JPH04211358A - 生物細胞に及ぼす物質の相互作用効果の研究及び定量方法及び器具 - Google Patents
生物細胞に及ぼす物質の相互作用効果の研究及び定量方法及び器具Info
- Publication number
- JPH04211358A JPH04211358A JP3036058A JP3605891A JPH04211358A JP H04211358 A JPH04211358 A JP H04211358A JP 3036058 A JP3036058 A JP 3036058A JP 3605891 A JP3605891 A JP 3605891A JP H04211358 A JPH04211358 A JP H04211358A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- concentration
- test area
- rectangular test
- substances
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物又は他の生物細
胞の成長阻害又は成長促進に及ぼす２種以上の物質の相
互作用効果を研究し定量するための方法及び器具に関す
る。
胞の成長阻害又は成長促進に及ぼす２種以上の物質の相
互作用効果を研究し定量するための方法及び器具に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】感染病の治療には多くの場合、抗菌剤が
併用される。広域スペクトル範囲を重病患者に付与する
ために、感染病原体が同定される前に抗菌剤の併用、例
えば２種の抗生物質、抗生物質と化学療法剤との併用、
又は抗生物質の併用、が最も頻繁に行なわれる。多菌性
感染病の場合、これとは異なる現存生物に対してはどの
薬剤も作用を及ぼしてはならない。且つ病原体混合物を
根絶することが、抗生物質の併用には求められる。例え
ば結核治療の場合、何れかの抗生物質に対し耐性が発生
するのを防ぐ、又は少なくとも遅れさすためにも、２種
の抗生物質が投与される。尿路伝染病治療では度々、化
学療法剤の併用、例えばトリメトプリム／サルファーメ
トキサゾール、又はトリメトプリム／サルファージアジ
ンの併用が行なわれる。抗生物質の併用には又、心内膜
炎や敗血症のような重大な感染病治療の場合、相剰効果
が成されることが求められる。原因となる生物がたとえ
判明している場合でも併用治療が単一治療よりも好まし
い、という特殊の場合としては、熱性患者が免疫抑制薬
で治療される場合がある。
併用される。広域スペクトル範囲を重病患者に付与する
ために、感染病原体が同定される前に抗菌剤の併用、例
えば２種の抗生物質、抗生物質と化学療法剤との併用、
又は抗生物質の併用、が最も頻繁に行なわれる。多菌性
感染病の場合、これとは異なる現存生物に対してはどの
薬剤も作用を及ぼしてはならない。且つ病原体混合物を
根絶することが、抗生物質の併用には求められる。例え
ば結核治療の場合、何れかの抗生物質に対し耐性が発生
するのを防ぐ、又は少なくとも遅れさすためにも、２種
の抗生物質が投与される。尿路伝染病治療では度々、化
学療法剤の併用、例えばトリメトプリム／サルファーメ
トキサゾール、又はトリメトプリム／サルファージアジ
ンの併用が行なわれる。抗生物質の併用には又、心内膜
炎や敗血症のような重大な感染病治療の場合、相剰効果
が成されることが求められる。原因となる生物がたとえ
判明している場合でも併用治療が単一治療よりも好まし
い、という特殊の場合としては、熱性患者が免疫抑制薬
で治療される場合がある。
【０００３】２種以上の薬剤を共に投与する場合、多く
の異なった相互作用効果がみられる。これらの物質は本
質的に互いに影響し合い、例えば１つの抗生物質が他の
抗生物質により不活性化される。具体的には投薬前に同
一の滲出瓶に保管していた場合、ゲンタマイシンがカル
ベニシリンにより不活性化される。その他には、抗腫瘍
剤と既知抗菌剤との相互作用がある。この場合、ガン患
者の治療には逆効果となる。
の異なった相互作用効果がみられる。これらの物質は本
質的に互いに影響し合い、例えば１つの抗生物質が他の
抗生物質により不活性化される。具体的には投薬前に同
一の滲出瓶に保管していた場合、ゲンタマイシンがカル
ベニシリンにより不活性化される。その他には、抗腫瘍
剤と既知抗菌剤との相互作用がある。この場合、ガン患
者の治療には逆効果となる。
【０００４】バクテリアに及ぼす抗生物質の併用効果は
、主に３種類に分けられる。第１は、両薬剤の活性が他
の薬剤の存在によって影響されない場合、相互作用は無
関係である。第２は、相互作用が相剰的である。即ち、
両薬剤を併用した場合の効果が、何れかの薬剤を単独で
同濃度で使用した場合より遥かに大きい。第３は、一方
の薬剤の活性が他の薬剤の存在により低下される場合、
薬剤の併用は相反する。
、主に３種類に分けられる。第１は、両薬剤の活性が他
の薬剤の存在によって影響されない場合、相互作用は無
関係である。第２は、相互作用が相剰的である。即ち、
両薬剤を併用した場合の効果が、何れかの薬剤を単独で
同濃度で使用した場合より遥かに大きい。第３は、一方
の薬剤の活性が他の薬剤の存在により低下される場合、
薬剤の併用は相反する。
【０００５】相剰効果は非常に重視されるが、相反性が
発生しないようにすることはこれと同じくらい重要であ
る。抗生物質の併用による相剰効果及び相反効果は、２
種の化合物の比を変化させる際に生ずる。アミノグリコ
サイド類、例えばゲンタマイシンのような潜在的毒性抗
生物質を用いる併用治療では、投与に係る薬剤毒性を避
けるために正確な投薬量で投薬されねばならない。従っ
て、抗生物質の併用効果を研究するためのラボ試験では
、どの薬剤を併用して処方されるべきであるか、又使用
される薬剤の最適投薬量及び投薬比についての定性的及
び定量的情報が与えられねばならない。微生物及び他の
生物細胞の代謝及び成長を促進させる又は遅らせる他の
物質の相互作用は、抗生物質併用に於ける上記の概念と
同様である。成長促進剤及び他の生物学的栄養剤を含む
研究は、薬剤処方を設定するのに有用である。薬剤併用
による発ガン性、変異原性及び奇形発生効果も又、医療
用新薬の開発に際しては研究される。
発生しないようにすることはこれと同じくらい重要であ
る。抗生物質の併用による相剰効果及び相反効果は、２
種の化合物の比を変化させる際に生ずる。アミノグリコ
サイド類、例えばゲンタマイシンのような潜在的毒性抗
生物質を用いる併用治療では、投与に係る薬剤毒性を避
けるために正確な投薬量で投薬されねばならない。従っ
て、抗生物質の併用効果を研究するためのラボ試験では
、どの薬剤を併用して処方されるべきであるか、又使用
される薬剤の最適投薬量及び投薬比についての定性的及
び定量的情報が与えられねばならない。微生物及び他の
生物細胞の代謝及び成長を促進させる又は遅らせる他の
物質の相互作用は、抗生物質併用に於ける上記の概念と
同様である。成長促進剤及び他の生物学的栄養剤を含む
研究は、薬剤処方を設定するのに有用である。薬剤併用
による発ガン性、変異原性及び奇形発生効果も又、医療
用新薬の開発に際しては研究される。
【０００６】ＥＰ−Ｂ−Ｏ１５７ ０７１では、活性
物質の相剰効果及び相反効果の測定器具と測定方法が記
載される。しかし、そこで記載される器具及び方法は、
相互作用効果を定量的に測定するものではなく、従って
活性物質の治療投薬量の決定には使用することが出来な
い。
物質の相剰効果及び相反効果の測定器具と測定方法が記
載される。しかし、そこで記載される器具及び方法は、
相互作用効果を定量的に測定するものではなく、従って
活性物質の治療投薬量の決定には使用することが出来な
い。
【０００７】「ラボ医学に於ける抗生物質」［クログス
タッド（Ｋｒｏｇｓｔａｄ）等、ローリアン（Ｌｏｒｉ
ａｎ）、１９８６年］に記載されるように、抗生物質の
併用効果の定量的測定は主にチェッカー板法又はチェス
板法によって行なわれる。これらの方法は、技術的に厄
介で、時間がかかり、そして実施するには非常に高価で
ある。
タッド（Ｋｒｏｇｓｔａｄ）等、ローリアン（Ｌｏｒｉ
ａｎ）、１９８６年］に記載されるように、抗生物質の
併用効果の定量的測定は主にチェッカー板法又はチェス
板法によって行なわれる。これらの方法は、技術的に厄
介で、時間がかかり、そして実施するには非常に高価で
ある。
【０００８】チェッカー板滴定法は、２種の抗生物質に
よる２重連続稀釈液に生物検体をさらす。これにより、
（用いた稀釈濃度範囲内に於いて）薬剤濃度のあらゆる
可能な組合せが試験される。この試験法は、予想される
最小阻害濃度（ＭＩＣ）のすぐ上の濃度から下の１０種
以上の稀釈濃度液を、各薬剤から調製することを含む。 チェッカー板は、試験管又は寒天板の縦列と横列から成
