JPH0420858A - 抗血小板抗体の検出方法 - Google Patents
抗血小板抗体の検出方法Info
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- JPH0420858A JPH0420858A JP12319490A JP12319490A JPH0420858A JP H0420858 A JPH0420858 A JP H0420858A JP 12319490 A JP12319490 A JP 12319490A JP 12319490 A JP12319490 A JP 12319490A JP H0420858 A JPH0420858 A JP H0420858A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、抗血小板抗体の検出方法に関する。
血小板は血液中に存在する直径２〜３−の無核細胞であ
り、骨髄に存在する巨核球の断片化により生成したもの
である。血流中の血小板は、傷付いた血管内皮細胞と接
触するとそこで粘着凝集反応を起こし、これが止血にお
いて重要な役割を果たす。
り、骨髄に存在する巨核球の断片化により生成したもの
である。血流中の血小板は、傷付いた血管内皮細胞と接
触するとそこで粘着凝集反応を起こし、これが止血にお
いて重要な役割を果たす。
近年、血小板減少または血小板機能障害に起因した出血
傾向をもつ患者に対して、止血および出血防止を目的と
して血小板輸血療法が行われている。これによって数多
くの患者が出血死を免れ、延命が可能となった。この血
小板輸血療法が導入されて以来、血小板製剤の使用量は
急激に増加してきている。
傾向をもつ患者に対して、止血および出血防止を目的と
して血小板輸血療法が行われている。これによって数多
くの患者が出血死を免れ、延命が可能となった。この血
小板輸血療法が導入されて以来、血小板製剤の使用量は
急激に増加してきている。
しかしながら、急性白血病および再生不良性貧血など長
期間にわたって頻繁かつ大量の血小板輸血を行わなけれ
ばならない患者では、輸血された血小板の表面膜上に存
在する抗原に対する抗体が産生されるようになる。この
ような患者は、もはや無作為供血者からの血小板輸血を
行っても反応せず、輸血後にも血小板数の増加がみられ
なくなる。このように血小板輸血が効果を示さない状態
になった場合には、患者が有する抗血小板抗体と反応し
ないような抗原型を有する血小板を輸血する必要がある
。
期間にわたって頻繁かつ大量の血小板輸血を行わなけれ
ばならない患者では、輸血された血小板の表面膜上に存
在する抗原に対する抗体が産生されるようになる。この
ような患者は、もはや無作為供血者からの血小板輸血を
行っても反応せず、輸血後にも血小板数の増加がみられ
なくなる。このように血小板輸血が効果を示さない状態
になった場合には、患者が有する抗血小板抗体と反応し
ないような抗原型を有する血小板を輸血する必要がある
。
抗血小板抗体は、間挿抗体と自己抗体とに大別される。
抗血小板抗体抗体は、上記の血小板輸血や妊娠によって
生じる抗体である。この同種抗体は、前述のように血小
板輸血の効果を左右するのみならず、輸血後紫斑病や新
生児血小板減少性紫斑病の原因となる。
生じる抗体である。この同種抗体は、前述のように血小
板輸血の効果を左右するのみならず、輸血後紫斑病や新
生児血小板減少性紫斑病の原因となる。
一方、抗血小板自己抗体は、特発性血小板減少性紫斑病
等の自己免疫疾患の患者によって産生されるものである
。この自己抗体は、自己免疫疾患を起こす原因物質と考
えられている。
等の自己免疫疾患の患者によって産生されるものである
