JPH04200400A - ヒト生体由来の試料からのウイルスゲノムの抽出法及び該ウイルスゲノムの検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒト生体由来の試料からのヒト感染ウィルスゲ
ノムの抽出法及び該ウィルスゲノムの検出法に係り、殊
にヒト　Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの抽出法及び該抽出法
により抽出されたヒト　Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの検出
法に係る。

〈従来の技術） ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは輸血に起因する肝炎の９
０−９５％を占めており、治療法も未だ確立するに至っ
ておらず、その診断法、治療法、輸血用血液中に場合に
より存在するヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを無害化する
処理剤、予防ワクチン等の開発が強く要望されている。

近年に至り、ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス自体の研究が
進み、感染には一本鎖ＲＮＡが関与するのではないかと
の報告がなされ（特開昭６２−２４９９９９公報及び同
６３−９１３２８公報）、又最近においては米国のカイ
ロン社がヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを感染させたチン
パンジーの肝臓からのｃＤＮＡをクローン化し、これを
ベクターλｇｔ　１１に組込んだ大腸菌で発現させた処
、その産物がヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス感染患者血清
と反応することを見い出した。最終的には、これが約１
００００個のヌクレオチドを有する１本鎖ＲＮＡウィル
スであってワラビウイルスに近いウィルスであることが
判明し、前記のカイロン社は、これをヒト　Ｃ型肝炎ウ
ィルス［Ｈｅｐａｔｌｔｉｓ　ＣＶｉｒｕｓ　：以下ｒ
　ＩＩＣＶＪと略記する］と命名すると共に、全ヌクレ
オチドの内の約７０００個のヌクレオチドについてのｃ
ＤＮＡ塩基配列を公表した（欧州特許公開第３１８２１
８公報）。更に、上記のカイロン社はこの遺伝子の一部
を用い酵母で発現させたポリペプチドを抗原とし、Ｆｉ
ＣＶ感染患者の血清中の抗体を測定する方法を開発して
いる。この測定法において、急性期を過ぎた頃に抗ｎｃ
ｖ抗体が出現するので、上記の測定法は、現状では、ウ
ィルス性慢性肝疾患の鑑別や診断並びに輸血用血液のス
クリーニングに適しているとされている。

ＨＣｖがクローン化されるに伴い、ポリメラーゼ連鎖反
応［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ　：以下ｒＰｃＲＪと略記する］法によるウィルス
ゲノムの検出も行われるようになった［金子等”Ｔｈｅ
Ｌａｎｃｅｔ”３３５．９１１ｉ７　（１９９０）］。

上記のＰＣＲ法とはブライマーの特異性に基いて標的Ｄ
ＮＡ遺伝子領域を１００万倍以上に増幅する方法であり
　（ウィルスゲノムがＲＮＡの場合には、ＰＣＲの実施
に先立つてＲＮＡをＤＮＡに変換しておくことが必要で
ある）、ウィルスゲノムが１コピーあれば原理的には増
幅できる高感度検出法である。従って、ＰＣＲ法は、ウ
ィルス自体の検出法としても、或は又感染後であって抗
体が産生される前の生体試料を検体として用い得る点で
有用性が認められている。

しかしながら、ＰＣＲ法は高感度検出法であるが故に、
コンタミネーション　（汚染）によって見掛は上「陽性
」として検出される場合のあることが問題となっている
。このコンタミネーションは、マイクロチューブの蓋の
開閉やピペット操作等により生じるウィルスゲノム含有
物の飛散や、増幅された標的遺伝子が実験器具や測定者
の手や衣服に付着しキャリーオーバーされることにより
生じる。

（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）慣用の
技術によれば、ＰＣＲ法を利用するものであって非常に
簡便であり且つ信頼性において優れたＨＣｖの検出法は
未だ確立されていない。

従来、ウィルスゲノムを抽出・分離するためにはグアニ
ジンイソチオンアネート、フエノーノベ尿素、クロロフ
ォルム等の蛋白変性剤及びドデシル硫酸す）　ＩＪウム
等の界面活性剤による処理が行われているが、除蛋白の
ための遠心、ウィルスゲノム含有溶液層を採取して別の
チューブに移し換えたり、更に該溶液層から処理剤を除
去するためにアルコールによりウィルスゲノムを沈澱さ
せ、次いで乾燥させる工程が必要である。これらの操作
は手間を要するので多検体を処理するには不適当である
上に、コンタミネーション発生の確率を高くする。しか
も、ウィルスゲノムが微量である場合に、アルコール沈
澱によるウィルスゲノムの回収率は低く（５０％以下）
、定量性の得られな℃１ことに大きな課題がある。