る。 縦列に於いては、１つの薬剤が同量含まれる。又この薬
剤はＸ軸に沿って稀釈される。各横列に於いては、もう
一方の薬剤が各同量含まれる。そしてこの薬剤はＹ軸に
沿って稀釈される。これは図１に示される。尚図１は、
上から見たときの試験管の各横列を示す。各試験管に於
いて、２種の被試験抗生物質の濃度は図示するように矢
印方向に増大し、左側底部の試験管に於いては両物質の
濃度は最小である。一方、上部横列中右側の試験管は両
物質濃度は最大である。従ってチェッカー板中の各区画
（試験管）は、２種の薬剤から成る唯一無二の併用（濃
度）剤である。使用する抗菌剤稀釈液は、普通ブイヨン
又は寒天で調製される。上記の図に示した具体例では、
無地の試験管には阻害が存在し（非成長）、斜線で示し
た混濁試験管には成長がある。
よる２重連続稀釈液に生物検体をさらす。これにより、
（用いた稀釈濃度範囲内に於いて）薬剤濃度のあらゆる
可能な組合せが試験される。この試験法は、予想される
最小阻害濃度（ＭＩＣ）のすぐ上の濃度から下の１０種
以上の稀釈濃度液を、各薬剤から調製することを含む。 チェッカー板は、試験管又は寒天板の縦列と横列から成
る。 縦列に於いては、１つの薬剤が同量含まれる。又この薬
剤はＸ軸に沿って稀釈される。各横列に於いては、もう
一方の薬剤が各同量含まれる。そしてこの薬剤はＹ軸に
沿って稀釈される。これは図１に示される。尚図１は、
上から見たときの試験管の各横列を示す。各試験管に於
いて、２種の被試験抗生物質の濃度は図示するように矢
印方向に増大し、左側底部の試験管に於いては両物質の
濃度は最小である。一方、上部横列中右側の試験管は両
物質濃度は最大である。従ってチェッカー板中の各区画
（試験管）は、２種の薬剤から成る唯一無二の併用（濃
度）剤である。使用する抗菌剤稀釈液は、普通ブイヨン
又は寒天で調製される。上記の図に示した具体例では、
無地の試験管には阻害が存在し（非成長）、斜線で示し
た混濁試験管には成長がある。
【０００９】チェッカー板滴定法は非常に労力を要し、
又時宜を得て実施されねばならない。第１に、適切な稀
釈範囲を選択するために、併用される２種の抗生物質の
ＭＩＣを決定せねばならない。
又時宜を得て実施されねばならない。第１に、適切な稀
釈範囲を選択するために、併用される２種の抗生物質の
ＭＩＣを決定せねばならない。
【００１０】例えば各物質について１５種類の稀釈液を
持つようにチェッカー板を作製しようとすると、２２５
個の試験管又は寒天板が測定用に必要となる。作業工程
は、多くの手作業段階を含む。従って、例えば不正確な
稀釈及び使用溶液の汚染等のラボエラーを招き、これは
不正確な又は誤りでさえもある結果を生ずる。チェッカ
ー板の研究結果を得るには少なくとも１〜２週間はかか
る。このことは重病患者の場合には、大きな欠点である
。この場合、治療法の選択が遅れたり、潜在的に相反す
る抗生物質の組合わせを経験により選択するために誤っ
た治療が行なわれると、致命的な結果を招く。
持つようにチェッカー板を作製しようとすると、２２５
個の試験管又は寒天板が測定用に必要となる。作業工程
は、多くの手作業段階を含む。従って、例えば不正確な
稀釈及び使用溶液の汚染等のラボエラーを招き、これは
不正確な又は誤りでさえもある結果を生ずる。チェッカ
ー板の研究結果を得るには少なくとも１〜２週間はかか
る。このことは重病患者の場合には、大きな欠点である
。この場合、治療法の選択が遅れたり、潜在的に相反す
る抗生物質の組合わせを経験により選択するために誤っ
た治療が行なわれると、致命的な結果を招く。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明に於いては、２
種以上の抗菌剤の相互作用を１〜２日以内に正確に定量
出来、それにより医者が適切な抗生物質併用剤を最適な
投薬量比で選択出来る。前述のチェッカー板法に於ける
欠点は本発明により解消される。本発明は、既製品を含
み、最少の補助的なラボ材料を必要とするだけで容易に
試験システムを使用出来、数段階で素速く作製出来、直
接読んで判定出来る結果を与える。従って本発明方法は
、専門的でない研究者でさえもルーチーンに使用出来、
抗菌剤の併用効果に関する重要な医療情報を与え、それ
により重い感染病に対して安全で効果的な治療を容易に
且つ素速く行なえる。
種以上の抗菌剤の相互作用を１〜２日以内に正確に定量
出来、それにより医者が適切な抗生物質併用剤を最適な
投薬量比で選択出来る。前述のチェッカー板法に於ける
欠点は本発明により解消される。本発明は、既製品を含
み、最少の補助的なラボ材料を必要とするだけで容易に
試験システムを使用出来、数段階で素速く作製出来、直
接読んで判定出来る結果を与える。従って本発明方法は
、専門的でない研究者でさえもルーチーンに使用出来、
抗菌剤の併用効果に関する重要な医療情報を与え、それ
により重い感染病に対して安全で効果的な治療を容易に
且つ素速く行なえる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明方法の一態様に於
いて、固体培地上で生育される微生物又は他の生物細胞
の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の物質の相互
作用効果は、以下のようにして測定される。即ち、増殖
培地表面上の方形試験領域に物質を予め定められた濃度
パターンで塗布する。尚このパターンに於いては、第１
物質の最小周界濃度が方形に於ける１辺のエッジ上にあ
り且つ最大周界濃度が反対側のエッジ上にある。又第２
物質の最小周界濃度が第３のエッジ上にあり且つ最大周
界濃度がその反対側のエッジ上にある。その後この処理
板を培養し、阻害パターンを読み、次いで予め定められ
た物質の濃度パターンに適合した読み目盛を用いて関連
する終点に於いて２種の物質の求めようとする濃度を測
定することにより、相互作用効果が測定される。従って
、第１物質は濃度勾配がＹ軸（即ち垂直方向）に沿って
あり、最大値が最小値の上方に存在する。又第２物質は
濃度勾配がＸ軸（即ち水平方向）に沿ってあり、最小濃
度がＸ軸の左側に且つ最大濃度が右側にある。このよう
に、２種の物質の濃度勾配の方向は互いに垂直である。
いて、固体培地上で生育される微生物又は他の生物細胞
の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の物質の相互
作用効果は、以下のようにして測定される。即ち、増殖
培地表面上の方形試験領域に物質を予め定められた濃度
パターンで塗布する。尚このパターンに於いては、第１
物質の最小周界濃度が方形に於ける１辺のエッジ上にあ
り且つ最大周界濃度が反対側のエッジ上にある。又第２
物質の最小周界濃度が第３のエッジ上にあり且つ最大周
界濃度がその反対側のエッジ上にある。その後この処理
板を培養し、阻害パターンを読み、次いで予め定められ
た物質の濃度パターンに適合した読み目盛を用いて関連
する終点に於いて２種の物質の求めようとする濃度を測
定することにより、相互作用効果が測定される。従って
、第１物質は濃度勾配がＹ軸（即ち垂直方向）に沿って
あり、最大値が最小値の上方に存在する。又第２物質は
濃度勾配がＸ軸（即ち水平方向）に沿ってあり、最小濃
度がＸ軸の左側に且つ最大濃度が右側にある。このよう
に、２種の物質の濃度勾配の方向は互いに垂直である。
【００１３】本発明方法の別の態様に於いては、１種の
物質が増殖培地上の方形試験領域内に均一濃度で塗布さ
れ、第２以上の物質が上述のような濃度勾配をもって塗
布される。
物質が増殖培地上の方形試験領域内に均一濃度で塗布さ
れ、第２以上の物質が上述のような濃度勾配をもって塗
布される。
【００１４】２種の物質は、増殖培地表面の方形試験領
域上に、不活性キャリヤーを培地に接触させることによ
り塗布される。キャリヤーは非孔質材料である。このキ
ャリヤー上に両物質が所望の濃度パターンで塗布されて
いる。従って、キャリヤーを寒天表面に接触させれば、
両物質の予め定められた濃度勾配が寒天培地に移され形
成される。キャリヤーは又、異なった物質がそれぞれ別
々に定着された別個のキャリヤーであってよい。この場
合、２種の物質の予め定められた所望の濃度パターンは
、以下のようにして寒天表面上につくられる。即ち、第
１物質を有するキャリヤーを培地表面の方形試験領域上
に貼付け、物質が培地中に完全に移動するに十分な時間
経過した後キャリヤーを剥す。その後第２物質を有する
第２キャリヤーを、寒天表面上の第１物質の印影上に、
２種の物質の濃度勾配方向が互いに垂直になるように、
載せる。これにより第２物質が塗布される。
域上に、不活性キャリヤーを培地に接触させることによ
り塗布される。キャリヤーは非孔質材料である。このキ
ャリヤー上に両物質が所望の濃度パターンで塗布されて
いる。従って、キャリヤーを寒天表面に接触させれば、