。この自己抗体は、自己免疫疾患を起こす原因物質と考
えられている。
抗血小板抗体の検出は、従来から数多くの方法で行われ
ている。その主なものは次の通りである。
ている。その主なものは次の通りである。
（ａ）凝集法
血小板抗体の検出に最初に用いられた方法で、元来はＰ
ＬＡ抗原系やＫＯ抗原系の検出に使用された方法である
。この方法では、主としてＩｇｋｌ抗体が検出され、Ｉ
ｇＧ抗体はほとんど検ａされない。また、血小板の自然
凝集に起因する非特異凝集が起こり易く、感度も低い。
ＬＡ抗原系やＫＯ抗原系の検出に使用された方法である
。この方法では、主としてＩｇｋｌ抗体が検出され、Ｉ
ｇＧ抗体はほとんど検ａされない。また、血小板の自然
凝集に起因する非特異凝集が起こり易く、感度も低い。
（ｂ）補体結合反応
被検血清と血小板と補体とを反応させた後、これに溶血
素感作ヒツジ赤血球を添加する。このヒツジ赤血球の溶
血の程度から、補体の消費を判断する。この方法は、血
小板膜表面上のＨＬＡ抗原、ＡＢＯ式血液型抗原等も検
圧することが可能である。しかしながら、感度は低い。
素感作ヒツジ赤血球を添加する。このヒツジ赤血球の溶
血の程度から、補体の消費を判断する。この方法は、血
小板膜表面上のＨＬＡ抗原、ＡＢＯ式血液型抗原等も検
圧することが可能である。しかしながら、感度は低い。
また、被検血清に抗補体活性がある場合には判定が困難
である。
である。
（ｃ）抗グロブリン消費試験
この試験では、まず血小板と非動化被検血清とを反応さ
せ、その後洗浄する。これに抗グロブリン血清を添加し
て反応させ遠心する。得られた上清の抗グロブリンカ価
を、抗り抗体感作赤血球を加えて反応させることにより
判定する。この方法は、偽陽性が現われ易く、感度も低
い。
せ、その後洗浄する。これに抗グロブリン血清を添加し
て反応させ遠心する。得られた上清の抗グロブリンカ価
を、抗り抗体感作赤血球を加えて反応させることにより
判定する。この方法は、偽陽性が現われ易く、感度も低
い。
（ｄ ） ＲＩ Ａ （ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ）放射性同位元素で標識した抗ヒ）ＩｇＧによる抗
グロブリン試験である。この方法では、血小板に結合し
た患者の抗血小板抗体に、放射性同位元素標識抗ヒｔ−
ＩｇＧを結合させた後、血小板に結合した放射性同位元
素をカウントする。
ａｙ）放射性同位元素で標識した抗ヒ）ＩｇＧによる抗
グロブリン試験である。この方法では、血小板に結合し
た患者の抗血小板抗体に、放射性同位元素標識抗ヒｔ−
ＩｇＧを結合させた後、血小板に結合した放射性同位元
素をカウントする。
（ｅ）ＭＰＨＡ
（ｍｉｘｅｄ ｐａｓｓｉｖｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔ
ｉｎａｔｉｏｎ ）この方法においては、まず、Ｕ字型
マイクロブレートのウェル内壁に血小板を固定し、この
ウェルに被検血清を加えて反応させる。ウェルを洗浄し
た後、抗ヒトＩｇＧ固定化ヒツジ赤血球を加えて反応さ
せる。反応後、ヒツジ赤血球がウェル中央部に集合した
像を陰性、ウェル全体に拡がった像を陽性と判定するこ
とにより血小板抗体の検出を行なう。
ｉｎａｔｉｏｎ ）この方法においては、まず、Ｕ字型
マイクロブレートのウェル内壁に血小板を固定し、この
ウェルに被検血清を加えて反応させる。ウェルを洗浄し
た後、抗ヒトＩｇＧ固定化ヒツジ赤血球を加えて反応さ
せる。反応後、ヒツジ赤血球がウェル中央部に集合した
像を陰性、ウェル全体に拡がった像を陽性と判定するこ
とにより血小板抗体の検出を行なう。
