JPH04200384A - 七面鳥ヘルペスウイルスの挿入突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は３型マレツク病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’５Ｄｉ
ｓａａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ、ＭＤＶ）に属する七面鳥ヘル
ペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｏｆＴｕｒｋ
ｅｙｓ、ＨＶＴ）の増殖に非必須な遺伝子領域に外来遺
伝子を挿入した突然変異体に関するものである。

［従来の技術］ 七面鳥ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｏ
ｆＴｕｒｋｅｙｓ、ＨＶＴ）はマレック病ウィルス（Ｍ
ａｒａｋ’５Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ、ＭＤＶ）の
発症予防用の生ワクチンとして１９７０年初めから利用
されている。

マレック病は世界中に広く分布し、鶏に脚まひ、多発性
神経炎、悪性Ｔ細胞性リンパ腫を引き起こし、わが国に
おいて鶏のもっともコストのかかる病気の一つであり、
上記ＨＶＴワクチンは、養鶏業界ではほとんどすべての
鶏に利用され、高い安全性の確認がなされているワクチ
ンである。

ところでこのワクチンは生まれて間もないヒヨコ（幼雛
）に接種され、親からの移行抗体にそれほど影響されず
強い免疫を与えることから、他の幼雛用ワクチンとの混
合使用の研究が進められている。また一方ではワクチン
接種に要する時間と人件費などのコストを軽減するため
に複数のワクチンを１回の接種ですませるという観点か
らもワクチンの混合利用の研究開発が進められている。

このような観点から研究され、提案されている従来のワ
クチンあるいは挿入突然変異体ウィルスについては以下
の様にまとめられる。

（１）マレック病ワクチン マレック病の制御はワクチン接種に大きく基づいており
、現在わが国で使用されているワクチンは３型マレツク
病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’５Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕ
ｓ、ＭＤＶ）である七面鳥ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐ
ｅｓｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｔｕｒｋｅｙｓ、）ＩＶＴ）　
［ライツタ−（ｌｉｔｔｅｒ）　、Ｒ，Ｌ、ら、アメリ
カン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（＾
ｍｅｒ。

Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅ５）、３１：５２５−５３８（１９７
０）　、オカザキ（Ｏｋａｚａｋｉ）　、Ｗ、ら、アビ
アン・デイシーズ（ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅ）　、１
４：４１３−４２９　（１９７０）］　の他に弱毒腫瘍
原性１型ＭＤＶ株［デュボアー（Ｄｅ　Ｂｏｒｅ）　、
Ｇ、Ｆ。

ら、アビアン・デイシーズ（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓ
ｅ）。

３０：２４６−２８３　（１９８６）］および２型２型
ＶとＨＶＴ　（７）混合型［ライツタ−（Ｗｉｔｔｅｒ
）　、Ｒ，Ｌ、、アビアン・バンロシー（Ａｖｉａｎ　
Ｐａｔｈｏｌ、）、１１：４９−６２（１９８２）、ラ
イツタ−（Ｗｉｔｔｅｒ）　、Ｒ，Ｌ、、アビアン・バ
ンロジー（Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ、）、１３ニア５
−９２（１９８４）］の３種類に分類される。

弱毒１型ＭＤＶはオランダを中心として使用され、２型
と３型の２価ＭＤＶワクチンはアメリカで利用されてい
る。これらのワクチンはＭＤＶの感染は阻止できないも
のの発症防御には大きく寄与している。

なお現在、ＭＤＶのワクチンはすべて生ワクチンが使用
されており、不活化ワクチンやサブユニットワクチンの
有効使用は報告されていない。

（２）挿入突然変異ウィルス 近年、ポックスウィルス属に分類されるワクチニアウィ
ルス（種痘ウィルス）に外来性遺伝子を組み込んだ組み
換えワクチニアウィルス構築法が考案され［モス（Ｍｏ
ｓｓ）　、Ｂ、とフレックスナー（Ｆｌｅｘｎｅｒ）　
、Ｃ，、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（
Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、５：３０５
−３０２４　（１９８７）］、外来性遺伝子として感染
症ウィルスの防御抗原遺伝子を用いた挿入突然変異ワク
チニアウィルスを生ワクチンとして利用する方法が提案
されるようになった［特開昭５８−１２９９７１号、特
公表昭６０−５００５１８　、特公表昭６１−５０１９
５７、特開平２−１５６８８３などコ。

しかし、遺伝子操作したワクチニアウィルスは病原性が
低下するという証拠が存在するが、ワクチンとしてそれ
らを一般的に使用することに対して、いくつかの主要な
障害がある。たとえば、ワクチニアウィルスはもともと
ヒトをはじめ多くの哨乳動物に感染性であり、異種のウ
ィルス種からの遺伝子をこの組み換え体に挿入すると、
組み換え体のワクチニアウィルスの宿主の範囲または組
織親和性が変わる危険性があり、ワクチニアウィルスと
固有の動物の痘ウィルスとの感染動物内組み換え体はヒ
トに対して毒性を回復する可能性がある。また、逆に鳥
類に対する感染性が低いことから鶏に利用するには不適
当と考えられている。

そこで同じポックスウィルス属のアビポックスウィルス
（鶏痘ウィルス）が同様に部用に外来遺伝子を挿入でき
るように構築されるようになった［ホイル（Ｂｏｙｌｅ
）　、Ｂ、Ｄ、とクーパー（Ｃｏｕｐａｒ）　、Ｅ、１
１．Ｂ、、ハイラス・リサーチ（ＶｉｒｕｓＲｅｓ、）
　、１０：３４３：３５６　（１９８８）、ティラー（
Ｔａｙｌｏｒ）　。

Ｊ、ら、ジャーナル・オブ・ピロロジー（Ｊ、Ｖｉ−ｒ
ｏｌ　、）　、　６４　：１４４１−１４５０　（１９
９０）　］、このことによりヒトに安全で鶏に有効な組
み換え生ワクチンへの道が開けつつある。

またポックスウィルス属以外でもヘルペスウィルス属を
用いた挿入突然変異体の構築が同様に組み換えワクチン
を目的に考案されている［特開平２−３５０７９など］
。遺伝子挿入突然変異体ウィルスをベクターとして用い
て外来遺伝子を産生させるためだけの構築例はすでに膨
大な数の報告例があるが、ＨＶＴ変異体をベクターとし
て構築した例は知られていない。

［本発明が解決しようとする課［１ ワクチニアウィルスに基づくウィルスベクターを用いた
場合、鶏の病原体からの保護は挿入した病原体遺伝子に
限られる。また、この病原体に対する免疫付与能がワク
チニアウィルスが鶏ではほとんど増殖しないために弱く
、逆にヒトをはじめ多くの哨乳動物に感染することから
、強毒株の再生または免疫不全者に対する危険性があり
、安全性には問題がある６ 鶏に対して効果的でヒトに対して安全といわれるアビポ
ックスウィルス（鶏痘ウィルス）に基づくウィルスベク
ターにはアビボックス自身の強い免疫付与効果により生
涯でほとんど１度しかワクチンとして利用出来ないとい
う欠点がる。

また、養鶏業界にとってマレック病の予防はほとんど必
須なのに対してアビボックス感染症の予防はそれほど行
なわれていない。このことは経済的に省力化を進める養
鶏業者にとって不要のワクチン接種を強いることになる
。

以上のような問題点を鑑み、本発明の目的は、）ＩＶＴ
変異体をベクターとして構築し、マレック病から鶏を保
護するばかりか、挿入する遺伝子を感染症の防御抗原遺
伝子とした場合にはこの感染からも鶏を保護する有効な
手段を提供するものである。

また、他の目的は鶏の病気の治療、または鶏の成長速度
、肉質、卵の質、太きさや数の改善、改良をする目的で
鶏の体内で有効な物質を組み替えＨＶＴを使って発現す
ることである。

［課題を解決するための手段］ そこで本発明者は、かかる従来技術の下で、マレック病
の生ワクチンであるＨＶＴの外来遺伝子挿入変異体を誠
意研究を重ね構築し、その挿入遺伝子が感染細胞中で産
生されることを見い出した。

かくして本発明によれば、外来遺伝子を、好ましくはプ
ロモーター機能を有するＤＮＡと供に、）ＩＶＴの増殖
に非必須な遺伝子領域に遺伝子発現の可能な形で組み込
まれた組み換えＨＶＴが提供され、さらに鶏にワクチン
として用いることで、マレック病に対する免疫と外来遺
伝子産物に対する免疫の両方を鶏に付与させる方法が提
供される。

本発明において挿入突然変異体の作製に供されるウィル
スは３型マレツク病ウイルスに分類されるウィルスであ
れはいかなるものでもよく、例えばｊｃ１２６株［ライ
ツタ−（Ｗｉｔｔｅｒ）　。

Ｒ，Ｌら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヘテリナリ
ー・リサーチ（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）　、
旦：５２５−５３８　（１９７０）　］、ＡＣ１６株、
ＡＣ１８株、ＷＴＨＶ−１株［カワムラ（Ｋａｗａｍｕ
ｒａ）　、Ｈ，ら、アビアン・デイシーズ（Ａｖｉａｎ
　Ｄｆｓ、）、１３：８５３−８６３（１９ｆｔ９）コ
、６２株、０１株［オノ（Ｏｎｏ）、に、ら、日本獣医
学雑誌、　３６：４０７−４２０（１９７４）］　など
が例示される。

本発明において供される外来遺伝子は、公知の方法によ
り人工合成されたもの、ＲＮＡから逆転写して得られた
ｃＤＮＡ、遺伝子から制限酵素等を利用して切り出され
たＤＮＡ断片、ポリメラーゼチエイン反応等により増幅
させたもの、また未加工のＤＮＡなどいかなる由来のも
のでも、いかなるものをコードしていてもよい。

本発明を実施するに当たっては、まずＨＶＴの増殖に非
必須な遺伝子領域を組み込んだ第一の組み換えベクター
で作製される。同領域内にＨＶＴで機能するプロモータ
ーが含まれているものが好ましい。ここで言う増殖に非
必須な遺伝子領域とは、たとえばＨＶＴのＡ抗原（ｇＡ
）遺伝子、チミジンキナーゼ（丁Ｋ）遺伝子など、外来
遺伝子の挿入による変異を受けても実買上ウィルスの増
殖に影響を及ぼさない領域を言う。

また、ＨＶＴ内で機能するプロモーターとは、合成・天
然を問わすＨＶＴが保有するＲＮＡ転写の系でプロモー
ターとして有効に機能しえるものならいかなる塩基配列
のものでも良く、その具体例としてはＡ抗原（ｇＡ）を
コードする）ＩＶＴ遺伝子のプロモーター、チミジンキ
ナーゼ（τＫ）をコードするＨＶＴ遺伝子のプロモータ
ーなどが例示される。用いられるベクターの具体例とし
てはｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１８．ｐＧＥＭ３ノどのプラ
スミツト、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ
、ｐＨＣ７９などのコスミッドが例示される。

本発明においては、ついで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの制御下に外来遺伝子を公知の方法に従っ
て挿入し、第二の組み換えベクターか作製される。例え
ば、第一のベクターのプロモーターの下流に予め設けら
れた制限酵素切断点を利用して外来遺伝子を挿入すれば
よい。これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に
当たっては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良
く、使用するベクターも目的に応じて適当なものである
限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、予め）ＩＶＴを感染させた動
物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入するか、も
しくは、ＨＶＴ遺伝子ＤＮＡと第二の組み換えベクター
を動物細胞に同時に移入し、ベクターＤＮＡとＨＶＴ遺
伝子ＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせ、１（ＶＴの
挿入突然変異体を構築することかできる。このとき実験
に供する第二ベクターに含まれる外来遺伝子を組み込ん
だＨＶＴの増殖に非必須な領域だけを切り離して、この
当該領域ＤＮＡだけを用いて動物培養細胞に移入させる
ことかでき、場合によっては、こちらの方か効率よ（Ｈ
ＶＴの挿入突然変異体を構築することかできる。ここで
用いる動物培養細胞とはＨＶＴか増殖可能なものであれ
ばよく、その具体例として、例えば鶏胚繊維芽細胞（Ｃ
ＥＦ）、ウズラ胚繊維芽細胞（ＱＥＦ）、鶏腎細胞（Ｃ
に）などが例示される。

ＨＶＴ挿入突然変異体を構築するに当たっては公知の方
法に従えばよく、例えば、ＨＶＴを感染させたＣＥＦに
第二のベクターから切り離した外来遺伝子を組み込んだ
ＨＶＴに非必須な領域ＤＮＡを電気パルス法または燐酸
カルシュラム共沈法により移入させ、得られる挿入突然
変異体ウィルスを含むウィルス集団を再びＣＥＦに希釈
して感染させ、当該ＤＮＡをプローブとするハイブリダ
イゼーション法を利用するか、あるいは当該ＤＮＡがコ
ードする蛋白質に対する抗血清を用いるイムノアッセイ
を利用しスクリーニングすればよい。この他にも、薬剤
耐性、選択培地の使用による選択手段も可能であるが、
どういった手法を使用するかについては挿入に使用する
外来遺伝子に依存している。

構築された組み換えＨＶＴは外来遺伝子を発現し、この
外来遺伝子として鶏の病原体の感染防御遺伝子を用いた
場合にはマレック病とこの病原体感染症の両方の防御抗
原を産生ずる組み換えＨＶＴが得られる。鶏の病原体の
感染防御遺伝子の具体例として、鶏ニューカッスル病ウ
ィルス（ＮＤＶ）のヘムアグルチニン・ニューラミダー
ゼ（ＨＮ）遺伝子とフュージョン（Ｆ）遺伝子、鶏伝染
性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）のスパイク（Ｓ）遺伝子
、鶏伝染性ファブリシラス嚢病ウィルス（ＩＢＤＶ）の
ＶＰ２遺伝子などが例示される。

［発明の効果コ かくして本発明によれば、ＨＶＴの増殖に非必須な遺伝
子領域に発現可能な形で組み込まれた外来遺伝子を有す
る組み換えＨＶＴが得られる。

これは部用ワクチンとして利用可能であり、さらに外来
遺伝子として、鶏にとって有害な感染症の防御抗原をコ
ードする遺伝子を用いることで、さらに２価ワクチンと
しての効果が期待できる。この組み換えＨＶＴワクチン
は幼雛に親からの移行抗体に妨げられることなく免疫を
付与することから、）ＩＶＴとこの感染症を単独に接種
する場合に比べて、より大きなワクチン効果を期待でき
る。

また、一方では）ＩＶＴは鶏に生涯にわたって保持され
ることから、鶏の病気の治療、または鶏の成長速度、肉
質、卵の質、大きさや数の改善、改良をする目的で鶏の
体内で有効な物質を発現させる外来遺伝子を用いれば、
この組み換え１（ＶＴを使って有効な物質を発現させる
ことが可能である。

［実　施　例］ 以下に本発明を図面に示す実施例に基づいて説明する。

実施例１ （１）　）ＩＶＴ　ノ遺信子ＤＮＡの分離ＨＶＴ、Ｈ２
株を鶏胚繊維芽細胞に感染させ、イーグルＭＥＭ　　に
ラスイ社製）に５％牛血清を含んだ培地中に３７度、５
％炭酸ガス存在下で培養した。３日後に細胞を採取し、
本発明者らによる方法［加ｆｌｉ（にａｔｏ）、Ａ、ら
、ジーン（Ｇｅｎｅ）８４：３９９−４０５（１９８９
）］　ニ従って）ＩＶＴ　（７）遺伝子ＤＮ−Ａを得た
。

ＨＶＴＡ抗原（ｇＡ）遺伝子を含むＨＶＴ　Ｈ２株の遺
伝子ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、イガラシら
［イガラシ（Ｉｇａｒａｓｈｉ）　、Ｔ、ら、ピロロジ
ー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、　１５７：３５１−３５８
　（１９８７）］の制限酵素地図による３、７ｋｂｐの
Ｍ及び４．４ｋｂｐのに２の２断片をそれぞれ常法によ
りＩ）ＵＣｌ３　　（東洋紡社製）のＢａｍＨＩサイト
にクローニングし、それぞれｐＵｃ１８−Ｍ、ｐＵｃ１
８−に２を得た。ｐ［Ｉｃ１８−ＭはさらにＢａｍＨＩ
　とＰｓｔｌて切断し、２．０ｋｂｐのＡ断片を得、そ
れを再びｐＬｌｃＩ８のＰｓｔｌとＢａｍＨＩサイトに
クローニングしｐＨｃ−Ａ２．０を得た。一方、ｐＵｃ
１８−に２はさらにＢａｍ）ＩＩ　とＥｃｏＲＩで切断
し３．０ｋｂｐのＢ断片を得、それを、ｐＨｃ−Ａ２．
０のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトに連結し第１のクロ
ーニングベクターｐＵｃ−Ａ８５．０を得た。

ＨＶＴｇＡプロモーター位置を確認する目的でＨＶＴ、
）（２株の本発明者らによるｇＡ遺伝子領域の塩基配列
［加藤（Ｋａｔｏ）　、Ａ、ら、ジーン（Ｇｅ−ｎｅ）
　、８４：３９９−４０５　（１９８９）］　を参考に
、ｐＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＴＡＣ：ＧＣの配列を持
つ１７ｍａｒのＤＮＡをＤＮＡ合成機（ベックマン社製
）を使って、機器使用説明書に従って合成した。得られ
た、合成りＮＡはＣ１８逆相カラム（ベックマン社製）
と高速液体クロマト装置（ベックマン社製）を用いて常
法により精製した。

ＨＶＴを感染させたＣＥＦとなにも感染させていないＣ
ＥＦの両方から、塩酸グアニジン・セシウムクロライド
法によりＲＮＡを調整した。それぞれのＲＮＡを鋳型に
、１７ｍａｒの合成りＮＡをブライマーにして逆転写酵
素（生化学工業社製）を用いて常法にしたかってブライ
マー伸長反応を行った。また、一方では同じ１７ｍａｒ
をブライマーに、ｐＵｃ−ＡＢ５．０を鋳型にＴ７ＤＮ
Ａシークエンスキット（ファルマシアＬＫＢ社製）を用
いてキットの添付説明書に従フてシーフェンス反応を行
った。

この３つの反応産物を常法に従ってシーフェンスゲルを
作製して、同時に電気株動させたところ、なにも感染さ
せていないＣＥＦ由来のＲＮＡを用いた反応系にはみら
れないバンドが感染ＣＥＦ由来のＲＮＡを用いた系では
見られた。このことがらｇＡのＲＮへの転写開始点が蛋
白合成の開始点の上流５５ｂｐにあることが決定した。

