JPH04211380A - ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 - Google Patents
ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物Info
- Publication number
- JPH04211380A JPH04211380A JP3050646A JP5064691A JPH04211380A JP H04211380 A JPH04211380 A JP H04211380A JP 3050646 A JP3050646 A JP 3050646A JP 5064691 A JP5064691 A JP 5064691A JP H04211380 A JPH04211380 A JP H04211380A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- asn
- protein
- gln
- zymogen
- pgt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は新規なチモーゲン（酵素前駆体）
型ヒトプロテインＣをコードしている新規なＤＮＡ化合
物および組換えＤＮＡベクターに関する。この本発明チ
モーゲンは操作されて、そのグリコシル化のパターンが
天然のヒトプロテインＣチモーゲンと比較して大幅に改
変されている。炭水化物部分が高いレベルでシアル酸を
含有している場合には特に、グリコシル化はタンパク質
の分泌と機能性に重要な役割を果たし得る。本発明の新
規チモーゲンは、グリコシル化部位それぞれが個別に改
変しているよう構築されている。本発明の発現ベクター
は組換え宿主細胞において本発明のヒトプロテインＣチ
モーゲンを発現することのできる簡単かつ効率的な手段
を提供するものである。本発明は、アミド分解活性およ
び抗凝血活性が活性化されれば天然型よりも高くなるよ
うなチモーゲン型プロテインＣを生産するための方法に
関する。この新規チモーゲン型ヒトプロテインＣは、種
々のグリコシル化部位のアミノ酸配列が当業界周知のも
のと異なっている。本発明の新規チモーゲン型プロテイ
ンＣは凝血に関連した血液疾患を処置するうえで特に有
益である。 【０００２】ビタミンＫ依存性血漿タンパク質であるプ
ロテインＣは、ホメオスタシス（恒常性）の制御にとっ
て生理学的に極めて重要なものである。プロテインＣは
、本明細書においては形成期プロテインＣと呼んでいる
不活性な分子として合成される。形成期プロテインＣは
、以下でより詳細に説明するように、複雑なプロセッシ
ングを受けて多くの種々の不活性分子を生じさせる。分
泌された不活性なプロテインＣを本明細書ではチモーゲ
ンプロテインＣと呼ぶことにする。プロテインＣの活性
化は、トロンボモジュリン−トロンビン複合体が関与し
ている反応によって血液中で起こる。活性化プロテイン
Ｃは、そのコファクターであるプロテインＳと共に、重
要な生理学的意義を有する抗凝血物質である。活性化プ
ロテインＣは血管内の血栓形成を予防することができ、
また既に存在している血餅の広がりを抑制することがで
きる。活性型プロテインＣの作用機序、および不活性な
チモーゲンが活性プロテアーゼに活性化される機序は最
近になって明らかにされた［概説としては、ガーディナ
ー（Ｊ．Ｅ．Ｇａｒｄｉｎｅｒ）およびグリフィン（Ｊ
．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎ）のＰｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１３巻，２６５−２７８頁，エル
マー・ビー・ブラウン（Ｅｌｍｅｒ Ｂ．Ｂｒｏｗｎ）
編，Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｉｎｃ
．，１９８３、およびエスモン（Ｅｓｍｏｎ，Ｎ．Ｉ．
）のＰｒｏｇ．Ｈｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．９：２９
−５５（１９８９）を参照のこと］。 【０００３】プロテインＣの活性化には、トロンビン、
凝血カスケードにおける最終セリンプロテアーゼ、およ
びトロンボモジュリンと呼ばれる内皮細胞膜−関連糖タ
ンパク質が関係している。トロンボモジュリンは、トロ
ンビンと一緒になって堅くて化学量論的な複合体を形成
する。トロンボモジュリンは、トロンビンと複合体化す
ると、トロンビンの機能性を劇的に変化させる。トロン
ビンは通常、フィブリノーゲンを凝固させ（ｃｌｏｔ）
、血小板を活性化し、そして凝固コファクターである第
Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子をそれぞれの活性型であるＶａ
およびＶＩＩＩａに変換させる。そして最後にトロンビ
ンはプロテインＣを活性化するが、それは極めて遅く、
非効率的でしかなく、さらにその活性化は生理学的Ｃａ
２＋によって阻害される。これとは対照的に、トロンボ
モジュリンと複合体化したトロンビンはフィブリノーゲ
ンを凝固させず、血小板を活性化せず、または凝固コフ
ァクターである第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子をそれぞ
れ活性型の第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子に変換さ
せないが、生理学的Ｃａ２＋の存在下、プロテインＣチ
モーゲンの非常に効率的なアクチベーターになる。トロ
ンボモジュリン−トロンビンによるプロテインＣチモー
ゲンの活性化の速度定数は、トロンビン単独の速度定数
よりも１，０００倍も高い。 【０００４】活性化プロテインＣがどのようにして血液
凝固を低下調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）するの
かを理解するため、以下に凝血酵素系の簡単な説明を行
う。凝血系は、活性セリンプロテアーゼに至るチモーゲ
ンの一連の活性化に関連した連鎖反応と見なすのが最良
である。この連鎖反応は結果としてトロンビン酵素を産
生させるが、このトロンビン酵素は限定タンパク質分解
反応を介して血漿フィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィ
ブリンに変換する酵素である。この凝血カスケードにお
ける２つの重要な事象は、凝固因子ＩＸａによる凝固因
子ＸからＸａへの変換、および凝固因子Ｘａによるプロ
トロンビンからトロンビンへの変換である。これら両反
応は共に、細胞表面上、最も顕著には血小板表面上で起
こり、そして両反応ともコファクター（補助因子）を必
要とする。この系中において主要なコファクターである
第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子は、比較的不活性な前駆
体として循環しているが、トロンビン分子が最初に幾つ
か形成されれば、トロンビンはループバック（ｌｏｏｐ
ｂａｃｋ）し、限定タンパク質分解を介してそれらコ
ファクターを活性化する。活性化されたコファクターで
ある第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子はプロトロンビ
ンのトロンビンへの変換、および第Ｘ因子の第Ｘａ因子
への変換をそれぞれ約５ケタの大きさだけ促進させる。 活性化プロテインＣは、不活性な凝固因子である第Ｖお
よび第ＶＩＩＩ因子の活性型である凝固コファクター第
Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子に対して優先的に作用
し、それらをタンパク質分解的に崩壊し、加水分解しそ
して不可逆的に破壊する。これとは対照的に、凝固因子
第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子は、インビボにおいては、非
常に僅かしか反応しない活性化プロテインＣに対する基
質である。 【０００５】活性化プロテインＣについての重要なコフ
ァクターは、別のビタミンＫ依存性血漿タンパク質であ
るプロテインＳである。プロテインＳは、第Ｖａ因子お
よび第ＶＩＩＩａ因子の活性化プロテインＣ介在性加水
分解を２５倍実質的に増大させる。 【０００６】プロテインＣは、価値ある治療物質として
認識されている［例えば、１９８８年１０月４日発行の
バング（Ｂａｎｇ）らの米国特許第４，７７５，６２４
号を参照のこと］。活性化プロテインＣは、例えばヘパ
リンおよび経口用ヒドロキシクマリン型抗凝血物質など
の入手し得る抗凝血物質よりも広い治療指数を有する新
規な抗血栓物質である。凝固因子Ｖの第Ｖａ因子への変
換、および第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子への変換
にはトロンビンが必要とされ、これら２つのコファクタ
ーの活性型は活性化プロテインＣにとって優先的な基質
であるので、チモーゲンプロテインＣまたは活性化プロ
テインＣはいずれもトロンビンが生成されるまで機能し
ない。さらに、チモーゲンプロテインＣが活性化される
には、トロンビンが必要であるが、その理由はトロンボ
モジュリン−トロンビン複合体が無ければ、プロテイン
Ｃチモーゲンはその活性型に効率的に変換されないから
である。 【０００７】活性化プロテインＣは、コファクター第Ｖ
ａおよび第ＶＩＩＩａ因子を不活化することによって機
能するものであり、したがって需要性のある抗凝血物質
である。トロンビンは第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子をそれ
らの活性型である第Ｖａおよび第ＶＩＩＩａ因子に変換
するのに必要であるので、プロテインＣのみがトロンビ
ンが生成された後に抗凝血物質として機能する。このよ
うな活性化プロテインＣとは対照的に、従来の抗凝血物
質は患者に投与されている限りは循環している間一定の
抗凝血状態を保持するので、出血という合併症発現の危
険性がプロテインＣまたは活性化プロテインＣ以上に実
質的に増大される。したがって、活性化プロテインＣは
、ヘパリンおよびヒドロキシクマリン類に替わる薬物と
して広範に臨床応用され得る需要性ある抗凝血物質であ
る。 【０００８】遺伝的なプロテインＣ欠乏症など、ある種
の疾患症状では、プロテインＣチモーゲンの治療学的重
要性は極めて高くなる。先天的なホモ接合性（ｈｏｍｏ
ｚｙｇｏｕｓ）のプロテインＣ欠乏症では、罹患個体は
、しばしば致死的な散在性血管内凝血という病態である
電撃性紫斑病のために幼少年期に死亡してしまう。ヘテ
ロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）のプロテインＣ
欠乏症では、罹患個体は重篤な再発性血栓塞栓症に見舞
われる。Ｂ型血友病または第ＩＸ因子欠乏症を処置する
よう設計された、不純物としてプロテインＣを含有する
血漿タンパク質濃縮物は、ヘテロ接合性プロテインＣ欠
乏症における血管内凝血の予防および処置に有用である
ことが臨床的に十分確立されている。さらに、散在性血
管内凝血症などの血栓状態、ならびに重い外傷、重い手
術および癌などの、血栓症にかかり易くなった疾病状態
においては、プロテインＣレベルが異常に低いことも注
目されている。 【０００９】プロテインＣの活性化および本発明の理解
を助けるため、形成期ヒトプロテインＣのコード化配列
および対応するアミノ酸残基配列を以下に記載する。こ
のアミノ酸残基配列およびその相当する部分はさらに、
本発明の目的に沿って「天然ヒトプロテインＣ」の特性
をも表すものである。 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルであり、ＡＬ
Ａはアラニン、ＡＲＧはアルギニン、ＡＳＮはアスパラ
ギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯＯＨはカルボキ
シ末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮはグルタミン、Ｇ
ＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン、ＨＩＳはヒス
チジン、Ｈ２Ｎ−はアミノ末端、ＩＬＥはイソロイシン
、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン、ＭＥＴはメチオ
ニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、
ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはスレオニン、ＴＲＰはトリプ
トファン、ＴＹＲはチロシン、およびＶＡＬはバリンで
ある］ 【００１０】上記のＤＮＡ配列は、ヒトプロテインＣを
コードしているヒト肝ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ
クローンから誘導された。当業者ならば、遺伝子コード
の同義性により、上記と同じアミノ酸残基配列をコード
する多くの異なるＤＮＡ配列を構築することができるこ
とは理解されよう。したがって、形成期ヒトプロテイン
Ｃの上記ｃＤＮＡ配列は、多くのあり得る形成期ヒトプ
ロテインＣのコード化配列のうちのただ１つに過ぎない
。 ｃＤＮＡクローンを構築するに当たっては、５’ポリＧ
配列、３’ポリＣ配列、および５’と３’とのＰｓｔＩ
制限酵素認識配列をプロテインＣコード化ｃＤＮＡの両
末端に作成した。これら２つのｃＤＮＡクローンを操作
して、形成期ヒトプロテインＣのコード化配列とさらに
そのコード化領域の５’および３’末端における非翻訳
ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ部分をも含有しているＤＮ
Ａ分子を構築した。このＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ部位に挿入し、プラスミドｐＨＣ７を