上記（ａ）〜 （ｅ）の従来の方法は、血小板そのもの
を抗原としている。ところで、血小板細胞上には血小板
抗原だけではな（ＨＬＡ抗原も発現している。そのため
、血小板抗原に反応する抗体だけではなく、ＨＬＡ抗原
に反応する抗体まで検８されてしまい、検出された抗体
が抗血小板抗体か抗ＨＬＡ抗体かの区別をつけることが
できなかった。
を抗原としている。ところで、血小板細胞上には血小板
抗原だけではな（ＨＬＡ抗原も発現している。そのため
、血小板抗原に反応する抗体だけではなく、ＨＬＡ抗原
に反応する抗体まで検８されてしまい、検出された抗体
が抗血小板抗体か抗ＨＬＡ抗体かの区別をつけることが
できなかった。
この発明は、上記課題に着目してなされたものであり、
抗ＨＬＡ抗体を含まず抗血小板抗体のみを容易にかつ効
率よく検出することが可能な方法を提供することを目的
とする。
抗ＨＬＡ抗体を含まず抗血小板抗体のみを容易にかつ効
率よく検出することが可能な方法を提供することを目的
とする。
〔課題を解決するための手段および作用〕発明者らは、
上記事情に鑑み、血小板からＨＬＡ抗原を簡便かつ短時
間に除去し、抗血小板抗体のみを検出することが可能な
方法を開発するため鋭意研究を行なった。その結果、血
小板から抽出した可溶性血小板膜抗原をクロロキンで処
理することによりＨＬＡ抗原を除去することかでき、こ
のクロロキン処理可溶性血小板膜抗原を用いることによ
り血小板特異型同種抗体のみを効率よく検出てきること
を見出した。
上記事情に鑑み、血小板からＨＬＡ抗原を簡便かつ短時
間に除去し、抗血小板抗体のみを検出することが可能な
方法を開発するため鋭意研究を行なった。その結果、血
小板から抽出した可溶性血小板膜抗原をクロロキンで処
理することによりＨＬＡ抗原を除去することかでき、こ
のクロロキン処理可溶性血小板膜抗原を用いることによ
り血小板特異型同種抗体のみを効率よく検出てきること
を見出した。
この発明の抗血小板抗体の検出方法は、通常、前記ＭＰ
ＨＡ法に従って行なう。すなわち、マイクロプレート
のウェル内壁に血小板そのものを固定する代わりに、ク
ロロキンで処理してＨＬＡ抗原を除去した上記抗血小板
抗体を固相化する。以下、この発明の検出方法において
用いられるマイクロプレートの調製方法を説明する。
ＨＡ法に従って行なう。すなわち、マイクロプレート
のウェル内壁に血小板そのものを固定する代わりに、ク
ロロキンで処理してＨＬＡ抗原を除去した上記抗血小板
抗体を固相化する。以下、この発明の検出方法において
用いられるマイクロプレートの調製方法を説明する。
まず、血小板から膜抗原成分を抽出する。血小板の抗原
成分は、血小板に対して超音波等の物理的な力を加える
ことにより可溶化された溶解質として得ることができる
。また、界面活性剤で処理し、血小板を可溶化すること
によっても得ることができる。さらに、血小板に物理的
な力を加えて血小板を破砕した後、これを界面活性剤で
処理して血小板を可溶化することによっても得ることが
できる。
成分は、血小板に対して超音波等の物理的な力を加える
ことにより可溶化された溶解質として得ることができる
。また、界面活性剤で処理し、血小板を可溶化すること
によっても得ることができる。さらに、血小板に物理的
な力を加えて血小板を破砕した後、これを界面活性剤で
処理して血小板を可溶化することによっても得ることが
できる。
次に、得られた血小板膜抗原成分をマイクロプレートの
ウェル内壁に固相化する。抗原成分を固相化する方法と
しては、公知の方法を用いることができる。例えば、タ
ンニン酸、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、塩化