両物質の予め定められた濃度勾配が寒天培地に移され形
成される。キャリヤーは又、異なった物質がそれぞれ別
々に定着された別個のキャリヤーであってよい。この場
合、２種の物質の予め定められた所望の濃度パターンは
、以下のようにして寒天表面上につくられる。即ち、第
１物質を有するキャリヤーを培地表面の方形試験領域上
に貼付け、物質が培地中に完全に移動するに十分な時間
経過した後キャリヤーを剥す。その後第２物質を有する
第２キャリヤーを、寒天表面上の第１物質の印影上に、
２種の物質の濃度勾配方向が互いに垂直になるように、
載せる。これにより第２物質が塗布される。
【００１５】３種以上の物質を同時に試験する場合、全
ての物質が所望の濃度パターンで塗布された１枚のキャ
リヤーを用いて、全ての物質を寒天上に塗布してよい。 同様に１種以上の物質を所望の濃度パターンで同一キャ
リヤー上に塗布してよいし、又寒天中の他の物質の濃度
勾配印影上に連続して塗布してよい。
ての物質が所望の濃度パターンで塗布された１枚のキャ
リヤーを用いて、全ての物質を寒天上に塗布してよい。 同様に１種以上の物質を所望の濃度パターンで同一キャ
リヤー上に塗布してよいし、又寒天中の他の物質の濃度
勾配印影上に連続して塗布してよい。
【００１６】本発明の使用に好適なキャリヤーの具体例
としては、不活性非孔質材料製、例えばポリアクリルア
ミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ
カーボネート又はその類似材料製の薄いシート類が挙げ
られる。
としては、不活性非孔質材料製、例えばポリアクリルア
ミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ
カーボネート又はその類似材料製の薄いシート類が挙げ
られる。
【００１７】本発明の器具の一態様に於いて、キャリヤ
ー上の方形試験領域は以下のように１種の物質で塗布さ
れる。即ちこの領域に於いては、１種の物質は、その最
小周界濃度が存する１辺のエッジから最大周界濃度が存
する反対側のエッジまで連続的に濃度勾配を有する。
ー上の方形試験領域は以下のように１種の物質で塗布さ
れる。即ちこの領域に於いては、１種の物質は、その最
小周界濃度が存する１辺のエッジから最大周界濃度が存
する反対側のエッジまで連続的に濃度勾配を有する。
【００１８】本発明の器具の他の態様に於いて、２種の
物質がキャリヤー上の方形領域に以下のように塗布され
る。即ちこの領域に於いては、第１物質の最小周界濃度
が１辺のエッジ上にあり、最大周界濃度が反対側のエッ
ジ上にある。又第２物質の濃度勾配は第１物質のそれと
垂直な方向にあり、且つ第２物質の最小周界濃度は第３
エッジ上にあり最大周界濃度はこれと反対側のエッジ上
にある。
物質がキャリヤー上の方形領域に以下のように塗布され
る。即ちこの領域に於いては、第１物質の最小周界濃度
が１辺のエッジ上にあり、最大周界濃度が反対側のエッ
ジ上にある。又第２物質の濃度勾配は第１物質のそれと
垂直な方向にあり、且つ第２物質の最小周界濃度は第３
エッジ上にあり最大周界濃度はこれと反対側のエッジ上
にある。
【００１９】本発明の器具の別の態様において、３種以
上の物質がキャリヤー上の方形領域に塗布される。最初
の２種の物質は上述のように塗布される。次いで別の物
質が、上記２種の物質の上面上に引続いて塗布される。 上記別の物質も又、最小周界濃度と最大周界濃度が互い
に反対側の各エッジ上に存する。
上の物質がキャリヤー上の方形領域に塗布される。最初
の２種の物質は上述のように塗布される。次いで別の物
質が、上記２種の物質の上面上に引続いて塗布される。 上記別の物質も又、最小周界濃度と最大周界濃度が互い
に反対側の各エッジ上に存する。
【００２０】本発明の器具の更に別の態様に於いて、１
種の物質が一定濃度でキャリヤーの方形領域上に塗布さ
れる。一方第２以上の物質が上述のように濃度勾配をも
って塗布される。
種の物質が一定濃度でキャリヤーの方形領域上に塗布さ
れる。一方第２以上の物質が上述のように濃度勾配をも
って塗布される。
【００２１】各物質は、自体公知の方法でキャリヤー表
面上に塗布される。例えば、濃度が決定された各抗生物
質の溶液を、徐々に量を増やしながら特定体積だけミク
ロピペットで正確に採って予め定められた濃度勾配に沿
って連続的な間隔でキャリヤーに移す。
面上に塗布される。例えば、濃度が決定された各抗生物
質の溶液を、徐々に量を増やしながら特定体積だけミク
ロピペットで正確に採って予め定められた濃度勾配に沿
って連続的な間隔でキャリヤーに移す。
【００２２】物質の別の塗布法としては、インク−ジェ
ット印刷、コンピューター制御された精密噴霧法又は他
の精密塗装法が挙げられる。
ット印刷、コンピューター制御された精密噴霧法又は他
の精密塗装法が挙げられる。
【００２３】キャリヤーは種々の形状、例えば正方形、
長方形又は円形の種々の大きさのものであってよい。各
物質はキャリヤーの方形試験領域上に塗布される。この
方形試験領域はキャリヤーの全体又は一部を含んでよい
。
長方形又は円形の種々の大きさのものであってよい。各
物質はキャリヤーの方形試験領域上に塗布される。この
方形試験領域はキャリヤーの全体又は一部を含んでよい
。
【００２４】物質の濃度勾配に適合した読み目盛りは、
キャリヤーから分離していてもよく、又キャリヤーと一
体であってもよい。読み目盛りはキャリヤーの上面側、
即ち物質が塗布される面とは反対側に貼られる。更にキ
ャリヤーの上面には又、物質名や他の関連情報でラベル
してよい。
キャリヤーから分離していてもよく、又キャリヤーと一
体であってもよい。読み目盛りはキャリヤーの上面側、
即ち物質が塗布される面とは反対側に貼られる。更にキ
ャリヤーの上面には又、物質名や他の関連情報でラベル
してよい。
【００２５】
【実施例】本発明を添付の図面を用い更に具体的に説明
する。図２〜図５で示されるチェッカー板の構成は、２
種の物質の予め定められた濃度パターンに適合した読み
目盛りによって囲まれる。図２及び図３は、１種の物質
が塗布された本発明器具の一態様を示す。図２は器具の
読み目盛りをもつ側を示す。図３はこの同じ器具のもう
一方の側を示す。尚図３に於いて、ドット（ｄｏｔ）密
度は、器具上部に於ける最大周界から底部に於ける最小
周界まで延びる物質の濃度勾配を表わす。図４及び図５
は、２種の物質が器具上に存在してチェッカー板を構成
する一態様を示す。図４は器具の読み目盛りが付いた側
を示し、図５はこの器具のもう一方側を示す。尚ドット
密度は、チェッカー板構成物中に於ける２種物質の濃度
パターンを表わす。図４に於いて、矢印は各物質の濃度
勾配の方向が垂直であることを示す。具体的に説明する
と、Ｘは物質Ａの濃度が１２μｇ／ｍｌに等しく且つ物
質Ｂが０．０１６μｇ／ｍｌである点を示す。
する。図２〜図５で示されるチェッカー板の構成は、２
種の物質の予め定められた濃度パターンに適合した読み
目盛りによって囲まれる。図２及び図３は、１種の物質
が塗布された本発明器具の一態様を示す。図２は器具の
読み目盛りをもつ側を示す。図３はこの同じ器具のもう
一方の側を示す。尚図３に於いて、ドット（ｄｏｔ）密
度は、器具上部に於ける最大周界から底部に於ける最小
周界まで延びる物質の濃度勾配を表わす。図４及び図５
は、２種の物質が器具上に存在してチェッカー板を構成
する一態様を示す。図４は器具の読み目盛りが付いた側
を示し、図５はこの器具のもう一方側を示す。尚ドット
密度は、チェッカー板構成物中に於ける２種物質の濃度
パターンを表わす。図４に於いて、矢印は各物質の濃度
勾配の方向が垂直であることを示す。具体的に説明する
と、Ｘは物質Ａの濃度が１２μｇ／ｍｌに等しく且つ物
質Ｂが０．０１６μｇ／ｍｌである点を示す。
【００２６】図６及び図７は、本発明のチェッカー板構
成の他の態様を示す。この正方形のチェッカー板は読み
目盛りで囲まれる。これにより、正方形内の如何なる場
所に於いても正確に２種の物質濃度を容易に書入れる事
が出来る。図６は、２種の物質の濃度勾配範囲が等しい
（即ち、Ａ及びＢが０．０１６〜２５６μｇ／ｍｌで存
在する。）態様を示す。一方図７では、各物質の濃度勾
配範囲が互いに異なる（即ち、Ａは０．００４〜６４μ
ｇ／ｍｌで存在し、Ｂは０．１６〜２５６μｇ／ｍｌで
存在する。）２種の物質Ａ及びＢの濃度勾配方向が垂直
である結果、正方形の４つの隅は以下の濃度を有する。 即ち低部左側の隅は、Ａの最小濃度／Ｂの最小濃度であ
り、ここより時計回り方向に各隅はそれぞれ、Ａの最大
濃度／Ｂの最小濃度、Ａの最大濃度／Ｂの最大濃度、及
びＢの最大濃度／Ａの最小濃度、である。図６及び図７
は、イソボール（ｉｓｏｂｏｌ）を示す。即ち各点を結
ぶラインは、物質Ａと物質Ｂとの比が一定であることを
示す。イソボールの１例は、最小濃度と最大濃度との間
