JPH04211370A - 新規プロテアーゼ - Google Patents
新規プロテアーゼInfo
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- JPH04211370A JPH04211370A JP2463391A JP2463391A JPH04211370A JP H04211370 A JPH04211370 A JP H04211370A JP 2463391 A JP2463391 A JP 2463391A JP 2463391 A JP2463391 A JP 2463391A JP H04211370 A JPH04211370 A JP H04211370A
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- JP
- Japan
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- dna
- protease
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，ポリペプチドのアミノ
酸配列中のグルタミン酸残基のＣ末端を特異的に開裂す
る新規プロテアーゼ，該プロテアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列，該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター，該発現ベ
クターを有する形質転換体，および該形質転換体を用い
たプロテアーゼの製造方法に関する。
酸配列中のグルタミン酸残基のＣ末端を特異的に開裂す
る新規プロテアーゼ，該プロテアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列，該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター，該発現ベ
クターを有する形質転換体，および該形質転換体を用い
たプロテアーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】スタフィロコッカス アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；以下，Ｓ
． ａｕｒｅｕｓとする）Ｖ８株由来のＶ８プロテアー
ゼが知られている。この酵素はセリンプロテアーゼであ
り，タンパク（ポリペプチド）に作用して，グルタミン
酸（Ｇｌｕ）残基のＣ末端を特異的に開裂する。Ｃ．Ｃ
ａｒｍｏｎａ ら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
，１５，６７５７（１９８７））は，この酵素をコード
するＤＮＡ配列をクローン化している（配列表２）。
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；以下，Ｓ
． ａｕｒｅｕｓとする）Ｖ８株由来のＶ８プロテアー
ゼが知られている。この酵素はセリンプロテアーゼであ
り，タンパク（ポリペプチド）に作用して，グルタミン
酸（Ｇｌｕ）残基のＣ末端を特異的に開裂する。Ｃ．Ｃ
ａｒｍｏｎａ ら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
，１５，６７５７（１９８７））は，この酵素をコード
するＤＮＡ配列をクローン化している（配列表２）。
【０００３】Ｖ８プロテアーゼは，分析などの目的のた
めにタンパクを上記位置で特異的に切断したい場合；遺
伝子組換え技術により目的タンパクを融合タンパクとし
て生産させた場合に，該融合タンパクを切断して目的の
タンパクを得る場合などに有用である。後者の場合では
，目的タンパクをＧｌｕ残基を介して他のタンパクと結
合させて生産した後，この酵素で切断処理することによ
り目的タンパクを分離することができる。そのため，上
記以外にもこのような酵素活性を有するプロテアーゼが
さらに求められている。
めにタンパクを上記位置で特異的に切断したい場合；遺
伝子組換え技術により目的タンパクを融合タンパクとし
て生産させた場合に，該融合タンパクを切断して目的の
タンパクを得る場合などに有用である。後者の場合では
，目的タンパクをＧｌｕ残基を介して他のタンパクと結
合させて生産した後，この酵素で切断処理することによ
り目的タンパクを分離することができる。そのため，上
記以外にもこのような酵素活性を有するプロテアーゼが
さらに求められている。
【０００４】
【発明の目的】本発明の目的は，Ｇｌｕ残基のＣ末端を
特異的に開裂する酵素活性を有する新規のＶ８様プロテ
アーゼ，該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列，該Ｄ
ＮＡ配列を有する発現ベクター，該発現ベクターを有す
る形質転換体，および該形質転換体を用いたプロテアー
ゼの製造方法を提供することにある。
特異的に開裂する酵素活性を有する新規のＶ８様プロテ
アーゼ，該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列，該Ｄ
ＮＡ配列を有する発現ベクター，該発現ベクターを有す
る形質転換体，および該形質転換体を用いたプロテアー
ゼの製造方法を提供することにある。
【０００５】
【発明の構成】発明者らは，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ のＶ
８株以外の菌株からＶ８プロテアーゼと同様の活性を有
するＶ８様プロテアーゼを得ようと種々の検討を行った
。その結果，Ｓ． ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ １２６００
株のゲノムＤＮＡに新規のＶ８様プロテアーゼをコード
するＤＮＡ配列を見い出し，本発明を完成するに至った
。
８株以外の菌株からＶ８プロテアーゼと同様の活性を有
するＶ８様プロテアーゼを得ようと種々の検討を行った
。その結果，Ｓ． ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ １２６００
株のゲノムＤＮＡに新規のＶ８様プロテアーゼをコード
するＤＮＡ配列を見い出し，本発明を完成するに至った
。
【０００６】本発明のプロテアーゼは，配列表１に示さ
れる＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａまでのアミ
ノ酸配列を含む。
れる＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａまでのアミ
ノ酸配列を含む。
【０００７】好適な実施態様によれば，本発明のプロテ
アーゼは，配列表１に示される−６８位のＭｅｔから＋
２８９位のＡｌａまでのアミノ酸配列を含む。
アーゼは，配列表１に示される−６８位のＭｅｔから＋
２８９位のＡｌａまでのアミノ酸配列を含む。
【０００８】本発明のＤＮＡ配列は，上記プロテアーゼ
をコードする。
をコードする。
【０００９】好適な実施態様によれば，本発明のＤＮＡ
配列は，配列表１の５５６位のＧから１４２２位のＡで
なる塩基配列を有する。
配列は，配列表１の５５６位のＧから１４２２位のＡで
なる塩基配列を有する。
【００１０】好適な実施態様によれば，上記ＤＮＡ配列
は，配列表１の３５２位のＡから１４２２位のＡでなる
塩基配列を有する。
は，配列表１の３５２位のＡから１４２２位のＡでなる
塩基配列を有する。
【００１１】本発明の発現ベクターは，上記ＤＮＡ配列
を有する。
を有する。
【００１２】本発明の形質転換体は，上記発現ベクター
を宿主に導入して得られる。
を宿主に導入して得られる。
【００１３】本発明のプロテアーゼの製造方法は，上記
記載の形質転換体を培養する工程，および生産されたプ
ロテアーゼを該培地から採取する工程を包含する。
記載の形質転換体を培養する工程，および生産されたプ
ロテアーゼを該培地から採取する工程を包含する。
【００１４】以下に，本発明を説明するうえで用いられ
る用語を説明する。
る用語を説明する。
【００１５】“オリゴヌクレオチド”とは，短い一本鎖
ＤＮＡを意味する。オリゴヌクレオチドは，既知の方法
により化学合成することができる。本発明に用いるオリ
ゴヌクレオチドは，特に明示しない限り，化学合成され
，セファデックスＧ５０を用いたゲルクロマトグラフィ
ーおよび逆相シリゲルカラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により精製して得られる。
ＤＮＡを意味する。オリゴヌクレオチドは，既知の方法
により化学合成することができる。本発明に用いるオリ
ゴヌクレオチドは，特に明示しない限り，化学合成され
，セファデックスＧ５０を用いたゲルクロマトグラフィ
ーおよび逆相シリゲルカラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により精製して得られる。
【００１６】“ＰＣＲ”とは，ポリメラーゼチェインリ
アクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）の略であり，ＤＮＡ上の一定の領域を酵
素的に増幅させる方法を意味する（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ， ２３９，４８７−４９７（１９８８））
。まず，増幅したいＤＮＡを熱変性させて一本鎖とし，
この一本鎖の鋳型ＤＮＡのそれぞれの３’末端領域に相
補的なオリゴヌクレオチドプライマー（センス鎖および
アンチセンス鎖の２種類）をアニーリングさせる。次に
，ＤＮＡポリメラーゼの作用によってそれぞれのプライ
マーからＤＮＡ鎖の伸長反応を行わせる。この一連の反
応を繰り返すことにより，目的のＤＮＡを１０万倍〜１
００万倍に増幅することができる。
アクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）の略であり，ＤＮＡ上の一定の領域を酵
素的に増幅させる方法を意味する（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ， ２３９，４８７−４９７（１９８８））
。まず，増幅したいＤＮＡを熱変性させて一本鎖とし，
この一本鎖の鋳型ＤＮＡのそれぞれの３’末端領域に相
補的なオリゴヌクレオチドプライマー（センス鎖および
アンチセンス鎖の２種類）をアニーリングさせる。次に
，ＤＮＡポリメラーゼの作用によってそれぞれのプライ
マーからＤＮＡ鎖の伸長反応を行わせる。この一連の反
応を繰り返すことにより，目的のＤＮＡを１０万倍〜１
００万倍に増幅することができる。
【００１７】“サザン分析”とは，ある制限酵素によっ
て切断して得たＤＮＡ断片に目的の遺伝子が含まれてい
るかどうかを検定するための方法である。サザン分析を
行うには，まず二本鎖ＤＮＡ上の特異的な塩基配列を認
識してＤＮＡを切断する制限酵素でＤＮＡを消化する。 得られた消化物の１％アガロースゲル電気泳動を行い，
アルカリ処理により変性させて１本鎖とし，ナイロンフ
ィルターに移す。一方，問題とする遺伝子の一部である
オリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ断片を準備し，標識
を施してプローブとする。このプローブとナイロンフィ
ルター上の１本鎖ＤＮＡとのハイブリッドを形成により
分析がなされる。
て切断して得たＤＮＡ断片に目的の遺伝子が含まれてい
るかどうかを検定するための方法である。サザン分析を
行うには，まず二本鎖ＤＮＡ上の特異的な塩基配列を認
識してＤＮＡを切断する制限酵素でＤＮＡを消化する。 得られた消化物の１％アガロースゲル電気泳動を行い，
アルカリ処理により変性させて１本鎖とし，ナイロンフ
ィルターに移す。一方，問題とする遺伝子の一部である
オリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ断片を準備し，標識
を施してプローブとする。このプローブとナイロンフィ
ルター上の１本鎖ＤＮＡとのハイブリッドを形成により
分析がなされる。
【００１８】“ライゲーション（結合）”とは，２個の
二本鎖ＤＮＡ断片の間にホスホジエステル結合を形成さ
せることを意味する。その際，二本鎖ＤＮＡ断片自身の
自己結合を防止するため，一方の断片の脱リン酸処理を
常法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，１３３−１３４（１９８２））により
行っておく。ライゲーションは，既知の緩衝液および反
応条件を用い， Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより行うこと
ができる。
二本鎖ＤＮＡ断片の間にホスホジエステル結合を形成さ
せることを意味する。その際，二本鎖ＤＮＡ断片自身の
自己結合を防止するため，一方の断片の脱リン酸処理を
常法（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，１３３−１３４（１９８２））により
行っておく。ライゲーションは，既知の緩衝液および反
応条件を用い， Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより行うこと
ができる。
【００１９】“形質転換”とは，外来性の遺伝子（ＤＮ
Ａ）を細胞（宿主細胞）内に導入することにより，該細
胞の遺伝形質が変化する現象を指す。形質転換後の細胞
は形質転換体と呼ばれ，外来ＤＮＡを該細胞の染色体外
成分として，または染色体に組み込まれて，複製され得
る状態で有する。
Ａ）を細胞（宿主細胞）内に導入することにより，該細
胞の遺伝形質が変化する現象を指す。形質転換後の細胞
は形質転換体と呼ばれ，外来ＤＮＡを該細胞の染色体外
成分として，または染色体に組み込まれて，複製され得
る状態で有する。
【００２０】
（Ｉ）Ｖ８様プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の決
定次に，本発明のＶ８様プロテアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列（以下，Ｖ８様遺伝子とする）の決定方法を，工
程の順に説明する。このＤＮＡ配列は，Ｓ． ａｕｒｅ
ｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株のゲノムＤＮＡを，ＰＣ
Ｒ解析，サザン分析，直接シークエンス法などを組み合
わせて分析することにより決定された。
定次に，本発明のＶ８様プロテアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列（以下，Ｖ８様遺伝子とする）の決定方法を，工
程の順に説明する。このＤＮＡ配列は，Ｓ． ａｕｒｅ
ｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株のゲノムＤＮＡを，ＰＣ
Ｒ解析，サザン分析，直接シークエンス法などを組み合
わせて分析することにより決定された。
【００２１】（Ａ） ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析Ｖ８様
プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列（Ｖ８様遺伝子）
は，例えば，ゲノムＤＮＡから得ることができる。それ
には，まずＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００
株のゲノムＤＮＡ を，該菌株の培養細胞から既知の方
法（Ｍ． Ｓｔａｈｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５４，４０６−４１２（１９８
３））に従って調製する。 このゲノムＤＮＡを，ＰＣＲ解析の鋳型ＤＮＡとして用
いる。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーは
，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８株由来のセリンプロテアー
ゼ（Ｖ８プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列（Ｃ．
Ｃａｒｍｏｎａ ら，前出；以下，Ｖ８遺伝子とする
）に基づいて，常法により合成することができる。例え
ば，配列表２に示すＶ８プロテアーゼのアミノ酸配列の
Ｎ末端側１位から６位に相当するアミノ酸をコードする
１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド （５’−ＧＴＴＡＴ
ＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣ）をセンスプライマーＶ８
４とし，該アミノ酸のＣ末端側 ２６２位から２５７位
に相当するアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドに
相補的な１８ｍｅｒ（５’−ＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴ
ＡＴＣＧＣＣ）をアンチセンスプライマーＶ８９とする
。上記ゲノムＤＮＡ，センスプライマーＶ８４，および
アンチセンスプライマーＶ８９を用いてＰＣＲを行うこ
とより，ゲノムＤＮＡ中の目的ＤＮＡ鎖が伸長され，増
幅される。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳
動により解析すると，約８５０ｂｐ長のＤＮＡ断片が得
られる。このＤＮＡ断片は，Ｖ８遺伝子よりも約６０ｂ
ｐ長い。
プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列（Ｖ８様遺伝子）
は，例えば，ゲノムＤＮＡから得ることができる。それ
には，まずＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００
株のゲノムＤＮＡ を，該菌株の培養細胞から既知の方
法（Ｍ． Ｓｔａｈｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５４，４０６−４１２（１９８
３））に従って調製する。 このゲノムＤＮＡを，ＰＣＲ解析の鋳型ＤＮＡとして用
いる。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーは
，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８株由来のセリンプロテアー
ゼ（Ｖ８プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列（Ｃ．
Ｃａｒｍｏｎａ ら，前出；以下，Ｖ８遺伝子とする
）に基づいて，常法により合成することができる。例え
ば，配列表２に示すＶ８プロテアーゼのアミノ酸配列の
Ｎ末端側１位から６位に相当するアミノ酸をコードする
１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチド （５’−ＧＴＴＡＴ
ＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣ）をセンスプライマーＶ８
４とし，該アミノ酸のＣ末端側 ２６２位から２５７位
に相当するアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドに
相補的な１８ｍｅｒ（５’−ＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴ
ＡＴＣＧＣＣ）をアンチセンスプライマーＶ８９とする
。上記ゲノムＤＮＡ，センスプライマーＶ８４，および
アンチセンスプライマーＶ８９を用いてＰＣＲを行うこ
とより，ゲノムＤＮＡ中の目的ＤＮＡ鎖が伸長され，増
幅される。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳
動により解析すると，約８５０ｂｐ長のＤＮＡ断片が得
られる。このＤＮＡ断片は，Ｖ８遺伝子よりも約６０ｂ
ｐ長い。
【００２２】このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｓｐＩで消化
し，得られた消化物をアガロースゲル電気泳動により分
析すると，それぞれ２６２，２４３，２２２および１２
２ｂｐオリゴヌクレオチド長に相当する４本のバンドが
認められる。Ｖ８遺伝子にも同様のＳｓｐＩの切断部位
が存在するため，上記ＤＮＡ断片はＶ８遺伝子と同様の
ＳｓｐＩ認識部位を有することがわかる。但し，Ｖ８様
遺伝子の３’末端側に相当する２６２ ｂｐ長のオリゴ
ヌクレオチドは，Ｖ８遺伝子のＳｓｐＩ消化物の相当す
るオリゴヌクレオチドよりも約６０ｂｐ長い。
し，得られた消化物をアガロースゲル電気泳動により分
析すると，それぞれ２６２，２４３，２２２および１２
２ｂｐオリゴヌクレオチド長に相当する４本のバンドが
認められる。Ｖ８遺伝子にも同様のＳｓｐＩの切断部位
が存在するため，上記ＤＮＡ断片はＶ８遺伝子と同様の
ＳｓｐＩ認識部位を有することがわかる。但し，Ｖ８様
遺伝子の３’末端側に相当する２６２ ｂｐ長のオリゴ
ヌクレオチドは，Ｖ８遺伝子のＳｓｐＩ消化物の相当す
るオリゴヌクレオチドよりも約６０ｂｐ長い。
【００２３】上記ＰＣＲ産物（以下，Ｖ８４−Ｖ８９と
する）の構造解析は，直接シークエンス法により行うこ
とができる。それにはまず，Ｖ８４−Ｖ８９の上記８５
０ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し，
これを二次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡ
に，センスプライマーＶ８４のみを加えた検体（Ｓ），
およびアンチセンスプライマーＶ８９のみを加えた検体
（ＡＳ）の２種の検体を作成し，二次ＰＣＲを行うこと
により一本鎖ＤＮＡを調製する。別に，直接シークエン
ス法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーＶ８４およ
びＶ８９を，常法により５’末端を３２Ｐ標識して調製
する。上記（Ｓ）で調製した一本鎖ＤＮＡと３２Ｐ標識
アンチセンスプライマーとを用い，さらに，上記（ＡＳ
）で調製した一本鎖ＤＮＡと３２Ｐ標識センスプライマ
ーとを用い，ジデオキシ法により塩基配列が決定され得
る。その結果， Ｖ８４−Ｖ８９領域の塩基配列は，Ｖ
８遺伝子と約９２％の相同性を有することが認められた
。このように，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株のゲノムＤＮＡ由来のＶ８様遺伝子ＤＮＡ配列は
，Ｖ８株由来のＶ８遺伝子ＤＮＡ配列とかなりの相同性
を有するが，同一ではないことが確認される。
する）の構造解析は，直接シークエンス法により行うこ
とができる。それにはまず，Ｖ８４−Ｖ８９の上記８５
０ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し，
これを二次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとする。この鋳型ＤＮＡ
に，センスプライマーＶ８４のみを加えた検体（Ｓ），
およびアンチセンスプライマーＶ８９のみを加えた検体
（ＡＳ）の２種の検体を作成し，二次ＰＣＲを行うこと
により一本鎖ＤＮＡを調製する。別に，直接シークエン
ス法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーＶ８４およ
びＶ８９を，常法により５’末端を３２Ｐ標識して調製
する。上記（Ｓ）で調製した一本鎖ＤＮＡと３２Ｐ標識
アンチセンスプライマーとを用い，さらに，上記（ＡＳ
）で調製した一本鎖ＤＮＡと３２Ｐ標識センスプライマ
ーとを用い，ジデオキシ法により塩基配列が決定され得
る。その結果， Ｖ８４−Ｖ８９領域の塩基配列は，Ｖ
８遺伝子と約９２％の相同性を有することが認められた
。このように，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株のゲノムＤＮＡ由来のＶ８様遺伝子ＤＮＡ配列は
，Ｖ８株由来のＶ８遺伝子ＤＮＡ配列とかなりの相同性
を有するが，同一ではないことが確認される。
【００２４】（Ｂ） ゲノムＤＮＡのサザン分析（Ａ）
項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６０
０株由来のゲノムＤＮＡ を，制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化し，これをアガロースゲル電気泳動にかけて分離した
後，該ＤＮＡ断片をナイロンメンブランフィルターにブ
ロッティングし，サザン分析を行う。ハイブリダイゼー
ション用プローブは，（Ａ）項で得られるＶ８４−Ｖ８
９を ３２Ｐ−ｄＣＴＰ を常法により標識して用いる
。このＶ８４−Ｖ８９とハイブリダイズしたＤＮＡ断片
は，アガロースゲル中の約３．５ｋｂ に相当するバン
ドに相当する。この実験により，上記ＰＣＲで増幅して
得られたＤＮＡ断片は，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のゲノムＤＮＡ中に存在することが
わかる。
項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６０
０株由来のゲノムＤＮＡ を，制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化し，これをアガロースゲル電気泳動にかけて分離した
後，該ＤＮＡ断片をナイロンメンブランフィルターにブ
ロッティングし，サザン分析を行う。ハイブリダイゼー
ション用プローブは，（Ａ）項で得られるＶ８４−Ｖ８
９を ３２Ｐ−ｄＣＴＰ を常法により標識して用いる
。このＶ８４−Ｖ８９とハイブリダイズしたＤＮＡ断片
は，アガロースゲル中の約３．５ｋｂ に相当するバン
ドに相当する。この実験により，上記ＰＣＲで増幅して
得られたＤＮＡ断片は，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のゲノムＤＮＡ中に存在することが
わかる。
【００２５】
（Ｃ） サブゲノムライブラリーの作製およびＰＣＲ解
析（Ａ） 項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化
して得られる上記３．５ｋｂのＤＮＡ断片を，ファージ
ベクターＭ１３ｍｐ１０に組み込む。次いで，この組換
えＭ１３ｍｐ１０ベクターを，既知の方法（Ｍａｎｄｅ
ｌら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，５３，１５９ （
１９７０））に従って適当な宿主細胞に導入することに
より，サブゲノムライブラリーが作製される。宿主細胞
としては，大腸菌ＪＭ１０３株が好適である。
析（Ａ） 項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化
して得られる上記３．５ｋｂのＤＮＡ断片を，ファージ
ベクターＭ１３ｍｐ１０に組み込む。次いで，この組換
えＭ１３ｍｐ１０ベクターを，既知の方法（Ｍａｎｄｅ
ｌら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，５３，１５９ （
１９７０））に従って適当な宿主細胞に導入することに
より，サブゲノムライブラリーが作製される。宿主細胞
としては，大腸菌ＪＭ１０３株が好適である。
【００２６】上記形質転換体の培養により得られるファ
ージＤＮＡを熱変性させ，以下のＰＣＲに用いる鋳型Ｄ
ＮＡとする。ＰＣＲに用いるプライマーは，上述のＶ８
４センスプライマーおよびＶ８９アンチセンスプライマ
ー，ならびにＭ１３ｍｐ１０ベクター中に存在するＤＮ
Ａに相補的なオリゴヌクレオチドであるＭ４アンチセン
スプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣ）（配列表３に示す）およびＲＶセンスプライマー
（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）（配列
表４に示す）の４種類である。これらのプライマーをＶ
８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，Ｖ８４−ＲＶ，Ｖ８９−
Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶの５種類の組合せで用い，Ｐ
ＣＲを行う。
ージＤＮＡを熱変性させ，以下のＰＣＲに用いる鋳型Ｄ
ＮＡとする。ＰＣＲに用いるプライマーは，上述のＶ８
４センスプライマーおよびＶ８９アンチセンスプライマ
ー，ならびにＭ１３ｍｐ１０ベクター中に存在するＤＮ
Ａに相補的なオリゴヌクレオチドであるＭ４アンチセン
スプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣ）（配列表３に示す）およびＲＶセンスプライマー
（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）（配列
表４に示す）の４種類である。これらのプライマーをＶ
８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，Ｖ８４−ＲＶ，Ｖ８９−
Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶの５種類の組合せで用い，Ｐ
ＣＲを行う。
【００２７】次いで，それぞれのＰＣＲ産物のサザン分
析を行う。サザン分析に用いるハイブリダイゼーション
用プローブは，先に決定したＶ８４−Ｖ８９領域内の塩
基配列に基づいて合成したＶ８１１（５’−ＴＧＡＧＴ
ＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡ）（この配列は配列表１内
に存在；その位置は図１，２および３に明示）の５’末
端を放射標識することにより作成される。サザン分析の
結果， Ｖ８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，およびＶ８９
−ＲＶのＰＣＲ産物について，陽性バンドが検出された
。陽性バンドは，Ｖ８４−Ｖ８９のＰＣＲ産物について
は約８５０ｂｐ，Ｖ８４−Ｍ４のＰＣＲ産物については
約２．５ｋｂ，そしてＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物につい
ては約１．８ｋｂに相当するバンドであった。 Ｖ８４
−Ｖ８９領域はＶ８４−Ｍ４領域に含まれる。従って，
Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物を解析す
ることにより，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株由来のＶ８様遺伝子が決定され得る。
析を行う。サザン分析に用いるハイブリダイゼーション
用プローブは，先に決定したＶ８４−Ｖ８９領域内の塩
基配列に基づいて合成したＶ８１１（５’−ＴＧＡＧＴ
ＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡ）（この配列は配列表１内
に存在；その位置は図１，２および３に明示）の５’末
端を放射標識することにより作成される。サザン分析の
結果， Ｖ８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，およびＶ８９
−ＲＶのＰＣＲ産物について，陽性バンドが検出された
。陽性バンドは，Ｖ８４−Ｖ８９のＰＣＲ産物について
は約８５０ｂｐ，Ｖ８４−Ｍ４のＰＣＲ産物については
約２．５ｋｂ，そしてＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物につい
ては約１．８ｋｂに相当するバンドであった。 Ｖ８４
−Ｖ８９領域はＶ８４−Ｍ４領域に含まれる。従って，
Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物を解析す
ることにより，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株由来のＶ８様遺伝子が決定され得る。
【００２８】（Ｄ） Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のＶ８様遺伝子の構造解析 Ｖ８様遺伝子のＤＮＡ配列の決定は，上記サブゲノムラ
イブラリーから得られたＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−Ｒ
ＶのＰＣＲ産物を用い，直接シークエンス法により行わ
れ得る。それには，まず，Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−
ＲＶのＰＣＲ産物の二次ＰＣＲをそれぞれ行い，１本鎖
ＤＮＡを合成する。これとは別に，以下の６種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを常法により合成し，５’末
端を放射標識する。これらのプライマーはＶ８様遺伝子
のＤＮＡ配列（配列表１に示す）上の一部と同じであり
，その位置を図１，２および３に下線を施して示す。
１２６００株由来のＶ８様遺伝子の構造解析 Ｖ８様遺伝子のＤＮＡ配列の決定は，上記サブゲノムラ
イブラリーから得られたＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−Ｒ
ＶのＰＣＲ産物を用い，直接シークエンス法により行わ
れ得る。それには，まず，Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−
ＲＶのＰＣＲ産物の二次ＰＣＲをそれぞれ行い，１本鎖
ＤＮＡを合成する。これとは別に，以下の６種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを常法により合成し，５’末
端を放射標識する。これらのプライマーはＶ８様遺伝子
のＤＮＡ配列（配列表１に示す）上の一部と同じであり
，その位置を図１，２および３に下線を施して示す。
【００２９】
Ｖ８５ ： ５’−ＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＧＴＴＧ
ＴＡＶ８１２： ５’−ＡＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＧＣＡ
ＡＡＴＧＶ８１５： ５’−ＧＧＣＧＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＡＡＴＴＣＡＶ８１０： ５’−ＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴ
ＴＡＡＡＡＧＶ８１４： ５’−ＴＧＣＡＴＡＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＴＣＧＴＶ８６ ： ５’−ＴＧＡＡＣＣＴＧ
ＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ上記１本鎖ＤＮＡとそれぞれのプ
ライマーとを用い，ジデオキシ法により，Ｖ８様遺伝子
のＤＮＡ配列が得られる。このＤＮＡ配列を配列表１お
よび図１，２および３に示す。 配列表１および図１，２および３から，Ｖ８様遺伝子は
，翻訳開始コドンＡＴＧがコードするメチオニン（Ｍｅ
ｔ）を含む６８残基のシグナルペプチド，および２８９
残基の成熟アミノ酸をコードすることがわかる。このシ
グナルペプチド６８残基は，Ｖ８遺伝子のコードするア
ミノ酸配列のシグナルペプチドと同じ長さである。しか
し，成熟アミノ酸２８９残基は，Ｖ８遺伝子のコードす
る成熟アミノ酸に比べて２１残基長い。これは，該成熟
アミノ酸のＣ末端のＰｒｏ Ａｓｎ（Ａｓｐ） Ａｓｎ
の繰り返しが，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列
よりも７回多いことに起因する。この繰り返しのアミノ
酸配列を，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列と比較
して，図４に示す。図４では，アミノ酸を１文字で表し
ており，ＤはＡｓｐ，ＨはＨｉｓ，ＱはＧｌｎ，ＰはＰ
ｒｏ，そしてＮはＡｓｎをそれぞれ表す。この成熟アミ
ノ酸の繰り返し部分は，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ
酸配列の２２０位と２２１位との間に存在する。これ以
外に，塩基置換に伴うアミノ酸置換が６箇所あり，これ
は以下の表１のとおりである。表１では，塩基配列がＶ
８遺伝子と異なる部分に下線を施して示してある。
ＴＡＶ８１２： ５’−ＡＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＧＣＡ
ＡＡＴＧＶ８１５： ５’−ＧＧＣＧＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＡＡＴＴＣＡＶ８１０： ５’−ＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴ
ＴＡＡＡＡＧＶ８１４： ５’−ＴＧＣＡＴＡＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＴＣＧＴＶ８６ ： ５’−ＴＧＡＡＣＣＴＧ
ＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ上記１本鎖ＤＮＡとそれぞれのプ
ライマーとを用い，ジデオキシ法により，Ｖ８様遺伝子
のＤＮＡ配列が得られる。このＤＮＡ配列を配列表１お
よび図１，２および３に示す。 配列表１および図１，２および３から，Ｖ８様遺伝子は
，翻訳開始コドンＡＴＧがコードするメチオニン（Ｍｅ
ｔ）を含む６８残基のシグナルペプチド，および２８９
残基の成熟アミノ酸をコードすることがわかる。このシ
グナルペプチド６８残基は，Ｖ８遺伝子のコードするア
ミノ酸配列のシグナルペプチドと同じ長さである。しか
し，成熟アミノ酸２８９残基は，Ｖ８遺伝子のコードす
る成熟アミノ酸に比べて２１残基長い。これは，該成熟
アミノ酸のＣ末端のＰｒｏ Ａｓｎ（Ａｓｐ） Ａｓｎ
の繰り返しが，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列
よりも７回多いことに起因する。この繰り返しのアミノ
酸配列を，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列と比較
して，図４に示す。図４では，アミノ酸を１文字で表し
ており，ＤはＡｓｐ，ＨはＨｉｓ，ＱはＧｌｎ，ＰはＰ
ｒｏ，そしてＮはＡｓｎをそれぞれ表す。この成熟アミ
ノ酸の繰り返し部分は，Ｖ８遺伝子がコードするアミノ
酸配列の２２０位と２２１位との間に存在する。これ以
外に，塩基置換に伴うアミノ酸置換が６箇所あり，これ
は以下の表１のとおりである。表１では，塩基配列がＶ
８遺伝子と異なる部分に下線を施して示してある。
【００３０】
【表１】
【００３１】（ＩＩ）発現ベクターの構築本発明のプロ
テアーゼをコードする上記ＤＮＡ配列は，適当なベクタ
ーに組み込まれて，該プロテアーゼを発現させるための
発現ベクターとされる。
テアーゼをコードする上記ＤＮＡ配列は，適当なベクタ
ーに組み込まれて，該プロテアーゼを発現させるための
発現ベクターとされる。
【００３２】ここでは，枯草菌または酵母細胞に導入し
得る，次の発現ベクターを構築した：（ア）ｐＨＹ３０
０Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐＨ
Ｙ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００ＢＡ
ＡＫＰＳＶ８ｔｔ，（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐＨＹＵ
ＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８，および（キ
）ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８。
得る，次の発現ベクターを構築した：（ア）ｐＨＹ３０
０Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐＨ
Ｙ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００ＢＡ
ＡＫＰＳＶ８ｔｔ，（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐＨＹＵ
ＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８，および（キ
）ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８。
【００３３】上記発現ベクターのうち（ア）〜（カ）は
枯草菌で発現可能であり，（キ）は酵母中で発現可能で
ある。 次に，発現ベクター（ア）〜（キ）の構築方法を説明す
る。
枯草菌で発現可能であり，（キ）は酵母中で発現可能で
ある。 次に，発現ベクター（ア）〜（キ）の構築方法を説明す
る。
【００３４】（ア）発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒの
構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３００Ｖ
８Ｒは，図５に示すように，大腸菌および枯草菌のシャ
トルベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）に，
本発明のＶ８様プロテアーゼをコードするＤＮＡ断片（
プロモーター，シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列，およびＶ８様プロテアーゼ成熟タンパクをコードす
る配列を含む）を組み込むことにより得られる。
構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３００Ｖ
８Ｒは，図５に示すように，大腸菌および枯草菌のシャ
トルベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）に，
本発明のＶ８様プロテアーゼをコードするＤＮＡ断片（
プロモーター，シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列，およびＶ８様プロテアーゼ成熟タンパクをコードす
る配列を含む）を組み込むことにより得られる。
【００３５】上記工程を順に説明すると，まず，Ｓ．
ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞からＭ．
Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡを単離し，
これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする。次に，セ
ンスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のＶ８様プロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター上流の５’末端付近の配列に相当し，ＥｃｏＲＩ
部位が付加された２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（セ
ンスプライマーＡ；配列表５に示す），そして，アンチ
センスプライマーとして，該遺伝子の３’末端付近（成
熟タンパクに相当するＤＮＡ配列よりも下流）の配列に
相補的であり，ＸｂａＩ部位が付加された２６ヌクレオ
チド長の一本鎖断片（アンチセンスプライマーＢ；配列
表６に示す）を化学合成し，これを用いてＰＣＲ反応を
行う。
ａｕｒｅｕｓＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞からＭ．
Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡを単離し，
これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする。次に，セ
ンスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のＶ８様プロテアーゼ遺伝子のプロモ
ーター上流の５’末端付近の配列に相当し，ＥｃｏＲＩ
部位が付加された２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（セ
ンスプライマーＡ；配列表５に示す），そして，アンチ
センスプライマーとして，該遺伝子の３’末端付近（成
熟タンパクに相当するＤＮＡ配列よりも下流）の配列に
相補的であり，ＸｂａＩ部位が付加された２６ヌクレオ
チド長の一本鎖断片（アンチセンスプライマーＢ；配列
表６に示す）を化学合成し，これを用いてＰＣＲ反応を
行う。
【００３６】
センスプライマーＡ：５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡ
ＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴ−３’ アンチセンスプライマーＢ：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＧＡ
ＴＡＴＴＴＴＧＣＧＴＴＧＴＴＡＡＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片を，ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分
解し，図５に示す断片■を得る。次に，ｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分解し，大きい方の
断片■を得る。これらの断片■および■を常法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮｅｗＹ
ｏｒｋ， １９８２）によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することにより，発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８
Ｒが得られる。
ＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴ−３’ アンチセンスプライマーＢ：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＧＡ
ＴＡＴＴＴＴＧＣＧＴＴＧＴＴＡＡＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片を，ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分
解し，図５に示す断片■を得る。次に，ｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分解し，大きい方の
断片■を得る。これらの断片■および■を常法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮｅｗＹ
ｏｒｋ， １９８２）によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することにより，発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８
Ｒが得られる。
【００３７】このｐＨＹ３００Ｖ８Ｒは，Ｖ８様プロテ
アーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアーゼ
のシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位のＡ
ｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼの成熟
タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）を
コードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコード
するＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有す
る。
アーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアーゼ
のシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位のＡ
ｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼの成熟
タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）を
コードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコード
するＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有す
る。
【００３８】（イ）発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔ
ｔの構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３０
０Ｖ８Ｒｔｔは，図６に示すように，上記（ア）項で得
られたｐＨＹ３００Ｖ８Ｒに，さらにＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアル
カリ性プロテアーゼのターミネーターが付加された形態
を有する。この発現ベクターは，■上記アルカリ性プロ
テアーゼのターミネーターをコードする塩基配列を含む
断片，■Ｖ８様プロテアーゼのプロモーター，Ｖ８様プ
ロテアーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列，
およびＶ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする
塩基配列を含む断片，および■ｐＨＹ３００ＰＬＫベク
ターを用いて構築される。図６に示すように，（ア）項
で得られた発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒを利用する
と簡便に構築がなされ得る。
ｔの構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３０
０Ｖ８Ｒｔｔは，図６に示すように，上記（ア）項で得
られたｐＨＹ３００Ｖ８Ｒに，さらにＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアル
カリ性プロテアーゼのターミネーターが付加された形態
を有する。この発現ベクターは，■上記アルカリ性プロ
テアーゼのターミネーターをコードする塩基配列を含む
断片，■Ｖ８様プロテアーゼのプロモーター，Ｖ８様プ
ロテアーゼのシグナルペプチドをコードする塩基配列，
およびＶ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする
塩基配列を含む断片，および■ｐＨＹ３００ＰＬＫベク
ターを用いて構築される。図６に示すように，（ア）項
で得られた発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒを利用する
と簡便に構築がなされ得る。
【００３９】この発現ベクターの構築を順に説明すると
，まず，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣ
Ｃ ６０５１株の培養細胞からＭ． Ｓｔａｈｌら（前
出）の方法に従って，ゲノムＤＮＡを単離し，これをＰ
ＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする。次に，センスプラ
イマーとして，Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ １６８株
由来のアルカリ性プロテアーゼ（ＭＡＲＫ Ｌ． ＳＴ
ＡＨＬら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ，１９８４，ｖｏｌ．１５８，Ｎｏ２，ｐｐ４１
１−４１８）のＣ末端付近に相当するＤＮＡ配列（ター
ミネーターの５’側に存在）を含み，ＸｂａＩ部位が付
加された２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプラ
イマーＣ：配列表７に示す），そして，アンチセンスプ
ライマーとして，該プロテアーゼの３’非翻訳領域の一
部（ターミネーターの３’側に存在）に相補的であり
ＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長
の一本鎖断片（アンチセンスプライマーＤ；配列表８に
示す）を化学合成し，これを用いてＰＣＲ反応を行う。
，まず，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣ
Ｃ ６０５１株の培養細胞からＭ． Ｓｔａｈｌら（前
出）の方法に従って，ゲノムＤＮＡを単離し，これをＰ
ＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする。次に，センスプラ
イマーとして，Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ １６８株
由来のアルカリ性プロテアーゼ（ＭＡＲＫ Ｌ． ＳＴ
ＡＨＬら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ，１９８４，ｖｏｌ．１５８，Ｎｏ２，ｐｐ４１
１−４１８）のＣ末端付近に相当するＤＮＡ配列（ター
ミネーターの５’側に存在）を含み，ＸｂａＩ部位が付
加された２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプラ
イマーＣ：配列表７に示す），そして，アンチセンスプ
ライマーとして，該プロテアーゼの３’非翻訳領域の一
部（ターミネーターの３’側に存在）に相補的であり
ＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長
の一本鎖断片（アンチセンスプライマーＤ；配列表８に
示す）を化学合成し，これを用いてＰＣＲ反応を行う。
【００４０】
センスプライマーＣ：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡ
ＧＣＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧ−３’ アンチセンスプライマーＤ：５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴ
ＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで分
解し，図６に示す断片■を得る。次に，（ア）項で得ら
れたｐＨＹ３００ＶＲ８をＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで分
解して小さい方の断片■を得る。この断片は上記（ア）
項のｐＨＹ３００ＶＲ８を構築するときに用いられたＤ
ＮＡ断片■と同一であり，（ア）項に示されたＰＣＲ法
によっても得られる。この断片は，Ｖ８様プロテアーゼ
のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列，該プロテ
アーゼの成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列，および
該プロテアーゼのターミネーターをコードするＤＮＡ配
列を有する。次に，（ア）項で得られた発現ベクターｐ
ＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで分
解して，大きい方の断片■を得る。上記断片■および■
は，ｐＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＸｂａＩで分解して，最も大きい断片（断片■）
，および次に大きい断片（断片■）を単離することによ
っても得られる。これらのＤＮＡ断片■，■，および■
を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８２）によりＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結することにより，発現ベクターｐ
ＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔが得られる。
ＧＣＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧ−３’ アンチセンスプライマーＤ：５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴ
ＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで分
解し，図６に示す断片■を得る。次に，（ア）項で得ら
れたｐＨＹ３００ＶＲ８をＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで分
解して小さい方の断片■を得る。この断片は上記（ア）
項のｐＨＹ３００ＶＲ８を構築するときに用いられたＤ
ＮＡ断片■と同一であり，（ア）項に示されたＰＣＲ法
によっても得られる。この断片は，Ｖ８様プロテアーゼ
のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列，該プロテ
アーゼの成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列，および
該プロテアーゼのターミネーターをコードするＤＮＡ配
列を有する。次に，（ア）項で得られた発現ベクターｐ
ＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで分
解して，大きい方の断片■を得る。上記断片■および■
は，ｐＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＸｂａＩで分解して，最も大きい断片（断片■）
，および次に大きい断片（断片■）を単離することによ
っても得られる。これらのＤＮＡ断片■，■，および■
を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８２）によりＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結することにより，発現ベクターｐ
ＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔが得られる。
【００４１】このｐＨＹ３００Ｖ８ＲｔｔはＶ８様プロ
テアーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアー
ゼのシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位の
Ａｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼを成
熟タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）
をコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有
し，さらに，その下流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プロテ
アーゼのターミネーターを有する。
テアーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアー
ゼのシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位の
Ａｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼを成
熟タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）
をコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有
し，さらに，その下流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プロテ
アーゼのターミネーターを有する。
【００４２】（ウ）発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＭ
ＹＶ８ｔｔの構築本発明の発現ベクターの一例であるｐ
ＨＹ３００ＢＡＡＭＹ８ｔｔは，図７に示すように，■
Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする塩基配
列を含むＤＮＡ断片，■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｅ−１８株由来のα−アミ
ラーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ断片，および■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プロ
テアーゼのターミネーターを含むｐＨＹ３００ＰＬＫ由
来のベクターを用いて構築される。
ＹＶ８ｔｔの構築本発明の発現ベクターの一例であるｐ
ＨＹ３００ＢＡＡＭＹ８ｔｔは，図７に示すように，■
Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする塩基配
列を含むＤＮＡ断片，■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｅ−１８株由来のα−アミ
ラーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ断片，および■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プロ
テアーゼのターミネーターを含むｐＨＹ３００ＰＬＫ由
来のベクターを用いて構築される。
【００４３】この発現ベクターを構築するには，まず，
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｖ８様プロテアーゼ
の＋１位のＶａｌから＋７位のＡｓｐにわたるペプチド
に相当するＤＮＡ配列にｐｍａＣＩ部位が付加された２
７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプライマーＥ；
配列表９に示す），および，アンチセンスプライマーと
して，上記（ア）項で使用したのと同様のアンチセンス
プライマーＢを化学合成し，これらを用いてＰＣＲ反応
を行う。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｖ８様プロテアーゼ
の＋１位のＶａｌから＋７位のＡｓｐにわたるペプチド
に相当するＤＮＡ配列にｐｍａＣＩ部位が付加された２
７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプライマーＥ；
配列表９に示す），および，アンチセンスプライマーと
して，上記（ア）項で使用したのと同様のアンチセンス
プライマーＢを化学合成し，これらを用いてＰＣＲ反応
を行う。
【００４４】センスプライマーＥ：５’−ＧＡＧＣＡＣ
ＧＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＧＡＴ−３’ 得られたＤＮＡ断片をｐｍａＣＩおよびＸｂａＩで分解
し，図７に示す断片■を得る。次に，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ８３８０株の
培養細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈｌら（前出）の方法に従
ってゲノムＤＮＡを単離し，該ＤＮＡをＰＣＲ法（前出
）に用いる鋳型ＤＮＡとする。センスプライマーとして
，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｅ−１８株由来のα−アミラーゼ遺伝子（Ｉｉｋ
ｋａ Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ，１９８１，１５，ｐｐ
４３−５１）の５’末端付近のＤＮＡ配列に相当し，Ｅ
ｃｏＲＩ部位が付加された２４ヌクレオチド長の一本鎖
断片（センスプライマーＦ；配列表１０に示す），およ
びアンチセンスプライマーとして，該α−アミラーゼの
−６位のＩｌｅから−１位のＡｌａまでのペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列に相補的であり，ＮａｅＩ部位が付
加された２４ヌクレオチド長の一本鎖断片（アンチセン
スプライマーＧ；配列表１１に示す）を化学合成し，こ
れらを用いてＰＣＲ反応を行う。
ＧＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＧＡＴ−３’ 得られたＤＮＡ断片をｐｍａＣＩおよびＸｂａＩで分解
し，図７に示す断片■を得る。次に，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ８３８０株の
培養細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈｌら（前出）の方法に従
ってゲノムＤＮＡを単離し，該ＤＮＡをＰＣＲ法（前出
）に用いる鋳型ＤＮＡとする。センスプライマーとして
，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ Ｅ−１８株由来のα−アミラーゼ遺伝子（Ｉｉｋ
ｋａ Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ，１９８１，１５，ｐｐ
４３−５１）の５’末端付近のＤＮＡ配列に相当し，Ｅ
ｃｏＲＩ部位が付加された２４ヌクレオチド長の一本鎖
断片（センスプライマーＦ；配列表１０に示す），およ
びアンチセンスプライマーとして，該α−アミラーゼの
−６位のＩｌｅから−１位のＡｌａまでのペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列に相補的であり，ＮａｅＩ部位が付
加された２４ヌクレオチド長の一本鎖断片（アンチセン
スプライマーＧ；配列表１１に示す）を化学合成し，こ
れらを用いてＰＣＲ反応を行う。
【００４５】センスプライマーＦ：５’−ＣＧＣＧＡＡ
ＴＴＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡ−３’ アンチセンスプライマーＧ：５’−ＣＧＣＧＣＣＧＧＣ
ＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＡＴ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＮａｅＩとで分解す
ることにより，α−アミラーゼのプロモーターおよび該
α−アミラーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列を有する断片■が得られる。次に（イ）項で得られ
た発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８ＲｔｔをＥｃｏＲＩお
よびＸｂａＩで分解し，大きい方の断片■を得る。これ
ら■，■および■の断片を常法（前出）によりＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結することにより，図７に示す
ように，発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ
が得られる。
ＴＴＣＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡ−３’ アンチセンスプライマーＧ：５’−ＣＧＣＧＣＣＧＧＣ
ＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＡＴ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＮａｅＩとで分解す
ることにより，α−アミラーゼのプロモーターおよび該
α−アミラーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列を有する断片■が得られる。次に（イ）項で得られ
た発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８ＲｔｔをＥｃｏＲＩお
よびＸｂａＩで分解し，大きい方の断片■を得る。これ
ら■，■および■の断片を常法（前出）によりＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結することにより，図７に示す
ように，発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ
が得られる。
【００４６】このｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔは，
Ｂａｃｉｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
８３８０株由来のα−アミラーゼのプロモーターの支
配下に，α−アミラーゼのシグナルペプチド（−３１位
のＭｅｔから−１位のＡｌａ）をコードするＤＮＡ配列
，Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列，および該成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列
の下流に存在する３’非翻訳領域を有し，さらにその下
流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ
６０５１株由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネー
ターを有する。
Ｂａｃｉｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
８３８０株由来のα−アミラーゼのプロモーターの支
配下に，α−アミラーゼのシグナルペプチド（−３１位
のＭｅｔから−１位のＡｌａ）をコードするＤＮＡ配列
，Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列，および該成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列
の下流に存在する３’非翻訳領域を有し，さらにその下
流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ
６０５１株由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネー
ターを有する。
【００４７】（エ）発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＫ
ＰＳＶ８ｔｔの構築本発明の発現ベクターの一例である
ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔは，図８に示すよう
に，■Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする
塩基配列を含むＤＮＡ断片，■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のアルカリ性プロ
テアーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドをコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ断片，および■Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓａｂｔｉｌｉｓ由来のアルカリ性プロテアー
ゼのターミネーターをコードする塩基配列を含むｐＨＹ
３００ＰＬＫ由来のベクター断片を用いて構築される。
ＰＳＶ８ｔｔの構築本発明の発現ベクターの一例である
ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔは，図８に示すよう
に，■Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクをコードする
塩基配列を含むＤＮＡ断片，■Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍ
ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のアルカリ性プロ
テアーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドをコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ断片，および■Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓａｂｔｉｌｉｓ由来のアルカリ性プロテアー
ゼのターミネーターをコードする塩基配列を含むｐＨＹ
３００ＰＬＫ由来のベクター断片を用いて構築される。
【００４８】この発現ベクターを構築するには，まず，
上記（ウ）項で行ったのと同様の方法によりＳ． ａｕ
ｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株のゲノムＤＮＡと，
センスプライマーＥとアンチセンスプライマーＢとから
ＰＣＲ法により，Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクを
コードする塩基配列を含むＤＮＡ断片■を調製する。次
いで，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ８３８０株の培養細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈ
ｌら（前出）の方法に従ってゲノムＤＮＡを単離し，該
ＤＮＡをＰＣＲ法（前出）に用いる鋳型ＤＮＡとする。 センスプライマーとして，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３８４４株
由来のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（Ｎ．ＶＡＳＡＮ
ＴＨＡら，Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ，１９８４，ｖｏｌ．１５９，Ｎｏ３，ｐｐ８
１１−８１９）のＮ末端付近のＤＮＡ配列（プロモータ
ーから上流側に位置する）を含み，ＥｃｏＲＩ部位が付
加された２５ヌクレオチド長の断片（センスプライマー
Ｈ；配列表１２に示す），および該プロテアーゼの−５
位のＨｉｓから−１位のＴｙｒまでのペプチドをコード
するＤＮＡ配列に相補的であり，ＳｎａＢＩ部位が付加
された２４ヌクレオチド長の断片（アンチセンスプライ
マーＩ；配列表１３に示す）を化学合成し，これらを用
いてＰＣＲ反応を行う。
上記（ウ）項で行ったのと同様の方法によりＳ． ａｕ
ｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株のゲノムＤＮＡと，
センスプライマーＥとアンチセンスプライマーＢとから
ＰＣＲ法により，Ｖ８様プロテアーゼの成熟タンパクを
コードする塩基配列を含むＤＮＡ断片■を調製する。次
いで，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ ８３８０株の培養細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈ
ｌら（前出）の方法に従ってゲノムＤＮＡを単離し，該
ＤＮＡをＰＣＲ法（前出）に用いる鋳型ＤＮＡとする。 センスプライマーとして，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３８４４株
由来のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（Ｎ．ＶＡＳＡＮ
ＴＨＡら，Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ，１９８４，ｖｏｌ．１５９，Ｎｏ３，ｐｐ８
１１−８１９）のＮ末端付近のＤＮＡ配列（プロモータ
ーから上流側に位置する）を含み，ＥｃｏＲＩ部位が付
加された２５ヌクレオチド長の断片（センスプライマー
Ｈ；配列表１２に示す），および該プロテアーゼの−５
位のＨｉｓから−１位のＴｙｒまでのペプチドをコード
するＤＮＡ配列に相補的であり，ＳｎａＢＩ部位が付加
された２４ヌクレオチド長の断片（アンチセンスプライ
マーＩ；配列表１３に示す）を化学合成し，これらを用
いてＰＣＲ反応を行う。
【００４９】
センスプライマーＨ：５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣ
ＧＣＡＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴ−３’アンチセンスプライ
マーＩ：５’−ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣ
ＴＡＣＧＴＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳｎａＢＩとで分解
することにより，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のアルカリ性プロテアーゼのプ
ロモーター，および該プロテアーゼのシグナルペプチド
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ配列■が得られる
。次に（イ）項で得られた発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ
８Ｒｔｔを上記（ウ）項における方法と同様の方法で処
理して，（ウ）項と同様にアルカリ性プロテアーゼのタ
ーミネーターを有するベクター断片■を得る。これら■
〜■の断片を，常法（前出）によりＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結することにより，図８に示すように，発
現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔが得られ
る。
ＧＣＡＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴ−３’アンチセンスプライ
マーＩ：５’−ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣ
ＴＡＣＧＴＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳｎａＢＩとで分解
することにより，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のアルカリ性プロテアーゼのプ
ロモーター，および該プロテアーゼのシグナルペプチド
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ配列■が得られる
。次に（イ）項で得られた発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ
８Ｒｔｔを上記（ウ）項における方法と同様の方法で処
理して，（ウ）項と同様にアルカリ性プロテアーゼのタ
ーミネーターを有するベクター断片■を得る。これら■
〜■の断片を，常法（前出）によりＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結することにより，図８に示すように，発
現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔが得られ
る。
【００５０】このｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔは
，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ ８３８０株由来のアルカリ性プロテアーゼのプロ
モーター支配下に，該アルカリ性プロテアーゼのシグナ
ルペプチド（−１０７位のｆＭｅｔから−１位のＴｙｒ
）をコードするＤＮＡ配列，Ｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣ
Ｃ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼの成熟タン
パクをコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクを
コードするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域
を有し，さらに，その下流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プ
ロテアーゼのターミネーターを有する。
，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ ８３８０株由来のアルカリ性プロテアーゼのプロ
モーター支配下に，該アルカリ性プロテアーゼのシグナ
ルペプチド（−１０７位のｆＭｅｔから−１位のＴｙｒ
）をコードするＤＮＡ配列，Ｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣ
Ｃ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼの成熟タン
パクをコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクを
コードするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域
を有し，さらに，その下流にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６０５１株由来のアルカリ性プ
ロテアーゼのターミネーターを有する。
【００５１】（オ）発現ベクターｐＨＹＵＢＶ８Ｒおよ
びｐＨＹＵＢＶ８Ｌこれらの発現ベクターは，図１０に
示すように，■Ｖ８様プロテアーゼのプロモーター，該
プロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列，及び該プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ断片，およびｐＨＹ３００ＰＬＫ
由来のベクターｐＨＹＵＢを用いて構築される。
びｐＨＹＵＢＶ８Ｌこれらの発現ベクターは，図１０に
示すように，■Ｖ８様プロテアーゼのプロモーター，該
プロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列，及び該プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ断片，およびｐＨＹ３００ＰＬＫ
由来のベクターｐＨＹＵＢを用いて構築される。
【００５２】この発現ベクターを構築するには，まず，
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＴＣＣ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼ遺伝
子の５’末端付近に相当し（プロモーター上流に存在す
る），ＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された２７ヌクレオチ
ド長の断片（センスプライマーＪ；配列表１４に示す）
，そして，アンチセンスプライマーとして，該遺伝子の
３’末端付近（成熟タンパクに相当するＤＮＡ配列より
も下流に存在）に相補的であり，ＨｉｎｄＩＩＩ部位が
付加された２８ヌクレオチド長の断片（アンチセンスプ
ライマーＫ；配列表１５に示す）を化学合成し，これを
用いてＰＣＲ反応を行う。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＴＣＣ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼ遺伝
子の５’末端付近に相当し（プロモーター上流に存在す
る），ＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された２７ヌクレオチ
ド長の断片（センスプライマーＪ；配列表１４に示す）
，そして，アンチセンスプライマーとして，該遺伝子の
３’末端付近（成熟タンパクに相当するＤＮＡ配列より
も下流に存在）に相補的であり，ＨｉｎｄＩＩＩ部位が
付加された２８ヌクレオチド長の断片（アンチセンスプ
ライマーＫ；配列表１５に示す）を化学合成し，これを
用いてＰＣＲ反応を行う。
【００５３】センスプライマーＪ；５’−ＧＡＧＡＡＧ
ＣＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴ−３’ アンチセンスプライマーＫ；５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴ
ＴＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩで分解することに
より，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株由
来のＶ８様プロテアーゼのプロモーター，シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列，および成熟タンパクをコ
ードするＤＮＡ断片■が得られる（図１０）。
ＣＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴ−３’ アンチセンスプライマーＫ；５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴ
ＴＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩで分解することに
より，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００株由
来のＶ８様プロテアーゼのプロモーター，シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列，および成熟タンパクをコ
ードするＤＮＡ断片■が得られる（図１０）。
【００５４】次に，大腸菌および枯草菌のシャトルベク
ターであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）を，ＮｃｏＩ
切断し，クレノーフラグメントで処理し切断面を平滑化
する。これをＥｃｏＲＩで切断し，得られた断片のうち
大きい方の断片■を得る。この断片■は，大腸菌におけ
るレプリケーションオリジンおよびアンピシリン耐性遺
伝子を有する（図９）。次に，枯草菌のプラスミドｐｕ
Ｂ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ， １５， ９３−１０，
１９８６）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで分解し，大
きい方の断片■を得る。この断片■は，枯草菌における
レプリケーションオリジンおよびカナマイシン耐性遺伝
子を有する（図９）。これらの断片■および■を常法（
前出）により，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する
ことにより，大腸菌および枯草菌のシャトルベクターで
あるｐＨＹＵＢが得られる。次にこのｐＨＹＵＢを図１
０に示すように，ＨｉｎｄＩＩＩで切断し，ＢＡＰで処
理することにより，ＤＮＡ断片■が得られる。
ターであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）を，ＮｃｏＩ
切断し，クレノーフラグメントで処理し切断面を平滑化
する。これをＥｃｏＲＩで切断し，得られた断片のうち
大きい方の断片■を得る。この断片■は，大腸菌におけ
るレプリケーションオリジンおよびアンピシリン耐性遺
伝子を有する（図９）。次に，枯草菌のプラスミドｐｕ
Ｂ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ， １５， ９３−１０，
１９８６）をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで分解し，大
きい方の断片■を得る。この断片■は，枯草菌における
レプリケーションオリジンおよびカナマイシン耐性遺伝
子を有する（図９）。これらの断片■および■を常法（
前出）により，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する
ことにより，大腸菌および枯草菌のシャトルベクターで
あるｐＨＹＵＢが得られる。次にこのｐＨＹＵＢを図１
０に示すように，ＨｉｎｄＩＩＩで切断し，ＢＡＰで処
理することにより，ＤＮＡ断片■が得られる。
【００５５】上記ＤＮＡ断片■および■を常法（前出）
によりＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結することによ
り，発現ベクターｐＨＹＵＢＶ８ＲおよびｐＨＹＵＢＶ
８Ｌが得られる。これらの発現ベクターは，Ｖ８様プロ
テアーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアー
ゼのシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位の
Ａｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼの成
熟タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）
をコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有
する。これらの発現ベクターは，大腸菌内でのレプリケ
ーションオリジン，アンピシリン耐性遺伝子，枯草菌内
でのレプリケーションオリジン，およびカナマイシン耐
性遺伝子を有する。そして，ｐＨＹＵＢＶ８Ｒにおいて
は，これらの遺伝子に対して同一方向でＶ８様プロテア
ーゼ遺伝子が転写され，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌにおいては，
これらの遺伝子に対して逆方向でＶ８様プロテアーゼ遺
伝子が転写される。
によりＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結することによ
り，発現ベクターｐＨＹＵＢＶ８ＲおよびｐＨＹＵＢＶ
８Ｌが得られる。これらの発現ベクターは，Ｖ８様プロ
テアーゼのプロモーターの支配下に，Ｖ８様プロテアー
ゼのシグナルペプチド（−６８位のＭｅｔから−１位の
Ａｓｎ）をコードするＤＮＡ配列，該プロテアーゼの成
熟タンパク（＋１位のＶａｌから＋２８９位のＡｌａ）
をコードするＤＮＡ配列，および該成熟タンパクをコー
ドするＤＮＡ配列の下流に存在する３’非翻訳領域を有
する。これらの発現ベクターは，大腸菌内でのレプリケ
ーションオリジン，アンピシリン耐性遺伝子，枯草菌内
でのレプリケーションオリジン，およびカナマイシン耐
性遺伝子を有する。そして，ｐＨＹＵＢＶ８Ｒにおいて
は，これらの遺伝子に対して同一方向でＶ８様プロテア
ーゼ遺伝子が転写され，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌにおいては，
これらの遺伝子に対して逆方向でＶ８様プロテアーゼ遺
伝子が転写される。
【００５６】（カ）発現ベクターｐＨＹ３００ＣＡＨＶ
８の構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３０
０ＣＡＨＶ８は，図１２に示すように，■Ｖ８様プロテ
アーゼのシグナルペプチドおよび成熟タンパクをコード
する塩基配列を有するＤＮＡ断片，■セファロスポリン
アチルハイドロラーゼ（ＣＡＨ）のプロモーターをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ断片，および■ｐＨＹ３
００ＰＬＫ由来のベクターを用いて構築される。
８の構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３０
０ＣＡＨＶ８は，図１２に示すように，■Ｖ８様プロテ
アーゼのシグナルペプチドおよび成熟タンパクをコード
する塩基配列を有するＤＮＡ断片，■セファロスポリン
アチルハイドロラーゼ（ＣＡＨ）のプロモーターをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ断片，および■ｐＨＹ３
００ＰＬＫ由来のベクターを用いて構築される。
【００５７】この発現ベクターを構築するには，まず，
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＴＣＣ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼのシ
グナルペプチドのＮ末端付近に相当するＤＮＡ配列を含
み，ＳａｃＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長の一
本鎖断片（センスプライマーＬ；配列表１６に示す）を
，そして，アンチセンスプライマーとして，（ア）項で
調製したのと同様にアンチセンスプライマーＢを化学合
成し，これらを用いてＰＣＲ反応を行った。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株の培養細胞
からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に従って，ゲノムＤＮＡ
を単離し，これをＰＣＲ反応に用いる鋳型ＤＮＡとする
。次に，センスプライマーとして，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＴＣＣ １２６００株由来のＶ８様プロテアーゼのシ
グナルペプチドのＮ末端付近に相当するＤＮＡ配列を含
み，ＳａｃＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長の一
本鎖断片（センスプライマーＬ；配列表１６に示す）を
，そして，アンチセンスプライマーとして，（ア）項で
調製したのと同様にアンチセンスプライマーＢを化学合
成し，これらを用いてＰＣＲ反応を行った。
【００５８】センスプライマーＬ：５’−ＣＧＡＧＡＧ
ＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＸｂａＩで分解す
ることにより，Ｖ８様プロテアーゼのシグナルペプチド
と成熟タンパクとをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
断片■が得られる。
ＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩおよびＸｂａＩで分解す
ることにより，Ｖ８様プロテアーゼのシグナルペプチド
と成熟タンパクとをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
断片■が得られる。
【００５９】次いで，ＣＡＨ遺伝子およびそのプロモー
ターを有するプラスミドｐＣＡＨ１０から，次のように
して，該プロモーターを有する断片を得る。このプラス
ミドｐＣＡＨ１０は，図１１に示すように，ｐＣＡＨ０
３をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで分解し，４．１ｋｂ
の断片を得，クレノー断片で処理後，Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼで処理し，再環化することにより得られる（特願平
２−１１３４８３号）。このｐＣＡＨ１０をＰＣＲ反応
の鋳型とする。センスプライマーとしてＣＡＨ遺伝子（
特願平２−１１３４８３号）の５’末端領域に相当し，
ＥｃｏＲＩ部位が付加された２７ヌクレオチド長の一本
鎖断片（センスプライマーＭ；配列表１７に示す），お
よびアンチセンプライマーとして，該遺伝子の開始コド
ン付近の領域のＤＮＡ配列に相補的であり，ＳａｃＩ部
位が付加された２６ヌクレオチド長の一本鎖断片（アン
チセンスプライマーＮ；配列表１８に示す）を化学合成
し，これらを用いてＰＣＲ反応を行う。
ターを有するプラスミドｐＣＡＨ１０から，次のように
して，該プロモーターを有する断片を得る。このプラス
ミドｐＣＡＨ１０は，図１１に示すように，ｐＣＡＨ０
３をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで分解し，４．１ｋｂ
の断片を得，クレノー断片で処理後，Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼで処理し，再環化することにより得られる（特願平
２−１１３４８３号）。このｐＣＡＨ１０をＰＣＲ反応
の鋳型とする。センスプライマーとしてＣＡＨ遺伝子（
特願平２−１１３４８３号）の５’末端領域に相当し，
ＥｃｏＲＩ部位が付加された２７ヌクレオチド長の一本
鎖断片（センスプライマーＭ；配列表１７に示す），お
よびアンチセンプライマーとして，該遺伝子の開始コド
ン付近の領域のＤＮＡ配列に相補的であり，ＳａｃＩ部
位が付加された２６ヌクレオチド長の一本鎖断片（アン
チセンスプライマーＮ；配列表１８に示す）を化学合成
し，これらを用いてＰＣＲ反応を行う。
【００６０】センスプライマーＭ：５’−ＧＡＧＧＡＡ
ＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧ−３’ アンチセンスプライマーＮ：５’−ＧＡＧＧＡＧＣＴＣ
ＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで分解
することによりＣＡＨのプロモーターを有するＤＮＡ断
片■が得られる。次いで，（オ）項で得られた発現ベク
ターｐＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで分
解して，大きい方のＤＮＡ断片■を得る。ｐＨＹ３００
Ｖ８Ｒを用いる代わりに，ｐＨＹ３００ＰＬＫを利用す
ることも可能である。
ＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧ−３’ アンチセンスプライマーＮ：５’−ＧＡＧＧＡＧＣＴＣ
ＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣ−３’ 得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで分解
することによりＣＡＨのプロモーターを有するＤＮＡ断
片■が得られる。次いで，（オ）項で得られた発現ベク
ターｐＨＹ３００Ｖ８ＲをＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで分
解して，大きい方のＤＮＡ断片■を得る。ｐＨＹ３００
Ｖ８Ｒを用いる代わりに，ｐＨＹ３００ＰＬＫを利用す
ることも可能である。
【００６１】上記断片■，■および■を常法によりＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結することにより，発現ベクター
ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８が得られる（図１２）。この発
現ベクターは，ＣＡＨのプロモーターの支配下に，Ｖ８
様プロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列，該プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列，および該成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列
の下流に存在する３’非翻訳領域を有する。但し，上記
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列においては，
−６８位のＭｅｔをコードするＡＴＧと−６７位のＬｙ
ｓをコードするＡＡＡとの間にＡＧＣＴＣＴ（ＳｅｒＳ
ｅｒ）の配列が挿入されている。
ＤＮＡリガーゼで連結することにより，発現ベクター
ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８が得られる（図１２）。この発
現ベクターは，ＣＡＨのプロモーターの支配下に，Ｖ８
様プロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列，該プロテアーゼの成熟タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列，および該成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列
の下流に存在する３’非翻訳領域を有する。但し，上記
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列においては，
−６８位のＭｅｔをコードするＡＴＧと−６７位のＬｙ
ｓをコードするＡＡＡとの間にＡＧＣＴＣＴ（ＳｅｒＳ
ｅｒ）の配列が挿入されている。
【００６２】セファロスポリンアセチルハイドロラーゼ
のプロモーターと，Ｖ８様プロテアーゼのシグナルペプ
チドのＮ末端付近に対応するＤＮＡ配列を図１２下部に
示す。
のプロモーターと，Ｖ８様プロテアーゼのシグナルペプ
チドのＮ末端付近に対応するＤＮＡ配列を図１２下部に
示す。
【００６３】（キ）発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
の構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＡＭ８２Ｓ
ＩＧＶ８は，図１６に示すように，■ラット膵臓ホスホ
リパーゼＡ２のシグナルペプチドおよびＶ８様プロテア
ーゼをコードする塩基配列をコードするＤＮＡ配列を含
む断片，および■ｐＡＭ８Ｌベクターを用いて構築され
る。
の構築本発明の発現ベクターの一例であるｐＡＭ８２Ｓ
ＩＧＶ８は，図１６に示すように，■ラット膵臓ホスホ
リパーゼＡ２のシグナルペプチドおよびＶ８様プロテア
ーゼをコードする塩基配列をコードするＤＮＡ配列を含
む断片，および■ｐＡＭ８Ｌベクターを用いて構築され
る。
【００６４】上記ＤＮＡ断片■は，プラスミドｐＧＥＭ
４ＳＩＧＶ８から得られる。このｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８
の調製法を次に説明する。まず，プラスミドｐＧＥＭ４
（プロメガ社）をＳａｃＩで切断し，クレノー処理によ
り切断面を平滑化する。これに，５’−ＣＣＴＣＧＡＧ
Ｇ−３’でなる８ｍｅｒの２本鎖のＸｈｏＩリンカーを
，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し，ＸｈｏＩ切断
部位を有するプラスミドｐＧＥＭ４（ＸｈｏＩ）を得る
。このプラスミドを，図１４に示すように，ＸｈｏＩお
よびＳｍａＩで分解し，大きい方の断片■を得る。これ
とは別に，ラットの膵臓からモレキュラークローニング
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２）の方法
に従ってｍ−ＲＮＡを調製し，次いでｃ−ＤＮＡを調製
する。このｃ−ＤＮＡをＰＣＲ法に用いる鋳型ＤＮＡと
する。ＰＣＲ反応のセンスプラマーとして，ラット膵臓
ホスホリパーゼＡ２遺伝子（小原ら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ ９９， ７３３−７３９（１９８６））の５’末
端付近の塩基配列（１８〜３５位；シグナルペプチドの
Ｎ末端部に相当する）に相当し，ＸｈｏＩ部位が付加さ
れた２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプライマ
ーＯ；配列表１９に示す），およびアンチセンスプライ
マーとして該遺伝子の７５〜１００位の塩基配列（シグ
ナルペプチドのＣ末端部に相当する）に相補的でありＳ
ｔｕＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長の一本鎖断
片（アンチセンスプライマーＰ；配列表２０に示す）を
化学合成し，これらを用いてＰＣＲ反応を行う。
４ＳＩＧＶ８から得られる。このｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８
の調製法を次に説明する。まず，プラスミドｐＧＥＭ４
（プロメガ社）をＳａｃＩで切断し，クレノー処理によ
り切断面を平滑化する。これに，５’−ＣＣＴＣＧＡＧ
Ｇ−３’でなる８ｍｅｒの２本鎖のＸｈｏＩリンカーを
，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し，ＸｈｏＩ切断
部位を有するプラスミドｐＧＥＭ４（ＸｈｏＩ）を得る
。このプラスミドを，図１４に示すように，ＸｈｏＩお
よびＳｍａＩで分解し，大きい方の断片■を得る。これ
とは別に，ラットの膵臓からモレキュラークローニング
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２）の方法
に従ってｍ−ＲＮＡを調製し，次いでｃ−ＤＮＡを調製
する。このｃ−ＤＮＡをＰＣＲ法に用いる鋳型ＤＮＡと
する。ＰＣＲ反応のセンスプラマーとして，ラット膵臓
ホスホリパーゼＡ２遺伝子（小原ら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ ９９， ７３３−７３９（１９８６））の５’末
端付近の塩基配列（１８〜３５位；シグナルペプチドの
Ｎ末端部に相当する）に相当し，ＸｈｏＩ部位が付加さ
れた２７ヌクレオチド長の一本鎖断片（センスプライマ
ーＯ；配列表１９に示す），およびアンチセンスプライ
マーとして該遺伝子の７５〜１００位の塩基配列（シグ
ナルペプチドのＣ末端部に相当する）に相補的でありＳ
ｔｕＩ部位が付加された２６ヌクレオチド長の一本鎖断
片（アンチセンスプライマーＰ；配列表２０に示す）を
化学合成し，これらを用いてＰＣＲ反応を行う。
【００６５】センスプライマーＯ：５’−ＧＡＧＣＴＣ
ＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣ−３’ アンチセンスプライマーＰ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＣＴ
ＡＧＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＴＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をクレノー断片で処理し，ＸｈｏＩ
で切断することにより，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２
のシグナルペプチドを有する断片■が得られる（図１４
）。上記断片■および■を，常法によりＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼで連結することにより，プラスミドｐＧＥＭ４Ｓ
ＩＧが得られる。
ＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣ−３’ アンチセンスプライマーＰ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＣＴ
ＡＧＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＴＧ−３’ 得られたＤＮＡ断片をクレノー断片で処理し，ＸｈｏＩ
で切断することにより，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２
のシグナルペプチドを有する断片■が得られる（図１４
）。上記断片■および■を，常法によりＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼで連結することにより，プラスミドｐＧＥＭ４Ｓ
ＩＧが得られる。
【００６６】このｐＧＥＭＳＩＧを，図１５に示すよう
に，ＳｔｕＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断し，大きい方の
断片■を得る。次に，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１
２６００株の培養細胞からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に
従って，ゲノムＤＮＡを単離し，これをＰＣＲ反応に用
いる鋳型ＤＮＡとする。センスプライマーとして，（ウ
）項で用いたのと同様のセンスプライマーＥを，そして
アンチセンスプライマーとして，（オ）項で用いたのと
同様のアンチセンスプライマーＫをそれぞれ化学合成し
，ＰＣＲ反応を行う。得られたＤＮＡ断片をｐｍａＣＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで分解することにより，Ｖ８様プロ
テアーゼの成熟タンパクをコードする塩基配列を有する
断片■が得られる。上記断片■および■を，常法により
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結することにより，プラスミ
ドｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８が得られる（図１５）。このプ
ラスミドは，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２のシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する。このプラス
ミドを図１６に示すように，ＸｈｏＩ及びＰｖｕＩＩＩ
で分解することにより，上記断片■が得られる。別に，
プラスミドｐＡＭ８２（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａら，Ｐｒ
ｏｃ． ＮａｔＩ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８
０， １−５（１９８３））をＸｈｏＩおよびＰｖｕＩ
Ｉで分解し，大きい方の断片■を得る。これらの断片■
および■を，常法によりＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結することにより，発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ
８が得られる。この発現ベクターは，ＰＨＯ５プロモー
ターの支配下に，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２のシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ配列，Ｖ８様プロテア
ーゼの成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列および該成
熟コードをコードするＤＮＡ配列の下流に存在する３’
非翻訳領域を有する。
に，ＳｔｕＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断し，大きい方の
断片■を得る。次に，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１
２６００株の培養細胞からＭ． Ｓｔａｈｌらの方法に
従って，ゲノムＤＮＡを単離し，これをＰＣＲ反応に用
いる鋳型ＤＮＡとする。センスプライマーとして，（ウ
）項で用いたのと同様のセンスプライマーＥを，そして
アンチセンスプライマーとして，（オ）項で用いたのと
同様のアンチセンスプライマーＫをそれぞれ化学合成し
，ＰＣＲ反応を行う。得られたＤＮＡ断片をｐｍａＣＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで分解することにより，Ｖ８様プロ
テアーゼの成熟タンパクをコードする塩基配列を有する
断片■が得られる。上記断片■および■を，常法により
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結することにより，プラスミ
ドｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８が得られる（図１５）。このプ
ラスミドは，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２のシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する。このプラス
ミドを図１６に示すように，ＸｈｏＩ及びＰｖｕＩＩＩ
で分解することにより，上記断片■が得られる。別に，
プラスミドｐＡＭ８２（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａら，Ｐｒ
ｏｃ． ＮａｔＩ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８
０， １−５（１９８３））をＸｈｏＩおよびＰｖｕＩ
Ｉで分解し，大きい方の断片■を得る。これらの断片■
および■を，常法によりＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結することにより，発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ
８が得られる。この発現ベクターは，ＰＨＯ５プロモー
ターの支配下に，ラット膵臓ホスホリパーゼＡ２のシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ配列，Ｖ８様プロテア
ーゼの成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列および該成
熟コードをコードするＤＮＡ配列の下流に存在する３’
非翻訳領域を有する。
【００６７】上記（ア）〜（キ）項で得られる発現ベク
ターにおいては，いずれも適当な宿主に導入し，アンピ
シリン含有平板寒天培地上で選択を行い，アンピシリン
耐性コロニーからＤＮＡを単離し，制限酵素切断パター
ンを確認することにより，目的とするＤＮＡ断片が正し
い位置および方向で挿入されていることが確認され得る
。
ターにおいては，いずれも適当な宿主に導入し，アンピ
シリン含有平板寒天培地上で選択を行い，アンピシリン
耐性コロニーからＤＮＡを単離し，制限酵素切断パター
ンを確認することにより，目的とするＤＮＡ断片が正し
い位置および方向で挿入されていることが確認され得る
。
【００６８】（ＩＩＩ）形質転換体の調製上記発現ベク
ターのうち，（ア）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ
３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８
ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔおよび
（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐ
ＨＹ３００ＣＡＨＶ８は，枯草菌に導入されて形質転換
体が得られる。たとえば，Ｊ． Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの
方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ， ４４， １０７２（１９５８））に従って
，枯草菌ＩＳＷ １２１４株に上記発現ベクターが導入
されて，形質転換体が得られる。上記（ア），（イ），
（ウ），（エ）および（カ）の発現ベクターが導入され
た形質転換体は，テトクサイクリン含有平板寒天培地上
で選択される。このようにして，（ア），（イ），（ウ
），（エ）および（カ）の発現ベクターがそれぞれ導入
された，次の形質転換体が得られる。：Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１
２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨ
Ｙ３００Ｖ８Ｒｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８
ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ
１２１４， およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８／ＩＳＷ１２１４。上記（
オ）の発現ベクターが導入された形質転換体は，カナマ
イシン含有平板寒天培地上で選択される。このようにし
て，（オ）の発現ベクター（ｐＨＹＵＢＶ８Ｒおよびｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ）がそれぞれ導入された，次の形質転換
体が得られる。：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４およびＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ／ＩＳＷ
１２１４。
ターのうち，（ア）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ
３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８
ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔおよび
（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐ
ＨＹ３００ＣＡＨＶ８は，枯草菌に導入されて形質転換
体が得られる。たとえば，Ｊ． Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの
方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ， ４４， １０７２（１９５８））に従って
，枯草菌ＩＳＷ １２１４株に上記発現ベクターが導入
されて，形質転換体が得られる。上記（ア），（イ），
（ウ），（エ）および（カ）の発現ベクターが導入され
た形質転換体は，テトクサイクリン含有平板寒天培地上
で選択される。このようにして，（ア），（イ），（ウ
），（エ）および（カ）の発現ベクターがそれぞれ導入
された，次の形質転換体が得られる。：Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１
２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨ
Ｙ３００Ｖ８Ｒｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８
ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ
１２１４， およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８／ＩＳＷ１２１４。上記（
オ）の発現ベクターが導入された形質転換体は，カナマ
イシン含有平板寒天培地上で選択される。このようにし
て，（オ）の発現ベクター（ｐＨＹＵＢＶ８Ｒおよびｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ）がそれぞれ導入された，次の形質転換
体が得られる。：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４およびＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ／ＩＳＷ
１２１４。
【００６９】発現ベクターｐＡＭ８２ ＳＩＧＶ８（キ
）は，酵母に導入されて形質転換体が得られる。例えば
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ２２株に導入され，ヒスチジン含有寒天培地上で選
択され，ロイシン非要求性の形質転換体Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩ
ＧＶ８／ＡＨ２２が得られる。
）は，酵母に導入されて形質転換体が得られる。例えば
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ２２株に導入され，ヒスチジン含有寒天培地上で選
択され，ロイシン非要求性の形質転換体Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩ
ＧＶ８／ＡＨ２２が得られる。
【００７０】（ＩＶ）Ｖ８様プロテアーゼの発現上記（
ＩＩＩ）節で得られた形質転換体で培養することにより
Ｖ８様プロテアーゼが生産される。例えば，上記枯草菌
の形質転換体はＳｃ＋培地で培養することによりＶ８様
プロテアーゼを産出する。上記酵母の形質転換体につい
ては，ＰＨＯ５プロモーターを有するため，培地中の無
機リン酸の有無によって発現のＯＮ−ＯＦＦのスイッチ
が行われ得る（Ｎａｋａｏら，Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ
． Ｂｉｏｌ． ６， ２６１３−２６２３， １９８
６）。従って，まず無機リン酸を含有する培地で増殖を
行い，次いで，これを無機リン酸を含有しない培地に移
すことにより，効果的にＶ８様プロテアーゼが産出され
る。Ｖ８様プロテアーゼの活性は，次の方法により測定
され得る。
ＩＩＩ）節で得られた形質転換体で培養することにより
Ｖ８様プロテアーゼが生産される。例えば，上記枯草菌
の形質転換体はＳｃ＋培地で培養することによりＶ８様
プロテアーゼを産出する。上記酵母の形質転換体につい
ては，ＰＨＯ５プロモーターを有するため，培地中の無
機リン酸の有無によって発現のＯＮ−ＯＦＦのスイッチ
が行われ得る（Ｎａｋａｏら，Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ
． Ｂｉｏｌ． ６， ２６１３−２６２３， １９８
６）。従って，まず無機リン酸を含有する培地で増殖を
行い，次いで，これを無機リン酸を含有しない培地に移
すことにより，効果的にＶ８様プロテアーゼが産出され
る。Ｖ８様プロテアーゼの活性は，次の方法により測定
され得る。
【００７１】Ｖ８様プロテアーゼの活性測定法培養液を
２５００×ｇで５分間遠心分離し，上清を採取する。試
験管に１０ｍＭのＺ−Ｐｈｅ−ｄｅｕ−Ｇｌｕ−ＰＮＡ
（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａ
ｎｙｌ−Ｌ−α−ｇｌｕａｍｙｌ−４−ｎｉｔｒａｎｉ
ｌｉｄ，ベーリンガーマンハイム社，＃７７５８４３）
２０μｌ，１０倍濃縮緩衝液（０．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ
３，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ＰＨ７．８）１００μｌ，お
よび上記培養上清を入れ，蒸留水を加えて１ｍｌとし，
２５℃で１０分間反応させる。この反応液のＡ４１０に
おける吸光度を測定する。発現量の算出には標準Ｖ８プ
ロテアーゼ（シグマ社，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ 株
由来Ｔｙｐｅ ＸＶＩＩ）を用いる。
２５００×ｇで５分間遠心分離し，上清を採取する。試
験管に１０ｍＭのＺ−Ｐｈｅ−ｄｅｕ−Ｇｌｕ−ＰＮＡ
（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａ
ｎｙｌ−Ｌ−α−ｇｌｕａｍｙｌ−４−ｎｉｔｒａｎｉ
ｌｉｄ，ベーリンガーマンハイム社，＃７７５８４３）
２０μｌ，１０倍濃縮緩衝液（０．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ
３，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ＰＨ７．８）１００μｌ，お
よび上記培養上清を入れ，蒸留水を加えて１ｍｌとし，
２５℃で１０分間反応させる。この反応液のＡ４１０に
おける吸光度を測定する。発現量の算出には標準Ｖ８プ
ロテアーゼ（シグマ社，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８ 株
由来Ｔｙｐｅ ＸＶＩＩ）を用いる。
【００７２】
【実施例】本発明を以下の実施例につき説明する。
【００７３】
（Ｉ）Ｖ８様プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の決
定（Ａ） ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析 Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００ 株の培養
細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈｌら（前出）の方法に従って
ゲノムＤＮＡを調製し，該ＤＮＡをＰＣＲ解析に用いる
鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチド
プライマーは，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８遺伝子に基
づいて，常法により合成した。つまり，配列表２に示す
Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列の，Ｎ末端側１位
から６位に相当するアミノ酸をコードするオリゴヌクレ
オチド１８ｍｅｒ （５’−ＧＴＴＡＴＡＴＴＡＣＣＡ
ＡＡＴＡＡＣ）をセンスプライマーＶ８４とし，該アミ
ノ酸のＣ末端側２６２位から２５７位に相当するアミノ
酸をコードするオリゴヌクレオチドに相補的な１８ｍｅ
ｒ（５’−ＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣ）を
アンチセンスプライマーＶ８９とし，これら２種類のプ
ライマーを合成した。次いで，ＰＣＲ法によりＤＮＡの
増幅を行うため，５００μｌ容のエッペンドルフチュー
ブに次の■〜■を入れた。
定（Ａ） ゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析 Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６００ 株の培養
細胞から，Ｍ． Ｓｔａｈｌら（前出）の方法に従って
ゲノムＤＮＡを調製し，該ＤＮＡをＰＣＲ解析に用いる
鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチド
プライマーは，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８遺伝子に基
づいて，常法により合成した。つまり，配列表２に示す
Ｖ８遺伝子がコードするアミノ酸配列の，Ｎ末端側１位
から６位に相当するアミノ酸をコードするオリゴヌクレ
オチド１８ｍｅｒ （５’−ＧＴＴＡＴＡＴＴＡＣＣＡ
ＡＡＴＡＡＣ）をセンスプライマーＶ８４とし，該アミ
ノ酸のＣ末端側２６２位から２５７位に相当するアミノ
酸をコードするオリゴヌクレオチドに相補的な１８ｍｅ
ｒ（５’−ＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣ）を
アンチセンスプライマーＶ８９とし，これら２種類のプ
ライマーを合成した。次いで，ＰＣＲ法によりＤＮＡの
増幅を行うため，５００μｌ容のエッペンドルフチュー
ブに次の■〜■を入れた。
【００７４】
■ＡＴＣＣ １２６００株由来のゲノムＤＮＡ（０．５
μｇ）■上記センスプライマーＶ８４およびアンチセン
スプライマーＶ８９（各１００ｐｍｏｌ） ■１０μｌのＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）■１μｌ
のｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ，各２５ｍＭ） ■２．５単位のタックポリメラーゼ ■上記■〜■までを合わせた総量が１００μｌとなるよ
うな量の滅菌蒸留水 このチューブを，ＰＣＲ自動化装置（サーモサイクラー
，Ｃｅｔｕｓ社製）を用いて，以下のように加熱処理し
た。
μｇ）■上記センスプライマーＶ８４およびアンチセン
スプライマーＶ８９（各１００ｐｍｏｌ） ■１０μｌのＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ ８．３），５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）■１μｌ
のｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ，各２５ｍＭ） ■２．５単位のタックポリメラーゼ ■上記■〜■までを合わせた総量が１００μｌとなるよ
うな量の滅菌蒸留水 このチューブを，ＰＣＲ自動化装置（サーモサイクラー
，Ｃｅｔｕｓ社製）を用いて，以下のように加熱処理し
た。
【００７５】ｉ）９４℃，３０秒間（ＤＮＡの熱変性）
ｉｉ）５０℃，３０秒間（プライマーとのアニーリング
）ｉｉｉ）７２℃，１分間（ＤＮＡ鎖の伸長反応）上記
ｉ）〜ｉｉｉ）のサイクルを３０回繰り返した。ただし
，最終回のＤＮＡ鎖の伸長反応は５分間行った。得られ
た反応液の一部（１０μｌ）をアガロースゲル電気泳動
により解析したところ，約８５０ｂｐ長のＤＮＡ断片が
得られた。この断片は，Ｖ８遺伝子よりも約６０ｂｐ長
かった。
ｉｉ）５０℃，３０秒間（プライマーとのアニーリング
）ｉｉｉ）７２℃，１分間（ＤＮＡ鎖の伸長反応）上記
ｉ）〜ｉｉｉ）のサイクルを３０回繰り返した。ただし
，最終回のＤＮＡ鎖の伸長反応は５分間行った。得られ
た反応液の一部（１０μｌ）をアガロースゲル電気泳動
により解析したところ，約８５０ｂｐ長のＤＮＡ断片が
得られた。この断片は，Ｖ８遺伝子よりも約６０ｂｐ長
かった。
【００７６】次に，このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｓｐＩ
で消化するために，ＰＣＲ産物 ８．５μｌに１０×Ｓ
ｓｐＩ緩衝液［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオ
スレイトール，１０００ｍＭ ＫＣｌ］１μｌと，５単
位のＳｓｐＩとを加え，３７℃にて１時間反応させた。 得られた消化物をアガロースゲル電気泳動により分析し
たところ，それぞれ２６２，２４３，２２２および１２
２ｂｐオリゴヌクレオチド長に相当する４本のバンドが
認められた。このことにより，上記ＤＮＡ断片は，Ｖ８
遺伝子が有するＳｓｐＩ認識部位と同じ認識部位を有す
ることが確認された。しかし，Ｖ８様遺伝子の３’末端
側に相当する２６２ ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは，
Ｖ８遺伝子のＳｓｐＩ消化物の３’末端側に相当するオ
リゴヌクレオチドよりも約６０ｂｐ長かった。そこで，
この約８５０ｂｐのＰＣＲ産物（Ｖ８４−Ｖ８９）の構
造解析を直接シークエンス法により行うことにした。
で消化するために，ＰＣＲ産物 ８．５μｌに１０×Ｓ
ｓｐＩ緩衝液［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ジチオ
スレイトール，１０００ｍＭ ＫＣｌ］１μｌと，５単
位のＳｓｐＩとを加え，３７℃にて１時間反応させた。 得られた消化物をアガロースゲル電気泳動により分析し
たところ，それぞれ２６２，２４３，２２２および１２
２ｂｐオリゴヌクレオチド長に相当する４本のバンドが
認められた。このことにより，上記ＤＮＡ断片は，Ｖ８
遺伝子が有するＳｓｐＩ認識部位と同じ認識部位を有す
ることが確認された。しかし，Ｖ８様遺伝子の３’末端
側に相当する２６２ ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは，
Ｖ８遺伝子のＳｓｐＩ消化物の３’末端側に相当するオ
リゴヌクレオチドよりも約６０ｂｐ長かった。そこで，
この約８５０ｂｐのＰＣＲ産物（Ｖ８４−Ｖ８９）の構
造解析を直接シークエンス法により行うことにした。
【００７７】まず，Ｖ８４−Ｖ８９反応混合物のアガロ
ースゲル電気泳動を行い，得られた約８５０ｂｐのバン
ドをカミソリで切り出して細片化した。この細片中のＤ
ＮＡを次の二次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。この細片化
ゲルを２本のチューブに入れ，一方のチューブにはセン
スプライマーＶ８４のみを加え（Ｓ），他方のチューブ
には，アンチセンスプライマーＶ８９のみを加え（ＡＳ
），それぞれのチューブにおいて，上述と同様にＰＣＲ
（二次ＰＣＲ）を行なった。このＰＣＲ反応を繰り返し
て行うことにより，合成されたセンスもしくはアンチセ
ンスの１本鎖ＤＮＡのみが大部分を占めるようになる。 反応後，それぞれのチューブ中のＤＮＡを常法によりフ
ェノールおよびクロロホルムを用いて抽出し，水層を得
た。この水層画分に，等量の５Ｍ 酢酸アンモニウムお
よび２．５倍量のエタノールを加え，４℃にて２〜１６
時間静置した。この液を遠心分離することによりペレッ
トを集め，該ペレットを７０％エタノールで洗浄した後
，減圧乾燥し，滅菌水１０μｌに溶かした。
ースゲル電気泳動を行い，得られた約８５０ｂｐのバン
ドをカミソリで切り出して細片化した。この細片中のＤ
ＮＡを次の二次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。この細片化
ゲルを２本のチューブに入れ，一方のチューブにはセン
スプライマーＶ８４のみを加え（Ｓ），他方のチューブ
には，アンチセンスプライマーＶ８９のみを加え（ＡＳ
），それぞれのチューブにおいて，上述と同様にＰＣＲ
（二次ＰＣＲ）を行なった。このＰＣＲ反応を繰り返し
て行うことにより，合成されたセンスもしくはアンチセ
ンスの１本鎖ＤＮＡのみが大部分を占めるようになる。 反応後，それぞれのチューブ中のＤＮＡを常法によりフ
ェノールおよびクロロホルムを用いて抽出し，水層を得
た。この水層画分に，等量の５Ｍ 酢酸アンモニウムお
よび２．５倍量のエタノールを加え，４℃にて２〜１６
時間静置した。この液を遠心分離することによりペレッ
トを集め，該ペレットを７０％エタノールで洗浄した後
，減圧乾燥し，滅菌水１０μｌに溶かした。
【００７８】直接シークエンス法に用いるオリゴヌクレ
オチドプライマーＶ８４およびＶ８９は，５’末端を３
２Ｐ標識して使用した。標識は，以下の■〜■を混合し
て３７℃にて３０分間反応させた後，１００℃にて２分
間加熱して反応停止させることにより行った。
オチドプライマーＶ８４およびＶ８９は，５’末端を３
２Ｐ標識して使用した。標識は，以下の■〜■を混合し
て３７℃にて３０分間反応させた後，１００℃にて２分
間加熱して反応停止させることにより行った。
【００７９】■１０ｐｍｏｌのセンスプライマーＶ８４
またはアンチセンスプライマーＶ８９ ■１．５μｌの１０×キナーゼ緩衝液（５００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１００ｍＭ２−メルカプトエタノール）■３．７
ＭＢｑの３２Ｐ−γＡＴＰ（１８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）
■１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ■上記■〜
■までを合わせた総量が１５μｌとなるような量の滅菌
蒸留水 上記（Ｓ）で調製した一本鎖ＤＮＡ ５μｌに３２Ｐ標
識アンチセンスプライマー３μｌを加えた。上記（ＡＳ
）で調製した一本鎖ＤＮＡ ５μｌには３２Ｐ標識セン
スプライマー３μｌを加えた。各検体に，５×ポリメラ
ーゼ緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．
５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ
）２μｌを加えて混和し，６５℃にて１０分間加熱し，
次いで室温にて２０分間アニーリングを行った。
またはアンチセンスプライマーＶ８９ ■１．５μｌの１０×キナーゼ緩衝液（５００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１００ｍＭ２−メルカプトエタノール）■３．７
ＭＢｑの３２Ｐ−γＡＴＰ（１８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）
■１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ■上記■〜
■までを合わせた総量が１５μｌとなるような量の滅菌
蒸留水 上記（Ｓ）で調製した一本鎖ＤＮＡ ５μｌに３２Ｐ標
識アンチセンスプライマー３μｌを加えた。上記（ＡＳ
）で調製した一本鎖ＤＮＡ ５μｌには３２Ｐ標識セン
スプライマー３μｌを加えた。各検体に，５×ポリメラ
ーゼ緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．
５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ ＮａＣｌ
）２μｌを加えて混和し，６５℃にて１０分間加熱し，
次いで室温にて２０分間アニーリングを行った。
【００８０】これとは別に，２μｌの溶液中に８０μＭ
ｄＮＴＰ，８μＭ ｄｄＮＴＰ，５０ｍＭ ＮａＣｌ
および２単位のシークエネースを含有するチューブを，
４種類の塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）についてそれぞれ準備
した。これらのチューブに，先にアニーリングを行った
試料をそれぞれ２．４μｌずつ添加し，５０℃にて４０
分間反応させた。さらに，これらの検体に３μｌの反応
停止液（９５％ホルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０
．０５％ブロムフェノール青，０．０５％キシレンシア
ノール）を添加して反応を停止させた。この液を７Ｍ尿
素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて塩基配列の決定を行った。その結果，測定されたＶ
８４−Ｖ８９領域の塩基配列は，Ｖ８遺伝子と約９２％
の相同性を有することが認められた。
ｄＮＴＰ，８μＭ ｄｄＮＴＰ，５０ｍＭ ＮａＣｌ
および２単位のシークエネースを含有するチューブを，
４種類の塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）についてそれぞれ準備
した。これらのチューブに，先にアニーリングを行った
試料をそれぞれ２．４μｌずつ添加し，５０℃にて４０
分間反応させた。さらに，これらの検体に３μｌの反応
停止液（９５％ホルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０
．０５％ブロムフェノール青，０．０５％キシレンシア
ノール）を添加して反応を停止させた。この液を７Ｍ尿
素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて塩基配列の決定を行った。その結果，測定されたＶ
８４−Ｖ８９領域の塩基配列は，Ｖ８遺伝子と約９２％
の相同性を有することが認められた。
【００８１】（Ｂ） ゲノムＤＮＡのサザン分析（Ａ）
項で調製した Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株由来のゲノムＤＮＡの１０μｇに，５０単位のＥ
ｃｏＲＩを含む１０μｌの １０×ＥｃｏＲＩ緩衝液（
１０００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５），
７０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌ，７０ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加え，３７℃にて５
時間反応させた。得られたＥｃｏＲＩを消化物を１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離した後
，転写装置（Ｖａｃｕ Ｇｅｎｅ，ファルマシア社製）
を用いて該ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンフィルター
（Ｚｅｔａ Ｐｒｏｂｅ，バイオラッド社製）にブロッ
ティングし，サザン分析を行った。サザン分析に用いる
ハイブリダイゼーション用プローブは，（Ａ）項で得た
Ｖ８４−Ｖ８９ＰＣＲ産物を，常法により３２Ｐ−ｄＣ
ＴＰで標識することにより調製した。上記ＥｃｏＲＩ切
断ＤＮＡ 断片がブロッティングされたナイロンメンブ
ランフィルターを，この３２Ｐ 標識プローブを含有す
るＧＭＣ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．
２），１ｍＭ ＥＤＴＡ，７％ ＳＤＳ，１％（ｗ／ｖ
）ＢＳＡ）中で６５℃にて１６時間インキュベートし，
ハイブリダイゼーションを行った。このナイロンメンブ
レンフィルターを洗浄液（０．３Ｍ ＮａＣｌ，０．０
３Ｍクエン酸３−ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）で室温
にて １０分間，３回，さらに６５℃にて１５分間，２
回洗浄した。ナイロンメンブレンフィルターのオートラ
ジオグラフィーを行ったところ，アガロースゲル中の約
３．５ｋｂ に相当するバンドが陽性バンドとして検出
された。
項で調製した Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １２６
００株由来のゲノムＤＮＡの１０μｇに，５０単位のＥ
ｃｏＲＩを含む１０μｌの １０×ＥｃｏＲＩ緩衝液（
１０００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５），
７０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌ，７０ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加え，３７℃にて５
時間反応させた。得られたＥｃｏＲＩを消化物を１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離した後
，転写装置（Ｖａｃｕ Ｇｅｎｅ，ファルマシア社製）
を用いて該ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンフィルター
（Ｚｅｔａ Ｐｒｏｂｅ，バイオラッド社製）にブロッ
ティングし，サザン分析を行った。サザン分析に用いる
ハイブリダイゼーション用プローブは，（Ａ）項で得た
Ｖ８４−Ｖ８９ＰＣＲ産物を，常法により３２Ｐ−ｄＣ
ＴＰで標識することにより調製した。上記ＥｃｏＲＩ切
断ＤＮＡ 断片がブロッティングされたナイロンメンブ
ランフィルターを，この３２Ｐ 標識プローブを含有す
るＧＭＣ緩衝液（０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．
２），１ｍＭ ＥＤＴＡ，７％ ＳＤＳ，１％（ｗ／ｖ
）ＢＳＡ）中で６５℃にて１６時間インキュベートし，
ハイブリダイゼーションを行った。このナイロンメンブ
レンフィルターを洗浄液（０．３Ｍ ＮａＣｌ，０．０
３Ｍクエン酸３−ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）で室温
にて １０分間，３回，さらに６５℃にて１５分間，２
回洗浄した。ナイロンメンブレンフィルターのオートラ
ジオグラフィーを行ったところ，アガロースゲル中の約
３．５ｋｂ に相当するバンドが陽性バンドとして検出
された。
【００８２】
（Ｃ）サブゲノムライブラリーの作製およびＰＣＲ解析
（Ａ）項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １
２６００株由来のゲノムＤＮＡを，（Ｂ）項と同様にＥ
ｃｏＲＩで消化し，得られた消化物をアガロースゲル電
気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離し，３．５ｋｂのバン
ドをゲルから切り出した。このゲルから約３．５ｋｂの
ＤＮＡ断片をＤＥＡＥメンブレンフィルターで溶出し，
回収した。これとは別に，ファージベクターＭ１３ｍｐ
１０のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後，Ｔ． Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（前出）に従って ５’末端の脱リン酸化
反応を行った。この Ｍ１３ｍｐ１０の ＥｃｏＲＩ
消化ＤＮＡの脱リン酸化物の０．１μｇに，先に回収し
た３．５ｋｂ ＤＮＡ断片，２μｌの １０×ライゲー
ション緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ
７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオ
スレイトール，１０ｍＭ ＡＴＰ），および３５０単位
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加えて総量２０μｌとし，１
２℃にて１６時間ライゲーション反応を行った。
（Ａ）項で調製したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １
２６００株由来のゲノムＤＮＡを，（Ｂ）項と同様にＥ
ｃｏＲＩで消化し，得られた消化物をアガロースゲル電
気泳動にかけてＤＮＡ断片を分離し，３．５ｋｂのバン
ドをゲルから切り出した。このゲルから約３．５ｋｂの
ＤＮＡ断片をＤＥＡＥメンブレンフィルターで溶出し，
回収した。これとは別に，ファージベクターＭ１３ｍｐ
１０のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後，Ｔ． Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（前出）に従って ５’末端の脱リン酸化
反応を行った。この Ｍ１３ｍｐ１０の ＥｃｏＲＩ
消化ＤＮＡの脱リン酸化物の０．１μｇに，先に回収し
た３．５ｋｂ ＤＮＡ断片，２μｌの １０×ライゲー
ション緩衝液（６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ
７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオ
スレイトール，１０ｍＭ ＡＴＰ），および３５０単位
のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加えて総量２０μｌとし，１
２℃にて１６時間ライゲーション反応を行った。
【００８３】次いで，この組換えＭ１３ｍｐ１０ベクタ
ーを，既知の方法（Ｍａｎｄｅｌら，前出）に従って大
腸菌ＪＭ１０３株に導入し，該大腸菌の形質転換を行っ
てサブゲノムライブラリーを作製した。この形質転換体
をＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母
エキス，０．５％ＮａＣｌ，０．２％マルトース，１．
５％寒天）上で培養するとプラークが形成された。そこ
で，この寒天培地１枚あたり２．５ｍｌのＬＢ液体培地
を加え，３７℃にて１時間インキュベートした後，該液
体培地を回収し，遠心分離により菌体を除去してファー
ジ粒子を含む培養液上清を得た。
ーを，既知の方法（Ｍａｎｄｅｌら，前出）に従って大
腸菌ＪＭ１０３株に導入し，該大腸菌の形質転換を行っ
てサブゲノムライブラリーを作製した。この形質転換体
をＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母
エキス，０．５％ＮａＣｌ，０．２％マルトース，１．
５％寒天）上で培養するとプラークが形成された。そこ
で，この寒天培地１枚あたり２．５ｍｌのＬＢ液体培地
を加え，３７℃にて１時間インキュベートした後，該液
体培地を回収し，遠心分離により菌体を除去してファー
ジ粒子を含む培養液上清を得た。
【００８４】この培養上清液を７０℃にて１０分間熱処
理することにより，ファージＤＮＡを熱変性させた。そ
のうちの一部（２μｌ）を以下のＰＣＲに用いる鋳型Ｄ
ＮＡとした。このＰＣＲに用いるプライマーとしては，
上述のＶ８４センスプライマーおよびＶ８９アンチセン
スプライマー，ならびにＭ１３ｍｐ１０のベクターＤＮ
Ａに相補的なオリゴヌクレオチドであるＭ４アンチセン
スプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣ）（配列表３に示す），および該ベクターＤＮＡ
中に存在するオリゴヌクレオチドであるＲＶセンスプラ
イマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）
（配列表４に示す）の４種類を用意した。そして，これ
らのプライマーをＶ８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，Ｖ８
４−ＲＶ，Ｖ８９−Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶの５種類
の組合せで用い，（Ａ）項と同様にしてＰＣＲを行った
。
理することにより，ファージＤＮＡを熱変性させた。そ
のうちの一部（２μｌ）を以下のＰＣＲに用いる鋳型Ｄ
ＮＡとした。このＰＣＲに用いるプライマーとしては，
上述のＶ８４センスプライマーおよびＶ８９アンチセン
スプライマー，ならびにＭ１３ｍｐ１０のベクターＤＮ
Ａに相補的なオリゴヌクレオチドであるＭ４アンチセン
スプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣ）（配列表３に示す），および該ベクターＤＮＡ
中に存在するオリゴヌクレオチドであるＲＶセンスプラ
イマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）
（配列表４に示す）の４種類を用意した。そして，これ
らのプライマーをＶ８４−Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，Ｖ８
４−ＲＶ，Ｖ８９−Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶの５種類
の組合せで用い，（Ａ）項と同様にしてＰＣＲを行った
。
【００８５】次いで，それぞれのＰＣＲ産物の一部（１
０μｌ）をアガロースゲル電気泳動にかけた後に，（Ｂ
）項と同様にナイロンメンブレンフィルターにブロッテ
ィングしてサザン分析を行った。サザン分析に用いるハ
イブリダイゼーション用プローブは，先に決定したＶ８
４−Ｖ８９領域内の塩基配列に基づいて合成したＶ８１
１（５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡ）（
この配列は配列表１内に存在し，その位置は図１，図２
および図３に明示）５’末端を，常法により３２Ｐ−γ
ＡＴＰで標識することにより調製した。上記ＤＮＡ 断
片がブロッティングされたナイロンメンブレンフィルタ
ーを，この３２Ｐ 標識プローブを含有するＧＭＣ緩衝
液中で４２℃にて１６時間インキュベートし，ハイブリ
ダイゼーションを行った。このナイロンメンブレンフィ
ルターを上記（Ｂ）項と同様に洗浄し，該フィルターの
オートラジオグラフィーを行った。その結果，Ｖ８４−
Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産
物について，それぞれアガロースゲル中の約８５０ｂｐ
，約２．５ｋｂおよび約１．８ｋｂに相当するバンドが
陽性バンドとして検出された。Ｖ８４−Ｖ８９領域はＶ
８４−Ｍ４領域に含まれている。従って，Ｓ． ａｕｒ
ｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株由来のＶ８様遺伝子を決
定するために，Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣ
Ｒ産物を解析することにした。
０μｌ）をアガロースゲル電気泳動にかけた後に，（Ｂ
）項と同様にナイロンメンブレンフィルターにブロッテ
ィングしてサザン分析を行った。サザン分析に用いるハ
イブリダイゼーション用プローブは，先に決定したＶ８
４−Ｖ８９領域内の塩基配列に基づいて合成したＶ８１
１（５’−ＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡ）（
この配列は配列表１内に存在し，その位置は図１，図２
および図３に明示）５’末端を，常法により３２Ｐ−γ
ＡＴＰで標識することにより調製した。上記ＤＮＡ 断
片がブロッティングされたナイロンメンブレンフィルタ
ーを，この３２Ｐ 標識プローブを含有するＧＭＣ緩衝
液中で４２℃にて１６時間インキュベートし，ハイブリ
ダイゼーションを行った。このナイロンメンブレンフィ
ルターを上記（Ｂ）項と同様に洗浄し，該フィルターの
オートラジオグラフィーを行った。その結果，Ｖ８４−
Ｖ８９，Ｖ８４−Ｍ４，およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産
物について，それぞれアガロースゲル中の約８５０ｂｐ
，約２．５ｋｂおよび約１．８ｋｂに相当するバンドが
陽性バンドとして検出された。Ｖ８４−Ｖ８９領域はＶ
８４−Ｍ４領域に含まれている。従って，Ｓ． ａｕｒ
ｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株由来のＶ８様遺伝子を決
定するために，Ｖ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣ
Ｒ産物を解析することにした。
【００８６】（Ｄ） Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ
１２６００株由来のＶ８様遺伝子の構造解析 上記（Ｃ）項において，サブゲノムライブラリーから得
られたＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物を
用い，直接シークエンス法により構造解析を行った。そ
れには，まずＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ
産物の二次ＰＣＲをそれぞれ行い，１本鎖ＤＮＡを合成
した。これとは別に，オリゴヌクレオチドプライマーと
して，以下の６種類のプライマーを合成した。各オリゴ
ヌクレオチドプライマーの位置を図１，図２および図３
に示す。
１２６００株由来のＶ８様遺伝子の構造解析 上記（Ｃ）項において，サブゲノムライブラリーから得
られたＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ産物を
用い，直接シークエンス法により構造解析を行った。そ
れには，まずＶ８４−Ｍ４およびＶ８９−ＲＶのＰＣＲ
産物の二次ＰＣＲをそれぞれ行い，１本鎖ＤＮＡを合成
した。これとは別に，オリゴヌクレオチドプライマーと
して，以下の６種類のプライマーを合成した。各オリゴ
ヌクレオチドプライマーの位置を図１，図２および図３
に示す。
【００８７】Ｖ８５ ： ５’−ＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧ
ＴＡＧＴＴＧＴＡＶ８１２： ５’−ＡＴＡＴＣＡＡＴ
ＴＴＣＧＣＡＡＡＴＧＶ８１５： ５’−ＧＧＣＧＡＴ
ＡＡＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＶ８１０： ５’−ＧＴＴＴ
ＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＶ８１４： ５’−ＴＧＣＡ
ＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＴＣＧＴＶ８６ ： ５’−ＴＧ
ＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ（Ａ）項と同様に，
上記１本鎖ＤＮＡとそれぞれのプライマーとをアニーリ
ングさせ，シークエネース反応を行い，ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後にオートラジオグラフィー
により分析した。これらの結果を総合し，Ｖ８様遺伝子
のＤＮＡ配列を決定した。その結果を配列表１および図
１，図２および図３に示す。
ＴＡＧＴＴＧＴＡＶ８１２： ５’−ＡＴＡＴＣＡＡＴ
ＴＴＣＧＣＡＡＡＴＧＶ８１５： ５’−ＧＧＣＧＡＴ
ＡＡＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＶ８１０： ５’−ＧＴＴＴ
ＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＶ８１４： ５’−ＴＧＣＡ
ＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＴＣＧＴＶ８６ ： ５’−ＴＧ
ＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ（Ａ）項と同様に，
上記１本鎖ＤＮＡとそれぞれのプライマーとをアニーリ
ングさせ，シークエネース反応を行い，ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った後にオートラジオグラフィー
により分析した。これらの結果を総合し，Ｖ８様遺伝子
のＤＮＡ配列を決定した。その結果を配列表１および図
１，図２および図３に示す。
【００８８】
（ＩＩ）発現ベクターの構築および形質転換体の調製「
発明の構成」の「（ＩＩ）発現ベクターの構築」の節に
記載の方法により，次の発現ベクターの構築を行った：
（ア）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ
ｔｔ，（ウ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）
ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ，（オ）ｐＨＹＵＢ
Ｖ８Ｒ，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨ
Ｖ８，および（キ）ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８。これらの発
現ベクターにおいて目的とする遺伝子が正しい位置およ
び方向で挿入されていることは，次の方法により確認さ
れた。まずこれらの発現ベクターを大腸菌に導入し，ア
ンピシリン含有平板寒天培地上で選択を行った。アンピ
シリン耐性コロニーより数個のコロニーを採取してプラ
スミドＤＮＡを単離した。制限酵素により生じる断片の
サイズを確認することにより，目的とする遺伝子が正し
い位置および方向で挿入されていることを確認した。
発明の構成」の「（ＩＩ）発現ベクターの構築」の節に
記載の方法により，次の発現ベクターの構築を行った：
（ア）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ
ｔｔ，（ウ）ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）
ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ，（オ）ｐＨＹＵＢ
Ｖ８Ｒ，ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨ
Ｖ８，および（キ）ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８。これらの発
現ベクターにおいて目的とする遺伝子が正しい位置およ
び方向で挿入されていることは，次の方法により確認さ
れた。まずこれらの発現ベクターを大腸菌に導入し，ア
ンピシリン含有平板寒天培地上で選択を行った。アンピ
シリン耐性コロニーより数個のコロニーを採取してプラ
スミドＤＮＡを単離した。制限酵素により生じる断片の
サイズを確認することにより，目的とする遺伝子が正し
い位置および方向で挿入されていることを確認した。
【００８９】上記発現ベクターのうち，（ア）ｐＨＹ３
００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐ
ＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００Ｂ
ＡＡＫＰＳＶ８ｔｔおよび（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８を，Ｊ
． Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ４４， １０７２（１９５
８））により，それぞれ枯草菌ＩＳＷ １２１４株に導
入した。形質転換処理を行った枯草菌は，（ア），（イ
），（ウ），（エ）および（カ）の発現ベクターを含む
菌については，テトラサイクリンを含有する平板寒天培
地で選択し，テトラサイクリン耐性の形質転換体を得た
。このようにして，それぞれの発現ベクターが導入され
た形質転換体である，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔ
ｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２
１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ
３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， およ
びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００
ＣＡＨＶ８／ＩＳＷ１２１４を得た。（オ）のベクター
を含む菌については，カナマイシンを含有する平板寒天
培地で選択を行い，カナマイシン耐性菌，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ／ＩＳＷ１
２１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ／ＩＳＷ１２１４が得られた。
００Ｖ８Ｒ，（イ）ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ，（ウ）ｐ
ＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ，（エ）ｐＨＹ３００Ｂ
ＡＡＫＰＳＶ８ｔｔおよび（オ）ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，ｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ，（カ）ｐＨＹ３００ＣＡＨＶ８を，Ｊ
． Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ４４， １０７２（１９５
８））により，それぞれ枯草菌ＩＳＷ １２１４株に導
入した。形質転換処理を行った枯草菌は，（ア），（イ
），（ウ），（エ）および（カ）の発現ベクターを含む
菌については，テトラサイクリンを含有する平板寒天培
地で選択し，テトラサイクリン耐性の形質転換体を得た
。このようにして，それぞれの発現ベクターが導入され
た形質転換体である，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔ
ｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２
１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ
３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， およ
びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００
ＣＡＨＶ８／ＩＳＷ１２１４を得た。（オ）のベクター
を含む菌については，カナマイシンを含有する平板寒天
培地で選択を行い，カナマイシン耐性菌，Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ／ＩＳＷ１
２１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐ
ＨＹＵＢＶ８Ｌ／ＩＳＷ１２１４が得られた。
【００９０】次に，発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
（キ）を酵母株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２株に導入した。形質転換
処理を行った酵母はヒスチジン含有寒天培地上で選択し
，ロイシン非要求性の形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
／ＡＨ２２を得た。
（キ）を酵母株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２株に導入した。形質転換
処理を行った酵母はヒスチジン含有寒天培地上で選択し
，ロイシン非要求性の形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
／ＡＨ２２を得た。
【００９１】（ＩＩＩ）Ｖ８様プロテアーゼの発現（Ａ
）枯草菌における発現 可溶性デンプン１０ｇ，グリセリン５ｇ，バクトソイト
ーン５ｇ，ＣＳＬ２．５ｇ，酵母抽出物１ｇおよび炭酸
カルシウム３ｇに水を加えて１Ｌとし，攪拌後，ｐＨを
７．０に調整し，Ｓｃ＋培地を得た。これを１２０℃に
て２０分間オートクレーブ処理して減菌した。
）枯草菌における発現 可溶性デンプン１０ｇ，グリセリン５ｇ，バクトソイト
ーン５ｇ，ＣＳＬ２．５ｇ，酵母抽出物１ｇおよび炭酸
カルシウム３ｇに水を加えて１Ｌとし，攪拌後，ｐＨを
７．０に調整し，Ｓｃ＋培地を得た。これを１２０℃に
て２０分間オートクレーブ処理して減菌した。
【００９２】形質転換体Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ
ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１
２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨ
Ｙ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＣＡ
ＨＶ８／ＩＳＷ１２１４，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，およびＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｌをそれぞれ，次
のように培養した。まず，プレート上に生育した形質転
換体のコロニーをＬＢ培地５ｍｌに植菌し，３７℃にて
１８時間振盪培養した。これを上記Ｓｃ＋培地１０ｍｌ
に移し，２８℃にて４日間振盪培養を行った。培養液を
「発明の構成」の項に記したＶ８様プロテアーゼの活性
測定法に従って測定し，Ｖ８様プロテアーゼの産出量を
算出した。その結果を表２に示す。
ｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ
ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１
２１４， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨ
Ｙ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ／ＩＳＷ１２１４， Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹ３００ＣＡ
ＨＶ８／ＩＳＷ１２１４，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ，およびＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐＨＹＵＢＶ８Ｌをそれぞれ，次
のように培養した。まず，プレート上に生育した形質転
換体のコロニーをＬＢ培地５ｍｌに植菌し，３７℃にて
１８時間振盪培養した。これを上記Ｓｃ＋培地１０ｍｌ
に移し，２８℃にて４日間振盪培養を行った。培養液を
「発明の構成」の項に記したＶ８様プロテアーゼの活性
測定法に従って測定し，Ｖ８様プロテアーゼの産出量を
算出した。その結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】（Ｂ）酵母における発現
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地のリン酸添加培地（１．
５ｇリン酸二水素カリウム／Ｌ）および無添加培地（１
．５ｇ塩化カリウム／Ｌ）を次のように調製した。まず
，表３および表５に示すリン酸添加４倍濃縮ストック溶
液，リン酸無添加４倍濃縮ストック溶液およびビタミン
ストック溶液を調製した。
５ｇリン酸二水素カリウム／Ｌ）および無添加培地（１
．５ｇ塩化カリウム／Ｌ）を次のように調製した。まず
，表３および表５に示すリン酸添加４倍濃縮ストック溶
液，リン酸無添加４倍濃縮ストック溶液およびビタミン
ストック溶液を調製した。
【００９５】
【表３】
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】上記リン酸添加４倍濃縮ストック溶液２５
０ｍｌ，ビタミンストック溶液１ｍｌ，グルコース２０
ｇ，およびアスパラギン２ｇに水を加えて１Ｌとした。 これに５０ｍｇのヒスチジン塩酸塩を添加し，０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ６．０に調整した。 このようにしてリン酸添加（ｐ＋）培地を得た。別に，
リン酸添加４倍濃縮ストック溶液の代わりにリン酸無添
加４倍濃縮ストック溶液を用い，同様に混合して，ｐＨ
を７．５に調整することによりリン酸無添加（ｐ−）培
地を得た。ｐ＋培地は１２０℃で１０分間，そしてＰ−
培地は１１０℃で１０分間，それぞれオートクレーブで
滅菌操作を行った。
０ｍｌ，ビタミンストック溶液１ｍｌ，グルコース２０
ｇ，およびアスパラギン２ｇに水を加えて１Ｌとした。 これに５０ｍｇのヒスチジン塩酸塩を添加し，０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ６．０に調整した。 このようにしてリン酸添加（ｐ＋）培地を得た。別に，
リン酸添加４倍濃縮ストック溶液の代わりにリン酸無添
加４倍濃縮ストック溶液を用い，同様に混合して，ｐＨ
を７．５に調整することによりリン酸無添加（ｐ−）培
地を得た。ｐ＋培地は１２０℃で１０分間，そしてＰ−
培地は１１０℃で１０分間，それぞれオートクレーブで
滅菌操作を行った。
【００９９】プレート上に生育したＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ
８／ＡＨ２２を上記ｐ＋培地１０ｍｌに植菌し，３０℃
で２昼夜振盪培養した。この培養液０．２ｍｌを，２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌが添加
されたｐ−培地１０ｍｌに加え，３０℃にて４日間振盪
培養を行った。得られた培養液には１ｍｇ／Ｌの割合で
Ｖ８様プロテアーゼが産生されていた。
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＡＭ８２ＳＩＧＶ
８／ＡＨ２２を上記ｐ＋培地１０ｍｌに植菌し，３０℃
で２昼夜振盪培養した。この培養液０．２ｍｌを，２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌが添加
されたｐ−培地１０ｍｌに加え，３０℃にて４日間振盪
培養を行った。得られた培養液には１ｍｇ／Ｌの割合で
Ｖ８様プロテアーゼが産生されていた。
【０１００】
【発明の効果】本発明によれば，このように，Ｓ． ａ
ｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株から新規のＶ８様プ
ロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が得られる。さらに
，該ＤＮＡ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベク
ターを有する形質転換体が得られ，この形質転換体を培
養することにより新規Ｖ８様プロテアーゼが大量かつ安
価で生産され得る。このようにして生産されたＶ８様プ
ロテアーゼは，従来使用されていたＳ． ａｕｒｅｕｓ
由来のＶ８プロテアーゼと一部アミノ酸配列が異なる新
規物質である。このプロテアーゼは，Ｖ８プロテアーゼ
と同様の酵素活性を有するので，Ｖ８プロテアーゼと同
様に使用することができる。
ｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１２６００株から新規のＶ８様プ
ロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が得られる。さらに
，該ＤＮＡ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベク
ターを有する形質転換体が得られ，この形質転換体を培
養することにより新規Ｖ８様プロテアーゼが大量かつ安
価で生産され得る。このようにして生産されたＶ８様プ
ロテアーゼは，従来使用されていたＳ． ａｕｒｅｕｓ
由来のＶ８プロテアーゼと一部アミノ酸配列が異なる新
規物質である。このプロテアーゼは，Ｖ８プロテアーゼ
と同様の酵素活性を有するので，Ｖ８プロテアーゼと同
様に使用することができる。
【０１０１】
【０１０２】
【配列番号：１】配列の長さ：１５８６配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株名：ＡＴＣＣ１
２６００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３５２．．１４２５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：３
５２．．５５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：５
５６．．１４２５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴ ＴＣＧＡＡＡＣＴＴＡ ＡＧＣ
ＡＣＴＣＡＡＡ ＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡ ＧＣＡＴＴＣ
ＡＴＡＴ ＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴ ６０ＴＴＧ
ＡＣＣＡＡＡＣ ＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴ ＣＡＡＡＣＧ
ＴＴＡＣ ＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴ ＴＡＴＡＡＡＣＡＡ
Ａ ＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴ １２０ＴＣＧＣＴＣ
ＴＣＡＡ ＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴ ＡＴＴＴＡＴＴＣＴ
Ｔ ＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴ ＧＣＡＡＡＣＡＡＴＴ Ｇ
ＡＣＧＡＣＣＴＴＡ １８０ＣＣＡＡＴＴＴＡＡ
Ｃ ＡＣＡＡＴＣＧＡＡＴ ＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴ Ａ
ＣＡＡＴＴＣＡＡＴ ＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣ ＴＴＡＡ
ＴＧＴＴＴＴ ２４０ＴＧＴＡＡＡＣＴＣＴ Ａ
ＡＴＣＴＴＴＡＣＡ ＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴ ＡＡＴＴ
ＴＡＴＴＴＡ ＴＡＴＡＴＴＣＴＴＡ ＴＴＧＡＣＴＴ
ＡＡＡ ３００ＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴ ＧＴＴＡ
ＴＡＴＴＴＡ ＡＣＴＴＧＴＡＡＡＴ ＡＡＡＴＴＴＴ
ＴＴＧ ＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡ Ｇ ＡＴＧ ＡＡＡ
３５７
Ｍｅｔ Ｌｙｓ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＴＴ Ａ
ＧＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＡＣ
Ｔ ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＣＡ ４０５Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ −６５
−６０
−５５ＧＣＧ ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＴＧ ＡＧ
Ｔ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＣＧ
ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＣＴ
４５３Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ−５０
−４５
−４０
−３５ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＣＡ
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ Ａ
ＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ５
０１Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
−３０
−２５ −２０Ａ
ＡＧ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＡ
Ｃ ＣＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＧＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ５４９Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒ
ｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ −１５
−１０
−５ＧＣＴ ＡＡＴ ＧＴＴ
ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＡＴ
ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＴ Ａ
ＣＡ ５９７Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ
１
５ １０ＡＣＧ
ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ Ｇ
ＴＴ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＧＡ
Ａ ＧＣＡ ＣＣＴ ６４５Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ １５
２０ ２５
３０ＡＣＴ ＧＧ
Ｔ ＡＣＡ ＴＴＴ ５ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ
ＡＣＡ ＣＴＴ ６９３Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ ３５
４０
４５ＴＴＡ ＡＣＡ ＡＡＴ
ＡＡＡ ＣＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＴ
ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ Ｇ
ＣＴ ７４１Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ
５０
５５
６０ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＣＴ Ｔ
ＣＴ ＧＣＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡ
Ｔ ＴＡＴ ＣＣＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ７８
９Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ ６５
７０
７５ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＣ
Ｔ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ
ＴＴＡ ８３７Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ
８０
８５ ９０ＧＣＡ
ＡＴＣ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＧＡＡ ８８５Ａｌａ Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ ９５
１００ １０５
１１０ＧＴＡ Ｇ
ＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧ
Ｔ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＡＡ
ＧＴＴ ＡＡＣ ９３３Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａ
ｌ Ａｓｎ １１５
１２０
１２５ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ
ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＣＴ
ＧＧＴ ＧＡＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＧＣＡ Ａ
ＣＡ ９８１Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ
１３０
１３５
１４０ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＡ Ｇ
ＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＴＧ １０２
９Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｍｅｔ １４５
１５０
１５５ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡ
Ｔ ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ
ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＴＴＴ １０７７Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ
１６０ １
６５ １７０ＡＡＴ
ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＴＴ
ＧＧＣ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＴ ＧＧＣ Ｇ
ＴＴ ＣＣＡ ＡＡＴ １１２５Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ａｓｎ１７５
１８０ １８５
１９０ＣＡＡ Ｔ
ＴＴ ＡＡＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＴＡ ＣＧＣ ＡＡＣ
ＴＴＣ ＴＴＡ １１７３Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａ
ｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ １９５
２００
２０５ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ
ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＴＴＣ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＣＴ Ａ
ＡＣ １２２１Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ
２１０
２１５
２２０ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ Ｇ
ＡＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＣＣＧ ＧＡ
Ｃ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ １２６
９Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ ２２５
２３０
２３５ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡ
Ｃ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＡＴ ＡＡＴ
ＣＣＴ １３１７Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ
２４０ ２
４５ ２５０ＧＡＴ
ＡＡＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＡＣ
ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＣ Ｃ
ＡＡ ＣＣＴ ＡＡＣ １３６５Ａｓｐ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ２５５
２６０ ２６５
２７０ＡＡＣ Ｃ
ＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＧ
Ｃ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＡＣ
ＡＡＣ ＣＣＴ １４１３Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ ２７５
２８０
２８５ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＣＡ
ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＴ ＣＴＴＡＡＴＴＴＧＧ ＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＡ ＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡ ＡＡＣＴＴ
ＡＡＣＡＡ １４７２Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ ２８９ ＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴ ＴＴＴＧＡＣＴＴＡＡ ＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＴＡ ＴＴＡＴＡＴＧＡＡＴ ＡＧＴＴＣＡ
ＴＧＴＡ ＡＡＡＣＴＡＧＡＧＴ １５３２ＡＴＴ
ＣＡＡＴＡＴＴ ＡＴＡＡＧＣＡＴＣＡ ＴＡＡＴＧＧ
ＴＴＴＣ ＡＡＴＧＣＴＴＡＴＴ ＴＴＡＴＣＡＣＴＡ
Ｇ ＧＣＧＣ １５８４
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株名：ＡＴＣＣ１
２６００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３５２．．１４２５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：３
５２．．５５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：５
５６．．１４２５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴ ＴＣＧＡＡＡＣＴＴＡ ＡＧＣ
ＡＣＴＣＡＡＡ ＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡ ＧＣＡＴＴＣ
ＡＴＡＴ ＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴ ６０ＴＴＧ
ＡＣＣＡＡＡＣ ＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴ ＣＡＡＡＣＧ
ＴＴＡＣ ＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴ ＴＡＴＡＡＡＣＡＡ
Ａ ＴＡＣＴＴＴＣＴＣＴ １２０ＴＣＧＣＴＣ
ＴＣＡＡ ＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴ ＡＴＴＴＡＴＴＣＴ
Ｔ ＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴ ＧＣＡＡＡＣＡＡＴＴ Ｇ
ＡＣＧＡＣＣＴＴＡ １８０ＣＣＡＡＴＴＴＡＡ
Ｃ ＡＣＡＡＴＣＧＡＡＴ ＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴ Ａ
ＣＡＡＴＴＣＡＡＴ ＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣ ＴＴＡＡ
ＴＧＴＴＴＴ ２４０ＴＧＴＡＡＡＣＴＣＴ Ａ
ＡＴＣＴＴＴＡＣＡ ＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴ ＡＡＴＴ
ＴＡＴＴＴＡ ＴＡＴＡＴＴＣＴＴＡ ＴＴＧＡＣＴＴ
ＡＡＡ ３００ＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴ ＧＴＴＡ
ＴＡＴＴＴＡ ＡＣＴＴＧＴＡＡＡＴ ＡＡＡＴＴＴＴ
ＴＴＧ ＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡ Ｇ ＡＴＧ ＡＡＡ
３５７
Ｍｅｔ Ｌｙｓ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＴＴ Ａ
ＧＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＡＣ
Ｔ ＴＴＧ ＡＣＡ ＡＣＡ ４０５Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ −６５
−６０
−５５ＧＣＧ ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＴＧ ＡＧ
Ｔ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＣＧ
ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＣＴ
４５３Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ−５０
−４５
−４０
−３５ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＣＡ
ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ Ａ
ＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ５
０１Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
−３０
−２５ −２０Ａ
ＡＧ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＡ
Ｃ ＣＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＡＡ
ＣＧＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ５４９Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒ
ｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ −１５
−１０
−５ＧＣＴ ＡＡＴ ＧＴＴ
ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＡＴ
ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＴ Ａ
ＣＡ ５９７Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ
１
５ １０ＡＣＧ
ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ Ｇ
ＴＴ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＧＡ
Ａ ＧＣＡ ＣＣＴ ６４５Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ １５
２０ ２５
３０ＡＣＴ ＧＧ
Ｔ ＡＣＡ ＴＴＴ ５ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ
ＡＣＡ ＣＴＴ ６９３Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ ３５
４０
４５ＴＴＡ ＡＣＡ ＡＡＴ
ＡＡＡ ＣＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＴ
ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ Ｇ
ＣＴ ７４１Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ
５０
５５
６０ＴＴＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＣＴ Ｔ
ＣＴ ＧＣＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡ
Ｔ ＴＡＴ ＣＣＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ７８
９Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ ６５
７０
７５ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＣ
Ｔ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ
ＴＴＡ ８３７Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ
８０
８５ ９０ＧＣＡ
ＡＴＣ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡＴ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＧＡＡ ８８５Ａｌａ Ｉｌ
ｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ ９５
１００ １０５
１１０ＧＴＡ Ｇ
ＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧ
Ｔ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＡＡ
ＧＴＴ ＡＡＣ ９３３Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａ
ｌ Ａｓｎ １１５
１２０
１２５ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ
ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＣＴ
ＧＧＴ ＧＡＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＧＣＡ Ａ
ＣＡ ９８１Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ
１３０
１３５
１４０ＡＴＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＡ Ｇ
ＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＴＧ １０２
９Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｍｅｔ １４５
１５０
１５５ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡ
Ｔ ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ
ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＴＴＴ １０７７Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ
１６０ １
６５ １７０ＡＡＴ
ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＴＴ
ＧＧＣ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＴ ＧＧＣ Ｇ
ＴＴ ＣＣＡ ＡＡＴ １１２５Ａｓｎ Ｇｌ
ｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ａｓｎ１７５
１８０ １８５
１９０ＣＡＡ Ｔ
ＴＴ ＡＡＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＴＡ ＣＧＣ ＡＡＣ
ＴＴＣ ＴＴＡ １１７３Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａ
ｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ １９５
２００
２０５ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ
ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＴＴＣ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＣＴ Ａ
ＡＣ １２２１Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ
２１０
２１５
２２０ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ ＣＣＡ Ｇ
ＡＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＣＣＧ ＧＡ
Ｃ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ １２６
９Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ ２２５
２３０
２３５ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡ
Ｃ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＡＴ ＡＡＴ
ＣＣＴ １３１７Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ
２４０ ２
４５ ２５０ＧＡＴ
ＡＡＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＡＣ
ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＣ Ｃ
ＡＡ ＣＣＴ ＡＡＣ １３６５Ａｓｐ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ２５５
２６０ ２６５
２７０ＡＡＣ Ｃ
ＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＧ
Ｃ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＡＣ
ＡＡＣ ＣＣＴ １４１３Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ ２７５
２８０
２８５ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＣＡ
ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＴ ＣＴＴＡＡＴＴＴＧＧ ＡＴ
ＴＴＡＧＴＡＴＡ ＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡ ＡＡＣＴＴ
ＡＡＣＡＡ １４７２Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ ２８９ ＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴ ＴＴＴＧＡＣＴＴＡＡ ＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＴＡ ＴＴＡＴＡＴＧＡＡＴ ＡＧＴＴＣＡ
ＴＧＴＡ ＡＡＡＣＴＡＧＡＧＴ １５３２ＡＴＴ
ＣＡＡＴＡＴＴ ＡＴＡＡＧＣＡＴＣＡ ＴＡＡＴＧＧ
ＴＴＴＣ ＡＡＴＧＣＴＴＡＴＴ ＴＴＡＴＣＡＣＴＡ
Ｇ ＧＣＧＣ １５８４
【０１０３】
【配列番号：２】配列の長さ：１５５８配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ起源
生物名：スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株名：Ｖ８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３５４．．１３６４ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：３
５４．．５５７ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：５
５８．．１３６４ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴ ＴＣＧＡＡＡＣＴＴＡ ＡＧＣ
ＡＣＴＣＡＡＡ ＴＡＡＴＡＴＡＴＣＡ ＣＣＡＴＴＣ
ＡＴＡＴ ＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴ ６０ＴＴＧ
ＧＧＣＣＣＡＡ ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡ ＴＴＣＡＡＡ
ＡＧＴＴ ＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴ ＡＴＴＡＴＡＡＡＣ
Ａ ＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣ １２０ＡＴＴＣＧＣ
ＴＣＴＣ ＡＡＴＴＣＣＴＴＴＣ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴ
Ｃ ＴＴＴＴＡＧＡＴＡＡ ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡ Ｔ
ＴＧＡＣＧＡＴＣＴ １８０ＴＡＴＣＡＡＴＴＴ
Ａ ＡＣＴＣＡＡＴＴＧＡ ＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡ Ａ
ＴＡＣＡＡＴＴＣＡ ＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣ ＣＣＴＴ
ＡＡＴＧＴＡ ２４０ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＴ Ｃ
ＴＡＡＴＣＴＴＴＡ ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ＴＴＡＡ
ＴＴＴＡＴＴ ＴＡＴＡＴＡＴＴＣＴ ＴＡＴＴＧＡＣ
ＴＴＡ ３００ＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡ ＴＴＧＴ
ＴＡＴＡＴＴ ＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡ ＡＴＡＡＡＴＴ
ＴＴＴ ＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴ ＴＡＧ ＡＴＧ
３５６
Ｍｅｔ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＡＡ Ｇ
ＴＴ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＣ
Ａ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＣＡ ４０４Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ −６５
−６０
−５５ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＣＡ ＣＴ
Ｔ ＧＴＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ
ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＧ
４５２Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
−５０ −４５
−４０ＧＣＴ ＡＴＧ
ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＡ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＡＧ Ｃ
ＡＡ ＡＣＡ ５００Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓ
ｐ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ−３５ −３
０ −２５
−２０ＣＣＴ ＡＡＧ Ａ
ＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＴ
Ｔ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＧＴ
ＧＡＡ ５４８Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌ
ｕ −１５
−１０
−５ＣＡＣ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴＴ
ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＡＴ Ｃ
ＧＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＴ
５９６Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ
１ ５
１０ ＡＣＡ
ＡＣＧ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＣＡ Ｃ
ＣＣ ＧＴＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＴ
Ｔ ＧＡＡ ＧＣＡ ６４４Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ １５
２０
２５ＣＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＧＣＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＴＡ
ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＣＴ ６９２
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ ３０
３５
４０ ４
５ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＡＣ
ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＴ ＡＣＧ ＣＡＣ Ｇ
ＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ７４０Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ
５０ ５５
６０ＧＣＴ Ｔ
ＴＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＣ
Ａ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＡＴ
ＣＣＡ ＡＡＴ ７８８Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉ
ｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ ６５
７０
７５ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＣＴ
ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ
８３６Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ
８０ ８
５ ９０ＴＴＡ
ＧＣＡ ＡＴＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＣＣ Ｃ
ＣＴ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡ
Ｔ ＡＴＴ ＧＧＴ ８８４Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｙ ９５
１００
１０５ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＣ
Ａ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ
ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ９３２
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ１１０
１１５
１２０ １２
５ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＡ
ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＴ Ａ
ＡＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ９８０Ａｓ
ｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ
１３０ １３５
１４０ＡＣＡ Ａ
ＴＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡ
Ａ ＡＴＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＣ
ＧＡＡ ＧＣＴ １０２８Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ １４５
１５０
１５５ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ
ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ
ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ
１０７６Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
１６０ １６
５ １７０ＴＴＴ
ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＧ Ａ
ＴＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＣ ＧＧ
Ｔ ＧＴＡ ＣＣＡ １１２４Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ １７５
１８０
１８５ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＣ
Ｇ ＧＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＣＧＣ ＡＡＣ ＴＴＣ １１７２
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ１９０
１９５
２００ ２０
５ＴＴＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ
ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ Ｇ
ＡＴ ＧＡＣ ＣＡＡ ＣＣＴ １２２０Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
２１０ ２１５
２２０ＡＡＴ Ａ
ＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡ
Ｃ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＣ
ＣＣＴ ＡＡＣ １２６８Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ ２２５
２３０
２３５ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＡＣ
ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
１３１６Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ
２４０ ２４
５ ２５０ＣＣＡ
ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ Ａ
ＡＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＣ
Ａ ＧＣＴ １３６１Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａ
ｌａ ２５５
２６０ ２６５
ＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡ ＴＴＡＡＧＴＴＣＧＴ ＣＴＡ
ＧＡＴＡＡＡＡ ＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡ ＧＴＣＴＴＡ
ＧＣＡＡ ＣＧＴＡＡＡＡＴＡＴ １４２１ＴＴＴ
ＧＡＴＴＴＡＡ ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＡ ＴＴＡＴＡＴ
ＧＡＡＴ ＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧ
Ｔ ＡＴＴＣＡＡＴＡＴＴ １４８１ＡＴＡＡＧＣ
ＡＴＣＡ ＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣ ＡＡＴＧＣＴＴＡＴ
Ｔ ＴＴＡＴＣＡＣＴＡＧ ＧＣＧＣＡＴＴＴＧＣ Ｔ
ＡＡＴＡＡＣＡＡＴ １５４１ＡＡＡＧＣＣＡＡＡ
Ｇ ＣＣＧＡＴＴＣ
１５５８
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株名：Ｖ８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３５４．．１３６４ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：３
５４．．５５７ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：５
５８．．１３６４ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴ ＴＣＧＡＡＡＣＴＴＡ ＡＧＣ
ＡＣＴＣＡＡＡ ＴＡＡＴＡＴＡＴＣＡ ＣＣＡＴＴＣ
ＡＴＡＴ ＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴ ６０ＴＴＧ
ＧＧＣＣＣＡＡ ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡ ＴＴＣＡＡＡ
ＡＧＴＴ ＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴ ＡＴＴＡＴＡＡＡＣ
Ａ ＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣ １２０ＡＴＴＣＧＣ
ＴＣＴＣ ＡＡＴＴＣＣＴＴＴＣ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴ
Ｃ ＴＴＴＴＡＧＡＴＡＡ ＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡ Ｔ
ＴＧＡＣＧＡＴＣＴ １８０ＴＡＴＣＡＡＴＴＴ
Ａ ＡＣＴＣＡＡＴＴＧＡ ＡＴＡＡＡＧＴＡＴＡ Ａ
ＴＡＣＡＡＴＴＣＡ ＡＴＴＴＴＡＡＴＴＣ ＣＣＴＴ
ＡＡＴＧＴＡ ２４０ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＴ Ｃ
ＴＡＡＴＣＴＴＴＡ ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ＴＴＡＡ
ＴＴＴＡＴＴ ＴＡＴＡＴＡＴＴＣＴ ＴＡＴＴＧＡＣ
ＴＴＡ ３００ＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡ ＴＴＧＴ
ＴＡＴＡＴＴ ＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡ ＡＴＡＡＡＴＴ
ＴＴＴ ＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴ ＴＡＧ ＡＴＧ
３５６
Ｍｅｔ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＡＡＡ Ｇ
ＴＴ ＡＧＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＣ
Ａ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＣＡ ４０４Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ −６５
−６０
−５５ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＣＡ ＣＴ
Ｔ ＧＴＧ ＡＧＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ
ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＧ
４５２Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
−５０ −４５
−４０ＧＣＴ ＡＴＧ
ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＡ
ＡＣＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＡＧ Ｃ
ＡＡ ＡＣＡ ５００Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓ
ｐ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ−３５ −３
０ −２５
−２０ＣＣＴ ＡＡＧ Ａ
ＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＡＣ ＣＴ
Ｔ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＧＴ
ＧＡＡ ５４８Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌ
ｕ −１５
−１０
−５ＣＡＣ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴＴ
ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＧＡＴ Ｃ
ＧＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＴ
５９６Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ
１ ５
１０ ＡＣＡ
ＡＣＧ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＡＴ ＧＣＡ Ｃ
ＣＣ ＧＴＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＴ
Ｔ ＧＡＡ ＧＣＡ ６４４Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ １５
２０
２５ＣＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＴＴ ＡＴ
Ｔ ＧＣＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＴＡ
ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＡＣＴ ６９２
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ ３０
３５
４０ ４
５ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＡＣ
ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＴ ＡＣＧ ＣＡＣ Ｇ
ＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ７４０Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ
５０ ５５
６０ＧＣＴ Ｔ
ＴＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＣ
Ａ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＡＴ
ＣＣＡ ＡＡＴ ７８８Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉ
ｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ ６５
７０
７５ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＣＴ
ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＡＴ
８３６Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ
８０ ８
５ ９０ＴＴＡ
ＧＣＡ ＡＴＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＣＣ Ｃ
ＣＴ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＡ
Ｔ ＡＴＴ ＧＧＴ ８８４Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｙ ９５
１００
１０５ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＣ
Ａ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＣＴ
ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ９３２
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ１１０
１１５
１２０ １２
５ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＡ
ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＡＴ Ａ
ＡＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ９８０Ａｓ
ｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ
１３０ １３５
１４０ＡＣＡ Ａ
ＴＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡ
Ａ ＡＴＣ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＣ
ＧＡＡ ＧＣＴ １０２８Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ １４５
１５０
１５５ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ
ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ
ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ
１０７６Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
１６０ １６
５ １７０ＴＴＴ
ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＧ Ａ
ＴＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＣ ＧＧ
Ｔ ＧＴＡ ＣＣＡ １１２４Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ １７５
１８０
１８５ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＣ
Ｇ ＧＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＣＧＣ ＡＡＣ ＴＴＣ １１７２
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ１９０
１９５
２００ ２０
５ＴＴＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＡ
ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＡＣ Ｇ
ＡＴ ＧＡＣ ＣＡＡ ＣＣＴ １２２０Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
２１０ ２１５
２２０ＡＡＴ Ａ
ＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡ
Ｃ ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＣ
ＣＣＴ ＡＡＣ １２６８Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ ２２５
２３０
２３５ＡＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＡＡ
ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＡＣ
ＣＣＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＡＴ
１３１６Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ
２４０ ２４
５ ２５０ＣＣＡ
ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ Ａ
ＡＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＣ
Ａ ＧＣＴ １３６１Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａ
ｌａ ２５５
２６０ ２６５
ＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡ ＴＴＡＡＧＴＴＣＧＴ ＣＴＡ
ＧＡＴＡＡＡＡ ＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡ ＧＴＣＴＴＡ
ＧＣＡＡ ＣＧＴＡＡＡＡＴＡＴ １４２１ＴＴＴ
ＧＡＴＴＴＡＡ ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＡ ＴＴＡＴＡＴ
ＧＡＡＴ ＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧ
Ｔ ＡＴＴＣＡＡＴＡＴＴ １４８１ＡＴＡＡＧＣ
ＡＴＣＡ ＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣ ＡＡＴＧＣＴＴＡＴ
Ｔ ＴＴＡＴＣＡＣＴＡＧ ＧＣＧＣＡＴＴＴＧＣ Ｔ
ＡＡＴＡＡＣＡＡＴ １５４１ＡＡＡＧＣＣＡＡＡ
Ｇ ＣＣＧＡＴＴＣ
１５５８
【０１０４】
【配列番号：３】配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＧＡＣ
１７
１７
【０１０５】
【配列番号：４】配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ
１７
１７
【０１０６】
【配列番号：５】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴ ＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴ ＣＧＡ
ＡＡＣＴ
２７
ＡＡＣＴ
２７
【０１０７】
【配列番号：６】配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＴＣＴＡＧＡＴ ＡＴＴＴＴＧＣＧＴＴ ＧＴＴ
ＡＡＧ
２６
ＡＡＧ
２６
【０１０８】
【配列番号：７】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧ ＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡ ＡＴＡ
ＡＴＡＧ
２７
ＡＴＡＧ
２７
【０１０９】
【配列番号：８】配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧ ＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡ ＧＡＧ
ＡＡＧ
２６
ＡＡＧ
２６
【０１１０】
【配列番号：９】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡ ＴＡＴＴＡＣＣＡＡＡ ＴＡＡ
ＣＧＡＴ
２７
ＣＧＡＴ
２７
【０１１１】
【配列番号：１０】配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧ ＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴ ＡＣＧ
Ａ
２４
Ａ
２４
【０１１２】
【配列番号：１１】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖
の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴ ＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧ Ｔ
ＡＡＴ
２４
の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＣＧＣＣＧＧＣＴ ＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧ Ｔ
ＡＡＴ
２４
【０１１３】
【配列番号：１２】配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴ ＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴ ＡＴＣ
ＡＴ
２５
ＡＴ
２５
【０１１４】
【配列番号：１３】配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＣ ＧＣＡＴＧＴＧＣＴＡ ＣＧＴ
Ｇ
２４
Ｇ
２４
【０１１５】
【配列番号：１４】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴ ＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴ Ｃ
ＧＡＡＡＣＴ
２７
ＧＡＡＡＣＴ
２７
【０１１６】
【配列番号：１５】配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴ ＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ＣＣＡ
ＴＴＴＡＡ
２８
ＴＴＴＡＡ
２８
【０１１７】
【配列番号：１６】配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴ ＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴ ＴＴＴ
ＴＡＡ
２６
ＴＡＡ
２６
【０１１８】
【配列番号：１７】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡ ＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴ Ａ
ＴＧＴＣＡＧ
２７
ＴＧＴＣＡＧ
２７
【０１１９】
【配列番号：１８】配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡ ＴＴＴＣＣＧＡＴＴＡ ＴＴＣ
ＣＣＣ
２６
ＣＣＣ
２６
【０１２０】
【配列番号：１９】配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣ ＣＣＴＣＧＣＣＡＡＧ ＡＴＧ
ＡＡＡＣ
２７
ＡＡＡＣ
２７
【０１２１】
【配列番号：２０】配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＣＡＧＧＣＣＴＡ ＧＴＧＣＴＧＡＴＧＣ Ｔ
ＧＴＧＴＧ
２６
ＧＴＧＴＧ
２６
【図１】本発明のＶ８様プロテアーゼのＤＮＡ配列およ
び該配列から推定されるアミノ酸配列を示す配列図であ
る。
び該配列から推定されるアミノ酸配列を示す配列図であ
る。
【図２】図１の配列の続きであり，本発明のＶ８様プロ
テアーゼのＤＮＡ配列および該配列から推定されるアミ
ノ酸配列を示す配列図である。
テアーゼのＤＮＡ配列および該配列から推定されるアミ
ノ酸配列を示す配列図である。
【図３】図１および図２の配列の続きであり，本発明の
Ｖ８様プロテアーゼのＤＮＡ配列および該配列から推定
されるアミノ酸配列を示す配列図である。
Ｖ８様プロテアーゼのＤＮＡ配列および該配列から推定
されるアミノ酸配列を示す配列図である。
【図４】本発明のＤＮＡ配列がコードする成熟アミノ酸
のＣ末端付近のアミノ酸配列と，Ｖ８遺伝子がコードす
るアミノ酸配列のＣ末端付近のアミノ酸配列との比較図
である。
のＣ末端付近のアミノ酸配列と，Ｖ８遺伝子がコードす
るアミノ酸配列のＣ末端付近のアミノ酸配列との比較図
である。
【図５】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒの構
築を示す概略図である。
築を示す概略図である。
【図６】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ
の構築を示す概略図である。
の構築を示す概略図である。
【図７】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＭＹ
Ｖ８ｔｔの構築を示す概略図である。
Ｖ８ｔｔの構築を示す概略図である。
【図８】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰ
ＳＶ８ｔｔの構築を示す概略図である。
ＳＶ８ｔｔの構築を示す概略図である。
【図９】本発明の発現ベクターｐＨＹＵＢＶ８Ｒおよび
ｐＨＹＵＢＶ８Ｌの構築に用いるｐＨＹＵＢの構築を示
す概略図である。
ｐＨＹＵＢＶ８Ｌの構築に用いるｐＨＹＵＢの構築を示
す概略図である。
【図１０】本発明の発現ベクターｐＨＹＵＢＶ８Ｒおよ
びｐＨＹＵＢＶ８Ｌの構築を示す概略図である。
びｐＨＹＵＢＶ８Ｌの構築を示す概略図である。
【図１１】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００ＣＡＨＶ
８の構築に用いるｐＣＡＨ１０の構築を示す概略図であ
る。
８の構築に用いるｐＣＡＨ１０の構築を示す概略図であ
る。
【図１２】本発明の発現ベクターｐＨＹ３００ＣＡＨＶ
８の構築を示す概略図である。
８の構築を示す概略図である。
【図１３】本発明の発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
の構築に用いるｐＧＥＭ４（ＸｈｏＩ）の構築を示す概
略図である。
の構築に用いるｐＧＥＭ４（ＸｈｏＩ）の構築を示す概
略図である。
【図１４】本発明の発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
の構築に用いるｐＧＥＭＳＩＧの構築を示す概略図であ
る。
の構築に用いるｐＧＥＭＳＩＧの構築を示す概略図であ
る。
【図１５】本発明の発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
の構築に用いるｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８の構築を示す概略
図である。
の構築に用いるｐＧＥＭ４ＳＩＧＶ８の構築を示す概略
図である。
【図１６】本発明の発現ベクターｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８
の構築を示す概略図である。
の構築を示す概略図である。
Claims (12)
- 【請求項１】配列表１に示される＋１位のＶａｌから＋
２８９位のＡｌａまでのアミノ酸配列を含むプロテアー
ゼ。 - 【請求項２】配列表１に示される−６８位のＭｅｔから
＋２８９位のＡｌａまでのアミノ酸配列を含む請求項１
に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項３】ポリペプチドのＧｌｕ残基のＣ末端を特異
的に開裂する，請求項１に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項４】スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）ＡＴＣＣ
１２６００株由来である，請求項１に記載のプロテア
ーゼ。 - 【請求項５】請求項１に記載のプロテアーゼをコードす
るＤＮＡ配列。 - 【請求項６】配列表１の５５６位のＧから１４２２位の
Ａでなる塩基配列を有する，請求項５に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項７】配列表１の３５２位のＡから１４２２位の
Ａでなる塩基配列を有する，請求項６に記載のＤＮＡ配
列。 - 【請求項８】請求項５に記載のＤＮＡ配列を有する発現
ベクター。 - 【請求項９】前記発現ベクターが，ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒ
， ｐＨＹ３００Ｖ８Ｒｔｔ， ｐＨＹ３００ＢＡＡＭ
ＹＶ８ｔｔ， ｐＨＹ３００ＢＡＡＫＰＳＶ８ｔｔ，
ｐＨＹＵＢＶ８Ｒ， ｐＨＹＵＢＶ８Ｌ， ｐＨＹ３０
０ＣＡＨＶ８，またはｐＡＭ８２ＳＩＧＶ８である，請
求項８に記載の発現ベクター。 - 【請求項１０】請求項８に記載の発現ベクターを宿主に
導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１１】前記宿主が枯草菌または酵母である，請
求項１０に記載の形質転換体。 - 【請求項１２】請求項１０に記載の形質転換体を培養す
る工程，および生産されたプロテアーゼを該培地から採
取する工程を包含する，プロテアーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2463391A JPH04211370A (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | 新規プロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-40398 | 1990-02-20 | ||
| JP4039890 | 1990-02-20 | ||
| JP2463391A JPH04211370A (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | 新規プロテアーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211370A true JPH04211370A (ja) | 1992-08-03 |
Family
ID=26362183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2463391A Pending JPH04211370A (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | 新規プロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04211370A (ja) |
-
1991
- 1991-02-19 JP JP2463391A patent/JPH04211370A/ja active Pending
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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