クロム等のカップリング剤を用いる方法を挙げることが
できる。また、物理吸着によって抗原成分を固相化する
こともできる。
ウェル内壁に固相化する。抗原成分を固相化する方法と
しては、公知の方法を用いることができる。例えば、タ
ンニン酸、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、塩化
クロム等のカップリング剤を用いる方法を挙げることが
できる。また、物理吸着によって抗原成分を固相化する
こともできる。
抗原成分を固相化した後、各ウェルをクロロキンで処理
する。すなわち、各ウェルにクロロキンを加えてよく撹
拌し、インキュベートした後洗浄する。この処理により
、固相化した抗原成分からＨＬＡ抗原が除去される。
する。すなわち、各ウェルにクロロキンを加えてよく撹
拌し、インキュベートした後洗浄する。この処理により
、固相化した抗原成分からＨＬＡ抗原が除去される。
このようにして調製されたマイクロプレートのウェル内
壁には血小板抗原のみが固相化されている。したがって
、このマイクロプレートを用いてＭＰＨＡ法を行なうこ
とにより、抗血小板抗体のみを効率よく検出することが
可能となる。
壁には血小板抗原のみが固相化されている。したがって
、このマイクロプレートを用いてＭＰＨＡ法を行なうこ
とにより、抗血小板抗体のみを効率よく検出することが
可能となる。
血小板抽出抗原からのＨＬＡ抗原の除去ＣＰＤ採血した
血液を遠心分離し、得られた血小板沈渣を生理食塩水に
再浮遊した。これを、４℃で３日間保存した後、上滑を
分離して抽出抗原とした。この抽出抗原を、至適濃度を
決めて９６ウ工ルＵ字型マイクロプレート（Ｎｕｎｋ社
製、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに２５μｊずつ滴下
し、４℃で一晩保存して血小板抽出抗原プレートを作成
した。
血液を遠心分離し、得られた血小板沈渣を生理食塩水に
再浮遊した。これを、４℃で３日間保存した後、上滑を
分離して抽出抗原とした。この抽出抗原を、至適濃度を
決めて９６ウ工ルＵ字型マイクロプレート（Ｎｕｎｋ社
製、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに２５μｊずつ滴下
し、４℃で一晩保存して血小板抽出抗原プレートを作成
した。
この血小板抽出抗原プレートがら以下の手順てＨＬＡ抗
原を除去した。まず、プレートがら抽出抗原の上滑を捨
て、各ウェルに ０．８Ｍクロロキンを５０μｊずつ滴
下して激しく混合した。次に、室温で１時間インキュベ
ートした後、０．０５％トウィーン２０−Ｐ Ｂ Ｓを
用いて各ウェルを１０回洗浄した。
原を除去した。まず、プレートがら抽出抗原の上滑を捨
て、各ウェルに ０．８Ｍクロロキンを５０μｊずつ滴
下して激しく混合した。次に、室温で１時間インキュベ
ートした後、０．０５％トウィーン２０−Ｐ Ｂ Ｓを
用いて各ウェルを１０回洗浄した。
上記手順によりクロロキン処理した血小板抽出抗原プレ
ートの各ウェルに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を２５バず
つ滴下し、抗体を室温で１時間反応させた。
ートの各ウェルに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を２５バず
つ滴下し、抗体を室温で１時間反応させた。
ここで用いた抗体は、血小板モノクローナル抗体Ｙｕ３
−５１−１６ （特異性：ＧｐＨｂ ／Ｈａ ） 、
ＨＬＡモノクローナル抗体ＴＯＫ３９−１ （特異性：
ＨＬＡクラスエモノモルフィック） 血小板抽出抗原と