の対角線である。ここでは一定比のＡとＢが含まれる。 対角線に平行な各ラインは、別のイソボールを構成する
。
成の他の態様を示す。この正方形のチェッカー板は読み
目盛りで囲まれる。これにより、正方形内の如何なる場
所に於いても正確に２種の物質濃度を容易に書入れる事
が出来る。図６は、２種の物質の濃度勾配範囲が等しい
（即ち、Ａ及びＢが０．０１６〜２５６μｇ／ｍｌで存
在する。）態様を示す。一方図７では、各物質の濃度勾
配範囲が互いに異なる（即ち、Ａは０．００４〜６４μ
ｇ／ｍｌで存在し、Ｂは０．１６〜２５６μｇ／ｍｌで
存在する。）２種の物質Ａ及びＢの濃度勾配方向が垂直
である結果、正方形の４つの隅は以下の濃度を有する。 即ち低部左側の隅は、Ａの最小濃度／Ｂの最小濃度であ
り、ここより時計回り方向に各隅はそれぞれ、Ａの最大
濃度／Ｂの最小濃度、Ａの最大濃度／Ｂの最大濃度、及
びＢの最大濃度／Ａの最小濃度、である。図６及び図７
は、イソボール（ｉｓｏｂｏｌ）を示す。即ち各点を結
ぶラインは、物質Ａと物質Ｂとの比が一定であることを
示す。イソボールの１例は、最小濃度と最大濃度との間
の対角線である。ここでは一定比のＡとＢが含まれる。 対角線に平行な各ラインは、別のイソボールを構成する
。
【００２７】図８と図９は、バクテリア菌が自体公知の
種々の方法で植えられた寒天板の表面上に、２種の物質
が如何して塗布されるかを示す。尚上記方法としては、
バクテリア懸濁液による寒天表面のフラッジング又はス
ワッビング、又は寒天へのバクテリア接種（即ちバクテ
リアの溶解寒天懸濁液を寒天表面上に注ぎこの層を固化
させる。）が、挙げられる。円はペトリ皿を表わす。図
８では、第１物質、たとえば抗生物質がキャリヤーを用
いて寒天表面上に塗布される。尚このキャリヤーに於い
ては、第１物質が予め定められた濃度パターンで方形領
域内に塗布されており、最小周界濃度がこの方形領域の
底部エッジ上にあり且つ最大周界濃度が頂部エッジ上に
ある。抗生物質をキャリヤー表面から寒天マトリックス
中に完全に移すのに要する時間が経過した後、即ち殆ど
の抗生物質を移すために約１時間経過させた後、キャリ
ヤーを剥す。次いで第２物質を含む第２キャリヤーを、
寒天表面と第１物質の印影上面上で正確に接触させる（
図９）。即ち、第２物質、例えば他の抗生物質の濃度勾
配の方向が第１物質のそれと垂直となり且つ第２物質の
最小濃度が方形の左側エッジ上に、最大濃度が反対側、
即ち右側のエッジ上に存するように、第２キャリヤーを
接触させる。濃度勾配が互いに垂直になるように各物質
を塗布するのを容易にするために、面上に濃度勾配の方
向がマークされたキャリヤーを用い、第１物質の塗布の
際にその濃度勾配の方向をペトリ皿上にマークするのが
、有利である。各物質が寒天中に移動した後にキャリヤ
ーを剥し、次いで新たな物質が塗布された新たなキャリ
ヤーに取換えこれを前の物質の印影上の寒天に載せる、
という操作を引続き行なう事により、更に別の物質を塗
布することが出来る。好気性バクテリアを正確に試験す
る場合は、最後のキャリヤーを１時間後に剥し、フレー
ム状の読目盛りを方形濃度勾配印影のまわりに配置し、
その後この板を培養する。嫌気性及び通性嫌気性バクテ
リアに対しては、最後のキャリヤーはそのまま適当に培
養期間中放置し、読み目盛りとして利用する。一般に、
チェッカー板構成に於ける予め定められた濃度パターン
に適合した読み目盛りは、物質の塗布前又は後に寒天板
上に貼られる。終夜培養後、阻害パターンを読む。
種々の方法で植えられた寒天板の表面上に、２種の物質
が如何して塗布されるかを示す。尚上記方法としては、
バクテリア懸濁液による寒天表面のフラッジング又はス
ワッビング、又は寒天へのバクテリア接種（即ちバクテ
リアの溶解寒天懸濁液を寒天表面上に注ぎこの層を固化
させる。）が、挙げられる。円はペトリ皿を表わす。図
８では、第１物質、たとえば抗生物質がキャリヤーを用
いて寒天表面上に塗布される。尚このキャリヤーに於い
ては、第１物質が予め定められた濃度パターンで方形領
域内に塗布されており、最小周界濃度がこの方形領域の
底部エッジ上にあり且つ最大周界濃度が頂部エッジ上に
ある。抗生物質をキャリヤー表面から寒天マトリックス
中に完全に移すのに要する時間が経過した後、即ち殆ど
の抗生物質を移すために約１時間経過させた後、キャリ
ヤーを剥す。次いで第２物質を含む第２キャリヤーを、
寒天表面と第１物質の印影上面上で正確に接触させる（
図９）。即ち、第２物質、例えば他の抗生物質の濃度勾
配の方向が第１物質のそれと垂直となり且つ第２物質の
最小濃度が方形の左側エッジ上に、最大濃度が反対側、
即ち右側のエッジ上に存するように、第２キャリヤーを
接触させる。濃度勾配が互いに垂直になるように各物質
を塗布するのを容易にするために、面上に濃度勾配の方
向がマークされたキャリヤーを用い、第１物質の塗布の
際にその濃度勾配の方向をペトリ皿上にマークするのが
、有利である。各物質が寒天中に移動した後にキャリヤ
ーを剥し、次いで新たな物質が塗布された新たなキャリ
ヤーに取換えこれを前の物質の印影上の寒天に載せる、
という操作を引続き行なう事により、更に別の物質を塗
布することが出来る。好気性バクテリアを正確に試験す
る場合は、最後のキャリヤーを１時間後に剥し、フレー
ム状の読目盛りを方形濃度勾配印影のまわりに配置し、
その後この板を培養する。嫌気性及び通性嫌気性バクテ
リアに対しては、最後のキャリヤーはそのまま適当に培
養期間中放置し、読み目盛りとして利用する。一般に、
チェッカー板構成に於ける予め定められた濃度パターン
に適合した読み目盛りは、物質の塗布前又は後に寒天板
上に貼られる。終夜培養後、阻害パターンを読む。
【００２８】図１０〜図１３は、例えば２種の抗生物質
（Ａ及びＢ）の相互作用の判定を示す。微生物の成長は
ドットで示す。一方、阻害領域、即ち全く成長が起こら
ない領域は空白部分である。これらの図及び図１５〜図
１７中、破線は単に結果の読みを容易にするための説明
的なものである。破線は、個々の物質のＭＩＣ（最小阻
害濃度）値又はＭＢＣ（最小殺菌濃度）値を表わす。阻
害領域中の湾入部の最も深い点（これは矢印で示される
。）は、被試験物質間の相互作用が最大である点を示す
、ことがこれらの図から明らかである。図１０は被試験
物質の無関係な効果、図１１は追加効果を示す。又図１
２は相反効果、図１３は相剰効果を示す。図１４は、図
１３と同じ２種の物質Ａ及びＢに及ぼす第３物質Ｃの効
果を示す。物質Ｃを寒天板の方形試験領域内に均一濃度
で塗布する。その後、物質Ａ及びＢを図１３のように塗
布する。物質Ｃは物質Ａの活性とは相反するが、物質Ｂ
の活性に無関係である。図１４から明らかなように全体
として、物質ＣはＡとＢとの相剰効果を阻害する。
（Ａ及びＢ）の相互作用の判定を示す。微生物の成長は
ドットで示す。一方、阻害領域、即ち全く成長が起こら
ない領域は空白部分である。これらの図及び図１５〜図
１７中、破線は単に結果の読みを容易にするための説明
的なものである。破線は、個々の物質のＭＩＣ（最小阻
害濃度）値又はＭＢＣ（最小殺菌濃度）値を表わす。阻
害領域中の湾入部の最も深い点（これは矢印で示される
。）は、被試験物質間の相互作用が最大である点を示す
、ことがこれらの図から明らかである。図１０は被試験
物質の無関係な効果、図１１は追加効果を示す。又図１
２は相反効果、図１３は相剰効果を示す。図１４は、図
１３と同じ２種の物質Ａ及びＢに及ぼす第３物質Ｃの効
果を示す。物質Ｃを寒天板の方形試験領域内に均一濃度
で塗布する。その後、物質Ａ及びＢを図１３のように塗
布する。物質Ｃは物質Ａの活性とは相反するが、物質Ｂ
の活性に無関係である。図１４から明らかなように全体
として、物質ＣはＡとＢとの相剰効果を阻害する。
【００２９】図１５及び図１６は、如何して殺菌相互作
用を研究するかを示す。これは、ベルベット状パッド又
は類似の器具を用い薬剤が全く存在しない別の板上に成
長阻害パターン（図１５）を複製し、或るいは寒天中に
現存する抗生物質を特定の不活性化化学物質、例えばア
ミノグリコシドを不活性にするポリアネトール硫酸ナト
リウム若しくはβ−ラクタム抗生物質を不活性にする酵
素（具体的にはβ−ラクタマーゼ）で不活性にし、その
後更にこの試験板を再培養することにより、行なわれる
。このように抗生物質が存在しない環境に於いて、一度
阻害を受けたがまだ十分に生育可能なバクテリア細胞は
阻害を受けた領域内で今度は成長し、新たな成長パター
ン（図１６）を形成する。このパターンは抗生物質併用
剤の殺菌効果又は死滅効果を反映する。
用を研究するかを示す。これは、ベルベット状パッド又
は類似の器具を用い薬剤が全く存在しない別の板上に成
長阻害パターン（図１５）を複製し、或るいは寒天中に
現存する抗生物質を特定の不活性化化学物質、例えばア
ミノグリコシドを不活性にするポリアネトール硫酸ナト
リウム若しくはβ−ラクタム抗生物質を不活性にする酵