従って、本発明の主たる目的は、ウィルス感染患者、殊
にＨＣｖ感染患者由来の生体試料から、簡便なる方法で
短時間の内にコンタミネーションを生じることなくウィ
ルスゲノムを抽出する方法を提供することにある。

本発明の附随的な、但し極めて重要である最終目的は、
上記の抽出法により得られた抽出液を用いてＰＣＲ法を
実施することによりウィルスゲノム、殊にＦｉＣＶゲノ
ムを検出する簡便、迅速且つ正確な検出法を提供するこ
とにある。

（課題を解決し目的を達成する手段及び作用）本発明者
等は生体試料からのウィルスゲノム抽出法について鋭意
検討を行った結果、非イオン性界面活性剤の存在下に蛋
白分解酵素により生体試料を処理すれば、これをその＠
　ＰＣＲ法を実施するための試料として供し得ることを
見い出し、これにより従来技術の課題を解決し、上記の
主目的を達成するに至った。

この本発明による抽出法において、上記の生体試料とし
ては血清、血漿及び摘出された組織であることができ、
非イオン性界面活性剤としてはノニデットＰ−４０等を
用いることができ、又蛋白分解酵素としてはプロテイナ
ーゼに等を用いることができる。

一方、本発明の上記の附随的な目的は、非イオン性界面
活性剤の存在下に蛋白分解酵素により生体試料を処理し
、得られた抽出液中に存在する可能性のあるウィルスゲ
ノムがＤＮＡである場合にはその侭で、又ＲＮＡである
場合にはこれをＤＮＡに変換した上で、 ５　’−ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣ：ＡＣＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ−３″の塩基配列を有
するプライマーと、 ５　’−ＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ
ＡＴＡＴＧＧＴＴＣ−３’の塩基配列を有するプライマ
ー及びＴａｑポリメラーゼを含有する反応液を添加して
上記のＤＮＡに関して第１回目のＰＣＲを行い、次いで ５　’−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧ
ＡＡＣＡＡＧＧＧ−３’の塩基配列を有するプライマー
と、 ５　’−４ＴＧＣ；ＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧ
ＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ−３’の塩基配列を有するプライ
マープライマー及びＴａｑポリメラーゼを含有する反応
液を添加して第２回目のＰＣＲを行い、次いで電気泳動
を行って検出すべきウィルスゲノムの産物に相当する所
定塩基対長さのバンドが検出されるか否かを調べること
を特徴とする、ウィルスゲノムの検出法により達成され
る。

本発明者等は反応条件等について鋭意検討した処、生体
試料として血清又は血漿を用いる場合には当該試料の量
を１−２０μｍ以内に、又生体組織を用いる場合にはｌ
０ｍｇ以内に留めれば、変性蛋白の煩雑な除去処理やア
ルコール沈殿操作を必要とせず、しかも反応チューブの
交換が不要であり唯一の反応チューブ内で、ウィルスゲ
ノムの抽出、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応及びＰＣ
Ｒを行うことのできることが判明した。

尚、本発明による検出法は、グアニジンインチオシアネ
ートを用いるコムクジンスキー等の方法［ＡＢｌｙｊｌ
Ｃ３１Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”＋　Ｖｏｌ、　１Ｅ
ｉ２．　ｐａｇｅｓ１５Ｂ　−１５９（１，９８７）コ
で抽出し、ＰＣＲ法を利用してウィルスゲノム産物を検
出した場合と比較して、検出感度の点においても約１０
倍優れていることも併せて判明した。

（実施例等） 次に、実施例、試験例及び比較試験例により本発明を更
に詳細に且つ具体的に説明する。

−讃１ 実１目礪」 （ヒト生体由来の試料からのウィルスゲノムの抽出） ０．５　ｍｌ容量ののマイクロチューブに、生体由来の
試料として、ＨＣｖ感染患者の血漿１０μｍを注入し、
これに対して、１μＩの溶解液［５００ｍＭ　　）　’
Ｊスヒドロキシアミノメタンー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）、２５０ｍＭ塩化カリウム、３０ｍ１ｌｌ塩化マグネ
シウム、０．５％ノニデットＰ−４０，１０ｍｇ／ｍｌ
プロティナーゼＫを含有コを添加して混和する。次いで
、５５°Ｃで１時間、続いて９４℃で１０分間インキュ
ベートすることによりウィルスゲノム抽出液を得た。