構築した。 したがって、プラスミドｐＨＣ７は上記のコード化配列
を含有しており、さらに形成期ヒトプロテインＣコード
化配列の暗号鎖における５’および３’末端にそれぞれ
以下に記載の配列を付加的に含有している（ここでもそ
の分子の一方のストランド（鎖）のみを記載する）：【
化８】 【００１１】ＤＮＡ塩基対の相補性により、２本鎖ＤＮ
Ａ分子の一方の鎖の配列を描けば、反対の鎖の配列を決
定するのに十分である。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザ
ン・リージォナル・リサーチ・ラボラトリー（ＮＲＲＬ
）［ペオリア、イリノイ］に寄託されており、そのパー
マネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部
を構成している菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌） Ｋ１２
ＲＲ１／ｐＨＣ７から常法に従って単離することがで
きる。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ１／ｐＨＣ７の培養
物は、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６の下に入手可
能である。プラスミドｐＨＣ７の制限部位および機能地
図を添付の図２に示す。 【００１２】形成期プロテインＣは以下のように模式図
的に表すことができる： 【化９】 プレ−プロ−プロテインＣの分泌およびγ−カルボキシ
ル化の指令にとって重要である、シグナルペプチドおよ
びヒトプロテインＣのプロ−ペプチドをコードしている
形成期ヒトプロテインＣの１−４２のアミノ酸残基であ
る。 ＬＣ−翻訳後修飾を受けるとプロテインＣの２鎖チモー
ゲン（以下に記載するように、ＫＲジペプチドの除去に
より１鎖チモーゲンから形成される）および活性型の両
方の軽鎖（ＬＣ）を構成する形成期プロテインＣの４３
−１９７アミノ酸残基である。 【００１３】ＫＲ−形成期ヒトプロテインＣの１９８−
１９９アミノ酸残基である。これらの残基は、まず（１
９７−１９８または１９９−２００残基間のいずれかが
）開裂され、次いでカルボキシペプチダーゼまたはアミ
ノペプチダーゼ作用を受けるという２段階反応によって
おそらくは除去される（これはウシプロテインＣとの相
同性に基づいている）と考えられ、それにより２鎖プロ
テインＣが生成される。 ＡＰ−チモーゲン型プロテインＣから除去されて活性化
プロテインＣを生成させる、活性ペプチドを構成してい
る形成期プロテインＣの２００−２１１アミノ酸残基で
ある。 ＡＨＣ−翻訳後修飾を受けると活性プロテインＣの活性
化重鎖（ＡＨＣ）を構成する形成期プロテインＣの２１
２−４６１アミノ酸残基である。 ＨＣ−翻訳後修飾を受けると２鎖型プロテインＣチモー
ゲンの重鎖を構成するアミノ酸残基２００−４６１のＡ
ＰおよびＡＨＣである。 【００１４】ヒトプロテインＣチモーゲンは、肝臓で合
成され、血中に存在しているセリンプロテアーゼ前駆体
である。プロテインＣが完全な生物学的活性を発現する
ためには、ビタミンＫを要する翻訳後修飾が必要とされ
る。成熟した２鎖のジスルフィド連結したプロテインＣ
チモーゲンは１鎖のチモーゲンから限定タンパク質分解
によって生成される。この限定タンパク質分解は、１９
８および１９９アミノ酸残基の開裂および除去を包含し
ていると考えられる。この活性セリンプロテアーゼへの
２鎖チモーゲンの活性化はＡＲＧ−ＬＥＵペプチド結合
（２１１および２１２残基）のタンパク質分解的開裂を
包含する。この後者の開裂により、２鎖チモーゲン分子
の比較的大きい（重）鎖のアミノ末端を構成する活性ペ
プチド、ドデカペプチド（２００−２１１残基）が遊離
される。プロテインＣは有意にグリコシル化されている
。すなわち、血漿由来のその成熟酵素は１５−２３％の
炭水化物を含有していると言われる。プロテインＣはさ
らに、γ−カルボキシグルタミン酸およびβ−ヒドロキ
シアスパラギン酸（エリスロ−Ｌ−β−ヒドロキシアス
パルテート）などの、普通のアミノ酸でないものを多く
含有している。γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）
は、コファクター（補酵素）としてビタミンＫを必要と
する肝ミクロゾームのカルボキシラーゼによるグルタミ
ン酸残基のγ−グルタミルカルボキシル化によって産生
される。 【００１５】ヒトプロテインＣの活性化も模式図的に表
すことができるので、それを以下に記載する。当業者で
あれば、この模式図で示された工程の順序がインビボに
おける経路順を必ずしも反映していないことは理解され
よう。 【化１０】 【００１６】本発明は、新規なプロテインＣチモーゲン
の新規化合物、ベクター、形質転換体、およびそれを組
換え的に発現させる方法を提供するものである。本明細
書に記載している本発明の目的に沿って、以下のように
用語を定義する。 【００１７】Ａｄ２ＬＰ−２型アデノウイルスの主要な
後期プロモーター。 タンパク質またはペプチド中におけるアミノ酸残基は本
明細書においては以下の表１に記載する略語を使用して
いる： 【表１】 【００１８】ＡｐＲ−アンピシリン耐性表現型またはそ
れを付与する遺伝子。 ＢＫ−ＢＫウイルス由来のＤＮＡ。 Ｅｎｈまたはエンハンサー−ＢＫウイルスのエンハンサ
ー。 ｅｐまたはＳＶ４０ｅｐ−Ｔ−抗原遺伝子のＳＶ４０初
期プロモーター、Ｔ−抗原結合部位、ＳＶ４０エンハン
サー、およびＳＶ４０複製起点を含有するＤＮＡセグメ
ント。 γ−カルボキシル化−グルタミン酸のγ−炭素にカルボ
キシ基を付加する反応。 γ−カルボキシル化タンパク質−幾つかのグルタミン酸
残基がγ−カルボキシル化を受けているタンパク質。 ＧＢＭＴ転写ユニット−アデノウイルスの主要な後期プ
ロモーターの上流調節要素に近づいて配置しているＢＫ
ウイルスのＰ２エンハンサー（ＭＬＴＦ）、アデノウイ
ルス−２の主要な後期プロモーター、該プロモーターを
刺激する位置にあるポリ−ＧＴ要素、およびアデノウイ
ルスのスプライスされたトリパータイト（ｔｒｉｐａｒ
ｔｉｔｅ）リーダー配列を含むＤＮＡ配列を含有してい
る修飾された転写制御ユニット。このＧＢＭＴ転写ユニ
ットはプラスミドｐＧＴ−ｈの約９００塩基対のＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限フラグメント上に見いだされる。 【００１９】ＩＶＳ−イントロンをコードしているＤＮ
Ａであって、介在配列とも呼ばれる。 ＭＭＴｐｒｏ−マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子のプ
ロモーター。 形成期タンパク質−ｍＲＮＡ転写物の翻訳の際に生成さ
れるポリペプチドであって、翻訳後修飾を受ける前のも
の。しかし、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化お
よびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化などの翻訳後
修飾は、タンパク質がｍＲＮＡ転写物から完全に翻訳さ
れる前に起こり始めている場合がある。 ＮｅｏＲ−ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これは
抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するのにも使用す
ることができる。 【００２０】ｐＡ−ポリアデニル化シグナルをコードし
ているＤＮＡ配列。 プロモーター−ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配列
。 プロテインＣ活性−タンパク質分解的、アミド分解的、
エステル分解的および生物学的（抗凝血またはプロフィ
ブリン分解的）な活性に関与しているヒトプロテインＣ
の性質。タンパク質の抗凝血活性の試験方法は当業界周
知であり、グリンネル（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ）らのＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１１８９（１９８７）に記載
されている。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ以
上の付加的なＤＮＡセグメントを追加できるか、または
既に追加されているＤＮＡ分子を含有する物質であって
、例えば染色体に組込む因子、自律的に複製するプラス
ミド、およびファージがあるが、これらに限定されない
。 【００２１】組換えＤＮＡ発現ベクター−プロモーター
が組み込まれており、それが遺伝子産物を発現するよう
に配置されている組換えＤＮＡクローニングベクター。 組換えＤＮＡベクター−組換えＤＮＡクローニングまた
は発現ベクター。 レプリコン−プラスミドまたは他のベクターの自律的複
製を行わしめ、それを制御しているＤＮＡ配列。 制限フラグメント−１つまたはそれ以上の制限エンドヌ
クレアーゼ酵素の作用によって生成される線状ＤＮＡ配
列。 感受性宿主細胞−特定の抗生物質または他の毒性化合物
の存在下では、それらの耐性を付与するＤＮＡセグメン
トが無いために増殖することができない宿主細胞。 【００２２】ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性表現型また
はそれを付与する遺伝子。 形質転換−受容宿主細胞の表現型を変化させるその受容
細胞へのＤＮＡの導入。 形質転換体−形質転換を受けた受容宿主細胞。 翻訳活性化配列−ｍＲＮＡ転写物をペプチドまたはポリ
ペプチドに翻訳させるＤＮＡ配列であって、５’−ＡＴ
Ｇ−３’などの翻訳開始コドンおよびリボソーム結合部
位をコードしているＤＮＡ配列を含有するもの。 チモーゲン（酵素前駆体）−タンパク質分解酵素の酵素
学的に不活性な前駆体。本明細書で使用しているプロテ
インＣチモーゲンとは、分泌された不活性型の１鎖また
は２鎖いずれかのプロテインＣを意味する。 【００２３】本明細書に添付の図面はすべて正確な縮尺
で描いていない。図１はプラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７
、図２はｐＬＰＣ−Ｑ２４８、図３はｐＬＰＣ−Ｑ３１
３、図４はｐＬＰＣ−Ｑ３２９、図５はｐＧＴＣ、図６
はｐＧＴ−ｄ、図７はｐＧＴ−ｈの制限部位および機能
地図をそれぞれ示している。 【００２４】本発明は新規なチモーゲン型ヒトプロテイ
ンＣの発現をコードしているＤＮＡ化合物を提供するも
のである。天然のヒトプロテインＣチモーゲンおよび天
然のヒトプロテインＣの生産方法はいくつか開示されて
いる［１９８８年１０月４日発行のバングらの米国特許
第４，７７５，６２４号および欧州特許公開第２１５５
４８号を参照のこと］。これらの従来の方法では、ヒト
の血中に存在するヒトプロテインＣのチモーゲン型とは
アミノ酸配列が相違していないヒトプロテインＣチモー
ゲン型を発現することができる。ヒト腎２９３セルライ
ンなどの特定の真核生物セルラインで発現させた場合、
ヒト血中に見いだされるチモーゲン型とは類似していな
い新規なグリコシル化パターンを有する天然ヒトプロテ
インＣチモーゲンが分泌される。 【００２５】本発明は、アミノ酸残基配列における部位
−特異的な変化によってグリコシル化パターンが改変さ
れたチモーゲン型ヒトプロテインＣを提供するものであ
る。これらチモーゲン型を活性化した場合、天然のヒト
プロテインＣと比較してアミド分解活性および抗凝血活
性が増大している。本発明はさらに、これら新規チモー
ゲン型プロテインＣのＤＮＡ化合物、組換えＤＮＡ発現
ベクター、形質転換されたセルライン、およびこれらを
組換え的に発現させる方法を提供するものである。本発
明のチモーゲン型ヒトプロテインＣを産生するための方
法は下記の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる方
法である： （Ａ）真核生物宿主細胞を形質転換するに当たり、（ｉ
）アミノ末端からカルボキシ末端にかけてアミノ酸配列
： 【化１１】 ［配列中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮま
たはＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮ
またはＧＬＮである］ を含有するアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ配
列、および （ｉｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるよう配置されている
プロモーターを含有する組換えＤＮＡベクターを使用し
、（Ｂ）工程Ａによって形質転換された該宿主細胞を該
ＤＮＡ配列が発現され得る条件下で培養し、そして（Ｃ
）得られた培養物から該プロテインＣチモーゲン型を回
収すること。この方法およびこの方法に有用な化合物に
ついては以下でより詳細に説明する。 【００２６】本発明はさらに、これら新規なチモーゲン
型ヒトプロテインＣを生産するための方法に有用である
ＤＮＡ化合物を提供するものである。これら新規な化合
物はすべて、分泌を促すシグナルペプチド、および（ビ
タミンＫ依存性カルボキシラーゼの作用により）γ−カ
ルボキシル化されたタンパク質由来のプロペプチドを含
有するプレ−プロペプチドをコードしている。このよう
なプロペプチド配列は当業界周知である。例えば、シュ
ッティー（Ｓｕｔｔｉｅ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６３４−６３７
（１９８７）を参照のこと。好ましくは、また簡便に構
築するには、シグナルペプチドコード化配列およびプロ
ペプチドコード化配列の両者をγ−カルボキシル化タン
パク質のプレ−プロペプチドのアミノ酸残基配列から誘
導する。このようなγ−カルボキシル化タンパク質とし