素（具体的にはβ−ラクタマーゼ）で不活性にし、その
後更にこの試験板を再培養することにより、行なわれる
。このように抗生物質が存在しない環境に於いて、一度
阻害を受けたがまだ十分に生育可能なバクテリア細胞は
阻害を受けた領域内で今度は成長し、新たな成長パター
ン（図１６）を形成する。このパターンは抗生物質併用
剤の殺菌効果又は死滅効果を反映する。
【００３０】即ち図１５は成長阻害パターンを、図１６
は死滅パターンを示す。これらの具体例では、成長阻害
パターンは被試験物質間の相互作用が無関係であること
を示し、死滅パターンは２種の物質の殺菌相互作用が相
剰的であることを示す。
は死滅パターンを示す。これらの具体例では、成長阻害
パターンは被試験物質間の相互作用が無関係であること
を示し、死滅パターンは２種の物質の殺菌相互作用が相
剰的であることを示す。
【００３１】図１７は、如何して結果が判定され定量さ
れるかを示す。読み目盛りを用いて各化合物（例えば２
種の抗生物質）間の相互作用が定量され、又異なった値
が読まれる。抗生物質の相互作用を定量し判定する場合
、個々の抗生物質は単独に使用したときのそれぞれのＭ
ＩＣ値又はＭＢＣ値を、これらの物質を併用して用いた
ときのそれぞれの濃度と比較する。次いでこれらの値を
用いて分数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）阻害濃度（ＦＩＣ
）指数又は分数殺菌濃度（ＦＢＣ）指数を以下の式：
ＦＩＣ＝ＦＩＣＡ＋ＦＩＣＢ＝（ＣＡ／Ｂ／ＭＩＣＡ
）＋（ＣＢ／Ａ／ＭＩＣＢ） ［式中、Ａ及びＢは２種の物質であり、ＣＡ／Ｂは相互
作用最大点に於けるＢ存在下のＡの濃度でありＣＢ／Ａ
は相互作用最大点におけるＡ存在下のＢの濃度であり、
ＭＩＣＡはＡの最小阻害濃度でありＭＩＣＢはＢの最小
阻害濃度である。］ ＦＢＣ＝ＦＢＣＡ＋ＦＢＣＢ＝（ＣＡ／Ｂ／ＭＢＣ
Ａ）＋（ＣＢ／Ａ／ＭＢＣＢ） ［式中、Ａ、Ｂ、ＣＡ／Ｂ及びＣＢ／Ａは前記と同意義
であり、ＭＢＣＡはＡの最小殺菌濃度でありＭＢＣＢは
Ｂの最小殺菌濃度である。］に従って計算する。これら
の定義は、「ラボ医薬に於ける抗生物質」［クログスタ
ッド（Ｋｒｏｇｓｔａｄ）等、ローリアン（Ｌｏｒｉａ
ｎ）、１９８６年、第５４５頁］に記載される。
れるかを示す。読み目盛りを用いて各化合物（例えば２
種の抗生物質）間の相互作用が定量され、又異なった値
が読まれる。抗生物質の相互作用を定量し判定する場合
、個々の抗生物質は単独に使用したときのそれぞれのＭ
ＩＣ値又はＭＢＣ値を、これらの物質を併用して用いた
ときのそれぞれの濃度と比較する。次いでこれらの値を
用いて分数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）阻害濃度（ＦＩＣ
）指数又は分数殺菌濃度（ＦＢＣ）指数を以下の式：
ＦＩＣ＝ＦＩＣＡ＋ＦＩＣＢ＝（ＣＡ／Ｂ／ＭＩＣＡ
）＋（ＣＢ／Ａ／ＭＩＣＢ） ［式中、Ａ及びＢは２種の物質であり、ＣＡ／Ｂは相互
作用最大点に於けるＢ存在下のＡの濃度でありＣＢ／Ａ
は相互作用最大点におけるＡ存在下のＢの濃度であり、
ＭＩＣＡはＡの最小阻害濃度でありＭＩＣＢはＢの最小
阻害濃度である。］ ＦＢＣ＝ＦＢＣＡ＋ＦＢＣＢ＝（ＣＡ／Ｂ／ＭＢＣ
Ａ）＋（ＣＢ／Ａ／ＭＢＣＢ） ［式中、Ａ、Ｂ、ＣＡ／Ｂ及びＣＢ／Ａは前記と同意義
であり、ＭＢＣＡはＡの最小殺菌濃度でありＭＢＣＢは
Ｂの最小殺菌濃度である。］に従って計算する。これら
の定義は、「ラボ医薬に於ける抗生物質」［クログスタ
ッド（Ｋｒｏｇｓｔａｄ）等、ローリアン（Ｌｏｒｉａ
ｎ）、１９８６年、第５４５頁］に記載される。
【００３２】ＦＩＣ指数の勾配は読み目盛りの対角線に
沿って（図１７参照）、又は対角線に平行な線に沿って
求められる。ＦＩＣ指数が０．５以下の場合は相剰的効
果であり、ほぼ１の場合は無関係又は付加的効果であり
、２．０以上のときは相反的効果であることが、一般に
認められている。このようにＡとＢとの併用効果は、Ｆ
ＩＣ指数項を用い、チェッカー板内側の阻害パターンの
境界ラインとＦＩＣ指数勾配の対角線との交点を読むこ
とにより、直接判定され定量される。例えば図示した例
では、個々の抗生物質Ａ及びＢのＭＩＣ値はそれぞれ境
界ラインと垂直目盛り又は水平目盛りとの交点から読ま
れる。図１７中相互作用が最適である点、即ち阻害パタ
ーンに於ける湾入部の最も入り込んだところ（矢印で示
す。）に於いては、ＣＡ／Ｂは０．５μｇ／ｍｌであり
ＣＢ／Ａは０．５μｇ／ｍｌである。更に図１７に於い
ては、ＭＩＣＡは８μｇ／ｍｌでありＭＩＣＢは８μｇ
／ｍｌである。従って前記式に従って、この点に於いて
は： ＦＩＣ＝（０．５／８）＋（０．５／８）＝０．１２５
である。図１７の場合、ＦＩＣ指数が０．１２５である
ことは、阻害パターンの境界ラインとＦＩＣ指数勾配と
の交点を単に読むだけで直接判り、物質ＡとＢとの相剰
効果に関し直ちに定量的な答えが与えられる。
沿って（図１７参照）、又は対角線に平行な線に沿って
求められる。ＦＩＣ指数が０．５以下の場合は相剰的効
果であり、ほぼ１の場合は無関係又は付加的効果であり
、２．０以上のときは相反的効果であることが、一般に
認められている。このようにＡとＢとの併用効果は、Ｆ
ＩＣ指数項を用い、チェッカー板内側の阻害パターンの
境界ラインとＦＩＣ指数勾配の対角線との交点を読むこ
とにより、直接判定され定量される。例えば図示した例
では、個々の抗生物質Ａ及びＢのＭＩＣ値はそれぞれ境
界ラインと垂直目盛り又は水平目盛りとの交点から読ま
れる。図１７中相互作用が最適である点、即ち阻害パタ
ーンに於ける湾入部の最も入り込んだところ（矢印で示
す。）に於いては、ＣＡ／Ｂは０．５μｇ／ｍｌであり
ＣＢ／Ａは０．５μｇ／ｍｌである。更に図１７に於い
ては、ＭＩＣＡは８μｇ／ｍｌでありＭＩＣＢは８μｇ
／ｍｌである。従って前記式に従って、この点に於いて
は： ＦＩＣ＝（０．５／８）＋（０．５／８）＝０．１２５
である。図１７の場合、ＦＩＣ指数が０．１２５である
ことは、阻害パターンの境界ラインとＦＩＣ指数勾配と
の交点を単に読むだけで直接判り、物質ＡとＢとの相剰
効果に関し直ちに定量的な答えが与えられる。
【００３３】本発明の「チェッカー板」測定法を実施す
る場合、ＦＩＣ値は阻害パターンの最も入り込んだ湾入
部に於いてＦＩＣ目盛りを読むことで直接与えられる。 尚ＦＩＣ目盛りは、試験キャリヤー上に予め印刷されて
いてもよく、又別個の読み目盛りとしてキャリヤーとは
分離して存在してもよい。
る場合、ＦＩＣ値は阻害パターンの最も入り込んだ湾入
部に於いてＦＩＣ目盛りを読むことで直接与えられる。 尚ＦＩＣ目盛りは、試験キャリヤー上に予め印刷されて
いてもよく、又別個の読み目盛りとしてキャリヤーとは
分離して存在してもよい。
【００３４】成長促進剤及び他の栄養剤間の相互作用を
研究する場合、上記抗生物質の併用物に対する場合と同
様の方法が用いられる。図１８に成長パターンを示す。 ここで、成長促進濃度は成長を支えるのに要する濃度、
並びに２種物質の濃度と比を意味する。尚２種物質の相
互作用効果は任意である。
研究する場合、上記抗生物質の併用物に対する場合と同
様の方法が用いられる。図１８に成長パターンを示す。 ここで、成長促進濃度は成長を支えるのに要する濃度、
並びに２種物質の濃度と比を意味する。尚２種物質の相
互作用効果は任意である。
【００３５】「微生物」とは、バクテリア、例えば腸内
細菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ヘモフィールス（ｈｅｍ
ｏｆｉｌｕｓ）、ネイセリア科、バクテリオイド及びク
ロストリジウム、マイコバクテリア、放線菌、マイコブ
ラズマ、ノカルジア、ウィルス、及び真菌、例えば糸状
菌、イースト菌及びカンジダを云う。「生物細胞」とし
ては、ガン細胞、正常な人間の細胞、動物細胞及び植物
細胞、「幹細胞」タイプのもの、が挙げられる。
細菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ヘモフィールス（ｈｅｍ
ｏｆｉｌｕｓ）、ネイセリア科、バクテリオイド及びク
ロストリジウム、マイコバクテリア、放線菌、マイコブ
ラズマ、ノカルジア、ウィルス、及び真菌、例えば糸状
菌、イースト菌及びカンジダを云う。「生物細胞」とし
ては、ガン細胞、正常な人間の細胞、動物細胞及び植物
細胞、「幹細胞」タイプのもの、が挙げられる。
【００３６】「物質」とは、成長促進剤及び成長阻害剤
、並びに自体本質的に活性ではないが別の物質の活性に
対し増強（相剰）効果又は相反効果を及ぼす物質を云う
。成長阻害剤の例としては、抗菌物質、例えば抗生物質
、具体的にはアミノグリコサイド、β−ラクタム抗生物
質、マクロライド抗生物質、ポリミキシン、ポリペプチ
ド及び他の化学療法剤、例えばスルホンアミド、抗真菌
