JPH04197192A - キシロースおよびその還元物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は、キシロースおよびその還元物の製造方法に関
し、更に詳細には、バガスを原料とした純度の高いキシ
ロースおよびその還元物であるキシリトールの効率的な
製造方法に関する。

〈従来の技術〉 従来からキシロースまたはキシリトールは、綿実殻、木
材（例えばシラカバ等の広葉樹）、トウモロコシの芯等
のキシラン含量の高い植物を原料として製造されている
。

バガスを原料としてキシロース又はキシリトールを製造
する技術は、■特開昭４９−５５８５６号公報等に紹介
されている。

また、工程中に混入してくるキシロース以外の不要の糖
を除く方法に関し、キシロースおよびキシリトールの製
造あるいはフラクトオリゴ糖高含有物の製造において、
特定の酵母および乳酸菌を用いてヘキソース、特にグル
コースを減少させる方法が知られているが（特公昭５０
−１３７６８号公報、ｒｌ１２９０の化学商品、化学工
業日報社（１９９０）ｐ、１１８７Ｊ　、特開昭６２−
１４７９２号公報）、アラビノースの除去についての記
載はない。

一方、バガスを原料として純度の高いキシロースを製造
する方法も報告されている（■「吉積智司、食品工業、
３下、３９〜４３．１９７１Ｊおよび■「水口純、大橋
實、層化、２４．２１９〜２２２．１９５０Ｊ参照）。

〈発明者が解決しようとする課題〉 しかしながら、バガスを原料としてキシロース又はキシ
リトールを製造するには、課題が残されていた。例えば
、バガスを原料として上述■の方法によりキシロースを
製造しようとした場合、バガスはその構成糖としてキシ
ロース以外の糖を多く含むため、酸分解液中にキシロー
ス以外のグルコース、アラビノース等の種々の糖が多く
抽出される。これらの糖の除去は通常の種々のクロマト
グラフィーなどの機械的方法では繁雑で難しく、また、
除去のためには多大な費用を要するので、この方法によ
るキシリトールの製造は困難である。

また、上述■および■の方法は、キシランを高純度で抽
出したり、混入してくる上記のような他の糖類を除去す
るために、アルカリ等による抽出や再結晶化あるいは溶
媒を用いた結晶化等を採用しており、費用あるいは手間
の面で満足できる方法ではない。

〔発明の概要〕

く要　旨〉 本発明は、上述の問題を解決してバガスから純度の高い
キシロースを効率良く製造し、そのキシロースを還元し
てキシリトールを製造することを目的とするものである
。

本発明者らは、バガスを原料として特定の工程、特に従
来キシランの抽出に使用されていた爆砕または蒸煮、を
不純物の抽出・除去工程として採用し、またグルコース
、アラビノース等の種々の不要の糖類を微生物によって
分解・除去することにより効率的にキシロースが得られ
ること、このキシロースから従来の還元によって容易に
キシリトールが得られることを見出し、この知見をもと
に本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明によるキシロースの製造方法は、下記
の工程（１）〜（４）を逐次的に実施すること、を特徴
とするものである。

（１）　　バガスを爆砕または蒸煮する第１工程、（２
）　　ｊｉ１１工程で得られた残渣を酸加水分解する第
２工程、 （３）　　第２工程で得られた酸加水分解液をアルカリ
で中和する第３工程、および （４）　　第３工程で得られた中和液中のキシロース以
外の糖類を微生物によって発酵させる第４工程。

また、本発明によるキシリトールの製造方法は、上記の
ようにして得られたキシロースを還元すること、を特徴
とするものである。

く効　果〉 本発明によれば、第１工程における爆砕または蒸煮によ
って不純物を除くことにより、従来使用されていた不純
物の抽出・除去のためのアルカリあるいは酸等の薬剤費
が不要となっただけでなく、このための操作時間を短縮
することができる。

マタ、第４工程で微生物を用いてグルコース、アラビノ
ース等の不要な糖類を除くことにより、キシロース純度
が高まり、従来必要とされていた再結晶化や溶媒を用い
た結晶化が不必要となる。