ては、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロ
ンビン、プロテインＳ、プロテインＺ、およびプロテイ
ンＣが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の
ベクターに使用するには、ヒトプロテインＣのプレ−プ
ロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が最も好ましい
。 【００２７】本発明のＤＮＡ化合物はさらに、プレ−プ
ロペプチドコード化配列の下流に隣接して位置し、かつ
それとの翻訳解読枠内にあるヒトプロテインＣの軽鎖を
コードするコード化配列を含有している。このヒトプロ
テインＣの軽鎖は、上記従来技術の項で説明した形成期
プロテインＣの４３から１９７個のアミノ酸残基をすべ
て含有している。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のア
ミノ末端部分、例えばプロテインＣの軽鎖のアミノ末端
部分はカルシウム結合部位を有している。第ＶＩＩ因子
、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびプロテ
インＳなどのこれら血漿タンパク質のカルシウム結合ド
メインは、ヒトプロテインＣの軽鎖のカルシウム結合ド
メインと同等の態様で使用することができる［欧州特許
公開第０２１５５４８Ａ１号の１２頁および１３頁を参
照のこと］。本発明の新規なチモーゲン型の１つ（Ｑ０
９７）は、軽鎖内の１３９位におけるアスパラギン残基
がグルタミン残基に変化していることから、そのグリコ
シル化部位が除去されている。 【００２８】本発明のＤＮＡ化合物はさらに、その軽鎖
コード化配列の下流に隣接して位置し、かつそれとの翻
訳解読枠内にあるジペプチド、ＬＹＳ−ＡＲＧ（ＫＲ）
をコードしているコード化配列をも含有している。ＬＹ
Ｓ−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドが形成期タンパク
質内における軽鎖のカルボキシ−末端側に配置されてい
る。ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドの発現タンパク質内にお
ける方向性は、本発明では問題でない。ＬＹＳ−ＬＹＳ
またはＡＲＧ−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドも本発
明では、ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドと同様に使用できる
。しかし、天然のヒトプロテインＣ内のジペプチドであ
るＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドが本発明にとっては好まし
い。 【００２９】ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドのコドンの直ぐ
下流は、活性ペプチドのコード化配列である。当業者で
あれば、本発明のチモーゲン型は、以下に説明するよう
に天然のヒトプロテインＣチモーゲン型とは本来的に異
なっていることは理解されよう。 【００３０】軽鎖の１３９位における置換に加えて他の
アミノ酸の置換も、得られたチモーゲンのアミド分解活
性および抗凝血活性を増大させ得る。この「得られたチ
モーゲン」なる用語では、形成期ヒトプロテインＣ内に
おけるアミノ酸の位置を引用して置換を表しているが、
（アミノ酸残基１から４２の除去の結果として）第１に
分泌されてチモーゲン型になっていなければならない形
成期ヒトプロテインＣ、を示すために用いている。した
がって、（形成期ヒトプロテインＣ内の）１３９位のア
スパラギン残基をグルタミン残基と置換すると、本発明
の新規なチモーゲンが得られる。２９０、３５５または
３７１位のアスパラギン残基をグルタミン残基と置換さ
せても、本発明の新規なチモーゲン型が得られる。 【００３１】このように本発明の好ましい新規チモーゲ
ン型ヒトプロテインＣは、以下の（化１２）で示される
アミノ酸残基配列を有する形成期ヒトプロテインＣ分子
の分泌およびプロセッシングの結果として得られる：【
化１２】 ［配列中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮま
たはＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮ
またはＧＬＮである］。 【００３２】新規チモーゲンＱ０９７は、１３９位のア
スパラギン残基がグルタミン残基と置換している。チモ
ーゲンＱ２４８は、２９０位のアスパラギン残基がグル
タミン残基と置換している。チモーゲンＱ３１３は３５
５位のアスパラギン残基がグルタミン残基と置換してお
り、チモーゲンＱ３２９は３７１位のアスパラギン残基
がグルタミン残基と置換している。 【００３３】当業者ならば、遺伝子コードの同義性によ
り、種々のＤＮＡ化合物が上記のポリペプチドをコード
することができることを理解するであろう。したがって
、以下に記載する構築方法、および本発明の好ましいＤ
ＮＡ化合物、ベクターおよび形質転換法に対応する実施
例は単なる例示であって、本発明の範囲を限定するもの
ではない。さらに、ＡＳＮに代わってＧＬＮを置換する
ことは例示であり、本発明の範囲を限定するものではな
く、ＣＹＳまたはＰＲＯを除く他の置換を使用すること
もできるであろう。また、当業者ならば、本発明の種々
の単一アミノ酸置換を組み合わせれば、他の新規チモー
ゲンが作成されることは理解されよう。 【００３４】本発明のＤＮＡ化合物はすべて、ヒトプロ
テインＣ遺伝子の部位特異的突然変異によって調製した
。そして、突然変異チモーゲンをコードしている分子を
真核生物発現ベクター中にそのチモーゲン遺伝子がアデ
ノウイルス−２の主要な後期プロモーターによって発現
されるように挿入した。このベクターは、そのプロモー
ターからの発現を増強するよう配置されているＢＫウイ
ルスのＰ２エンハンサー要素をも含有している。その得
られたベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）Ｋ１２ ＡＧ１細胞に導入し、ノーザン・リー
ジォナル・リサーチ・ラボラトリー［イリノイ６１６０
４、ペオリア］に１９９０年１月９日に寄託してそのパ
ーマネント・ストック・カルチャー・コレクションを形
成させた。具体的な培養物および受託番号を以下の表２
に示す。 【００３５】 【表２】 培養物
受託番号 Ｅ．ｃ
ｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７
ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０８
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰ
Ｃ−Ｑ２４８ ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０９
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ Ａ
Ｇ１／ｐＬＰＣ−Ｑ３１３ ＮＲＲＬ Ｂ−
１８６１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌
）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ３２９ Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８６１１ 【００３６】それ
らの培養物を入手し、常法によってプラスミドを単離し
、次いでそれを直接真核生物宿主細胞にトランスフェク
トすれば、チモーゲン型のヒトプロテインＣを産生させ
ることができる。アデノウイルスＥ１Ａ即時型（ｉｍｍ
ｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子産物を発現する宿主
細胞内にプラスミドを導入することは、そのベクター上
に見いだされるＢＫエンハンサーがＥ１Ａの存在下に発
現性を最も効率的に増大させるので、好ましい。当業者
ならば、多くの宿主細胞が大きなＤＮＡウイルスの即時
型遺伝子産物を発現し、またはそれを発現するように調
製できることは十分に理解されよう。好ましいセルライ
ンはヒト腎２９３セルライン（アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５７３の下に入手可能である）またはシリアンハム
スターセルラインＡＶ１２（ＡＴＣＣ９５９５）である
。ヒト胚腎セルライン２９３が最も好ましいのである。 【００３７】より高いレベルの発現を得るためには、種
々のチモーゲン型プロテインＣをコードしている遺伝子
をその寄託されているベクターから切り出し、ＧＢＭＴ
転写制御ユニットを含有するベクター中に連結すればよ
い。具体的には、そのＧＢＭＴユニットによって駆動さ
れる天然ヒトプロテインＣ遺伝子を含有するプラスミド
ｐＧＴ−ｈを受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２の下に
ＮＲＲＬから（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＡＧ１として）
入手すればよい。ＧＭ４８（ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５
）などの、Ｅ．ｃｏｌｉ のｄａｍ￣メチラーゼ菌株中
からプラスミドＤＮＡを単離した後に制限酵素ＢｃｌＩ
でそのプラスミドを消化することによって、プラスミド
バックボーンを開裂させる。得られた個々のプラスミド
からＢｃｌＩ消化によって新規チモーゲン遺伝子をそれ
ぞれ取り出すことができる。そのベクターバックボーン
を精製し、脱リン酸化し、次いで本発明の新規チモーゲ
ン遺伝子をＢｃｌＩ部位に連結する。次いで、発現され
るようにＧＢＭＴ転写ユニットの後方に配置している新
規チモーゲン遺伝子を含有するプラスミドを２９３細胞
中に導入し、培養し、得られた培養物から当業界周知の
方法によって新規チモーゲンを精製すればよい。ヒトプ
ロテインＣを細胞培養物から精製する１つの方法は、１
９９０年４月１１日公開のヤン（Ｙａｎ）の欧州特許公
開第０３６３１２６号に開示されている。 【００３８】本発明の化合物はさらに本発明の形成期タ
ンパク質の分泌の際に生成されるチモーゲン型をも包含
している。したがって、本発明の化合物には、ＤＮＡコ
ード化配列、この配列を発現させる発現ベクター、この
コード化配列から生成されるｍＲＮＡ転写物の翻訳の際
に生成される形成期タンパク質、この形成期タンパク質
の分泌の際に生成されるチモーゲン、およびそのチモー
ゲンの特定のものの活性化誘導体が包含される。 【００３９】本発明のＤＮＡ化合物は化学的に、または
制限フラグメントを結合させて、または当業界既知の方
法を組み合わせて合成することができる。ＤＮＡの合成
装置も入手可能であり、それを使用して本発明の化合物
を構築することができる。 【００４０】本発明の例示ベクターは、本発明のコード
化配列のアデノウイルス主要後期プロモーターによる転
写を刺激する位置にあるＢＫエンハンサーを含有してい
る。当業者は、大多数の真核生物プロモーター、エンハ
ンサー、および発現ベクターが当業界周知であり、それ
らが本発明の方法に使用できることを認識している。当
業者はさらに、真核生物発現ベクターはエンハンサー要
素が無くても機能できることを認識している。本発明の
重要な局面は、プロテインＣチモーゲンを発現させるた
めに使用する特定のエンハンサー、またはプロモーター
にあるのではなく、本発明の新規コード化配列およびそ
の配列から生成される対応タンパク質にある。 【００４１】しかし、プロモーター、エンハンサーおよ
び選択マーカーなどのベクター要素の選択性は、真核生
物宿主細胞によって産生されるタンパク質の最終レベル
に対して多大の影響を与える。１９８７年１１月１９日
公開の欧州特許公開第０２４５９４９号には、形成期ヒ
トプロテインＣを発現させる位置にある真核生物プロモ
ーターを刺激するためのＢＫエンハンサーを利用する、
天然チモーゲンプロテインＣのための多くの発現ベクタ
ーが開示されている。これらのベクターは、アデノウイ
ルスのＥ１Ａ遺伝子産物のような大きなＤＮＡウイルス
の即時型遺伝子産物をも発現させる真核生物細胞内に導
入した場合に特に高いレベルで発現させる。本明細書に
開示する例示ベクターｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ−
Ｑ２４８−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈ、およびｐＧＴ−
３２９−ｈから明らかなように、ＧＢＭＴ−Ｅ１Ａ遺伝
子産物の発現方法は本発明のベクターを用いて行う場合
に特に好ましい。 【００４２】本発明の用途は特定の真核生物宿主細胞に
限定されるものではない。種々の真核生物宿主細胞がア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）［ＭＤ２０８５２，ロックビル］などの寄託機関か
ら入手可能であり、本発明のベクターに使用するのに適
している。 具体的な宿主細胞の選択性の幅は、本発明のプロテイン
Ｃコード化ＤＮＡ化合物を発現させるのに使用される特
定の発現ベクターによってある程度左右される。しかし
、形成期ヒトプロテインＣおよび本発明の形成期ヒトプ
ロテインＣ誘導体は実質的に翻訳後修飾を受けるので、
宿主細胞の中には本発明のベクターに使用する上で比較
的好ましいものがある。欧州特許公開第０２４５９４９
号、およびグリンネル（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ）らのＢｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９（１９８７）に
は、ヒトプロテインＣのようなγ−カルボキシル化タン