剤、具体的には５−フルオロシトシン、アムホテリシン
、抗ウィルス剤、例えばアデニンアラビノシド（Ａｎａ
−Ａ）、トリフルオロチミジン；抗結核剤、例えばイソ
ニアジド及びシクロセリン；抗ガン剤、例えばシクロホ
スホアミド，メトトレキサート、５−フルオロウラシル
及びマイトマイシン、消毒剤、防腐剤及び保存剤、例え
ばクロロヘキシジン、エタノール及び塩化ベンズアルコ
ニウム、が挙げられる。β−ラクタマーゼ酵素インヒビ
ターのような物質、例えばクラブラン酸（ｃｌａｖｕｌ
ａｎｉｃ ａｃｉｄ）及びｐＨ−調整化合物、例えば
緩衝液は、本質的には活性を有さないが、他の物質の効
果を増大又は低減し得る。
、並びに自体本質的に活性ではないが別の物質の活性に
対し増強（相剰）効果又は相反効果を及ぼす物質を云う
。成長阻害剤の例としては、抗菌物質、例えば抗生物質
、具体的にはアミノグリコサイド、β−ラクタム抗生物
質、マクロライド抗生物質、ポリミキシン、ポリペプチ
ド及び他の化学療法剤、例えばスルホンアミド、抗真菌
剤、具体的には５−フルオロシトシン、アムホテリシン
、抗ウィルス剤、例えばアデニンアラビノシド（Ａｎａ
−Ａ）、トリフルオロチミジン；抗結核剤、例えばイソ
ニアジド及びシクロセリン；抗ガン剤、例えばシクロホ
スホアミド，メトトレキサート、５−フルオロウラシル
及びマイトマイシン、消毒剤、防腐剤及び保存剤、例え
ばクロロヘキシジン、エタノール及び塩化ベンズアルコ
ニウム、が挙げられる。β−ラクタマーゼ酵素インヒビ
ターのような物質、例えばクラブラン酸（ｃｌａｖｕｌ
ａｎｉｃ ａｃｉｄ）及びｐＨ−調整化合物、例えば
緩衝液は、本質的には活性を有さないが、他の物質の効
果を増大又は低減し得る。
【００３７】成長促進剤としては、例えばビタミン、ホ
ルモン、アミノ酸及び稀少成分が挙げられる。栄養剤と
しては、炭水化物、ペプトン、窒素化合物及び脂肪酸が
挙げられる。発ガン性、変異原性及び奇形発生効果を有
する薬剤としては、シクロホスホアミド、ヒドロキシル
アミン及びメトトレキサートが挙げられる。
ルモン、アミノ酸及び稀少成分が挙げられる。栄養剤と
しては、炭水化物、ペプトン、窒素化合物及び脂肪酸が
挙げられる。発ガン性、変異原性及び奇形発生効果を有
する薬剤としては、シクロホスホアミド、ヒドロキシル
アミン及びメトトレキサートが挙げられる。
【図１】 従来の試験管を用いたチェッカー板滴定法
を示す。
を示す。
【図２】 １種の物質が塗布された器具を示す。
【図３】 １種の物質が塗布された器具を示す。
【図４】 連続的チェッカー板構成を示す。
【図５】 連続的チェッカー板構成を示す。
【図６】 図４と同じチェッカー板構成であるが、各
物質の最大及び最小周界濃度、並びにそれらの濃度比の
イソボールを示す。
物質の最大及び最小周界濃度、並びにそれらの濃度比の
イソボールを示す。
【図７】 図４と同じチェッカー板構成であるが、各
物質の最大及び最小周界濃度、並びにそれらの濃度比の
イソボールを示す。
物質の最大及び最小周界濃度、並びにそれらの濃度比の
イソボールを示す。
【図８】 図２及び図３の器具を用いて、如何して各
物質が培地表面上に連続的に塗布されるかを示す。
物質が培地表面上に連続的に塗布されるかを示す。
【図９】 図２及び図３の器具を用いて、如何して各
物質が培地表面上に連続的に塗布されるかを示す。
物質が培地表面上に連続的に塗布されるかを示す。
【図１０】 各物質間の相互作用の判定を示す。
【図１１】 各物質間の相互作用の判定を示す。
【図１２】 各物質間の相互作用の判定を示す。
【図１３】 各物質間の相互作用の判定を示す。
【図１４】 各物質間の相互作用の判定を示す。
【図１５】 如何して殺菌相互作用が研究されるかを
示す。
示す。
【図１６】 如何して殺菌相互作用が研究されるかを
示す。
示す。
【図１７】 各物質間の相互作用の定量法を示す。
【図１８】 成長促進剤間の相互作用を示す。
Ｘ 物質Ａの濃度が１２μｇ／ｍｌで物質Ｂの濃度が
０．０１６μｇ／ｍｌである点 ＦＩＣ 分数阻害濃度
０．０１６μｇ／ｍｌである点 ＦＩＣ 分数阻害濃度
Claims (14)
- 【請求項１】 固体培地上で成育される微生物又は他
の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の
物質の相互作用効果を定量測定するための器具に於いて
、器具が不活性非孔質キャリヤーを含み、該キャリヤー
の一方の面上の方形試験領域上に２種の物質が存在し、
該方形試験領域がキャリヤーの全体又は一部を含み、第
１物質の最小周界濃度が方形試験領域の１辺のエッジ上
に存在し且つ最大周界濃度が反対側の第２エッジ上に存
在し、第２物質の濃度勾配が第１物質のそれとは垂直な
方向に延び第２物質の最小周界濃度が方形試験領域の第
３エッジ上に存在し且つ最大周界濃度が反対側の第４エ
ッジ上に存在する、ことを特徴とする相互作用効果を定
量測定するための器具。 - 【請求項２】 固体培地上で成育される微生物又は他
の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の
物質の相互作用効果を定量測定するための器具に於いて
、器具が不活性非孔質キャリヤーを含み、該キャリヤー
の一方の面上の方形試験領域上に３種以上の物質が存在
し、該方形試験領域がキャリヤーの全体又は一部を含み
、第１物質の最小周界濃度が方形試験領域の１辺のエッ
ジ上に存在し且つ最大周界濃度が反対側の第２エッジ上
に存在し、第２物質の濃度勾配が第１物質のそれとは垂
直な方向に延び第２物質の最小周界濃度が方形試験領域
の第３エッジに存在し且つ最大周界濃度が反対側の第４
エッジ上に存在し、初めの２種物質の表面上に第３又は
それ以上の物質が存在し且つそれらの最小及び最大周界
濃度も又方形試験領域の相対する両側のエッジ上に存在
する、ことを特徴とする相互作用効果を定量測定するた
めの器具。 - 【請求項３】 固体培地上で成育される微生物の成長
促進又は成長阻害に及ぼす２種物質の相互作用効果を定
量測定するための器具に於いて、器具が不活性非孔質キ
ャリヤーを含み、該キャリヤーの一方の面上の方形試験
領域上に２種の物質が存在し、該方形試験領域がキャリ
ヤーの全体又は一部を含み、第１物質が方形試験領域内
に均一濃度で存在し、第２物質の最小周界濃度が方形試
験領域の１辺のエッジ上に存在し且つ最大周界濃度が反
対側のエッジ上に存在する、ことを特徴とする相互作用
効果を定量測定するための器具。 - 【請求項４】 固体培地上で成育される微生物又は他
の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす３種以上の
物質の相互作用効果を定量測定するための器具に於いて
、器具が不活性非孔質キャリヤーを含み、該キャリヤー
の一方の面上の方形試験領域上に３種以上の物質が存在
し、該方形試験領域がキャリヤーの全体又は一部を含み
、第１物質が方形試験領域内に均一濃度で存在し、第２
物質の最小周界濃度が方形試験領域の１辺のエッジ上に
存在し且つ最大周界濃度が反対側のエッジ上に存在し、
初めの２種物質の表面上に第３又はそれ以上の物質が存
在し且つそれらの最小及び最大周界濃度も又方形試験領
域の相対する両側のエッジ上に存在する、ことを特徴と
する相互作用効果を定量測定するための器具。 - 【請求項５】 固体培地上で成育される微生物又は他
の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の
物質の相互作用効果を定量測定するための器具に於いて
、器具が不活性非孔質キャリヤーを含み、該キャリヤー
の一方の面上の方形試験領域上に１種の物質が存在し、
該方形試験領域がキャリヤーの全体又は一部を含み、キ
ャリヤーの１辺のエッジ上の最小周界濃度から方形試験
領域の反対側のエッジ上の最大周界濃度まで該物質の濃
度勾配が延びる、ことを特徴とする相互作用効果を定量
測定するための器具。 - 【請求項６】 固体培地上で成育される微生物の成長
促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の物質の相互作用効
果を定量測定するための器具に於いて、器具が不活性非
孔質キャリヤーを含み、該キャリヤーの一方の面上の方
形試験領域上に１種の物質が均一濃度で存在する、こと
を特徴とする相互作用効果を定量測定するための器具。 - 【請求項７】 器具がキャリヤーに取付けられた読み
目盛りを更に含むことを特徴とする請求項１〜６に何れ
かに記載の器具。 - 【請求項８】 器具が物質濃度用読み目盛り、並びに
分数阻害濃度指数用及び／又は分数殺菌濃度指数用読み
目盛りを含む、ことを特徴とする請求項７記載の器具。 - 【請求項９】 固体培地上で成育される微生物又は他
の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上の
