JPH04193832A - 魚類、甲殻類の細菌病予防治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は魚類、甲殻類の細菌病予防治療剤及びそれを含
む養魚用餌料に関する。

〔従来の技術〕

日本における養魚技術は近年角、速な発展を遂げ、養殖
生産量は年々増加している。しかし、天然の魚類と違い
、養殖魚は高い密度で飼育されるため病気にかかる魚も
多い。特に病原性細菌による魚病による被害が多い。

例えばブリの連鎖球菌症、類結節症、タイのビブリオ病
、ウナギのパラコロ病、ニジマスのビブリオ病、クルマ
エビのビブリオ病などがある。

これら細菌病を予防・治療するため、従来、抗生物質が
使われてきたが、耐性菌の発生や、魚体への抗生物質の
残留問題が起り、最近は抗生物質の使用は制限される方
向にある。

そこで、抗生物質にかわる安全で効果の優れた新しい予
防治療薬が養魚業者に望まれている。

一方細菌の細胞壁成分は免疫賦活剤（アジュバント）と
して古くから知られており、細菌ミコバクテリウムボビ
スの細菌壁から調製したものについては免疫増強活性な
らびに癌免疫療法剤としての有効性が検討されている、
（癌、第６５巻４９３〜５０５ページ１９７４年）また
家畜疾病を対称としたものとして細菌ビフィドバクテリ
ウムサーモフィラムの細胞壁から調製したものを用いた
家畜下痢予防治療剤としての利用が報告されている（Ｊ
ｐｎ、　Ｊ、Ｖｅｔ、Ｓｃｉ、４９巻２３５〜２４３ペ
一ジ１９８７年、特開昭６２−２６５２３１）。しかし
ながらこれら免疫賦活剤の魚類、甲殻類の細菌病に対す
る予防治療効果は知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

抗生物質等にかわりうる安全で優れた効果を持つ魚類・
甲殻類の細菌病予防・治療薬を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上述の事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、
バチラス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウ
ム属、アセリシア属、ラクトバチラス属、ストレプトコ
ッカス属、ストレプトミセス属又はビフィドバクテリウ
ム属に属する細菌の細胞壁成分含有物が、魚類・甲殻類
の細菌病を予防　治療する効果を有することを見出し本
発明を完成するに至った。

すなわち本発明はバチラス属、ブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、アセリシア属、ラクトバチラス
属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属又はビ
フィドバクテリウム属に属する細菌の菌体の殺菌処理物
、該細菌の菌体を機械的破砕処理もしくは酵素分解処理
を行うことによって得られる細胞破砕物および該細胞破
砕物を分画して得られる細胞壁成分含有物のうち少なく
とも１種を含有することを特徴とする魚類・甲殻類の細
菌病、予防、治療剤およびこれらを含有する飼料に関す
るものである。

本発明の予防、治療剤に使用される細菌としては、バチ
ラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）八ＴＣＣ１３９５２等のバチラス属細菌、ブレビバク
テリウム°ラクトフアーメンクム（ＢｒｅｖｉｂａｃＬ
ｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ　ｔｕｍ）八ＴＣＣ
１３８６９等のフ゛レビハクテリウム属細菌、コリネバ
クテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）八ＴＣＣ１３０６０等
のコリネバクテリウム属細菌、エセリシア・コライ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ８７３９等
のエセルシア属細菌、ラフ！・バチラス・アシドフィラ
ス（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉ
ｌｕｓ）ＡＴＣＣ４３５６等のラクトバチラス属細菌、
ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ１
９９８７等のストレプトコッカス属細菌、ストレプトマ
イセス０タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ１５２３８等のス
トレプトマチセス属細菌、ビフィドバクテリウム・サー
モフィラム・ＡＴＣＣ２５５２５等のビフィドバクテリ
ウム細菌などが例として挙げられる。

これらの細菌の培養には、通常これらの細菌が資化しう
る栄養源であれば何でも使用し得る。たとえばグルコー
ス、シュークロース等の炭水化物、エタノール、グリセ
ロール等のアルコール、酢酸、１０ピオン酸等の有機酸
、大豆油等またはこれらの混合物の炭素源、酵母エキス
、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、硫安
、アンモニア等の含窒素無機有機栄養源、リン酸塩、マ
グネシウム、鉄、マンガン、カリ等の無機栄養源、およ
びビオチン、チオミン等のビタミン類を適宜配合した通
常の培地が用いられる。培養の方法としては、栄養培地
のｐＨを４．０〜９．５の範囲で２０°Ｃ〜４０°Ｃで
１２時間〜５日間培養すればよい。

培養によって得られた菌体は培養物から分離しかつ加熱
処理等で殺菌したものをそのまま用いることができる。

しかしながら、菌体の破砕処理を行ったものが好ましい
。破砕処理する菌体は生菌体、殺菌処理物のいずれであ
ってもよい。破砕する方法は機械的方法、酵素を利用す
る方法のいずれであってもよい。機械的方法としては、
例えば、フレンチプレスなどを用いて約８００〜２００
０ｋｇ　／　ｃｍ”の圧力で菌体の破砕を行なってもよ
く、あるいは超音波破砕機などを用いて細胞の破砕を行
ってもよい。酵素を用いて細菌細胞を破砕する場合には
、培養菌体あるいは培養菌体の機械的破砕処理物を生理
食塩水等に懸濁しこれに細胞壁溶解酵素を添加し菌体の
細胞壁を分解する。この除用いる酵素は細胞壁を分解す
る能力のあるものであれば、いかなるものでもよく、リ
ゾチーム、プロテアーゼなどが代表例である。酵素処理
条件は公知の方法に従えばよい。機械的方法、酵素法の
いずれにおいても、細胞の破砕率は２０％程度以上がよ
く、６０％程度以上が好ましい、破砕率は懸濁液の波長
６６０ｎｍにおける濁度減少率で測定できる。

また、破砕率を高めるために機械的方法と酵素法を併用
することが好ましい。

菌体の破砕処理物を分画して細胞壁成分含有物を分離し
用いることもできる。分画方法は遠心して単に不溶物を
除去するだけでもよく、また、蛋白質等を分子量分画す
る公知の方法、例えば限外濾過、ゲル濾過等の方法を利
用できる。

本発明の予防治療剤の使用方法としては、調製された菌
体、その破砕物あるいは細胞壁成分含有物を直接与える
か飼料に添加して経口で与えることができる。

投与時期は問わないが、仔稚魚期より与えておけば予防
的効果がある。

投与量は乾燥物として飼料に０．０１〜５％、好ましく
は０．０５〜１％添加すると良い。

飼料としては、通常養殖用に用いられている飼料原料を
対象に応じて配合すれば良い。

−船釣には魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉
、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、ビタミン等が用いら
れる。

本発明において魚類・甲殻類とはブリ、タイ、ウナギ、
コイ、ニジマス、アユ、ギンザケ、マアジ、ティラピア
、ヒラメ、フナ、クルマエビ、ブラックタイガー等であ
る。

以下、実施例により詳細に説明する。

〔実施例〕

実施例１ （１）細菌菌体の調製 グルコース１．０ｇ／ｄＡ、酵母エキス１．０ｇ／ｄ！
、ペプトン１．０ｇ／ｄｊ２、（ＮＨ４）２ＳＯ４０，
５ｇ／ｄｆｆｉ、Ｋ２ＨＰＯ４０，３ｇ　／　ｄ　Ｉ！
、、Ｋｌｌ□Ｐ０．０．１ｇ／　ｄ　ｌ、及びＭｇＳＯ
４・７８ｚ００．０５　ｇ／　ｄ　ｌを含む培地（ｐ）
１７）を５００ｍＩ！、容フラスコに５０ｍＩ！、入れ
、１１５°Ｃで１５分間殺菌した。これにブイヨン寒天
培地で３０°Ｃで１日間培養したバチラス・サチラスＡ
ＴＣＣ１３９５２、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グ
ルタミカムへＴＣＣ１３０６０、エセリシア・コライＡ
ＴＣＣ８７３９、ラクトバチラス・アシドフィラスＡＴ
ＣＣ４３５６、ストレプトコッカス・サーモフィラスＡ
ＴＣＣ１９９８７、ストレフ“トマイセス・タナシェン
シスＡＴＣＣ１５２３８をそれぞれ一白金耳接種し、３
０°Ｃで２４時間振とう培養した。培養終了後各培養液
とも遠心分離して菌体を集めた。各菌体をいずれも培養
液と同量の生理食塩水に懸濁して１００°Ｃで１０分間
加熱処理を行い、再び遠心分離により菌体を集めた。

表　　　１ （２）機械処理物 （１）にて調製した各菌体（湿菌体）をいずれも２５ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に１０重量％になるよ
うに懸濁した。この菌体懸濁液をステンレスボトル（５
０ｍｊ２容）に入れ、超音波破砕機（ＵＲ−２００Ｐ型
、トミー精工■製）により発振周波数２０ｋ）Ｉｚ、２
００Ｗの出力で１５分間処理した。

処理後さらに遠心分離によって細胞壁画分含有物を分画
した。

（３）酵素分解処理物 （２）にて調製した細胞の機械的処理物を固形物として
１０重量％含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋　７．０
　）に卵白リゾチーム（シグマ社製）０．０１重量％と
アクチナーゼ（科研製薬製７００００単位）０．０２重
量％を添加し、３７°Ｃで１２時間処理した。その後・
１００°Ｃで２分間加熱処理して酵素を失活させた。

（４）マウス肺臓細胞を用いた免疫賦活効果ＲＰ旧１６
４０培地に１０％ウシ胎仔非働化血清、５Ｘ１０−’Ｍ
　２メルカプトエタノールを添加し、濾過滅菌した。こ
れに１０週令のメスＤＢＡ／２系マウスの肺臓より調製
した肺臓・浮遊細胞を２．５×１０６個／　ｍ　ｌにな
るように懸濁した。それに（１）及び（３）で調製した
細菌の菌体並びに酵素分解処理物または（１）、（３）
と同様の方法で調製したクルイベラ・シトマイリア（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒａ　ｃｉｔｏｐｈｉｌｉａ）ＩＦＯ８１９
３、ヘイジェリンキア・インデイカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎ
ｃｋｉａｉｎｄｊｃａ）ＡＴＣＣ９０３７の菌体並びに
酵素分解処理物を各濃度になるように添加し、３７°Ｃ
・５％ＣＯ□インキュベータ内で４日間培養した。培養
後、培養上清を１％のウシ血清アルブミンを含んだ０．
０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，１）で１ｏｏｏ倍に
希釈したのち、ＥＬＩＳＡ法によって培養液中に生産さ
れた総マウスｒｇＭ量を測定することによって各添加調
製物の免疫賦活効果を測定した。なお、免疫賦活作用効
果を検定するための標準物質としては、病原大腸菌由来
のリポ多糖（ＬＰＳ）を用いた。

その結果を第１図に示した。

第１図は各局の殺菌処理菌体とその酵素分解処理物のマ
ウスＩｇＭ・抗体産生との関係を示したものである。同
図において横軸は添加濃度（８８７ｍりを示し、縦軸は
肺臓培養細胞の培養液中に産生された総マウスＩｇＭの
濃度（μｇ／ｍｆｆ１）を示す。破線は殺菌処理菌体を
添加した場合、実線は酵素分解処理物を添加した場合で
ある。

第１図から明らかなように、本発明のバチラス・サチラ
スＡＴＣＣ１３９５２、フ゛レビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムへＴＣＣ１３０６０、エセリシア・コ
ライＡＴＣＣ８７３９、ラクトバチラス・アシドフィラ
スＡＴＣＣ，４３５６、ストレブトコ・マウス・ザーモ
フィラスＡＴＣＣ１９９８７、ストレプトマイセス・タ
ナシェンシスＡＴＣＣ１５２３８の酵素処理物の抗体産
生能は殺菌菌体の場合に比べ高い傾向が認められ、いづ
れもＬＰＳでの抗体産生の最大値（１５０μｇ／　ｍ　
Ｉ！、　）を上まわる高い活性を示し、優れた免疫賦活
効果を有していることがわかる。

実施例２ （１）細菌病予防・治療剤含有飼料の調製ニジマス稚魚
用の配合飼料を表−１の組成で配合し、実施例−１で調
製したブレビバクテリウムラクトファーメンタム菌体の
殺菌及び機械分解、酵素分解処理物を０．１．１重量％
添加した。得られた配合物を常法によりペレット状に成
型してニジマス稚魚用飼料を得た。

表−１ニジマス稚魚用配合飼料の組成 第一１　つづき 原　　料　　小麦粉　ビール酵母　ビタミン　八−り飼
料用油 （２）ニジマスのビブリオ病に対する効果ニジマス稚魚
（平均体重２．０　ｇ　）に、前項で調製した菌体の殺
菌及び機械分解、酵素分解処理物含有飼料にビブリオ菌
（Ｖｉｂｎｉｏ　Ａｎｇｎｉｌｌａｒｕｍ）　　５×１
０−７個／飼料１００ｇを添加して与え、水温２０°Ｃ
で通気下３０日間飼育した。

ニジマス稚魚は５００１の水槽に各１００匹として飼育
し、比較例として菌体の酵素分解処理物を加えないビブ
リオ菌添加配合飼料を与えた。

３０日飼育後の生存率を表−２に示した。

表−２ニジマスビブリオ病に対する効果機械処理物　　
　　　１　　　７５ 酵素分解処理物　　　１　　　９０ ０、１　　　　６０ 比較例　　０１０ 菌体の分解処理物を与えることにより、ニジマスのビブ
リオ病に対する予防・治療効果が明らかに示された。