生体由来の試料である血漿が１０μｍ以下の場合には、
ノニデッド　Ｐ−４０とブロテイナーゼＫを含有してい
ない点を除き上記溶解液と同様の溶液をを１０倍に希釈
したものを添加することにより容量を１０μｍになす。

尚、組織を試料とする場合には、組織１０ｍｇに対して
ノニデット　Ｐ−４０とプロテアーゼＫを含有していな
い点を除き上記溶解液と同様の溶液を１０倍に希釈した
ものを１０μ）添加し、以下同様にインキュベートする
。

！置皿」 （ＲＮＡからＤＮＡへの変換とＰＣＢ法によるＤＮＡの
増幅） 実施例１における場合のようにウィルスゲノムがＲＮＡ
であれば、ＰＣＲを実施する前に当該ＲＮＡをＤＮＡに
変換しおく必要性がある。この場合に、先ず実施例１で
得たウィルスゲノム抽出液１１μｌに、各２０ｐＭのプ
ライマー（後記参照）及び１４単位の逆転写酵素を含む
反応液［５０ｍ　Ｍ　ト’Ｊスヒドロキシアミノメタン
ー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、２５ｍＭ塩化カリウム、
３ｍＭ塩化マグネシウム、各２５０μ属の４種のデオキ
シリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、　ｄＤＴＦ’、　ｄＣ
ＴＰ、　ｄＴＴＰ）、２．５ｍＭジチオスレイトール、
　４０単位ＲＮａｓｊｎ］　１４μｌを添加し、４２°
Ｃで１時間インキュベーションすることにより相補ＤＮ
Ａを合成した。上記のＲＮＡと相補ＤＮＡとを含有する
この混合溶液に、５単位のＴａｑポリメラーゼを含有す
る反応液［５０ｍＭ　トリスヒドロキシアミンメタン　
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、５０ｍＭ塩化カリウム、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ゼラチンを含
有］７５μｌを添加し、９４°Ｃで３０秒、５５°Ｃで
１分、７２°Ｃで　１分を１サイクルとして、２０サイ
クルからなる第１回目のＰＣＲを行った。その後更に、
第１回目のＰＣＲ液１０μｍを別の０．５ｍｌ容量のマ
イクロチューブに移し、各２０ｐＭのプライマー（後記
参照）及び５単位Ｔａｑポリメラーゼを含有する反応液
［１０ｍＭ　トリスヒドロキシアミンメタン　−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）、５０ｎ＋Ｍ塩化カリウム、１．５
ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭの４種のデオキシ
リボヌクレオチド　（ｄＡＴＰ、　ｄＤＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ）１９０μｍを加え、第１回目の
ＰＣＲと同様の系からなり且つ３０サイクルの第２回目
のＰＣＢを行った。

次いで、電気泳動後にエチジウムブロマイド染色した処
、ＨＣＶゲノム産物に相当する所定塩基対長さのバンド
が存在することを確認した。

尚、該ＨｃＶの検出に際しては、第１図に示され且つ本
発明者等がクローン化したＨ（、ＹのｃＤＮＡ配列（特
願平１−３４４８７８）の一部をプライマーとして用い
た。即ち、第１回目のＰＣＨには、第１図の■における
２２番目から５２番目迄の配列である ５　’−ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣ：ＣＴ
ＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ−３’の配列のものと
、１７４番目から２０４０４番目迄列である ５　’−ＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ
ＡＴＡＴＧＧＴＴＣ−３″の配列を有するものが用いら
れ、又第２回目のＰ’ＯＲには、第１図の■において５
′側にＥｃｏＲ１認識部位を有する３７番目から５７番
目迄の配列である ５　’−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧ
ＡＡＣＡＡＧＧＧ〜３′の配列を有するものと、同様に
５″側にＥｃｏＲＩ認識部位を有する　１７４番目から
１９４９４番目迄列である ５′−人ＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴ
ＴＣＧＣＣＣＡＧ−３’の配列を有するものとが用いら
れた。尚、ＨＣＶゲノム産物に相当する塩基対長さは約
１８０ｂｐである。