従って、本発明による製造方法によって、バガスを原料
として利用して純度の高いキシロースおよびキシリトー
ルを効率よく製造することが可能となった。

〔発明の詳細な説明〕

本発明によるキシロースの製造方法は、工程（１）〜（
４）、すなわち （１）　　バガスを爆砕または蒸煮する第１工程、（２
）　　第１工程で得られた残渣を酸加水分解する第２工
程、 （３）　　第２工程で得られた酸加水分解液をアルカリ
で中和する第３工程、および （４）　　第３工程で得られた中和液中のキシロース以
外の糖類を微生物によって発酵させる第４工程、 の４つの工程を逐次的に実施することを特徴とするもの
であることは前記した通りであり、原料としてのバガス
を爆砕または蒸煮することによって不純物を可溶化して
必要な残渣を得た後、この残渣を酸加水分解処理してキ
シロースを含有する抽出液を得て、この抽出液について
適当な微生物によってキシロース以外の不要な糖を発酵
分解させてこれを除去することにより、キシロースを得
ることを基本原理とするものである。

■）キシロースの製造 （１）原料 本発明で言うバガスとは、サトウキビの茎からショ糖を
搾り取った搾り粕のことである。具体的には、例えば、
サトウキビから向流抽出により、ケインジュースを搾り
取った粕のことであり、砂糖工場において、通常水分約
５０％の状態で得られるものである。

（２）第１工程 上記したようなバガス（通常水分約５０％）を適当な条
件下で爆砕または蒸煮することにより、大幅なキシラン
の損失なしに不純物を可溶化し、必要な残渣を得る工程
である。この処理条件が強すぎると、すなわち高圧力で
長時間の処理条件では、キシランの分解が進むことによ
って後の工程で得られるキシロースの収率が低下し、ま
た、弱すぎると、すなわち低圧力で短時間の処理条件で
は、不純物の除去が不十分となり、キシロースの純度が
低くなる。

本発明における爆砕とは、処理対象物（すなわち、バガ
ス）を高温、高圧の水蒸気中に一定時間保持した後、−
気に大気圧下に放出して化学的・物理的に処理する方法
であり、その操作条件は水蒸気圧（温度は水蒸気圧によ
り一義的に決まる）と保持時間で決定される。爆砕の好
ましい処理条件は、水蒸気圧が５〜２８ｋｇ／ｃ−で保
持時間が３０秒〜２０分であり、より好ましくは水蒸気
圧が５〜１５ｋｇ／ｃ−で保持時間が１〜１０分である
。

このような好ましい処理条件を設定することにより、キ
シラン分解の過度の進行によるキシランの損失を小さく
してかつ不純物を抽出除去でき、その後の工程で得られ
るキシロースの収率あるいは純度をより高めることがで
きる。爆砕の一般的な記載、および爆砕を利用したキシ
ラン抽出を経てのキシロースの製造については、「棚橋
光彦、樋口隆昌、高分子加工、３２、ｖｏｌ、１２．５
９５〜８０３　、１９８３Ｊを参照することができる。

　　　゛また、本発明における蒸煮とは、処理対象物を
高温、高圧の水蒸気中に一定時間保持した後、緩やかに
大気圧まで減圧する方法である。これの爆砕との違いは
、蒸煮では高圧水蒸気を一気に大気圧下に放出しない点
であり、その操作条件は爆砕同様に蒸気圧（温度は水蒸
気圧により一義的に決まる）と保持時間で決定される。

蒸煮の好ましい処理条件は、水蒸気圧が２〜１５ｋｇ／
ｃｄで保持時間が５〜８０分であり、より好ましくは水
蒸気圧が４〜８　ｋｇ　／　ｃ−で保持時間が１０〜６
０分である。

このような好ましい処理条件を設定することにより、爆
砕の場合と同様にキシラン分解の過度の進行によるキシ
ランの損失を小さくし、その後の工程で得られるキシロ
ースの収率あるいは純度を高めることができる。蒸煮の
一般的な記載については「食品設備実用総覧編集委員会
編、食品設備実用総覧、■産栄調査会出版部（１９８１
）　Ｐ、１１４〜１１５）Ｊを参照することができる。

望ましくは上述のような処理条件で爆砕または蒸煮した
後、遠心分離機、濾過機などにより固液分離し、さらに
必要に応じて加水洗浄して、不純物を除去することによ
り、必要なキシランを高純度で含む残渣を得ることがで
きる。

（３）第２工程 これは、第１工程で得られた残渣を適当な条件下で酸加
水分解し、キシロースを含有する加水分解液を得る工程
である。

本工程において、酸加水分解条件が強すぎると、すなわ
ち酸添加量不足、高圧力、長時間の条件では、キシラン
以外のセルロース等まで分解してキシロース純度が低下
し、弱すぎると、すなわち酸添加量不足、低圧力、短時
間の条件では、キシランが十分に分解できずキシロース
収率が低下する。

酸加水分解にはこの目的に関する公知の方法が使用でき
、例えば、残渣に酸水溶液を加え、加温あるいは加温し
ながら加圧する方法が適用できる。

酸加水分解に用いる酸については特に制限は無く、たと
えば硫酸、塩酸、燐酸などの無機酸、あるいは酢酸、ク
エン酸等の有機酸が例示できるが、コストを勘案すれば
硫酸のような強酸が望ましい。

残渣への酸の添加量は、残渣乾物重量に対し、好ましく
は酸（希釈前の酸）の重量として０．２〜３０％（ν／
Ｖ）、より好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）であり
、使用の際には残渣全体に酸が行き渡る様に酸を適量の
水に溶解した希釈液として加えることが望ましい。

上記の加温・加圧は蒸煮または爆砕により行うことがで
き、その条件は蒸煮の場合は、好ましくは水蒸気圧が２
〜１５ｋｇ／ｃｊで保持時間が２０〜１２０分であり、
より好ましくは４〜８　ｋｇ　／　ｃ−で保持時間が４
０〜１００分であり、爆砕の場合は、好ましくは水蒸気
圧が５〜２８ｋｇ／ｃ−で保持時間が３０秒〜２０分で
あり、より好ましくは水蒸気圧が５〜１０ｋｇ／ｃｄで
保持時間が１〜１０分である。

望ましくは上述のような処理条件で酸加水分解した後、
遠心分離機、濾過機などを用いて固液分離することによ
り、キシロースを含む抽出液を得ることができる。

なお、この種の酸加水分解の一般的な記載は「津久井亜
紀夫、東京家政学院大学紀要、４１０゜４７〜５０　（
１９７０）、Ｊを参照することができる。

（４）第３工程 これは、第２工程で得られた抽出液にアルカリを添加し
、次の工程で微生物処理、すなわち微生物によるキシロ
ース以外の不要の糖の発酵分解、が可能なｐＨにこの抽
出液を中和する工程である。

中和にはこの目的に関する公知の方法が使用でき、例え
ば、抽出液にアルカリを加えて攪拌する方法が適用でき
る。

中和に使用するアルカリについては特に制限は無く、た
とえば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、アンモニ
ア水等が例示できる。なお、第２工程の酸加水分解で硫
酸を用いた場合には、水酸化カルシウムや炭酸カルシウ
ム等のカルシウム塩基を使用すれば、硫酸カルシウム沈
殿として硫酸イオンを除くことができるので、後述する
第４工程後に必要に応じて行う精製工程におけるイオン
交換負荷を低減することができる。

アルカリの添加量は、中和後のｐＨで規定することがで
き、そのｐＨは第４工程で微生物処理が可能なｐＨであ
れば良い。そのようなｐＨは、２．５〜７．０が好まし
く、３．５〜６．５がより好ましい。

なお、ｐＨが高すぎると、第４工程後に必要に応じて行
う精製工程における余分なイオン交換負荷の増大につな
がり、低すぎると第４工程において微生物の能力を発揮
できない。