しての抗ＹｕＫ” 抗Ｎａｋ ’ 抗Ｂａｋ ’
およびＨＬＡ同種抗体としての抗）ＨＬＡ−Ａ１１＋
Ａ３１＋Ａｖ３３である。
−５１−１６ （特異性：ＧｐＨｂ ／Ｈａ ） 、
ＨＬＡモノクローナル抗体ＴＯＫ３９−１ （特異性：
ＨＬＡクラスエモノモルフィック） 血小板抽出抗原と
しての抗ＹｕＫ” 抗Ｎａｋ ’ 抗Ｂａｋ ’
およびＨＬＡ同種抗体としての抗）ＨＬＡ−Ａ１１＋
Ａ３１＋Ａｖ３３である。
その結果、血小板モノクローナル抗体Ｙｕ３−５１−１
６、および血小板同種抗体抗ＹｕＫゝ、抗Ｎａｋ”抗Ｂ
ａｋ ”は、クロロキン未処理プレートとクロロキン処
理プレートとの間では反応性の変化は認められなかった
。これに対して、ＨＬＡモノクローナル抗体ＴＯＫ３９
−１およびＨＬＡ同種抗体抗ＨＬＡ−Ａ１１＋Ａ３１＋
Ａｖ３３の反応はりｏｏキン処理後認められなくなった
。抗ＨＬＡ−Ａ１１＋Ａ３１＋Ａｖ３３（ＬＣＴ Ｔｉ
ｔｅｒ ｘ２）を含有する血清を用い、標的細胞をＡＩ
？Ａ （ＨＬＡ−ＡＩｌ、Ａ２Ｂ ）血小板、抽出抗原
とした場合の結果を第１ａ図に、また、抗Ｎａｋ ”を
含有する血清を用い、標的細胞をＡＲＡ （Ｎａｋ”）
血小板、抽出抗原とした場合の結果を第１ｂ図にそれぞ
れ示した。第１ａ図および第１ｂ図において、縦軸はい
ずれも血清の希釈倍率を示す。また、第１ａ図および第
１ｂ図における横軸は、いずれも、左から未処理の血小
板と抽出抗原、およびクロロキン処理血小板と抽出抗原
を示す。第１ａ図は、血小板および抽出抗原のいずれも
、未処理の場合には１６倍希釈の血清に対しても反応を
示したのに対してクロロキン処理したものは原液に対し
ても反応を示さなかったことを表わしている。第１ｂ図
は、未処理の場合でもクロロキン処理した場合でも、血
小板は２倍希釈の血清まで反応を示し、抽出抗原は４倍
希釈の血清まで反応を示したことを表わしている。
６、および血小板同種抗体抗ＹｕＫゝ、抗Ｎａｋ”抗Ｂ
ａｋ ”は、クロロキン未処理プレートとクロロキン処
理プレートとの間では反応性の変化は認められなかった
。これに対して、ＨＬＡモノクローナル抗体ＴＯＫ３９
−１およびＨＬＡ同種抗体抗ＨＬＡ−Ａ１１＋Ａ３１＋
Ａｖ３３の反応はりｏｏキン処理後認められなくなった
。抗ＨＬＡ−Ａ１１＋Ａ３１＋Ａｖ３３（ＬＣＴ Ｔｉ
ｔｅｒ ｘ２）を含有する血清を用い、標的細胞をＡＩ
？Ａ （ＨＬＡ−ＡＩｌ、Ａ２Ｂ ）血小板、抽出抗原
とした場合の結果を第１ａ図に、また、抗Ｎａｋ ”を
含有する血清を用い、標的細胞をＡＲＡ （Ｎａｋ”）
血小板、抽出抗原とした場合の結果を第１ｂ図にそれぞ
れ示した。第１ａ図および第１ｂ図において、縦軸はい
ずれも血清の希釈倍率を示す。また、第１ａ図および第
１ｂ図における横軸は、いずれも、左から未処理の血小
板と抽出抗原、およびクロロキン処理血小板と抽出抗原
を示す。第１ａ図は、血小板および抽出抗原のいずれも
、未処理の場合には１６倍希釈の血清に対しても反応を
示したのに対してクロロキン処理したものは原液に対し
ても反応を示さなかったことを表わしている。第１ｂ図
は、未処理の場合でもクロロキン処理した場合でも、血
小板は２倍希釈の血清まで反応を示し、抽出抗原は４倍
希釈の血清まで反応を示したことを表わしている。
抗血小板抗体の検出
（１） ＨＬＡ除去血小板抽出抗原プレートの作成Ａ
ＣＤ−Ａ液または他の抗凝固剤１容量部に対して７容量
部のＯ型ヒト全血を採血する。通常、ＡＣＤ−Ａ液の容
量を３１とし、２１ ｔｉＩの全血を採血する。ＡＣＤ
−Ａ液を添加した全血を１４００ ｒｐＩＩｌで１０分
間遠心して濃厚血小板血漿（ＰＲＰ）を分離する。
ＣＤ−Ａ液または他の抗凝固剤１容量部に対して７容量