パク質の組換え的生産に使用するには、アデノウイルス
により形質転換されたヒト胚腎セルラインが特に好まし
いことが開示されている。このようなアデノウイルス形
質転換ヒト胚腎セルラインの１つは、受託番号ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３の下にＡＴＣＣから入手され得る２
９３セルラインである。この２９３セルラインも本発明
のベクターと共に使用するのに好ましい。 【００４３】しかしながら、ヒトプロテインＣチモーゲ
ンなどのγ−カルボキシル化タンパク質をアデノウイル
ス−形質転換セルラインにおいて産生させる利点が、ア
デノウイルス形質転換ヒト胚腎細胞に限定されるもので
はない。事実、アデノウイルス形質転換細胞は一般にγ
−カルボキシル化ヒトプロテインＣ生産のための宿主と
して普通よりも優れたものである。このタイプの１つの
特に好ましいセルラインは、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ
９５９５の下にＡＴＣＣから入手され得るＡＶ１２−
６６４（以下「ＡＶ１２」と呼称する）セルラインであ
る。 ＡＶ１２セルラインは、シリアン（Ｓｙｒｉａｎ）ハム
スターの首筋にヒトアデノウイルス１２を注射し、得ら
れた腫瘍から細胞を単離することによって構築した。以
下に記載の実施例３は、例示ベクターｐＧＴ−Ｑ０９７
−ｈを使用して２９３およびＡＶ１２セルラインの両者
を形質転換する方法を説明するものである。 【００４４】本発明のベクターは種々の真核生物、特に
哺乳動物の宿主細胞を形質転換でき、そして発現させる
ことができる。安定な真核生物形質転換体を単離して同
定するための選択マーカーを保持していない本発明のベ
クターは、一時検定の目的ばかりでなく、同時形質転換
（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［１９８３年８
月２６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号に記載
されている操作］にとっても有用である。本発明のベク
ターはさらにＥ．ｃｏｌｉ での複製を可能にする配列
をも含有しており、それは他の宿主生物よりもＥ．ｃｏ
ｌｉ においてプラスミドＤＮＡを調製するうえで効率
的なのが通常である。 【００４５】本発明のベクターに含有されているヒトプ
ロテインＣのコード化配列は、その構造遺伝子に付随す
る特定のプロモーターが機能する宿主細胞内で発現され
る。本発明に使用するのに適している宿主細胞を以下の
表３に例示する。適当な脚注も記載している。 【００４６】 【表３】 宿主細胞 起源
供給元
脚注ＨｅｐＧ−２ ヒト肝臓肝
芽腫 ＊ＡＴＣＣ ＃ ＨＢ ８０６
５ 米国特許第４，３９３，
１３３号
にはこのセ
ルラインの使用が
記載されているＣＶ−１ アフリ
カミドリザル腎臓 ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ７０ＬＬ
Ｃ−ＭＫ２原体 アカゲザル腎臓
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ７ＬＬＣ−ＭＫ２誘導体
アカゲザル腎臓 ＡＴＣＣ ＃
ＣＣＬ ７．１ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７より
も速く増殖する３Ｔ３
マウス胚線維芽細胞 ＡＴＣＣ ＃ ＣＣ
Ｌ ９２ＣＨＯ−Ｋ１ チャイニーズ
ハムス ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ６１
プロリン要求性。 ター卵巣
この宿主からは、
ｄｈｆｒ−誘導化Ｄ
ＸＢ１１
などのＣＨＯ−Ｋ１の誘
導体を生成させる
ことができる。 ＨｅＬａ ヒト子宮頚上皮様
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ２ＲＰＭＩ８２２
６ ヒト骨髄腫
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ １５５ ＩｇＧλ−型
軽鎖分泌
性。 Ｈ４ＩＩＥＣ３ ラット肝癌
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １６００
この宿主からは、
８−アザグアニン耐
性のＦＡＺＡ宿主細胞
などの誘
導体を生
成させることがで
き
る。 Ｃ１２７Ｉ マウス線維芽細胞
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １６１６ＨＳ−Ｓ
ｕｌｔａｎ ヒト形質細胞腫
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １４８４ＢＨＫ−２１
幼若ハムスター腎臓 ＡＴ
ＣＣ ＃ ＣＣＬ １０
＊：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、メリーランド２０８５２−１７７６、ロック
ビル、パークローン・ドライブ１２３０１番 【００４７】上記表３に示しているように、多くの哺乳
動物宿主細胞は、本発明の形成期タンパク質のシグナル
ペプチドを認識し、適切にプロセッシングするための必
須細胞メカニズムを有しており、また血漿中に存在する
ヒトプロテインＣで観察されるような、グリコシル化、
γ−カルボキシル化およびβ−ヒドロキシル化などの翻
訳後修飾を行うことができる。しかし、既述したように
、ＨＰＣの最適の翻訳後プロセッシングはアデノウイル
ス−形質転換細胞にて起こる。以下に記載する広範なベ
クターが上記の真核生物宿主細胞の形質転換用に存在す
るが、例示しているベクターは本発明の範囲の限定を意
図するものではない。 【００４８】ｐＳＶ２型ベクターは、規定された真核生
物転写ユニット、すなわちプロモーター（ｅｐ）、介在
配列（ＩＶＳ）およびポリアデニル化（ｐＡ）部位を構
成するＳＶ４０ゲノムのセグメントを含有している。Ｓ
Ｖ４０のＴ−抗原が存在しない場合は、プラスミドｐＳ
Ｖ２型のベクターは哺乳動物および他の真核生物宿主細
胞をそれら宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みによって
形質転換する。種々のプラスミドｐＳＶ２型ベクター、
例えばＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子を転写させる
ものであるプラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ、ｐＳＶ２−ｎ
ｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＳＶ２−ｈｙｇ、および
ｐＳＶ２−β−グロビンが構築されている［コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプ
リング・ハーバー，ニューヨークによって発行されたグ
ルッツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編のＥｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（１９８２）を参照の
こと］。これらのベクターは、本発明のコード化配列に
使用するのに適しており、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）またはノーザン・リー
ジォナル・リサーチ・ラボラトリー（ＮＲＲＬ）のいず
れかから入手可能である。 【００４９】プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下
にあるネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺
伝子を含有している。適切な条件下では、ｄｈｆｒ遺伝
子は宿主の染色体において増幅し、または複製すること
が知られている。シムケ（Ｓｃｈｉｍｋｅ）のＣｅｌｌ
３７：７０３−７１３（１９８４）によって概説され
ているこの増幅法は、ｄｈｆｒ遺伝子に近接するＤＮＡ
配列、例えば本発明の形成期ヒトプロテインＣをコード
している配列などに適用することができ、したがって本
発明のプロテインＣチモーゲンの生産性を増大させるた
めに使用することができる。 【００５０】本発明の形成期プロテインＣおよびプロテ
インＣチモーゲンを哺乳動物および他の真核生物宿主細
胞内で発現させるために構築したプラスミドは、広範な
範囲のプロモーターを利用することができる。本発明は
、本明細書に例示している特定の真核生物プロモーター
の使用に限定されるものではない。ＳＶ４０後期プロモ
ーター、またはブッチャー（Ｂｕｃｈｅｒ）らのＮｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． １４（２４）：１００９（
１９８６）に開示されている真核生物プロモーター、ま
たは例えばエストロゲン−誘発性ニワトリオバルブミン
遺伝子、インターフェロン遺伝子、糖質コルチコイド誘
発性チロシン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミ
ジンキナーゼ遺伝子、および主要な初期および後期アデ
ノウイルス遺伝子などの真核生物遺伝子由来のプロモー
ターは容易に単離することができ、真核生物宿主細胞に
おいてヒトプロテインＣチモーゲンを産生するように設
計した組換えＤＮＡ発現ベクター上に使用できるよう修
飾することが可能である。真核生物プロモーターは直列
して（タンデムとして）、本発明のコード化配列を発現
させるために使用することができる。さらには、広範な
真核生物宿主細胞を感染する多くのレトロウイルスが知
られている。そのレトロウイルスＤＮＡ内の長い末端反
復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ
）はプロモーター活性をコードしていることが多く、し
たがってそれも本発明のコード化配列を発現させるため
に使用することができる。 【００５１】プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３
７１５２）は、ニワトリおよび他の宿主細胞を感染する
ことで知られている、ロウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（
Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）の長い末端反復
配列を含有している。このＲＳＶの長い末端反復配列は
、プラスミドｐＲＳＶｃａｔの〜０．７６ｋｂ Ｎｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント上に単離すること
ができる。ＲＳＶの長い末端反復配列［ゴールマン（Ｇ
ｏｒｍａｎ）らのＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７９：６７７７（１
９８２）］は、本発明のベクターに使用するのに適して
いる。プラスミドｐＭＳＶｉ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２
９）は、マウスおよび他の宿主細胞を感染することで知
られているネズミ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）の長い末端反
復配列を含有している。これらの反復配列は、本発明の
ベクターにおけるプロモーターとして使用するのに適し
ている。マウスメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモータ
ーも真核生物宿主細胞で使用できるものとして十分に特
性化されており、本発明のベクター内で使用するのに適
している。このＭＭＴプロモーターは、本発明の他のプ
ラスミドを構築するための出発物質として使用できる、
１５ｋｂ のプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（Ａ
ＴＣＣ ３７２２４）内に存在している。 【００５２】本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミド
には多くの修飾および改変が可能である。例えば、遺伝
子コードの同義性により、コードされているポリペプチ
ドのコード化配列は変化させないで、ポリペプチドコー
ド化領域の全域にわたってのヌクレオチド、および翻訳
終止シグナル内のヌクレオチドを置換することができる
。このような置換可能な配列は、ヒトプロテインＣの既
知のアミノ酸またはＤＮＡ配列から推定することができ
、そしてそれらは以下に記載の常法である合成法または
部位−特異的突然変異法によって構築することができる
。合成法は、イタクラらのＳｃｉｅｎｃｅ １９８：１
０５６（１９７７）およびクレア（Ｃｒｅａ）らのＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７
５：５７６５（１９７８）に実質的にしたがって実施す
ればよい。このように、本発明は、例示している特定の
ＤＮＡ配列およびプラスミドに限定されるものではない
。 【００５３】本発明のベクターを真核生物宿主細胞内に
導入した後では、選択可能な表現型に基づいて形質転換
体を選択することができる。この選択可能な表現型は、
発現ベクター上または宿主細胞内にその発現ベクターと
一緒に同時形質転換した他のベクター上に存在している
、いずれかの選択マーカーによって付与することができ
る。形質転換体を選択したなら、望ましくは、いずれの
形質転換体がその発現ベクターによってコードされてい
る所望のタンパク質を最も高いレベルで発現しているか
を同定する。このような同定法は、選択マーカーを含有
しているプラスミドのみを含有しており発現ベクターを
含有していない多くの形質転換体が生成される方法であ
る、同時形質転換法の場合には特に重要である。以下に
記載の実施例４では、所望のタンパク質を発現し、かつ
分泌する細胞を同定するためばかりでなく、分泌された