転写開始点の上流３０ｂｐにはＴＴＴＡＡＡという配列
をもったプロモーター配列があることから、ここがプロ
モーターであるとした。

（４）外来゛信子が挿入された第２の組み換えべ大腸菌
のβ−ガラクトシダーゼのＬａＣ７遺伝子をプラスミツ
ドｐＭｃ１８６１　　（ファルマシアＬＫＢ社製）から
３．０　ｋｂｐのＢａｍＨＩ切断断片として得た。この
遺伝子をアミノ酸への翻訳フレームがずれないようにｇ
Ａ遺伝子の蛋白合成開始点から５４０ｂｐ下流のＢａｍ
ＨＩサイトにインフレームで結合させ、１）ＬＩＣ−Ａ
Ｂ５．ＯＺを得た。ｐＵｃ−Ａ８５．０２では翻訳はｇ
Ａから始まり、ＬａｃＺで終わるよう工夫されており、
Ａ抗原蛋白のアミノ酸末端側約１８０アミノ酸とβ−ガ
ラクトシダーゼの融合蛋白が産生されるように構築され
ている。このｐＵＣ−ＡＢ５．ＯＺで形質転換された大
腸菌はβ−ガラクトシダーゼの発色基質であるＸ−ｇａ
ｌ　　（宝酒造社製）を培地に添加すると白い菌のコロ
ニーが′青くなるので容易にスクリーニングできる。

（５）外来゛信子挿入　然　異体ＨＶＴ　（ｒＨＶＴ）
　ノ作製 １０ｃｍ直径の細胞培養用ベトリ皿にＨＶＴ　ＰＬ、染
ＣＥＦと新しく調製したＣＥＦを１０：１の割合で混ぜ
、ＤＭＥＭ培地にラスイ社製）に１０％の牛胎児血清を
添加した培地で３７度、５％炭酸ガス存在下で培養した
。翌日、浮遊細胞とＣＥＦ調製に使ったトリプシンを除
くために培地を新しいものに交換した。市販の燐酸カル
シウムＤＮＡトランスフェクションキット（ＢＲＬ社製
）を使い、ｐＨ（ニーＡＢ５．ＯＺから旧ｎｄｌｌｌ、
Ｋｐｎｌで切り出した８、０ｋｂｐ（７）　ＤＮＡ断片
（ＡＢ５．ＯＺ）を１つのベトリ皿あたり１０μｇ使用
し、キットの添付説明書に従ってホモローガス組み換え
実験に供した。

ＤＮＡをトランスフェクトした後、培養器の炭酸ガス濃
度を５％から３％に下げ、１晩後にβ−ガラクトシダー
ゼの発色基質であるＸ−Ｇａ１を培地に５０μｇ／ｍｌ
の濃度で添加し、炭酸ガス濃度を５％に戻した。すると
、２日後に青い細胞からなる感染傷害細胞（ＣＰＥ）が
得られ（第４図参照）、β−ガラクトシダーゼの発現が
酵素活性として確Ｕ、された。このＣＰＥを０，２５％
トリプシンで消化、再び新しく調製したＣＥＦと混ぜ、
再度培養することてクローニングをおこなった。

蛋白の発現を直接知る目的で、この感染細胞をスライド
グラスの上で生育させ、２日後に５分間メタノールで固
定し、市販のマウス抗β−ガラクトシダーセモノクロー
ナル抗体（ベーリンガーマンハイム社製）と生理燐酸緩
衝液（ＰＢＳ）中、３７度で１時間反応させた。その後
、反応液をＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳで希釈したイソチア
ン酸フルオレセイン（ＦＩＴ（：）で蛍光ｍ識されたウ
サギ抗マウス抗体を再び３７度、１時間反応させた。反
応液をよ＜　ＰＢＳで洗浄後、８０％無蛍光グリセリン
（和光純薬製）　／ＰＢＳをスライドグラスに滴下して
、カバーグラスをかけた後、落射蛍光顕微鏡（オリンパ
ス社製）で観察した。Ｘ−Ｇａ１を用いたβ−ガラクト
シダーゼの活性染色時と同様にＣＰＥに蛍光が認められ
（第５図参照）　、　ｒＨＶＴが融合β−ガラクトシダ
ーゼを産生じていることを免疫学的に確認した。

（７）　ｒＨＶ７の構築の確認 さらに、［ｌＮＡ　レヘルて組み換えが起ぎていること
を確かめる目的で、サザンハイプリダイセーションを試
みた。まず、１０ｃ＋ｎ径のベトリ皿１枚からｒＨＶＴ
感染細胞を０．２５％トリプシン消化し、１５００回転
、５分の遠心により細胞を集めた。集めた細胞は０．５
ｍｌの０．０１ｍＭ　ＥＤＴ八、１％ＳＤＳ　　（ラウ
リン硫酸ナトリウム）、１０ｍＭトリスＭ？ｆｌ液（ｐ
ｌ（８，５）　　に浮遊させた後、Ｉμｓ／ｍｌになる
ようにプロティナーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社製
）を添加し、５５度で１晩反応させた。反応後、核酸を
フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロ
ロホルム抽出した後、１９ゲージの注射針から何度も溶
液を押し出すことでＤＮＡを物理的に断片化させた。

断片化させたＤＮＡに２倍量のエタノールを加え、−８
０度に１５分間装いた後、１５０００回転で１０分遠心
して、核酸を沈澱として回収しｒＨＶＴ遺伝子検出用プ
ローブとした。常法に従って、プローブをブロッティン
グしたニトロセルロース膜と混ぜ、ササンハイブリダイ
ゼーションを５０％ホルムアミド存在下４２度で１晩行
った。ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロース膜
を５０度、０．２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶ン夜中マ
ン夜中間の洗いを３回行った。洗浄後、ニトロセルロー
ス膜をビニール袋で覆い、オートラジオグラフィーを行
フた（第６図参照）。

オートラジオグラフィーの結果、それぞれの制限酵素地
図（第７図参照）に対応して特異的サイズのバンドが認
められた。このことにより、ｒ）ＩＶＴがホモローガス
組み換えの結果、正しく構築されていることが示された
。以下に、ｒＨＶＴの核酸の塩基配列を示す。

ｍｎ　　　　　　フ１フｎ　　　　　　７Ｌｌｎ　　　
　　　７１１ｆ’ｌ　　　　　　フ＋５０　　　　　２
１６０彫形彰形形形彬％彫Ｚ彬形影形彫形彰形彩形彫形
彫形形形彰形形形形形影彰彫影彰彰形形ＣＧ（：ＧＧＧ
Ｇ（：ＣＡＣＡＣＴＡＧＴＡＴＣＣＡ［：ＡＡＴ八八へ
へＣＧ’ｒＣららＡＡＡＧＴＣＴＧ＆ＡＣ：ＴＣＧ＾八
ＴＣへＣＣＴb（：Ａ Ａ’１７ｒｌ　　　　　　　　４フＩｌｌ’ｔ　　　　
　　　ＡフＱｎ　　　　　　　４１０［１４３１０４３
２０ＣＡＧＩ；ＧＡＣ［；ＣＡＧＧＣｆ；ＴＵｉ’Ａ＾
［ｉｒＡしし八Ｔ［ｉＴｌ；ｉ”ｒ［；ＣＡＴ［；八ｌ
”ｒ八［ｉＡ［ｉへｌ’Ｇ［；［G［；［ｉ［；１ｉＴ
ｌｉ−１’Ａ比１１

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例における第１の組み換えベクタ
ーの構築手順を示したものである。 ＨＶＴの遺伝子ＤＮＡは上段に模式的に表してあり、長
方形（ロ）の部分はヘルペスウィルス属に特徴的なりＮ
Ａの繰り返し構造部分を示している。Ａ抗原遺伝子（ｇ
Ａ）部分は下段左側に網掛けの長方形として示した。使
用した制限酵素は一部、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：Ｐｓｔｌの様に略して記
しである。 第２図（ａ）は、ブライマー伸長法にて表れたＤＮＡの
バンド（ＨＶＴ）及び同じブライマーを用いたＨＶＴＤ
ＮＡのシーフェンスラダー（＾：アデニン、Ｇニゲアニ
ン、Ｔ、チミン、Ｃ：シトシン）を表した電気泳動の写
真である。ブライマー伸長法によって表れたバンド（開
始点）はブライマーから９６番目のＣと一致している。 第２図（ｂ）は塩基配列とアミノ酸配列の一部を示した
もので転写開始点を＋１として番号がふっである。第２
図（ｂ）中、用いたブライマ一部分を矢印で囲い、開始
点上流のプロモーター配列（ＡＡＡＴＴＴ）をアンダー
ラインで示した。 第３図は本発明の組み換えベクターの構築手順を示した
ものである。β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）
は斜め線の長方形、Ａ抗原遺伝子（ｇＡ）は網掛けの長
方形として示しである。使用した制限酵素は一部、Ｂ：
ＢａｍＨＩ、Ｅ：ＥｃｏＲｌ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ
：Ｐｓｔｌの様に略して記しである。 ′ｆＳ４図は生物の形態を表わした写真であり、組み換
えＨＶＴ感染細胞においてβ−ガラクトシダーゼの酵素
作用で細胞が青く呈色する様子を示したものである。感
染細胞はウィルスによる傷害作用（ＣＰＥ）によりその
形態がいちじるしく不定形となっているが、β−ガラク
トシダーゼの発色基質（Ｘ−Ｇａｌ）添加で細胞全体が
青く（写真では黒色に）染まっている。 第５図は生物の形態を表した写真であり、組み換えＨＶ
Ｔ感染細胞おいてβ−ガラクトシダーゼ蛋白質が産生き
れている様子を示したものである。感染細胞はウィルス
感染により形態が不定形となっているが、抗β−ガラク
トシダーゼ抗体と反応して蛍光（写真の中央の白色部分
）を発している。 第６図はオートラジオグラフィーを表わした写真であり
、組み換えＨＶＴのＤＮＡを用いたサザンハイプリダイ
ゼーションの結果を示したものである。図中、ＤＮＡの
切断に用いた制限酵素ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＡａｔＩＩ
、ＮｃｏＩはそれぞれＸ、Ｐ、Ａ、Ｎと略して記しであ
る。得られたＤＮＡ断片の長さは左側にキロベース（Ｋ
ｂｐ）で記しである。 第７図は本実施例における組み換えＨＶＴの構築様式を
示したものである。ＨＶＴの遺伝子ＤＮＡを上段に、組
み換えＨＶＴ　（ｒＨＶＴ）の遺伝子ＤＮＡを下段に模
式的に表しである。β−ガラクトシダーゼ遺伝子（１ａ
ｃＺ）は斜め線でＡ抗原遺伝子（ｇＡ）は網掛けで表し
である。図中、制限酵素の切断点をＸ：ＸｈｏＩ、Ｐ：
ＰｓｔＩ、Ａ二ＡａｔＩＩ、Ｎ：Ｎｃｏｒと略しである
。数字はＤＮＡの長さをキロベース（Ｋｂｐ）で示しで
ある。 第１図 ρＬＩ　Ｃ−Ａ　Ｂ　５．０ 第２区 （ＣＩ） ＼て 第２図（ｂ） ＲＬ　Ｔ　Ｇ　Ｗ　Ｖ　Ｇ　Ｉ　Ｆ　Ｌ　Ｖ　Ｌ　Ｓ　
Ｌ　Ｑ　Ｑ　ｌ’　Ｓ　Ｕ　Ａ第３図 ｐＵＣ−ＡＢ５．ＯＺ 第４区 （Ｑ） 第５図 （ａ） 第６図 ＰＡＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、七面鳥ヘルペスウイルスの増殖に非必須な遺伝子領
   域に外来遺伝子を挿入した組み換え七面鳥ヘルペスウィ
   ルス。 ２、該外来遺伝子がプロモーターの支配下にある請求項
   （１）記載の組み換え七面鳥ヘルペスウィルス。 ３、請求項（１）または（２）記載の組み換え七面鳥ヘ
   ルペスウィルスに、外来遺伝子を感染細胞または感染個
   体で発現させることを特徴とする七面鳥ウィルスの挿入
   突然変異体。