部のＯ型ヒト全血を採血する。通常、ＡＣＤ−Ａ液の容
量を３１とし、２１ ｔｉＩの全血を採血する。ＡＣＤ
−Ａ液を添加した全血を１４００ ｒｐＩＩｌで１０分
間遠心して濃厚血小板血漿（ＰＲＰ）を分離する。
この際、赤血球の混入をできるだけ避けるために、採血
後３０分程度放置した後に遠心を開始することが好まし
い。血小板の収量を良くするために、得られたＰＲＰの
１０％量のＡＣＤ−Ａ液をＰＲＰに添加した後、２５０
Ｏｒｐｍで１５分間遠心し、上滑を捨てて濃縮血小板（
Ｐ、Ｃ，）を得る。このｐ、ｃ、に無菌生理食塩水（テ
ルモ社製）５−を添加し、２５０Ｏｒｐｍで１０分間遠
心して洗浄することを２回繰り返す。洗浄した血小板を
０．５１の生理食塩水に浮遊させ、４℃で３ないし５日
間放置して抗原を抽出する。
後３０分程度放置した後に遠心を開始することが好まし
い。血小板の収量を良くするために、得られたＰＲＰの
１０％量のＡＣＤ−Ａ液をＰＲＰに添加した後、２５０
Ｏｒｐｍで１５分間遠心し、上滑を捨てて濃縮血小板（
Ｐ、Ｃ，）を得る。このｐ、ｃ、に無菌生理食塩水（テ
ルモ社製）５−を添加し、２５０Ｏｒｐｍで１０分間遠
心して洗浄することを２回繰り返す。洗浄した血小板を
０．５１の生理食塩水に浮遊させ、４℃で３ないし５日
間放置して抗原を抽出する。
上記生食浮遊液を１ｏｏｏｏｃで５分間遠心し、得られ
た上滑を生理食塩水で５０倍希釈して抽出抗原とする。
た上滑を生理食塩水で５０倍希釈して抽出抗原とする。
予め静電気を除去しておいたスチロール製９６六マイク
ロプレート（Ｎｕｎｋ社： Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウ
ェルに、上記抽出抗原２５ｍＪを入れ、４℃で一晩放置
して抗原付着プレートを作成する。
ロプレート（Ｎｕｎｋ社： Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウ
ェルに、上記抽出抗原２５ｍＪを入れ、４℃で一晩放置
して抗原付着プレートを作成する。
この抗原付着プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、各ウ
ェルに０．８Ｍクロロキン５０μｇを滴下して激しく混
合し、室温で１時間インキュベートする。インキュベー
トの後、クロロキン溶液を捨て、０．０５％トウィーン
２０− Ｐ Ｂ Ｓで１０回洗浄する。
ェルに０．８Ｍクロロキン５０μｇを滴下して激しく混
合し、室温で１時間インキュベートする。インキュベー
トの後、クロロキン溶液を捨て、０．０５％トウィーン
２０− Ｐ Ｂ Ｓで１０回洗浄する。
（ｉｔ）ＨＬＡ除去血小板抽出抗原プレートの感作上記
ＨＬＡ除去血小板抽出抗原プレートの各ウェルに ０．
０５％トウイーン２Ｏ−ＰＢ３２５μｇを入れ、さらに
血小板特異゛抗血清（Ｎａｋ’抗血／ｆｉ）およびＨＬ
Ａ抗血清（Ａｌｌ＋Ａ３１＋入り３３）を下記プロトコ
ールに従って２５ｄずつ添加して室温湿潤条件下で１時
間感作させる。
ＨＬＡ除去血小板抽出抗原プレートの各ウェルに ０．
０５％トウイーン２Ｏ−ＰＢ３２５μｇを入れ、さらに
血小板特異゛抗血清（Ｎａｋ’抗血／ｆｉ）およびＨＬ
Ａ抗血清（Ａｌｌ＋Ａ３１＋入り３３）を下記プロトコ
ールに従って２５ｄずつ添加して室温湿潤条件下で１時
間感作させる。
（Ｉｉｉ） 感作粒子の作成
タンニン酸固定ヒツジ赤血球を以下のようにして作成す
る。
る。
採血後２日以内の新鮮なヒツジ赤血球（５ＲＢＣ）をＰ
Ｂ Ｓ （ｐ）Ｉ ７．２）で４回洗浄する。次いて
、２５００ ｒｐｍで５分間遠心し、生じてくる白色の
膜様物質を完全に除去した後、洗浄し、ＰＢＳで希釈し
て５％赤血球とする。この５％赤血球１００−に対して