タンパク質の量をその方法によって他の細胞との比較に
おいて定量するためのプロトコールについて、説明して
いる。このプロトコールは所望のタンパク質を最も高い
レベルで分泌している生細胞を単離するのにも使用する
ことができる。 【００５４】チモーゲン型ヒトプロテインＣを活性化プ
ロテインＣ（ＡＰＣ）に活性化するための活性化方法は
従来技術であり、当業者には周知である。プロテインＣ
の活性化はトロンビン単独で、またはトロンビン／トロ
ンボモジュリン複合体によって、またはラッセルのヘビ
毒液（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ ｖｉｐｅｒ ｖｅｎｏｍ）
によって、または広範な他の手段によって行うことがで
きる。プロテインＣチモーゲンの活性は全アミド分解検
定または抗凝血検定のいずれかに基づいてトロンビン活
性化を追跡することによって測定することができる。ト
ロンビンの活性化およびプロテインＣ活性検定（アミド
分解および抗凝血性）をグリンネンらのＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ５：１１８７−１１９２（１９８７）の
教示通りに行った。ヒトプロテインＣ炭水化物突然変異
体の特定のアミド分解活性を以下の表４に示す。 【００５５】 【表４】 アミド分解活性
抗凝血活性ａ） 機能的活性の ＡＰ
Ｃ型 （Ｕ／ｍｇ）
（％） 相対的レベルｃ）
天然ＡＰＣ ３２±１０
１１９±２４ １ Ｑ０９７
８０±１０ １１８±１１
２．５ Ｑ２４８
ＮＤｂ） ＮＤ
ＮＤ Ｑ３１３
５２±８ ９８±８
１．４ Ｑ３２９ １１６±
１６ １２８±２１ ３
．９ ａ）ＡＰＴＴ検定によって測定した活性化プロテイ
ンＣの量をアミド分解検定によって測定した量で割り算
する。 ｂ）測定せず。 ｃ）天然ＡＰＣと比較した相対的アミド分解活性と相対
的抗凝血活性との積。 【００５６】表４の検定で使用しているチモーゲン分子
の定量はＥＬＩＳＡ検定によって行ったが、その検定に
は、野生型分子と同じ程度で上記突然変異体または誘導
体と反応することができないモノクローナル抗体であっ
て、その野生型分子によって惹起させたものを使用した
。したがって、タンパク質含量に基づいてさらに精製し
、定量することにより、以下の表５に示すデータを得た
。 【００５７】 【表５】
機能的活性（単位／ｍｇ）
アミド分解活性
抗凝血活性 ＨＰＣ型
（対−野生型ＨＰＣ） （対
−血漿野生型ＨＰＣ） 血漿−由来
ＮＤ
２５０（１） 野生型ＡＰＣ
３５ ± ５ （１）（ｎ＝７）
３２５ ± ６５ （１．３）（ｎ＝５）
Ｑ０９７ ３２ ± ４ （
０．９）（ｎ＝１０） ３０３ ±
３３ （１．２）（ｎ＝３） Ｑ２４８
６３ ± １２ （１．８）（ｎ＝８）
６６９ ± １７２ （２．７）（ｎ
＝３） Ｑ３１３ ５２ ±
７ （１．５）（ｎ＝９） ６２
７ ± ９９ （２．５）（ｎ＝３） Ｑ３２９
４７ ± ６ （１．４）（ｎ＝
９） ５１６ ± ２９ （２．１
）（ｎ＝３） 最初の括弧内の数字は、血漿由来のＨＰＣの活性に
対する倍率である。２番目の括弧は、二重試験または３
重試験で測定した独立した試料数（ｎ）を示している。 【００５８】上記表５に示した誘導体の増大した抗凝血
活性に加えて、突然変異Ｑ３１３は、増大されたトロン
ビンに対する親和性を示し、トロンビン単独による、ま
たはコファクターであるトロンボモジュリンとの複合体
としての活性化速度を約３倍増大せしめた。この速度の
増大は、より感受性の高い臨床用のチモーゲン型プロテ
インＣを作成するうえで有用であり、かつチモーゲン型
プロテインＣを開裂して活性化プロテインＣを作成する
ための産生方法を改良するうえでも有用である。チモー
ゲンＱ３１３の活性化の速度論的パラメーターを以下の
表６に示す。 【００５９】 【表６】 基質 Ｋｍ
ｋｃａｔ ｋｃａｔ／Ｋｍ
（μＭ）
（分−１） （分−１ｍＭ−
１） 野生型ＨＰＣ ６．１ ± ０．４５ ｎ＝３
４８０±１４ ７９Ｑ３１３
１．９ ± ０．５０ ｎ＝４
３８０±１４ ２００ 上記の結果は、３つの独立した測定値の平均である
。 それぞれの値は、非直線回帰分析で測定した。 【００６０】活性化プロテインＣは、静脈内血栓の広が
りを防止し、動脈血栓の形成を予防し、そしてグラム陰
性敗血症、内毒血症および散在性血管内凝血に由来する
死および器官損傷を予防するための抗−血栓特性を本質
的に有している。特に重要なことは、本発明の活性化プ
ロテインＣ誘導体の増大した機能的活性により、安全性
の幅が拡大されると共に、上記の臨床適応症に投与する
投与量を減少させることができることである。 【００６１】本発明の活性化組換えプロテインＣチモー
ゲンは、深部静脈血栓、肺動脈塞栓症、末梢動脈血栓、
心臓または末梢動脈に起因する塞栓症、急性心筋梗塞、
血栓性発作、および播種性（散在性）血管内凝血などの
、血管内凝血に関連した広範な範囲の後天性疾患を処置
および予防するのに有用である。これらプロテインＣ誘
導体はさらに、再発性深部静脈血栓を提示するヘテロ接
合性プロテインＣ欠乏症に罹患した顕著に多い患者を処
置する場合、および電撃性紫斑病を伴ったホモ接合性プ
ロテインＣ欠乏症患者の場合にも効率的に使用すること
ができる。活性化プロテインＣの治療上魅力的な適応例
は、低用量のヘパリンで処理するのが普通である深部静
脈血栓および肺動脈塞栓の予防である。 【００６２】同様に、本発明のプロテインＣ誘導体は、
血小板機能を抑制できる薬物、経口用抗凝血物質または
それらの併用療法など、現在使用されている処置法では
満足できるほどに処置または予防できていない、けい動
脈において最も顕著な、末梢動脈の血栓に由来する塞栓
の処置にも使用することができる。 【００６３】本発明の活性化誘導体は一旦活性化される
とプロ−フィブリン溶解性を有するので、急性の心筋梗
塞の処置に対しても有用である。これらの活性化誘導体
は急性期の心筋梗塞では組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと共に投与することができる。閉塞性の冠状動脈
血栓が溶解した後に、本発明の活性化誘導体をさらに数
日投与すれば、急性心筋梗塞の再発を予防することがで
きる。 【００６４】活性化プロテインＣは散在性血管内凝血の
処置に有用である。散在性血管内凝血症（ＤＩＣ）に罹
患した患者に対しては膨大な臨床試験としてヘパリンお
よび経口用抗凝血物質が投与されてきたが、その成績は
期待はずれであった。散在性血管内凝血症では、活性化
プロテインＣは、本発明のチモーゲンと同様に従来の抗
凝血物質よりも遥かに有用であった。 【００６５】従来の抗凝血薬、特にワーファリンは侵食
性悪性腫瘍の処置に有用である。多くの腫瘍細胞は、局
所のフィブリン沈着をもたらす凝血系の活性化を誘発さ
せる物質を産生する。これらのフィブリン沈着は、癌細
胞が分裂して転移性損傷を形成し得る「病巣」として機
能する。しかし、ワーファリンまたは他の従来から抗凝
血物質療法は血小板数を著しく下落させ、かつ血小板減
少症はワーファリン療法と相俟って重篤な出血合併症の
許容できない高い危険性を患者に招来するので、これら
を投与することはできない。従来の抗凝血物質よりも選
択的であり、かつヘパリンまたは経口用抗凝血物質のい
ずれよりも治療指数の高い本発明のプロテインＣ誘導体
は活性化プロテインＣと同様に、血小板減少症の患者に
比較的安全に投与することができ、したがって本発明の
活性化プロテインＣ誘導体を併用した効果的かつ集中的
な治療法を侵食癌の患者に施すことができる。 【００６６】本発明のチモーゲンおよびその活性化体は
周知の方法にしたがって製剤化でき、本発明のヒトプロ
テインＣチモーゲンまたは活性化プロテインＣを医薬的
に許容できる担体ビヒクルを含有する混合物と混合する
ことによって、医薬的に有用な組成物とすることができ
る。適当な担体ビヒクルおよび他のヒトタンパク質、例
えばヒト血清アルブミンを含有するその製剤は、例えば
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６版，１９８０［Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，オソル（Ｏｓｏｌ）ら編
］に記載されている。 このような組成物は、適量の担体ビヒクルと共に有効量
のプロテインＣチモーゲンまたはその活性化体を含有し
、宿主に効率的に投与するのに適している医薬的に許容
し得る組成物である。プロテインＣ組成物は非経口的に
、またはその有効な形態で血流に供給できる他の方法に
よって投与することができる。 【００６７】以下に実施例を記載し、方法、ならびに本
発明の代表的化合物、ベクターおよび形質転換体の構築
プロトコールについて説明するが、これらは本発明の範
囲を限定するものではない。 【００６８】 実施例１ プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７の単離 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ
−Ｑ０９７の凍結乾燥品をノーザン・リージォナル・リ
サーチ・ラボラトリー［イリノイ６１６０４，ペオリア
］から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０８の下に入手す
る。その凍結乾燥品を、ＬＢ培地［１リットル当たりバ
クト（Ｂａｃｔｏ）−トリプトン１０ｇ、バクト−酵母
エキス５ｇおよびＮａＣｌ １０ｇ；ｐＨを７．５に調
節］１０ｍｌ を入れた試験管中にデカントし、３２℃
で２時間インキュベートし、得られた培養物をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ に調整し、次いで３７℃で一晩イ
ンキュベートする。 【００６９】その一晩培養物を少量、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含有するＬＢ−寒天（１５ｇ／Ｌバクト
−寒天を含むＬＢ培地）平板上に入れ、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７の単一のコロニー
単離物が得られるようにする。得られた単一コロニーを
５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＬＢ培地１０
ｍｌ に接種し、激しく振盪させながら３７℃で一晩イ
ンキュベートした。その一晩培養物１０ｍｌ を５０μ
ｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＬＢ培地５００ｍｌ
中に接種し、激しく振盪させながらインキュベートし
てその培養物を定常期に至らしめた。 【００７０】以下の操作法は、マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９
８２）を改作したものである。 【００７１】４℃における４０００Ｇ、１０分の遠心に
よって細胞を採取し、上清を捨てた。得られた細胞ペレ
ットを氷冷ＳＴＥ緩衝液［０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８、および１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ］１００ｍｌ 中で洗浄した。洗浄後、細胞ペレッ
トを５ｍｇ／ｍｌ リゾチームを含有する溶液１［５０
ｍＭ グルコース、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８
．０、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ］１０ｍｌ 中に再懸
濁し、次いで室温に１０分間放置した。 次いで、溶液２［０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ
］２０ｍｌ をリゾチーム処理細胞に加え、得られた溶
液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を氷上で
１０分間インキュベートした。 【００７２】氷冷５Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ４．８）１
５ｍｌ を上記の細胞溶解−細胞混合物に加え、反転さ
せて溶液を混合した。その溶液を氷上で１０分間インキ
ュベートした。氷酢酸１１．５ｍｌ を水２８．５ｍｌ
および５Ｍ 酢酸カリウムに加え、５Ｍ 酢酸カリウ
ム溶液を調製した（得られた溶液は、カリウムについて
は３Ｍ、酢酸については５Ｍ である）。 【００７３】その細胞溶解混合物をベックマンＳＷ２７
（またはそれと同等の装置）によって４℃で２０，００
０ｒｐｍ、２０分間遠心した。得られた細胞ＤＮＡおよ
び残骸は管の底にペレットを形成した。上清約３６ｍｌ
を回収し、０．６容量のイソプロパノールを加え、混
合し、得られた溶液を室温で１５分間放置した。そのプ
ラスミドＤＮＡを１２，０００Ｇ、３０分（室温）の遠
心によって採取した。上清を捨て、ＤＮＡペレットを７
０％エタノールで洗浄した（室温）。エタノール洗液を
デカントし、得られたペレットを真空乾燥機中で乾燥さ
せた。次いで、そのペレットをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、および１ｍＭ ＥＤＴＡ
］８ｍｌ 中に再懸濁した。 【００７４】ＣｓＣｌ（８ｇ）をそのＤＮＡ溶液に加え
た。 臭化エチジウムの１０ｍｇ／ｍｌ 水溶液約０．８ｍｌ
を各ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液１０ｍｌ に加えた。この
溶液の最終密度は約１．５５ｇ／ｍｌ であり、臭化エ
チジウム濃度は約６００μｇ／ｍｌ であった。この溶
液をベックマン５０型遠心管に移し、パラフィン油で上
端まで満たし、栓をし、２０℃で２４時間４５，０００
ｒｐｍで遠心した。遠心後、ＤＮＡの２つのバンドが普
通光で観察された。その遠心管から栓をとり、次いで２