（５）第４工程 これは、第３工程で得られた中和液中のキシロース以外
の糖を、微生物によって発酵させて除く工程である。

ここで使用できる微生物は、キシロースを資化せず、中
和液中に特に多量に含まれるグルコースまたは（および
）アラビノースを資化できる微生物であれば良く、その
ような微生物としては例えば、ビール酵母、パン酵母（
たとえば 菌が例示できる。酵母を用いた場合には、グルコースだ
けが資化されるが、乳酸菌を用いた場合には、グルコー
スの他にアラビノース等も資化できるのでキシロース純
度をさらに上げることができる。なお、不要の糖を除く
方法に関し、キシロースおよびキシリトールの製造ある
いはフラクトオリゴ糖高含有物の製造において、特定の
酵母および乳酸菌を用いてヘキソース、特にグルコース
を減少させる方法が知られているが（特公昭５０−１３
７６８号公報、「１１２９０の化学商品、化学工業日報
柱（１９９０）　ｐ、１１８７　Ｊ　、特開昭６２−１
４７９２号公報）、アラビノースの除去についての記載
はない。

微生物処理、すなわち微生物によるキシロース以外の糖
の発酵分解、の条件は、中和液に微生物を懸濁して微生
物が死滅せずに発酵を行える条件であれば良く、その好
ましい条件は下記に示されている。通常は、微生物を懸
濁した中和液を室温に静置しておくだけでこの処理は可
能である。

微生物の中和液への添加量は、微生物乾燥重量として０
．１〜１０．０％（ｖ／ｗ）が好ましく、０．３〜２．
０％（ν／Ｗ）がより好ましい。処理温度は１５〜３７
℃が好ましく、２５〜３０℃がより好ましい。処理時間
は１分〜１５時間が好ましく、１０分〜６時間がより好
ましい。

また、使用する微生物の形態は、上記のように懸濁液中
で遊離した形の他に、通常の方法によって担体に固定し
た固定化微生物の形でも可能である。

微生物添加量もしくは使用量が多すぎるとコストアップ
につながり、少なすぎると処理時間が長くなる。処理温
度が高すぎると微生物が死滅し、目的が達せられないだ
けでなく、自己消化により菌体内容物が混入し、この第
４工程後に必要に応じて行う精製工程におけるイオン交
換負荷の増大につながる。また、処理時間は短いほど良
いが、後述する処理後の菌体の分離を考えれば自ずと限
界がある。長すぎると微生物の自己消化が起き第４工程
後に必要に応じて行う精製工程におけるイオン交換負荷
の増大につながる。

なお、遊離の微生物菌体は濾過、遠心分離等の通常使用
されている方法によって除くことができ、また、微生物
により生じた物質は常法により、例えば、エタノールは
濃縮で、乳酸等の有機酸はイオン交換樹脂で除くことが
できる。

このような微生物処理によって得られた粗精製液は必要
に応じて公知の方法、例えばイオン交換、電気透析など
により精製し、純度９０〜９８％のキシロース溶液とす
ることができる。このような方法の具体例としては、例
えば、活性炭を対固形分１〜３％（Ｖ／Ｗ）添加し、６
０℃に１時間保つ活性炭処理後、カチオン交換樹脂（た
とえばアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ等）とアニオン交
換樹脂（たとえばアンバーライトＩＲＡ−６８、ＩＲＡ
−４１０等）を組み合わせたイオン交換処理を行う方法
が例示できる。このような精製方法の一般的な記載につ
いては、たとえば「（財）林業科学技術振興所編集・発
行、広葉樹バイオマス資源の変換・利用（１９８ｇ）　
９．１４８〜１６１　Ｊを参照することができる。

得られたキシロース溶液は、必要に応じて常法により結
晶化または粉末化することもできる。

２）キシリトールの製造 本発明によるキシリトールの製造法は、キシロースの製
造における第４工程で得られたキシロースもしくはキシ
ロース液を還元することによりキシリトールを得るもの
である。

キシロースの還元は常法により行うことができる。具体
的には例えば、ラネーニッケル触媒の存在下で、キシロ
ース濃度１０〜７５％、温度５゜〜２００℃、水素圧２
〜２５０ｋｇ／ｃ−の条件、を適用することによりキシ
リトールを得ることができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　：　
ＲｏｙＬ、　ｖｈｉｓｔｌｅｒおよびＭ、　Ｌ、　Ｗｏ
ｌｆｒｏｉ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、
、　ｖｏｌ、ＩＩ、　７７〜７９（１９６３）参照）。

還元によって得られたキシリトールの粗精製液は、必要
に応じてイオン交換等の通常の精製法により精製した後
、常法（たとえば、特公昭４５−３７８１７号公報参照
）により結晶化して結晶キシリトールとすることができ
る。このようにして得られたキシリトールは純度９９．
５％以上である。

また、還元によって得られたキシリトール液は、必要に
応じてイオン交換等により精製した後、常法により粉末
化して粉末状キシリトールとすることもできる。

以上述べたような本発明製造方法によれば、第１工程に
おいて、グルコース、アラビノース等の糖類が一部溶出
除去され、第２工程で得られる抽出液のキシロース純度
が上がる。さらに、第４工程で微生物によりキシロース
以外の糖類が除去され、キシロース純度が上昇する。

従って、バガスにより効率的に高純度のキシロースを得
ることができ、そのキシロースの還元により容易にキシ
リトールを製造できる。

得られたキシロースは奏産練り製品の着色改善剤や肉等
の加工等に利用できる。

また、得られたキシリトールは、輸液その他、安定剤、
賦形剤等の医薬品原料として、また、甘味料等の食品添
加物として利用できる。

〔実施例〕

実施例１ 原料として、バガス９．２６ｋｇ（乾物重量）を、第１
工程として、爆砕を水蒸気圧１０ｋｇ／ｃ−に３分間保
持する条件で行った後、可溶物を水洗除去して残渣を得
た。

第２工程として、残渣に硫酸２００ｇを水２６１に溶解
した酸水溶液を加え、水蒸気圧６ｋｇ／　ｃｊに８０分
間保持する条件で蒸煮し、抽出液１００１　（蒸煮装置
からの洗い出しに使った水も含む）を得た。

第３工程として、抽出液に水酸化カルシウムを加え、ｐ
Ｈ６，０に調整した。

第４工程として、中和液にＬａｃｔｏｂａｅｉｌｌｕｓ
　ｂｒｅ−ｖｉｓ　　（事前に乳酸菌培養に一般的に用
いられているＭＲ５培地で培養後、水洗した菌体）９０
０ｇ（乾物重量）を加え、攪拌しながら３０℃に５時間
保った後、遠心分離により菌体を除去した。

その後、活性炭１９．５ｇを加え、６０℃に１時間保っ
たのち、濾過により活性炭を除去し、アンバーライトＩ
Ｒ−１２０Ｂ　（オルガノ株式会社製）Ｈ型７１および
アンバーライトＩＲＡ−４１０（オルガノ株式会社製）
ＯＨ型１４１で脱イオン精製後、減圧下で濃縮した。

この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーで測定したと
ころ、８７９．７ｇのキシロースを含み、その固形分中
のキシロース純度は９５．０％であった。

実施例２ 実施例１で得られたキシロースを１０％濃度の水溶液と
したちの５００ｇに、市販のラネーニッケル触媒３．０
ｇを加え、内容積１１の電磁攪拌ステンレス製オートク
レーブに入れた。

これに、水素ガスを１００ｋｇ／ｃｄまで充填し、１６
０℃で２時間攪拌しながら反応させた。

触媒濾過後、濾液をアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ　（
オルガノ株式会社製）Ｈ型１２０ｍ１およびアンバーラ
イトＩＲＡ−４１０（オルガノ株式会社製）ＯＨ型２４
０ｍ１で脱イオン精製し、脱イオン液を減圧下で５８ｇ
（濃度８７％）まで濃縮し一夜放置することにより、無
色のキシリトール結晶が析出した。これを濾過・乾燥し
て、キシリトール結晶３５．ｏｇを得た。

実施例３ 実施例１の第１工程における爆砕の代わりに、水蒸気圧
６　ｋｇ　／　ｃ−に４０分間保持する条件で蒸煮した
以外は、実施例１と同様に処理し、８７０．４ｇのキシ
ロースを含む濃縮液を得た。

その固形分中のキシロース純度は９５．１％であった。

実施例４ 実施例３で得られたキシロースを５０％濃度の水溶液と
したもの５００ｇに、市販のラネーニッケル触媒１０．
を加え、内容積１１の電磁攪拌ステンレス製オートクレ
ーブに入れ、水素ガスを１００ｋｇ／ｃｄまで充填し、
１５０℃で２時間攪拌しながら反応させた。

触媒濾過後、実施例２と同様に脱イオンし、濃度８０％
まで濃縮した後、４５℃に冷却し、これにキシリトール
結晶０．１ｇを加えて２４時間で１８℃まで冷却してキ
シリトールのマスキットを得た。

次いで、得られたキシリトールのマスキットを分密する
ことにより１４２．５ｇのキシリトール結晶を得た。

このキシリトールの純度は、高速液体クロマトグラフィ
ーで測定したところ、９９．８％であった。

実施例５ 原料として、バガス９２．６ｇ（乾物重量）を、第１工
程として、水蒸気圧１０ｋｇ／ｃｄに５分間保持する条
件で爆砕後、可溶物を水洗除去して残渣を得た。

第２工程として、残渣に硫酸２ｇを水１００ｍ１に溶解
した酸水溶液を加え、水蒸気圧６　ｋｇ　／　ｃ−に６
分間保持する条件で爆砕し、抽出液２１（爆砕装置から
の洗い出しに使った水も含む）を得た。

第３工程として、抽出液に水酸化カルシウムを加え、ｐ
Ｈ６，０に調整した。

ｖｉｓ４０ｇ（乾物重量）を加え、攪拌しながら３０℃
に２時間保った後、遠心分離により菌体を除去した。

その後、活性炭０．２ｇを加え、６０℃に１時間保った
のち、濾過により活性炭を除去し、アンバーライトＩＲ
−１２０Ｂ　（オルガノ株式会社製）Ｈ型７０ｍ１およ
びアンバーライトＩ　ＲＡ−４１０（オルガノ株式会社
製）ＯＨ型１４０ｍ１で脱イオン精製後、減圧下で濃縮
した。

この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーで測定したと
ころ、９．４ｇのキシロースを含み、その固形分中のキ
シロース純度は９４．２％であった。

実施例６ 原料として、バガス９２．　６ｇ　（乾物重量）を、第
１工程として、水蒸気圧１０ｋｇ／ｃｄに３分間保持す
る条件で爆砕後、可溶物を水洗除去して残渣を得た。

第２工程として、残渣に硫酸２ｇを水２６０ｍ１に溶解
した酸水溶液を加え、水蒸気圧６　ｋｇ　／　ｃｄに８
０分間保持する条件で蒸煮し、抽出液２１（蒸煮装置か
らの洗い出しに使った水も含む）を得た。

第３工程以降は実施例５と同様に処理し、９．８ｇのキ
シロースを含む濃縮液を得た。その固形分中のキシロー
ス純度は９５．２％であった。

実施例７ 実施例６における第４工程を市販圧搾パン酵母（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　５ｅｒｅｖ１ｓ１ａｅ）　３
０　ｇ　（乾物重量）を加え、攪拌しながら３０℃に３
０分間保った後、遠心分離により菌体を除去するという
処理に変更した以外は、実施例５と同様に処理し、キシ
ロース１０．６ｇを含む濃縮液を得た。その固形分中の
キシロース純度は９０．２％であった。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（１）〜（４）を逐次的に実施すること
   を特徴とする、キシロースの製造方法。 （１）バガスを爆砕または蒸煮する第１工程、（２）第
   １工程で得られた残渣を酸加水分解する第２工程、 （３）第２工程で得られた酸加水分解液をアルカリで中
   和する第３工程、および （４）第３工程で得られた中和液中のキシロース以外の
   糖類を微生物によって発酵させる第４工程。 ２、請求項１の方法によって得られたキシロースを還元
   することを特徴とする、キシリトールの製造方法。 ３、第１工程の爆砕を、蒸気圧が５〜２８ｋｇ／ｃｍ＾
   ２および保持時間が３０秒〜２０分間の条件で実施する
   、請求項１または２記載の製造方法。 ４、第１工程の蒸煮を、蒸気圧が２〜１５ｋｇ／ｃｍ＾
   ２および保持時間が５〜８０分間の条件で実施する、請
   求項１または２記載の製造方法。 ５、第４工程の微生物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
   ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉ−ｌｌｕｓ　ｃｅｌ
   ｌｏｂｉｏｓｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｂｕｃｈｎｅｒｉからなる群から選ばれる１種または２
   種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製
   造方法。