物質の相互作用効果を定量測定するための方法に於いて
、寒天培地表面上の方形試験領域内に物質を予め定めら
れた濃度パターンで塗布し、該パターンに於いて第１物
質の最小周界濃度が方形試験領域の１辺のエッジ上に存
在し且つ最大周界濃度が反対側の第２エッジ上に存在し
そして第２物質の最小周界濃度が第３エッジ上に存在し
且つ最大周界濃度が反対側の第４エッジ上に存在し、こ
の処理板を培養し、阻害、死滅又は促進パターンを読み
、そして物質の予め定められた濃度パターンに適合され
た読み目盛りを用いて物質濃度を関連する終点に於いて
測定する各段階、を特徴とする相互作用効果を定量測定
するための方法。 - 【請求項１０】 固体培地上で成育される微生物又は
他の生物細胞の成長促進又は成長阻害に及ぼす２種以上
の物質の相互作用効果を定量測定するための方法に於い
て、寒天培地表面上の方形試験領域内に物質を予め定め
られた濃度パターンで塗布し、該パターンに於いて第１
物質が方形試験領域内に均一濃度で存在しそして第２物
質の最小周界濃度が方形試験領域の１辺のエッジ上に存
在し且つ最大周界濃度が反対側のエッジ上に存在し、こ
の処理板を培養し、阻害、死滅又は促進パターンを読み
、そして物質の予め定められた濃度パターンに適合され
た読み目盛りを用いて物質濃度を関連する終点に於いて
測定する各段階、を特徴とする相互作用効果を定量測定
するための方法。 - 【請求項１１】 第３以上の物質が、寒天板表面上の
同じ方形試験領域内に初めの２種物質と同様に塗布され
最小及び最大周界濃度が方形試験領域に於ける相対する
エッジ上に存在する、ことを特徴とする請求項９〜１０
の何れかに記載の方法。 - 【請求項１２】 各物質の濃度パターンが寒天板表面
上に同時に塗布される、ことを特徴とする請求項９〜１
１の何れかに記載の方法。 - 【請求項１３】 １種の物質が寒天板表面上の方形試
験領域内に先ず塗布され、その後第２物質が同じ方形試
験領域内に塗布され、両物質が濃度勾配をもって塗布さ
れる場合には第２物質の濃度勾配の方向が第１物質のそ
れと垂直になるように各物質が塗布される、ことを特徴
とする請求項９〜１１の何れかに記載の方法。 - 【請求項１４】 第３以上の物質が、寒天板の表面上
の同じ方形試験領域内に初めの２種物質と同様にして引
続き塗布され最小及び最大周界濃度が方形試験領域に於
ける相対するエッジ上に存在する、ことを特徴とする請
求項１３に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90850087A EP0444390B1 (en) | 1990-03-02 | 1990-03-02 | Method and device for studying and quantifying interacting effects of substances on biological cells |
| SE90850087.9 | 1990-03-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211358A true JPH04211358A (ja) | 1992-08-03 |
| JP3192433B2 JP3192433B2 (ja) | 2001-07-30 |
Family
ID=8206049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03605891A Expired - Lifetime JP3192433B2 (ja) | 1990-03-02 | 1991-03-01 | 生物細胞に及ぼす物質の相互作用効果の研究及び定量方法及び器具 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0444390B1 (ja) |
| JP (1) | JP3192433B2 (ja) |
| AT (1) | ATE140487T1 (ja) |
| AU (1) | AU7198491A (ja) |
| CA (1) | CA2037181A1 (ja) |
| DE (1) | DE69027845T2 (ja) |
| ES (1) | ES2090117T3 (ja) |
| FI (1) | FI910999A7 (ja) |
| NO (1) | NO910817L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270003A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Akita Prefecture | 変異株選抜培地および該培地の調製方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE184652T1 (de) * | 1993-01-15 | 1999-10-15 | Univ Minnesota | Verfahren zur voraussage des bakterienzuwachses auf einer oberfläche |
| GB9313052D0 (en) * | 1993-06-24 | 1993-08-11 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of microbial growth |
| US5883074A (en) * | 1995-02-08 | 1999-03-16 | Microcide Pharmaceuticals, Inc. | Potentiators of antibacterial agents |
| SE522297C2 (sv) | 2001-05-17 | 2004-01-27 | Biodisk Ab | Förfarande och anordning för anbringande av tunna föremål samt användning av förpackning för de tunna föremålen |
| IT1395483B1 (it) | 2009-09-21 | 2012-09-28 | Liofilchem Srl | Striscia di carta per la determinazione della concentrazione minima inibente (cmi) di molecole antibiotiche. |
| PL442949A1 (pl) * | 2022-11-25 | 2024-05-27 | Biomaxima Spółka Akcyjna | Pasek testowy do wykrywania minimalnego stężenia hamującego (MIC) |
| PL442950A1 (pl) * | 2022-11-25 | 2024-05-27 | Biomaxima Spółka Akcyjna | Pasek testowy do wykrywania minimalnego stężenia hamującego (MIC) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH389164A (de) * | 1958-08-25 | 1965-03-15 | Goetz Alexander Dr Prof | Verfahren zur Beeinflussung des Wachstums von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien oder dergleichen |
| SE403382B (sv) * | 1974-03-12 | 1978-08-14 | Orion Yhtyme Oy Orion Diagnost | Sett vid undersokning av effekten av ett biologiskt aktivt emne pa tillvexten av mikroorganismer som odlas pa ett fast eller gelformigt odlingsmedium |
| ATE45043T1 (de) * | 1984-04-03 | 1989-08-15 | Biodisk Ab | Verfahren und vorrichtung zum produzieren von mustern wechselnder konzentrationen von chemisch oder biologisch aktiven substanzen. |