２．５％ゲルタールアルデヒド溶液２０−を固定剤とし
て添加し、ターンテーブルを使用して室温で３時間撹拌
することにより固定する。なお、固定剤′としてはホル
マリンを使用することもできる。３時間経過した後、Ｐ
ＢＳを加えて２５０Ｏｒｐｍで５分間遠心することによ
り洗浄し、これを４回繰り返す。洗浄後、ＰＢＳで希釈
して５％固定ヒツジ赤血球とし、さらに保存剤として０
．０１％ＮａＮ３を添加して保存する。
Ｂ Ｓ （ｐ）Ｉ ７．２）で４回洗浄する。次いて
、２５００ ｒｐｍで５分間遠心し、生じてくる白色の
膜様物質を完全に除去した後、洗浄し、ＰＢＳで希釈し
て５％赤血球とする。この５％赤血球１００−に対して
２．５％ゲルタールアルデヒド溶液２０−を固定剤とし
て添加し、ターンテーブルを使用して室温で３時間撹拌
することにより固定する。なお、固定剤′としてはホル
マリンを使用することもできる。３時間経過した後、Ｐ
ＢＳを加えて２５０Ｏｒｐｍで５分間遠心することによ
り洗浄し、これを４回繰り返す。洗浄後、ＰＢＳで希釈
して５％固定ヒツジ赤血球とし、さらに保存剤として０
．０１％ＮａＮ３を添加して保存する。
上記５％固定ヒツジ赤血球をＰＢＳで１回洗浄し、この
赤血球 １０（ｌａｌ）と０．０２％タンニン酸溶液１
００−とを３７℃で１５分間反応させる。次いで、ＰＢ
Ｓで１回洗浄し、さらにウサギ由来の抗ヒトＩｇＧを加
えて室温で２時間撹拌して反応させる。
赤血球 １０（ｌａｌ）と０．０２％タンニン酸溶液１
００−とを３７℃で１５分間反応させる。次いで、ＰＢ
Ｓで１回洗浄し、さらにウサギ由来の抗ヒトＩｇＧを加
えて室温で２時間撹拌して反応させる。
反応後、ＰＢＳを添加して２５００ｒｐｍで５分間遠心
することにより洗浄し、これを４回繰り返す。得られた
赤血球を３２６正常血清（ＮＲ５：Ｐｅ ｌ ｆ’ ｒ
ｅｅｚｅ社製）−ＰＢＳ溶液に浮遊させ、０．２％血球
浮遊液とする。
することにより洗浄し、これを４回繰り返す。得られた
赤血球を３２６正常血清（ＮＲ５：Ｐｅ ｌ ｆ’ ｒ
ｅｅｚｅ社製）−ＰＢＳ溶液に浮遊させ、０．２％血球
浮遊液とする。
（１ｖ） 抗血小板抗体の検出
上記の通り感作したＨＬＡ除去血小板抽出抗原プレート
を ０，０５％トウイーン２０−Ｐ Ｂ ５（ｐＨ７，
２）で５回洗浄する。次いて、トウビーン２Ｏ−ＰＢＳ
、指示血球としての上記０．２％血球浮遊液および未感
作血球２５ｔＩＩを所定のウェルに加える。このプレー
トを、室温湿潤状態かつ振動のないところに静置し、３
ないし４時間後に判定する。
を ０，０５％トウイーン２０−Ｐ Ｂ ５（ｐＨ７，
２）で５回洗浄する。次いて、トウビーン２Ｏ−ＰＢＳ
、指示血球としての上記０．２％血球浮遊液および未感
作血球２５ｔＩＩを所定のウェルに加える。このプレー
トを、室温湿潤状態かつ振動のないところに静置し、３
ないし４時間後に判定する。
判定は、以下に示す受身赤血球凝集反応の判定基準に従
って行なう。
って行なう。
＋＋：血液がウェルの底面全体に凝集して−様な膜を形
成する。
成する。
十 ：ウエルの中心部に大きく薄い血球の集合かわずか
に見られる ± ：血球がリング状に見られるが、その周辺にわずか
に血球の分散が見られる ：ウエルの中心部に全ての血球が集まり、きれいなリン
グを形成している。
に見られる ± ：血球がリング状に見られるが、その周辺にわずか
に血球の分散が見られる ：ウエルの中心部に全ての血球が集まり、きれいなリン
グを形成している。
上記判定に基づいて、（＋＋）および（＋）を陽性、（
土）および（−）を陰性とする。
土）および（−）を陰性とする。
以上のように、この発明の方法によると、血小板抽出抗