〔発明の効果〕

本発明の細菌菌体の殺菌処理物、機械的破砕もしくは酵
素処理物は、魚類、甲殻類の細菌病予防治療剤として有
用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は各局の殺菌処理菌体とその酵素分解処理物のマ
ウスＩｇＭ・　抗体産生との関係を示すグラフである。 第１図 ″リネパクテリウ”°　　　　　　エセリツア、、ライ
グルタミカム 調製物添加量（Ｐｇ／ｍｌ） ストレプトマイセス・　　　　　　ＬＰＳ４　　２（Ｊ
　　ＩＵ（ＪＩＬｌ［Ｊ　　　　　　　　　　（Ｊ、４
　　　Ｚ　　　ｌ［Ｊ　　ｅｔＪ手続補正書 平成４年１月２１日 １、事件の表示 平成２年特許願第３２４７６０号 ２、発明の名称 魚類、甲殻類の細菌病予防治療剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　東京都中央区京橋−丁目１５番１号５、補正に
より増加する請求項の数　　なし６、補正の対象　　発
明の詳細な説明の欄７、補正の内容 ■第１４頁全文を次の文に訂正する。 表−１つづき 原料　　小麦粉　し−ル酵母　ビタミン　飼料用油−Ｄ 配合組成　２２．０　１０．０　　　３．０　　４．５
（重量％） （２）ニジマスのビブリオ病に対する効果ニジマス稚魚
（平均体重２．０ｇ）に、前項で調製した菌体の殺菌及
び機械分解、酵素分解処理物含有飼料にビブリオ菌（Ｖ
ｉｂｒ＋ｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）５×１０７／飼
料１００ｇを添加して与え、水温２０℃で通気下３０日
間飼育した。 ニジマス稚魚は５００リツトルの水槽に各１００匹とし
て飼育し、比較例として菌体の酵素分解処理物を加えな
いビブリオ菌添加配合飼料を与えた。 ３０日飼育後の生存率を表−２に示した。 ■第１５頁下から第９行目の後に次の文を加入する。 実施例３ （１）エビの細菌病予防治療剤含有飼料の調製ブラノク
タイガー用の配合飼料を、表−３の組成で配合し、実施
例１で調製したバチラス・サチラス菌体及びプレビバク
テリウムラクトファメンタム菌体の殺菌及び機械分解、
酵素分解処理物を０．０１〜１重量％添加した。得られ
た配合物を常法によりペレット状に成型してブラノクタ
イガー用飼料を得た。 表−３ブラノクタイガー用配合飼料の組成原料　　　　
　　配合割合（重量％） 米ぬか　　　　　　　　６ 米澱粉　　　　　　　　３．５ 小麦粉　　　　　　　２０ 小麦グルテン　　　　　５ エビミール　　　　　１０ イカミール　　　　　　５ 大豆粕　　　　　　　１０ 魚粉　　　　　　　　３０ イカ肝油　　　　　　　２ レンチン　　　　　　　１ ビタミン混合物　　　　１ ミネラル混合物　　　　５ ゼオライト　　　　　　１．５ 合計　　　　　　　１００ （２）ブラックタイガーのビブリオ病 に対する効果 ブラノクタイガー（平均体重　１．１ｇ）に、前項で調
製した菌体の殺菌及び機械分解、酵素分解処理物含有飼
料にビブリオ菌（Ｖｉｂｒｊ。 ａｎｇｕＮＩａｒｕｍ）　５　ｘ　１０７個／飼料１０
０ｇを添加して与え、水温２７℃で通気下８週間飼育し
た。 ブラソクタイガーは４５リツトルの水槽に各１５尾収容
して飼育し、比較例として菌体の処理物を加えないビブ
リオ菌添加配合飼料を与えた。 ８週間飼育後の生存率を表−４に示した。 表−４ブラックタイガービブリオ病に対する効果 添加物と添加量　　　　　８週間後生存率（重量％）　
　　　　　　　（％） ｌビチルス　　　フ゛レヒ゛へ″クテリウムサチラス　
　　　　ラクトフＴメンタム閑体殺菌処理物　０．１　
　　４０　　　　４５機械処理物　　　０．１　　　７
０　　　　７５酵素分解処理物　１　　　　’　　７５
　　　　８００．０１　　６０　　　　６５ 比較例　　　　　−１５ 菌体の各種分解処理物を与えることにより、′ブラック
タイガーのビブリオ病に対する予防、治療効果が明らか
に示された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチラス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
   リウム属、エセリシア属、ラクトバチラス属、ストレプ
   トコッカス属、ストレプトマイセス属又はビフィドバク
   テリウム属に属する細菌の菌体の殺菌処理物、該細菌の
   菌体を機械的破砕処理もしくは酵素分解処理を行うこと
   によって得られる細胞破砕物および該細胞破砕物を分画
   して得られる細胞壁成分含有物のうち少なくとも１種を
   含有することを特徴とする魚類、甲殻類の細菌病予防治
   療剤。 ２、請求項１記載の細菌病予防治療剤を含む魚類、甲殼
   類用飼料。