| SE456246B (sv) * | 1985-08-01 | 1988-09-19 | Biodisk Ab | Anordning for kenslighetsbestemning av mikroorganismer innefattande en icke-poros testremsa med tva olika testsubstanser |
-
1990
- 1990-03-02 ES ES90850087T patent/ES2090117T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-02 DE DE69027845T patent/DE69027845T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-02 EP EP90850087A patent/EP0444390B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-02 AT AT90850087T patent/ATE140487T1/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-02-27 CA CA002037181A patent/CA2037181A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-28 FI FI910999A patent/FI910999A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-03-01 NO NO91910817A patent/NO910817L/no unknown
- 1991-03-01 JP JP03605891A patent/JP3192433B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-01 AU AU71984/91A patent/AU7198491A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270003A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Akita Prefecture | 変異株選抜培地および該培地の調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2037181A1 (en) | 1991-09-03 |
| ES2090117T3 (es) | 1996-10-16 |
| JP3192433B2 (ja) | 2001-07-30 |
| FI910999L (fi) | 1991-09-03 |
| DE69027845D1 (de) | 1996-08-22 |
| NO910817D0 (no) | 1991-03-01 |
| EP0444390A1 (en) | 1991-09-04 |
| FI910999A0 (fi) | 1991-02-28 |
| ATE140487T1 (de) | 1996-08-15 |
| NO910817L (no) | 1991-09-03 |
| EP0444390B1 (en) | 1996-07-17 |
| AU7198491A (en) | 1991-09-05 |
| DE69027845T2 (de) | 1996-11-21 |
| FI910999A7 (fi) | 1991-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hewitt | Theory and application of microbiological assay | |
| Minassian et al. | A comparison between single-dose fosfomycin trometamol (Monuril®) and a 5-day course of trimethoprim in the treatment of uncomplicated lower urinary tract infection in women | |
| Gould et al. | The determination of bacterial sensitivity to antibiotics | |
| US5501959A (en) | Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents | |
| US5639632A (en) | Method and device for studying and quantifying interacting effects of substances on biological cells | |
| Motyl et al. | Basic microbiological techniques used in antibacterial drug discovery | |
| JP3192433B2 (ja) | 生物細胞に及ぼす物質の相互作用効果の研究及び定量方法及び器具 | |
| HUT67913A (en) | Unit and method for the detection of residues of antibacterial compaunds in liquids | |
| Cedeiio et al. | Susceptibility testing of Entamoeba histolytica | |
| Levison | Microbiological agar diffusion assay for metronidazole concentrations in serum | |
| WO2019012321A1 (en) | TEST DEVICE FOR DETERMINING MINIMUM INHIBITOR CONCENTRATION AND ANTIMICROBIAL RESISTANCE IN PATHOGENIC / NON-PATHOGENIC ORGANISMS | |
| CN111789831A (zh) | 苯乙肼在制备抗脓肿分枝杆菌感染的药物中的应用 | |
| CN111870594A (zh) | 苯乙肼在制备抗偶发分枝杆菌感染的药物中的应用 | |
| US7960136B2 (en) | Direct antimicrobial susceptibility assay | |
| Veeraraghavan et al. | Antimicrobial Susceptibility Testing Methods for Acinetobacter spp. | |
| Mohamed | New simple and validated densitometric method for determination of amoxicillin and cloxacillin interaction | |
| CN1301111C (zh) | 三氟拉嗪在制备辐射增敏药物中的应用 | |
| Mayo | Chemical methods of control: Antimicrobial drugs | |
| Sabath | Rapid assay of some nephrotoxic antibiotics and the assay of antibiotics in mixtures | |
| CN100372941C (zh) | 快速结核分支杆菌培养基 | |
| Annear et al. | The agar dilution method of testing the sensitivity of bacteria to antibiotics | |
| Lorian et al. | Quantitative bacteriological analysis of sputum as a test of antibiotic efficacy | |
| JPS6192597A (ja) | 細菌の薬剤感受性検査方法 | |
| Garrod et al. | Tests of bacterial sensitivity to drugs | |
| Bowie | The clinical laboratory aspect of antibiotic therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090525 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100525 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110525 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |