JPH04202200A - 新規ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を有する新規なペプチドを提供する
ものであり、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等として
有用なペプチドに関する。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ ［従来の技術］ アンギオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンシン１．（Ａ
ｓｐ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ　−Ｉｌｅ　−Ｈ
ｉｓ　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ）に作用
して、アンギオテンシン■のＣ末端よりジペプチド（Ｈ
ｉｓ８−ＬｅｕＩｏ）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用
を有するアンギオテンシン■を生成させる酵素である。

また、この酵素は生体内降圧物質であるプラジキニンを
破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与し
ている。

従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害すれ
ば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に有
効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトグリルが合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンシン
変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天然物か
らの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンシン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることが期待されるからである。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチド。

５Ｑ２０８８＋）等や、ストレプトミセス属に属する放
線菌の代謝産物ｌ５８３　（特開昭５８−１７７９２０
号公報）が知られているに過ぎない。また、天然物を酵
素処理して得られたアンギオテンシン変換酵素阻害物質
としては、牛乳カゼインをトリプトシンにより分解して
得たペプチド類等が知られているが（特開昭５８−１ｔ
　０９４２５号、同５９−４４３２３号、同５９−’４
−４３２４号、同６１３６２２６号、同６１−３６２２
７号）新規な阻害物質の開発が望まれているところであ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副作
用の少ないアンギオテンシン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、蛋白質特にアルブミンを特定の酵素で加水
分解した組成物中にアンギオテンシン変換酵素阻害活性
を有する物質の存在をつきとめ、該物質がＡｒｇ−Ｌｙ
ｓ−Ｉ　ｌｅ−’ＬｙＳ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを骨
格とするペプチドであることを知見し、本発明を完成し
た。

本発明のＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ　
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを骨格とするペプチドは文献未載の新
規なペプチドであり、アルブミン等の蛋白質をペプシン
によって加水分解することによって製造され、実用にあ
たっては組成物をそのまま用いても良く、あるいは必要
に応じて精製して使用される。更にはペプチド合成の常
套手段を適用して合成することによって製造することも
できる。

上記でいうＡｒｇはアルギニン、Ｌｙｓはリジン、■ｌ
ｅはイソロイシン、ｖａｌはバリン、Ｔｙｒはチロシン
、Ｌｅｕはロイシンを意味し、かかるアミノ酸はいずれ
もし一体である。

本発明のペプチドは蛋白質をペプシンで加水分解するこ
とによっても、ペプチド合成法でも取得できる。蛋白質
をペプシンで加水分解するには、蛋白質の性状により処
決は異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋白質を混合し
強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のペプシンを加え
温度１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、Ｐ　ＨＯ
’。

１〜４．０で１０分〜３日間静置又は撹拌反応を行う。

蛋白質としては、アルブミンが有用である。アルブミン
としては動物や植物の体液及び組織中に広く分布してい
る可溶性蛋白質例えば、卵白アルブミン、血清アルブミ
ン、乳アルブミン、筋アルブミン等が任意に用いられる
が、特に卵白アルブミンが有用である。加水分解液中に
は本発明のペプチド以外に、他のペプチドが存在してる
が、これらは混合物のままで各種の用途に用いられても
良く、又、本発明のペプチドのみを単離して用いても差
し支えない。

単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法
、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置
で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応
性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメント
に相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジイ
ミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する
縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させる
ことによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばベンジルオキシアルボニル、ｔ−ブヂルオキシ
カルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボ
ニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙
げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が＝
６− 挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル
基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコ
キシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投
与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが
、通常１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．
０ｌ−１０Ｂを１日当たり１〜３回である。本発明のペ
プチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形
で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において
常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用
いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニ
ット、デキストリン、ンクロデキストリン、デンプン、
蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸
アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム
、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメヂルセル
ロースカルンウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース
、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸
、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベ
ントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸
エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪
酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラヂ
ン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流
動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イ
オン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げら
れる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティン
グしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水
あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤
や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、
好ましくは０５〜７０％の割合で含有することができる
。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有
していてもよい。

［作　　用］ 本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れたアン
ギオテンシン変換酵素阻害作用を゛有し、血圧降下作用
、プラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、
腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療
剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いら
れる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減
少、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用で
ある。

［実施何］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

生卵白を蒸留水で５倍に希釈溶解した後、ｌＮ−ＨＣｌ
でＰＨ１，６に調整した溶解液（２０ｍＷ／　ｍ（！の
蛋白を含む）にペプシン０．２ｍｇ／＋＋＋＋２（シグ
マ社製）を添加して３７℃、３時間静置反応を行い１０
０℃、１０分間煮洲して反応を停止させた。この反応液
をｌｏｏｏｏｒｐｍで５分間遠心分離を行い、濃縮した
後高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ−、ＰＨ−及び
ＣＮ−カラム）より精製し、ペプチドを得た。

氷晶を気相プロティンシーケンサ−（アプライド　バイ
オシステムズ社製　４７７　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ｌ　ｅ　ｕ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ［ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン８水−１５゜
３：１０：１２］ （シリカゲルプレート、ニンヒドリン発色）Ｒｆ：０．
４５ 一１〇− ｍ、ｐ：３００℃ 元素分析　Ｃ４４Ｈ７８Ｎ　＋　２０９・０．５Ｈ，Ｏ
としてＣＨＮ 計算値　５６．９４　８．５８　１８．１１測定値　５
６，７９　８．５３　１８．１０比旋光度［α］２と（
Ｃ＝０．５　　水）、−４７，１５〔ペプチドの合成〕 市販のＢｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｌｅｕ−０−Ｒ
ｅｓｉｎ　　０．８３ｇをバイオザーチ社のペプチド合
成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のように合成を
行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２．５％アニソールを含む塩
化メチレン中、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去
したのち、塩化メチレンによる洗浄、１０％ジイソプロ
ピルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び
塩化メチレンによる洗浄を行った。