試ＪＬ例 （ウィルスゲノムの抽出に必要なプロティナーゼＫの濃
度範囲の設定） ウィルスゲノムの抽出に必要なプロティナーゼにの濃度
範囲を求めるために、実施例１に記載のｌμｌの溶解液
中におけるプロティナーゼＫの濃度を変化させた。尚、
試料には同一の１（ＣＶ肝炎患者由来の血漿量ｌＯμｍ
を用い且つ実施例２に記載されている要領でＰＣＲによ
りウィルスゲノム産物を検出した。結果は第２図に示さ
れる通りであった。

プロティナーゼに濃度０−１０ｍｇ／ｍｌの範囲内では
、第１図の電気泳動パターンにおけるレーン番号５から
　１２で示されるように、２．５−１０ｍｇ／ｍｌの範
囲で目的とするＨＣＶゲノム産物のバンドが検出され、
プロティナーゼに濃度が５ｍｇ／ｍ１以上であれば目的
のバンドが充分検出できることが判明した。

比上Ｊ訓１列 （本発明法と従来法とにおける検出感度の比較）本発明
によるウィルスゲノムの抽出法と従来法でありのグアニ
ジンインチオシアネートを用いるコムクジンスキー等の
抽出法［”ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ　ｌｏｃｈｅｍ　１
ｓｔｒｙ”、　Ｖｏｌ、　１６２．　ｐａｇｅｓ　１５
６−１５９゜（１９８７）］を用いた場合における検出
感度を比較するために、ＨＣＶ患者由来の血漿を試料と
して用い、実施例２に示した方法でＰＣＲによりウィル
スゲノム産物の検出を行った。

第３図は、両方法でウィルスゲノムを抽出し、ＰＣＲで
の検出を比較したものである。各々同一患者由来の血漿
１０μｍを使用して検出操作を行った処、本発明方法の
場合でのみ目的とするＨＣＶゲノム産物のバンドが検出
された。コムクジンスキー等の方法で抽出を行った場合
には血漿量が１０（ｌμｌ程度又はそれ以上必要である
ことから、本発明方法は検出感度において約ｌθ倍優れ
ていることが明らかになった。

第４Ａ図及び第４Ｂ図は、両方法で同一の１２例の患者
血漿からウィルスゲノムを抽出し、ＰＣＲで得られる結
果を比較したものである。第４Ａ図が本発明方法による
場合であって、患者血漿量として１０μｍを使用し、又
第４Ｂ図がフムクジンスキー等の方法による場合であっ
て、患者血漿量として１００μｍを使用してウィルスゲ
ノムの抽出を行い、何れも実施例２に記載の要領でＰＣ
Ｒで検出した結果である。尚、同じ患者の血漿を試料と
して用いた場合については同一の番号により表示されて
いる。

これらの結果から、両方法共に電気泳動パターンのレー
ン番号１．３．４．５．７で使用した同じ患者血漿で目
的とする　ＰＣＲ産物のバンドが検出され、本発明方法
によりウィルスゲノムを抽出しても、従来法と比較して
同等又はそれ以上の信顆性を有する検出の可能であるこ
とが明かとなった。

（発明の効果） 本発明のウィルスゲノム抽出法によれば、変性蛋白の除
去処理やアルコールによる沈澱処理操作を必要としない
。従って、生体由来の試料からのウィルスゲノムの検出
に際しては、当該試料と蛋白分解酵素及び非イオン性界
面活性剤との反応に始まり、必要に応じて行われるウィ
ルスのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応及びポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）処理に至るまでの過程を連続して
唯１本の反応チューブ内で行うことができるので、操作
の簡素化がもたらされると共に、コンタミネーションの
確率を大幅に低下させることができる。