１番皮下注射針を遠心管の側面から挿入して低いほうの
ＤＮＡバンドを取り出した。 【００７５】水−飽和１−ブタノールで数回抽出するこ
とにより臭化エチジウムを除去した。ＴＥ緩衝液に対し
て透析し、ＣｓＣｌを除去した。緩衝化フェノールで、
次いでクロロホルムで抽出した後、沈殿させ、得られた
ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。プラス
ミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７約１ｍｇが入手され、それを濃
度約１μｇ／μｌ でＴＥ緩衝液中に４℃で保存した。 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７の制限部位および機能地
図を添付の図１に示す。同様にして、プラスミドｐＬＰ
Ｃ−Ｑ２４８、ｐＬＰＣ−Ｑ３１３、およびｐＬＰＣ−
Ｑ３２９も、ＮＲＲＬから入手可能なそれらの対応宿主
細胞から単離される。それらプラスミドの制限部位およ
び機能地図を添付の図面にそれぞれ示す。 【００７６】 実施例２ プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈの構築 プラスミド
ｐＬＰＣ−Ｑ０９７、ｐＬＰＣ−Ｑ２４８、ｐＬＰＣ−
Ｑ３１３およびｐＬＰＣ−Ｑ３２９は、ヒトプロテイン
Ｃチモーゲンを高レベルで産生させるためには、真核生
物宿主細胞（好ましくは２９３細胞）に直接導入すれば
よい。この突然変異チモーゲンをコードしている遺伝子
がＧＢＭＴ転写ユニットから駆動されるようなベクター
にその遺伝子を連結させれば、タンパク質の発現性およ
び分泌性を極めて高くすることができる。 【００７７】プラスミドｐＧＴＣは、野生型ヒトプロテ
インＣチモーゲン遺伝子がＧＢＭＴ転写ユニットによっ
て駆動されているベクターの１つである。野生型のプロ
テインＣ遺伝子は、そのベクターのＢｃｌＩ制限フラグ
メント上から容易に取り出すことができ、本発明の遺伝
子はいずれもそのベクターのＢｃｌＩ制限フラグメント
上に挿入することができる。プラスミドＤＮＡのＢｃｌ
Ｉによる消化は、配列５’−ＧＡＴＣ−３’のアデニン
位のメチル化によって阻害される。したがって、プラス
ミドｐＧＴＣは、ｄａｍ遺伝子によってコードされてい
るような、配列５’−ＧＡＴＣ−３’のアデニン残基を
メチル化する産物であるアデニンメチラーゼを欠いてい
る大腸菌宿主細胞から調製した。大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４
８（ＮＲＲＬＢ−１５７２５）は機能的ｄａｍメチラー
ゼを欠いており、したがってこれは、プラスミド誘導体
を構築する際の出発物質として使用できるプラスミドｐ
ＧＴＣのＤＮＡを調製する目的として適切な宿主である
。 【００７８】大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８細胞を培養し、形
質転換に対して感受性（コンピーテント）にし、実施例
１に記載の操作法に実質的に従ってプラスミドｐＧＴＣ
を使用して大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８細胞を形質転換した
。 得られた形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬ−寒
天上にプレートし、アンピシリン耐性の大腸菌Ｋ１２
ＧＭ４８／ｐＧＴＣ形質転換体がコロニーを形成したな
ら、実施例１の操作法に実質的に従って、その１つを使
用してプラスミドｐＧＴＣ ＤＮＡを調製した。プラス
ミドｐＧＴＣ ＤＮＡ約１ｍｇを入手し、ＴＥ緩衝液約
１ｍｌ 中に懸濁した。同様に、プラスミドｐＧＴ−ｈ
およびｐＧＴ−ｄからプラスミドＤＮＡを調製した。プ
ラスミドｐＧＴ−ｄは、ＢｃｌＩ部位に遺伝子を有さな
いでＧＢＭＴ転写ユニットを含有しており、したがって
あらゆる遺伝子を容易に挿入することができる。プラス
ミドｐＧＴ−ｄはさらにネズミｄｈｆｒ遺伝子を含有し
ているので、メトトレキサート耐性表現型を使用してあ
らゆる形質転換体を選択でき、または増幅することがで
きる。プラスミドｐＧＴ−ｈは、ＧＢＭＴ転写ユニット
、目的遺伝子を容易に挿入できるＢｃｌＩ部位およびハ
イグラマイシン耐性付与遺伝子を含有している。これら
プラスミドのいずれかを含有する大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１
株は１９９０年１月１８日にＮＲＲＬに寄託した。それ
ら菌株は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９１（大腸菌Ｋ
１２ ＡＧ１／ｐＧＴ−ｄについて）、ＮＲＲＬ Ｂ−
１８５９２（大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴ−ｈについ
て）、およびＮＲＲＬ Ｂ−１８５９３（大腸菌Ｋ１２
ＡＧ１／ｐＧＴＣについて）の下に入手できる。これ
らプラスミドの制限部位および機能地図を添付の図面に
示す。 【００７９】ＧＭ４８細胞から調製したプラスミドｐＬ
ＰＣ−Ｑ０９７ ＤＮＡ約１０μｌ を、１０×Ｂｃｌ
Ｉ制限緩衝液［１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
４、１．５Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、およ
び１０ｍＭ ＤＴＴ］２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
２０μｌ、制限酵素ＢｃｌＩ［ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＢＲＬ）により規定され
た〜５０単位。以下、本明細書で使用するすべての制限
酵素はここから入手した。］５μｌ、および水１４５μ
ｌ と混合し、得られた反応物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。本明細書に記載している制限酵素反応は
、フェノール次いでクロロホルム抽出するという常法に
よって停止させ、次いでＤＮＡを沈澱させてエタノール
洗浄し、そして得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液中に再懸濁
している。次に、得られた消化ＤＮＡを１％アガロース
調製用ゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｐｒｅｐ ｇｅｌ）の電
気泳動に付し、次いでバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ キットをその製造元の教示に従っ
て使用し、突然変異遺伝子を含有する約１４００塩基対
の制限フラグメントを精製する。 【００８０】次いで、実施例１の教示に実質的に従って
プラスミドｐＧＴ−ｈを大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴ
Ｃ（ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２）から単離し、実施例２
のようにしてＧＭ４８中で増殖させて単離した。次いで
、プラスミドｐＧＴ−ｈ ＤＮＡを上記のようにして制
限酵素ＢｃｌＩで消化した後、大きなベクターフラグメ
ントを単離し、精製した。このベクターフラグメントを
ＴＥ（ｐＨ８．０）を用いて９０μｌ 容量にし、次い
で子牛腸内アルカリホスファターゼ１０μｌ（０．０５
単位）を加え、そのベクターの末端を脱リン酸化した。 得られた混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、
次いで５００ｍＭ ＥＧＴＡ（１０μｌ）を加え、得ら
れた反応物を６５℃で４５分間インキュベートしてその
酵素を不活化した。次いで、その反応物をフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、洗浄し、水２
０μｌ 中に再懸濁した。 【００８１】次に、そのＢｃｌＩ消化ベクターのバック
ボーン約７μｌ（１０ｎｇ）をプラスミドｐＬＰＣ−Ｑ
０９７の約１４００塩基対ＢｃｌＩ制限フラグメント約
１μｌ（１００ｍｇ）、１０×リガーゼ緩衝液［０．５
Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴおよび５００μｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ］１μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ と
混合した。次いで、この連結反応物を１６℃で１２〜１
６時間インキュベートした。この連結反応により、ＧＢ
ＭＴ転写ユニットからの転写用に適して配向した突然変
異チモーゲン遺伝子を含有するプラスミド、またはその
遺伝子が反対の配向性で連結されたプラスミドが導かれ
得る。転写に対して適切な配向性の遺伝子を含有するプ
ラスミドをプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈと命名した
。 【００８２】凍結したコンピーテントな大腸菌Ｋ１２
ＡＧ１細胞をストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）
［カリフォルニア９２１２１，サンジェゴ，タンセイ・
ロード３７７０番］から入手した。連結反応物約５μｌ
をコンピーテント細胞１００μｌ と混合した後、得
られた細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベー
トし、４２℃で４５秒間熱−ショックを与え、次いで氷
上で約２分間冷蔵した。得られた細胞−ＤＮＡ混合物を
、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５９管中、ＳＯＣ培
地１．０ｍｌ に希釈し、３７℃で１時間インキュベー
トした。その１００μｌをアンピシリンを含有するＬＢ
寒天平板上にプレートし、コロニーが現れるまで３７℃
でインキュベートした。 【００８３】得られたコロニーを個々に培養し、それぞ
れのコロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によっ
て調査した。プラスミドＤＮＡの単離法は実施例１の操
作に実質的に従って行うが、それよりも小規模であり、
またＣｓＣｌ工程は、適切な大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐ
ＧＴ−Ｑ０９７−ｈ形質転換体が同定されるまで省いた
。同定された時点で、高度に精製されたプラスミドの調
製を大規模に行った。実施例１および２の教示に従えば
、あらゆる突然変異チモーゲン遺伝子を容易にあらゆる
ＧＢＭＴベクターにクローンすることができ、それによ
りプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ２４８
−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈおよびｐＧＴ−Ｑ３２９−
ｈを作成することができる。 【００８４】 実施例３ アデノウイルス−形質転換ヒト胚腎セルライン２９３お
よびアデ ノウイルス−形質転換シリアンハ
ムスター セルラインＡＶ１２ の形質転換
体のプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈを使用する構築法
ヒト胚腎セルライン２９３は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから、受託番号ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３の下で入手できる。また、アデノウイ
ルスで形質転換されたシリアンハムスター セルライン
ＡＶ１２も、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９５９５の下
で入手できる。以下に説明する形質転換操作法は宿主セ
ルラインとして２９３細胞について言及するものである
が、この操作法は、ＡＶ１２セルラインなどのほとんど
の真核生物セルラインに、および本発明の発現ベクター
に一般的に適用可能である。 【００８５】受託番号ＣＲＬ １５７３の下で２９３細
胞をＡＴＣＣから入手し、それを、１０％の熱−不活化
ウマ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必須培地
（Ｇｉｂｃｏ）中に全面単層の約５．５×１０６個の細
胞を含む２５ｍｍ２フラスコとした。このフラスコを３
７℃でインキュベートし、培地を週２回交換した。培地
は、１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイ
シンおよび１０μｇ／ｍｌ ＡｑｕａＭＥＰＨＹＴＯＮ
Ｒ フィトナジオン ビタミンＫ１［メルク・シャープ
・アンド・ドーム（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ａｎｄ
Ｄｏｈｍｅ， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．
，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ， ＰＡ１９４８６）］を追加
したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）であった。培地を除き、ハ
ンクのバランス塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅ
ｄ Ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）［Ｇｉｂｃｏ］で
すすぎ、０．２５％トリプシン（０．２ｇ／Ｌ ＥＤＴ
Ａを含む）を１〜２分間加え、新鮮な培地ですすぎ、ア
スピレーター処理を行い、そして継代培養比１：５また
は１：１０で新しいフラスコに分けることにより、細胞
を継代培養した。 【００８６】形質転換する前日に、細胞を１００ｍｍ皿
あたり０．７×１０６細胞の割合で接種した。ＴＥ緩衝
液に溶解し、滅菌したエタノール沈澱プラスミドＤＮＡ
を使用し、２５μｇ／ｍｌ の形質転換用プラスミドＤ
ＮＡおよび２５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２×ＤＮ
Ａ−ＣａＣｌ２溶液を調製した。２８０ｍＭ ＮａＣｌ
、５０ｍＭ ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）および１．５ｍＭ
リン酸ナトリウムを含有する、ｐＨを７．０５〜７．１
５に調節した２×ＨＢＳＳを調製した。前記２×ＤＮＡ
−ＣａＣｌ２溶液を等量の滅菌２× ＨＢＳＳに滴加し
た。２×ＨＢＳＳを入れた混合管に綿プラグ付きの１ｍ
ｌ の滅菌プラスチック製ピペットを挿入し、ＤＮＡを
加えながら、気泡を吹き込んだ。撹拌することなく室温
で３０〜４５分間、カルシウム−リン酸塩−ＤＮＡ 沈
澱物を形成させた。 【００８７】次に、プラスチック製ピペットで穏やかに
ピペッティングすることによりその沈澱物を混合し、受
容細胞を覆う増殖培地１０ｍｌに平板１個あたり１ｍｌ
の沈澱物を直接加えた。３７℃で４時間インキュベー
トした後、その培地を新鮮な培地と取り替え、選択圧を
かける前に細胞をさらに７２時間インキュベートした。 真核生物細胞内で機能する選択マーカーを含んでいない
プラスミドに対しては、プラスミドの混合物、即ち、選
択マーカーを欠いている本発明の発現ベクターおよび真
核生物細胞内で機能する選択マーカーを含んでいる発現
ベクターの混合物、を形質転換法に用いる。このような
同時形質転換系で使用できるベクターは多種あり、それ
にはプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１４９）、
ｐＳＶ２−ｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１４５）、およびｐ
ＳＶ２−ｈｙｇ（ＮＲＲＬ Ｂ−１８０３９）がある。 プラスミドｐＳＶ２−ｈｙｇは真核生物宿主細胞にハイ
グロマイシンＢ耐性を付与する。この同時形質転換法に
よれば、選択マーカーを持つプラスミドを含んでいる細
胞を選択することができる。これらの細胞をさらに試験
して形質転換用プラスミドの両方を含んでいる細胞を同
定する。当然ながら、本発明は、真核生物細胞用の選択
マーカーを含んでいるために、同時形質転換法を必要と
しない発現ベクターをも包含している。 【００８８】ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を
含んでいる、プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈなどのプ
ラスミドでトランスフェクトされた細胞に対しては、最
終濃度が約２００μｇ／ｍｌ となるようにハイグロマ
イシンＢをその増殖培地に加える。次いで、３〜４日毎
に培地を交換しながら、２〜４週間、３７℃で細胞をイ
ンキュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコ
ロニーを、その特徴を調べるため別々の培養フラスコに
移した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏはネオマイシン（
Ｇ４１８をネオマイシンの代わりに用いることもできる
）に対する耐性を付与し、Ｇ４１８を最終濃度３００μ
ｇ／ｍｌ で加えること以外は実質的にハイグロマイシ
ン耐性細胞の選択法に従って、Ｇ４１８耐性コロニーの
選択を行った。 【００８９】ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺
伝子あるいはメトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ
遺伝子の誘導体（ｄｈｆｒ−ｍｔｘ）を、ｄｈｆｒ−欠
損セルラインに遺伝子あるいはプラスミドを導入するた
めの選択マーカーとして用いること、ならびに、次にプ
ラスミドのコピー数を増幅するためにメトトレキサート
を用いることは、文献において十分に確立されている。 ２９３細胞はｄｈｆｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子
を含むプラスミドを含有している２９３形質転換体は、
ｄｈｆｒ陽性の表現型（ヒポキサンチンとチミジンを欠
く培地で増殖する能力）に基づいてのみでは選択されな
い。機能的なｄｈｆｒ遺伝子を欠き、ｄｈｆｒを含有す
るプラスミドで形質転換されたセルラインは、ｄｈｆｒ
＋の表現型に基づいて選択することができる。ｄｈｆｒ
を産生する細胞において選択および増幅マーカーとして
ｄｈｆｒを用いることは十分に研究されてはいないが、
文献中の証拠により、ｄｈｆｒ産生細胞中での遺伝子増
幅用に、および選択マーカーとしてｄｈｆｒを使用し得
ることが示唆されていると考えられる。本発明は、発現
ベクターに用いる選択マーカーによって限定されるもの
ではない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノシ
ン デアミナーゼ遺伝子、またはＰ−糖タンパク質遺伝
子で例示される多遺伝子耐性族の一員などの増幅マーカ
ーを用いることもできる。 【００９０】プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ
−Ｑ２４８−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈおよびｐＧＴ−
Ｑ３２９−ｈを使用して２９３セルラインを形質転換し
、多くの形質転換体を得た。これらの形質転換体を実施
例４に記載のようにして分析した。 【００９１】 実施例４ ヒトプロテインＣチモーゲン突然変異体を分泌する細胞
の選択 実施例３で得られたハイグロマイシン耐性の形質転
換体を１００ｍｍ２組織培養皿上において、組織培養皿
１個あたり数百の細胞クローンの密度で増殖させた。こ
の培地をデカントし、細胞をハンクのバランス塩溶液（
Ｇｉｂｃｏ）５ｍｌ ずつで２回すすいだ。滅菌した０
．４５％寒天［Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ４ アガロース
；カタログ番号Ａ３６４３；シグマ・ケミカル（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
１４５０８， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１７８）
］の溶液を、１．８％寒天（４７℃）１ｍｌ をダルベ
ッコの改変イーグル（ＤＭＥ）塩（Ｇｉｂｃｏ）（３７
℃）３ｍｌ と混合することによって調製し、この０．
４５％寒天溶液２ｍｌ を細胞上に重層した。 【００９２】ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｉｎｃ．，
Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ ０３４３１）を煮沸し、次いで２
時間オートクレーブ処理し、細胞にとって毒性である浸
潤性物質を除去した。次に、このフィルターを寒天層の
上に置き、気泡を除去した後、得られた平板を３７℃で
１〜３時間インキュベートした。次いで、後に行うコロ
ニーの同定を容易にするため、皿上のフィルターの最初
の方向がわかるように、あらかじめ印をつけておいたフ
ィルターを取り出し、ＰＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ＝７．２および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に入れ
た。 【００９３】フィルターの分析の間、皿上の細胞を生き
たままに保つため、１．８％寒天（４７℃）２ｍｌ、Ｄ
ＭＥ塩（３７℃）２ｍｌ、および２０％ウシ胎仔血清を
含むＤＭＥ塩（３７℃）４ｍｌからなる混合物８ｍｌ
を細胞上に重層した。次に、この細胞を３７℃のインキ
ュベーター内に入れた。 【００９４】フィルターで行う洗浄および反応はすべて
、フィルターを振動台（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏ
ｒｍ）の上に置いて行った。始めにこのフィルターを、
５％のミルクを含むＰＢＳ中、室温でインキュベートす
ることによってブロックした。次に、このフィルターを
ＰＢＳ中で４回すすいだ（１回のすすぎは５分間）。２
．５％ウシ血清アルブミン中の１０μｇ／ｍｌビオチン
化ヤギ抗−ヒトプロテインＣポリクローナル抗体を、フ
ィルターを覆うに十分な量でフィルターに加え、次いで
これを３７℃で１時間インキュベートした。 【００９５】プロテインＣに対する抗体を調製するため
に後に使用するプロテインＣの精製は、キシール（Ｋｉ
ｓｉｅｌ）の Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ６４：
７６１（１９７９）に記載のようにして行うことができ
る。ポリクローナル抗体は、キャバット（Ｅ．Ａ．Ｋａ
ｂａｔ）の ”ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＣｏｎｃｅｐｔｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｈｏｌｄ，Ｒｈｉｎｅｈａｒ
ｔ，およびＷｉｎｓｔｏｎ出版（１９６８）］に開示さ
れている方法によって調製することができる。また、本
検定で用いるのに適したモノクローナル抗体は、コーラ
ーおよびミルシュタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６
：４９５］の記載のようにして、または米国特許第４，
６９６，８９５号、ＥＰＯ 公開番号第２０５０４６号
；ラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）らの ＦＥＢＳ１９１（
１）：７５（１９８５）；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）らの
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９７：１２７−１３８（１９
８５）；およびＥＰＯ 公開番号第１３８２２２号に記
載されているようにして調製することができる。本検定
で用いるアビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴ
Ｍ キット［Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
， Ｉｎｃ．， ３０ Ｉｎｇｏｌｄ Ｒｏａｄ， Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ ９４０１０］から入手す
ることができる。また、ビオチンもＶｅｃｔｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得られる。 【００９６】フィルターを４℃のＰＢＳで４回すすいだ
。次に、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴＭ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）キット中の製造元の指示に従
って、アビジンＤおよびビオチン化西洋ワサビペルオキ
シダーゼを調製し、加えた。ＨＲＰとコンジュゲートし
たアビジンＤとともに４℃で１時間（タンパク質が少量
分泌されているときには、もっと長いインキュベート時
間、例えば一晩を用いることができる）、フィルターを
インキュベートし、次いで、このフィルターを４℃のＰ
ＢＳで４回すすいだ。 【００９７】フィルターの指示色を発色させるため、氷
冷の１００％メタノールに溶解したＨＲＰカラー発色剤
（４−クロロ−１−ナフトール；Ｓｉｇｍａ）（約３０
ｍｇ）をＰＢＳ（５０ｍｌ）および３０％Ｈ２Ｏ２（３
０μｌ）に加えた。 この混合物をニトロセルロースフィルターに加え、これ
を発色するまで室温でインキュベートした。本発明のヒ
トプロテインＣチモーゲンを最大量分泌しているコロニ
ーは、フィルターの最も早い発色によってだけでなく、
フィルター上の一段と暗いスポットによっても示される
。 【００９８】フィルターを発色させた後、もう一度この
フィルターを最初の平板と並べ、どのコロニーがフィル
ターのどのスポットと関係しているかを調べた。そして
、本発明のヒトプロテインＣチモーゲンを最大に分泌し
ているコロニーを選び、これを該チモーゲンの製造に使
用した。 【００９９】上記の検定が高分泌セルラインを同定する
ための単なる例示方法であるにすぎないことは当業者の
理解するところであろう。この方法において多種の検定
法を成功裏に用いることができる。例えば、ビオチン化
したヤギ抗プロテインＣ抗体を、ヤギ抗−プロテインＣ
抗体（ＩｇＧ）およびビオチン化した抗−ヤギＩｇＧ抗
体と置き換えた２重−抗体反応を用いることができる。 【０１００】チモーゲン突然変異体は細胞培養物から精
製することができる。その上清を組換え産物を産生する
細胞から除去し、ファルマシア［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］
のＦａｓｔｆｌｏｗ−Ｑカラムで精製した。樹脂約１ｍ
ｌ を２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１
５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび４ｍＭ ベン
ズアミジンで平衡化した。上記の培養上清をトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび４ｍＭ ベ