原からＨＬＡ抗原のみを除去し、この抗原を用いた抗原
抗体反応によって抗血小板抗体のみを効率良く検ａする
ことが可能°である。
原からＨＬＡ抗原のみを除去し、この抗原を用いた抗原
抗体反応によって抗血小板抗体のみを効率良く検ａする
ことが可能°である。
第１ａ図は未処理およびクロロキン処理した血小板およ
び血小板抽出抗原に対する抗ＨＬＡ抗体の反応性を示す
グラフ、 第１ｂ図は未処理およびクロロキン処理した血小板およ
び血小板抽出抗原に対する抗血小板抗体の反応性を示す
グラフである。 出願人代理人 弁理士 坪井 淳 第１ａ図 第１ｂ図
び血小板抽出抗原に対する抗ＨＬＡ抗体の反応性を示す
グラフ、 第１ｂ図は未処理およびクロロキン処理した血小板およ
び血小板抽出抗原に対する抗血小板抗体の反応性を示す
グラフである。 出願人代理人 弁理士 坪井 淳 第１ａ図 第１ｂ図
Claims (1)
- 血小板から抽出し、かつクロロキンで処理してＨＬＡ
抗原を除去した可溶性血小板膜抗原を用いて抗原抗体反
応を行なうことを特徴とする抗血小板抗体の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12319490A JPH0420858A (ja) | 1990-05-15 | 1990-05-15 | 抗血小板抗体の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12319490A JPH0420858A (ja) | 1990-05-15 | 1990-05-15 | 抗血小板抗体の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0420858A true JPH0420858A (ja) | 1992-01-24 |
Family
ID=14854522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12319490A Pending JPH0420858A (ja) | 1990-05-15 | 1990-05-15 | 抗血小板抗体の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0420858A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0217821B1 (en) * | 1985-03-06 | 1991-07-03 | BEGLEITER, Eric | Edible holographic element |
| JP2008083048A (ja) * | 2006-09-25 | 2008-04-10 | Dade Behring Marburg Gmbh | 凝集能力を有する血小板フラグメントの製造方法及びその使用 |
-
1990
- 1990-05-15 JP JP12319490A patent/JPH0420858A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0217821B1 (en) * | 1985-03-06 | 1991-07-03 | BEGLEITER, Eric | Edible holographic element |
| JP2008083048A (ja) * | 2006-09-25 | 2008-04-10 | Dade Behring Marburg Gmbh | 凝集能力を有する血小板フラグメントの製造方法及びその使用 |
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