本発明の場合にウィルスゲノムの抽出所要時間は２時間
以内に短縮され、これは従来法の半分以下の時間であり
、又ヒ）Ｃ型肝炎ウィルス（Ｅ［ＣＶ）をＰＣＲ法を利
用してＦｉＣＶゲノム産物として検出する場合に、従来
法によれば２日間を要していたが、本発明方法を利用す
れば８時間以内で行うことができ、更に本発明方法は簡
便であるために検出の自動化乃至半自動化が可能である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明者等らがクローン化したヒトＣ型肝炎ウ
ィルス　（■ＣＶ）のｃＤＮＡ配列の一部（特願平１−
３４４８７８）を示したものであり、第２図はウィルス
ゲノムの抽出に必要とするプロティナーゼにの濃度を調
べるため、ＨＣＹ肝炎患者の血漿を用い、実施例２に記
載の要領でウィルスゲノム産物の検出を行った結果を示
すものであり、電気泳動パターンを模写した図面であり
、第３図は本発明方法と従来法とによりウィルスゲノム
を抽出し、Ｐｃｔ？によりウィルスゲノム産物の検出を
行い、検出感度を比較した結果を示す電気泳動パターン
を模写した図面、第４Ａ図及び第４Ｂ図は本発明による
方法と、グアニジンインチオシアネートを用いるコムク
ジンスキー等の方法［”ＡｎａｌｙｔｌｃａｌＢ　Ｉｏ
ｃｈｅｍ　１ｓｔｒｙ”、　Ｖｏｌ、　１［ｉＬ　ｐａ
ｇｅｓ　１５Ｂ　−１５９゜（１９８７）］をヒト　Ｃ
型肝炎ウィルス患者由来の血漿に、但し血漿の使用量は
本発明方法の場合がＩ／１０であるが、適用してウィル
スゲノムの抽出を行い、次いで実施例２に記載の要領で
ウィルスゲノム産物の検出を行った結果を示すものであ
り、それぞれの電気泳動パターンを模写した図面である
。 １：令仔量マーカー ２７Ｉ（ ３２１〈 ６・　　　　　　　　　　　　　　　ｏ、０１　　　・
・７：　　　　　　　　　　　　　　　０．０４　　　
・・８・　　　　　　　　　　　　　　０．１６　　　
、。 ９：　　　　　　　　　　　　　　　　０．６３　　　
。 １０：　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５　
　　　、。 １１：５．０　　　・ １２：　　　　　　　　　　　　　　　　１０１３：労
５ｆマー刀− １：分３量マー万− 幌Ａ図 第４Ｂ図 １　２３４５６７８９１０１１Ｔ２ １−１２：硬体に漿

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）非イオン性界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素に
   より生体試料を処理することを特徴とする、ヒト生体由
   来の試料からのウイルスゲノム抽出法。
2. （２）生体試料が血清、血漿及び摘出された組織から選
   択されたものであることを特徴とする、請求項（１）に
   記載のヒト生体由来の試料からのウイルスゲノム抽出法
   。
3. （３）非イオン性界面活性剤がノニデットＰ４０であり
   、蛋白分解酵素がプロティナーゼＫであり、ウイルスゲ
   ノムがヒトＣ型肝炎ウイルスゲノムであることを特徴と
   する、請求項（１）又は（２）に記載のヒト生体由来の
   試料からのウイルスゲノム抽出法。
4. （４）非イオン性界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素に
   より生体試料を処理し、得られた抽出液中に存在する可
   能性のあるウイルスゲノムがＤＮＡである場合にはその
   儘で、又ＲＮＡである場合にはこれをＤＮＡに変換した
   上で、 ５’−ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＡ
   ＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ−３’の塩基配列を有する
   プライマーと、 ５’−ＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣＡ
   ＴＡＴＧＧＴＴＣ−３’の塩基配列を有するプライマー
   及びＴａｑポリメラーゼを含有する反応液を添加して上
   記のＤＮＡに関して第１回目のポリメラーゼ連鎖反応（
   ＰＣＲ）を行い、次いで ５’−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ
   ＡＣＡＡＧＧＧ−３’の塩基配列を有するプライマーと
   、 ５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴ
   ＴＣＧＣＣＣＡＧ−３’の塩基配列を有するプライマー
   及びＴａｑポリメラーゼを含有する反応液を添加して第
   ２回目のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、次い
   で電気泳動を行って検出すべきウイルスゲノムの産物に
   相当する所定塩基対長さのバンドが検出されるか否かを
   調べることを特徴とする、ウイルスゲノムの検出法。
5. （５）生体試料が血清、血漿及び摘出された組織から選
   択されたものであることを特徴とする、請求項（４）に
   記載のウイルスゲノムの検出法。
6. （６）非イオン性界面活性剤がノニデットＰ４０であり
   、蛋白分解酵素がプロティナーゼＫであり、ウイルスゲ
   ノムがヒトＣ型肝炎ウイルスゲノムであることを特徴と
   する、請求項（４）又は（５）に記載のウイルスゲノム
   の検出法。
7. （７）生体試料として血清又は血漿を用いる場合には当
   該試料の量を１−２０μｌ以内に、又生体組織を用いる
   場合には１０ｍｇ以内に留めることを特徴とする、請求
   項（４）、（５）又は（６）に記載のウイルスゲノムの
   検出法。