これと５ｍｌの０．４Ｍ　Ｂｏ　ｃ−Ｔｙ　ｒ（ＣＬ−
Ｂｚ　Ｉ）（ジクロルベンジル基）のジメチルホルムア
ミド溶液、５ｍｌの０、．４　Ｍジイソプロピルカルボ
ジイミドの塩化メチレン溶液とを混合した後、反応槽に
加え、室温にて２時間撹拌反応させた。

得られた樹脂をジメチルポルムアミド、塩化メチレン、
１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメチルポルムア
ミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃ１２−Ｂ
ｚ　］）−Ｐｒｏ樹脂を得た。引き続き同様のＢｏｃ基
の除去、Ｂｏ　ｃｈアミノ酸のカップリングを繰り返し
Ａｒｇ（ＴＯ８）（トシル基）−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）（
クロルベンジルオギシカルボニル基）−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｙ
ｓ（ＣＩ−ｚ）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ＣＩ２−Ｂｚ　１）
−Ｌｅｕ−樹脂を得た。

該樹脂を２０ｍ１の１０％アニソールを含むフッ化水素
中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させ
た。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽出
し、凍結乾燥して粗ペプヂドを得た。これをＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５　Ｃ＋ｓ）による逆相クロ
マトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ
　１ｅ−Ｌ’ｙｓ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ（
収量１００ｍｆ＋）を得た。

氷晶を前記と同一のプロティンシーケンサ−により分析
した結果、上記の組成であることが判明した。

該ペプチドの物性値はっぎのとうりである。

尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。

Ｒｆ：０．４５ 元素分析　Ｃ４ｔＨ７ｓＮ１２０ｅ・０．７Ｈ２０とし
てＣ’ＨＮ 計算値　５６．７２　８．５９　１８．０４測定値　５
６．８２　８．５１　１８．０９比旋光度［α］”；　
（Ｃ＝０．５　　水）、−４７，１５ρ 又、目的とするペプチドのアミノ酸種に応じて反応薬剤
を変更した以外は上記の合成例に準じてＨ−Ｇｌｕ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ　Ｉｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−ＯＨを合成した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ：０．４２ ｍ、ｐ＋３００°Ｃ 元素分析　Ｃ４ｅＨ８５Ｎ　＋３０１２・０．７Ｈ２０
としてＣＨＮ 計算値　５５．４７　８．２１　　７．１６測定値　５
５，４０　８．１２　１７．０６比旋光度［α］”；　
（Ｃ＝０．５　　水）、−３８，７４〜１３一 実施例１〜２ （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンシン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕｓｈｍａｎの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａ
ｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０　。

１６３７（１９７１））に準じて以下の方法で行った。

酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇａｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵　素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
（ｌｙを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍ１中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μＱ１酵素溶液を１２μａ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μρとした後、３７℃で３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μρを用いて終了させた
。

反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ　ｏｒｔｅ
ｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１．Ｏｍｌをとり出して、酢酸エチル
を留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し
、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ　
２ｔａ）を測定した。

阻害率は阻害剤なしで反応したときのＯＤ　２２８を１
００％とし、反応時間０分のときの０Ｄ２２８を０％と
して求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド
）の濃度ＩＣ６０（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

又、参考例として本発明以外の阻害剤についても測定を
行ったので第１表に合わせて示す。

第　　１　　表 （注）Ｇｌｕ；グルタミン酸 ［効　　果］ 本発明ではアンギオテンシン変換酵素阻害剤として有用
な、新規なペプチドが得られる。

特許出願人　　　日本合成化学工業株式会社手続補正書 １、事件の表示 平成２年特許願第３３４３１５号 ２、発明の名称 新規ペプチド、その製造法及び用途 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　大阪市北区野崎町９番６号（郵便番号５３ｏ）
４、補正の対象 特許願及び明細書の発明の詳細な説明の欄５、補正の内
容 （１）本願特許願を別紙の如く補正する。

（２）明細書第２頁第１５行の「プラノキニン」を「ブ
ラジキニン−１と訂正する。

（３）明細書第３頁第１５行の「トリプトシン」を「ト
リプシンＪと訂正する。

（４）明細書第５頁第１０行の「筋アルブミン」を削除
する。

（５）明細書第６頁第１６行の 「ベンジルオキシアルボニル」を 「ベンジルオキシカルボニル」と訂正する。

（６）明細書第９頁第１５行の 「ブラジキニン不活化抑制作用」を ［ブラジキニン不活化抑制作用」と訂正する。

（７）明細書第１２頁第６行のｒＰｒｏ樹脂ｊをｒＬｅ
ｕ樹脂」と訂正する。

（８）明細書第１４頁第４行の「２０」を「てＬ」と訂
正する。

（９）明細書第１５頁の第１表の実施例２の阻害剤ｒＨ
−Ｑｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔ　１ｅ−Ｌｙｓ−ＶａＩ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨＪを ｒＨ−Ｑｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔ　Ｉｅ−Ｌｙｓ　−
Ｖａ　Ｉ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０１４Ｊと訂正する。

−３＝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
   −Ｌｅｕ骨格をもつ新規ペプチド。 ２、蛋白質をペプシンで加水分解することを特徴とする
   Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌ
   ｅｕ骨格をもつ新規ペプチドの製造法。 ３、蛋白質としてアルブミンを使用する請求項２記載の
   製造法。 ４、アルブミンとして卵白アルブミンを使用する請求項
   ３記載の製造法。 ５、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
   −Ｌｅｕ骨格をもつペプチドを有効成分とするアンギオ
   テンシン変換酵素阻害剤。