、その合成基質液１曽ｌにペンタシ
アノアミンフェロエート系の停止呈色試薬液を２　ｖａ
ｎ加えて７００ｎ−で眼光度を測定した。

Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮ＾は５０μＭと
なるように溶解し、その合成基質液３−２を４０５ｎｍ
で吸光度を測定した。

それぞれのブランクには、合成基質溶解直後インキュベ
ートをしないで測定したものを用いた。

結果を以下の第２表に示す。

基質濃度のはるかに大きな）Ｉ−Ｄ−フェニルアラニル
−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロ
キシアニリドのほうがＨ−Ｄ−フェニルアラニルービベ
コリルーアルギニルーバラニトロアニリドと比較したと
き吸光度の上昇が半分以下に小さい、この結果からも本
発明の試薬において用いられるＨ−Ｄ−フェニルアラニ
ル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒド
ロキシアニリドが組織トロンボプラスチンによる分解作
用を被りにくい合成基質であることが示される。

実施例３ 常法によりウシ脳アセトンパウダーからその１９倍重量
の生理食塩水を用いて、組織トロンボプラスチン抽出液
を調製した。

また、トロンビン生成反応促進剤として生化学工業株式
会社製ウシフィブリノーゲン結晶乾燥粉末をｐＨ７，６
のバルビタール酸１２．７ｍＭ１ｌ衝液に１％となるよ
うに溶解しそれに、エタノールを溶液全体の８％となる
ように加えてそのうわすみ液を得た。これは、ウシの血
液凝固第５因子を高濃度、かつ高純度に含有すると考え
られるものである。

Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＩＡ　　　　　　
１．６７　ｍＭ尿素　　”　　　　　　　　　　　１８
０ｍＭ塩化カルシウム　　　　　　　　　　８ｍＭ塩化
ナトリウム　　　　　　　　０．１９ｍＭトリス　　　
　　　　　　　　　　６６．７ｍＭ組織トロンボプラス
チン抽出液　　　　３％トロンビン生成反応促進剤　　
　　　８．３％という組成からなるｐＨ８，１の試薬に
ついて、そのポリエチレングリコール６０００ｍ度を０
％、０，６７％、３．３３％、と変化させて以下の測定
条件で検量線を作成した。

市販の標準血漿ベリハイノーマルシトレート（ゼネラル
・ダイアグノスティック社製）を添付書記載の方法で溶
解し、無希釈のものと生理食塩水によって血漿濃度が１
０％、３０％、５０％、６０％、８０％に希釈された試
料、およびブランクに用いる生理食塩水を用意する。

上記の試薬３００μｌを５分間３７℃でインキュベート
し、その後これに試料血漿１０μｌを加えて１０分間イ
ンキュベートする。つぎにペンタシアノアミンフェロエ
ート系の停止呈色試薬を３ｍｌ加えて１０分間インキュ
ベートし、それを７００ｎ閣で吸光度を測定した。

結果を第１図に示す。

ポリエチレングリコール６０００をまったく含まないも
のに比べたときポリエチレングリコール６０００を含む
ものは、検量線の直線性が高い事が明らかである。

実施例４ 同一の患者血漿をオーレン社から販売されているトロン
ボテストと、ウシ脳およびウサギ脳より抽出された組織
トロンボプラスチンを用いて調製した本発明の試薬でそ
の外因系血液凝固反応機構の活性を測定し、測定値間の
相関係数と回帰式を求めた。

トロンボテストによる測定では、添付書記載の方法で試
薬を調製、操作して血漿の血液凝固活性を求め、得られ
た血液凝固までの時間を添付された検量線に当てはめて
活性値をパーセントで表示した。

この実施例における本発明の試薬の試薬組成は、Ｈ−Ｄ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＩＡ　　　　　　　０．
２７　ｍ　Ｍ塩化カルシウム　　　　　　　　　６．７
ｍＭＰＥＧ６０００４％ トリス　　　　　　　　　　　　　　６６．７ｍＭへマ
セル　　　　　　　　　　　　０．２７％塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　　　０．３％でｐＨを８．１に設定
したものに、組織トロンボプラスチンとポリブレンを添
加することからなる。

組織トロンボプラスチンがウシ脳由来のものは、その試
薬中の濃度を２．３％、ポリブレンの試薬中の濃度を２
．６ｐｐ−とした。

ウサギ脳由来のものは、その試薬中の濃度を１．１５％
、ポリブレンの試薬中の濃度を６．６ｐｐｍとした。

上記の組成の試薬を用いて次の操作で試料の凝固活性を
求めた。

日立７０５０型自動分析装置を用いて、サンプルは無希
釈血漿３μ！、Ｒ−１に上記試薬液３７５μｌ　Ｒ−２
にチモール系停止呈色試薬液３７５μ１１アツセイコー
ドは最終測光点においてエンドポイント法を指定し、６
６０ｎｍで吸光度を測定した。検量線はベリハイノーマ
ルシトレートの無希釈血漿と生理食塩水による２０倍希
釈血漿をそれぞれ活性１００％、５％として作成した。

その結果、トロンボテストによって得られた活性値をＸ
、本発明による試薬によって得られた活性値をｙとした
とき、ウシ脳由来の組織トロンボプラスチンを用いた場
合の相関性は、試料数５１のとき、ｙ＝０．９４ｘ＋ｏ
、２９．ｒ＝０．９４９、ウサギ脳由来の組織トロンボ
プラスチンを用いた場合の相関性は、試料数５０のとき
、ｙ＝１．００ｘ＋２．３４．ｒ＝０．９６５であった
。

いずれも非常に良好な相関性を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリエチレングリコール６０００添加の効果を
示すもので、標準血漿とその生理食塩水希釈系列を試料
に用いて作成した検量線である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）合成基質、組織トロンボプラスチン及びカルシウ
   ム塩を主成分として含む外因系血液凝固反応測定用試薬
   において、合成基質がＨ−Ｄ−フェニルアラニル−プロ
   リル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシア
   ニリドまたはその塩であることを特徴とする外因系血液
   凝固反応測定用試薬。
2. （２）請求項１においてさらにポリエチレングリコール
   を含む外因系血液凝固反応測定用試薬。
3. （３）請求項２においてポリエチレングリコールを０．
   ２〜１５％の濃度で含む外因系血液凝固反応測定用試薬
   。
4. （４）血漿試料を請求項１の外因系血液凝固反応測定用
   試薬に加えてインキュベートし、血漿試料の血液凝固反
   応系が該試薬中の組織トロンボプラスチンによって活性
   化されて生成するトロンビンと該試薬中の合成基質との
   酸素反応により生じる５−アミノサリチル酸を測定して
   、血漿試料の外因系血液凝固反応の活性を測定すること
   を特徴とする外因系血液凝固反応活性の測定法。
5. （５）請求項４においてエンドポイント法により酸素反
   応を測定する外因系血液凝固反応活性の測定法。