ンズアミジンの添加によってｐＨ７．４に調節した。上
清をカラム中の樹脂に入れ、３カラム容量のトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで、次いで３カラム容量の２０ｍＭ トリス（Ｈ
Ｃｌ）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ ベンズアミン
で洗浄した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２を２０ｍＭ トリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ベンズアミンに含有する溶出緩衝液を使用し、そのカ
ラムから組換え産物を溶出させた。 【００９９】その産物の比活性をグリンネル（Ｇｒｉｎ
ｎｅｌｌ）らのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１
８９−１１９２（１９８７）の操作法にしたがって以下
のようにして測定した。カラム溶出液を濃縮し、透析し
て得た産物を固定化トロンビン−トロンボモジュリン複
合体によってまず始めに活性化し、次いでその産物のア
ミド分解活性を、トリペプチド基質Ｓ−２３６６［ヘレ
ナ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ）から入手］の加水分解に
よって測定した。この産物の抗凝血活性は、ヘレナから
得た試薬を使用し、活性化された部分的トロンボプラス
チン時間の延長度によって測定した。
型ヒトプロテインＣをコードしている新規なＤＮＡ化合
物および組換えＤＮＡベクターに関する。この本発明チ
モーゲンは操作されて、そのグリコシル化のパターンが
天然のヒトプロテインＣチモーゲンと比較して大幅に改
変されている。炭水化物部分が高いレベルでシアル酸を
含有している場合には特に、グリコシル化はタンパク質
の分泌と機能性に重要な役割を果たし得る。本発明の新
規チモーゲンは、グリコシル化部位それぞれが個別に改
変しているよう構築されている。本発明の発現ベクター
は組換え宿主細胞において本発明のヒトプロテインＣチ
モーゲンを発現することのできる簡単かつ効率的な手段
を提供するものである。本発明は、アミド分解活性およ
び抗凝血活性が活性化されれば天然型よりも高くなるよ
うなチモーゲン型プロテインＣを生産するための方法に
関する。この新規チモーゲン型ヒトプロテインＣは、種
々のグリコシル化部位のアミノ酸配列が当業界周知のも
のと異なっている。本発明の新規チモーゲン型プロテイ
ンＣは凝血に関連した血液疾患を処置するうえで特に有
益である。 【０００２】ビタミンＫ依存性血漿タンパク質であるプ
ロテインＣは、ホメオスタシス（恒常性）の制御にとっ
て生理学的に極めて重要なものである。プロテインＣは
、本明細書においては形成期プロテインＣと呼んでいる
不活性な分子として合成される。形成期プロテインＣは
、以下でより詳細に説明するように、複雑なプロセッシ
ングを受けて多くの種々の不活性分子を生じさせる。分
泌された不活性なプロテインＣを本明細書ではチモーゲ
ンプロテインＣと呼ぶことにする。プロテインＣの活性
化は、トロンボモジュリン−トロンビン複合体が関与し
ている反応によって血液中で起こる。活性化プロテイン
Ｃは、そのコファクターであるプロテインＳと共に、重
要な生理学的意義を有する抗凝血物質である。活性化プ
ロテインＣは血管内の血栓形成を予防することができ、
また既に存在している血餅の広がりを抑制することがで
きる。活性型プロテインＣの作用機序、および不活性な
チモーゲンが活性プロテアーゼに活性化される機序は最
近になって明らかにされた［概説としては、ガーディナ
ー（Ｊ．Ｅ．Ｇａｒｄｉｎｅｒ）およびグリフィン（Ｊ
．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎ）のＰｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１３巻，２６５−２７８頁，エル
マー・ビー・ブラウン（Ｅｌｍｅｒ Ｂ．Ｂｒｏｗｎ）
編，Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｉｎｃ
．，１９８３、およびエスモン（Ｅｓｍｏｎ，Ｎ．Ｉ．
）のＰｒｏｇ．Ｈｅｍｏｓｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．９：２９
−５５（１９８９）を参照のこと］。 【０００３】プロテインＣの活性化には、トロンビン、
凝血カスケードにおける最終セリンプロテアーゼ、およ
びトロンボモジュリンと呼ばれる内皮細胞膜−関連糖タ
ンパク質が関係している。トロンボモジュリンは、トロ
ンビンと一緒になって堅くて化学量論的な複合体を形成
する。トロンボモジュリンは、トロンビンと複合体化す
ると、トロンビンの機能性を劇的に変化させる。トロン
ビンは通常、フィブリノーゲンを凝固させ（ｃｌｏｔ）
、血小板を活性化し、そして凝固コファクターである第
Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子をそれぞれの活性型であるＶａ
およびＶＩＩＩａに変換させる。そして最後にトロンビ
ンはプロテインＣを活性化するが、それは極めて遅く、
非効率的でしかなく、さらにその活性化は生理学的Ｃａ
２＋によって阻害される。これとは対照的に、トロンボ
モジュリンと複合体化したトロンビンはフィブリノーゲ
ンを凝固させず、血小板を活性化せず、または凝固コフ
ァクターである第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子をそれぞ
れ活性型の第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子に変換さ
せないが、生理学的Ｃａ２＋の存在下、プロテインＣチ
モーゲンの非常に効率的なアクチベーターになる。トロ
ンボモジュリン−トロンビンによるプロテインＣチモー
ゲンの活性化の速度定数は、トロンビン単独の速度定数
よりも１，０００倍も高い。 【０００４】活性化プロテインＣがどのようにして血液
凝固を低下調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）するの
かを理解するため、以下に凝血酵素系の簡単な説明を行
う。凝血系は、活性セリンプロテアーゼに至るチモーゲ
ンの一連の活性化に関連した連鎖反応と見なすのが最良
である。この連鎖反応は結果としてトロンビン酵素を産
生させるが、このトロンビン酵素は限定タンパク質分解
反応を介して血漿フィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィ
ブリンに変換する酵素である。この凝血カスケードにお
ける２つの重要な事象は、凝固因子ＩＸａによる凝固因
子ＸからＸａへの変換、および凝固因子Ｘａによるプロ
トロンビンからトロンビンへの変換である。これら両反
応は共に、細胞表面上、最も顕著には血小板表面上で起
こり、そして両反応ともコファクター（補助因子）を必
要とする。この系中において主要なコファクターである
第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子は、比較的不活性な前駆
体として循環しているが、トロンビン分子が最初に幾つ
か形成されれば、トロンビンはループバック（ｌｏｏｐ
ｂａｃｋ）し、限定タンパク質分解を介してそれらコ
ファクターを活性化する。活性化されたコファクターで
ある第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子はプロトロンビ
ンのトロンビンへの変換、および第Ｘ因子の第Ｘａ因子
への変換をそれぞれ約５ケタの大きさだけ促進させる。 活性化プロテインＣは、不活性な凝固因子である第Ｖお
よび第ＶＩＩＩ因子の活性型である凝固コファクター第
Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子に対して優先的に作用
し、それらをタンパク質分解的に崩壊し、加水分解しそ
して不可逆的に破壊する。これとは対照的に、凝固因子
第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子は、インビボにおいては、非
常に僅かしか反応しない活性化プロテインＣに対する基
質である。 【０００５】活性化プロテインＣについての重要なコフ
ァクターは、別のビタミンＫ依存性血漿タンパク質であ
るプロテインＳである。プロテインＳは、第Ｖａ因子お
よび第ＶＩＩＩａ因子の活性化プロテインＣ介在性加水
分解を２５倍実質的に増大させる。 【０００６】プロテインＣは、価値ある治療物質として
認識されている［例えば、１９８８年１０月４日発行の
バング（Ｂａｎｇ）らの米国特許第４，７７５，６２４
号を参照のこと］。活性化プロテインＣは、例えばヘパ
リンおよび経口用ヒドロキシクマリン型抗凝血物質など
の入手し得る抗凝血物質よりも広い治療指数を有する新
規な抗血栓物質である。凝固因子Ｖの第Ｖａ因子への変
換、および第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子への変換
にはトロンビンが必要とされ、これら２つのコファクタ
ーの活性型は活性化プロテインＣにとって優先的な基質
であるので、チモーゲンプロテインＣまたは活性化プロ
テインＣはいずれもトロンビンが生成されるまで機能し
ない。さらに、チモーゲンプロテインＣが活性化される
には、トロンビンが必要であるが、その理由はトロンボ
モジュリン−トロンビン複合体が無ければ、プロテイン
Ｃチモーゲンはその活性型に効率的に変換されないから
である。 【０００７】活性化プロテインＣは、コファクター第Ｖ
ａおよび第ＶＩＩＩａ因子を不活化することによって機
能するものであり、したがって需要性のある抗凝血物質
である。トロンビンは第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子をそれ
らの活性型である第Ｖａおよび第ＶＩＩＩａ因子に変換
するのに必要であるので、プロテインＣのみがトロンビ
ンが生成された後に抗凝血物質として機能する。このよ
うな活性化プロテインＣとは対照的に、従来の抗凝血物
質は患者に投与されている限りは循環している間一定の
抗凝血状態を保持するので、出血という合併症発現の危
険性がプロテインＣまたは活性化プロテインＣ以上に実
質的に増大される。したがって、活性化プロテインＣは
、ヘパリンおよびヒドロキシクマリン類に替わる薬物と
して広範に臨床応用され得る需要性ある抗凝血物質であ
る。 【０００８】遺伝的なプロテインＣ欠乏症など、ある種
の疾患症状では、プロテインＣチモーゲンの治療学的重
要性は極めて高くなる。先天的なホモ接合性（ｈｏｍｏ
ｚｙｇｏｕｓ）のプロテインＣ欠乏症では、罹患個体は
、しばしば致死的な散在性血管内凝血という病態である
電撃性紫斑病のために幼少年期に死亡してしまう。ヘテ
ロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）のプロテインＣ
欠乏症では、罹患個体は重篤な再発性血栓塞栓症に見舞
われる。Ｂ型血友病または第ＩＸ因子欠乏症を処置する
よう設計された、不純物としてプロテインＣを含有する
血漿タンパク質濃縮物は、ヘテロ接合性プロテインＣ欠
乏症における血管内凝血の予防および処置に有用である
ことが臨床的に十分確立されている。さらに、散在性血
管内凝血症などの血栓状態、ならびに重い外傷、重い手
術および癌などの、血栓症にかかり易くなった疾病状態
においては、プロテインＣレベルが異常に低いことも注
目されている。 【０００９】プロテインＣの活性化および本発明の理解
を助けるため、形成期ヒトプロテインＣのコード化配列
および対応するアミノ酸残基配列を以下に記載する。こ
のアミノ酸残基配列およびその相当する部分はさらに、
本発明の目的に沿って「天然ヒトプロテインＣ」の特性
をも表すものである。 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルであり、ＡＬ
Ａはアラニン、ＡＲＧはアルギニン、ＡＳＮはアスパラ
ギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯＯＨはカルボキ
シ末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮはグルタミン、Ｇ
ＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン、ＨＩＳはヒス
チジン、Ｈ２Ｎ−はアミノ末端、ＩＬＥはイソロイシン
、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン、ＭＥＴはメチオ
ニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、ＰＲＯはプロリン、
ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはスレオニン、ＴＲＰはトリプ
トファン、ＴＹＲはチロシン、およびＶＡＬはバリンで
ある］ 【００１０】上記のＤＮＡ配列は、ヒトプロテインＣを
コードしているヒト肝ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ
クローンから誘導された。当業者ならば、遺伝子コード
の同義性により、上記と同じアミノ酸残基配列をコード
する多くの異なるＤＮＡ配列を構築することができるこ
とは理解されよう。したがって、形成期ヒトプロテイン
Ｃの上記ｃＤＮＡ配列は、多くのあり得る形成期ヒトプ
ロテインＣのコード化配列のうちのただ１つに過ぎない
。 ｃＤＮＡクローンを構築するに当たっては、５’ポリＧ
配列、３’ポリＣ配列、および５’と３’とのＰｓｔＩ
制限酵素認識配列をプロテインＣコード化ｃＤＮＡの両
末端に作成した。これら２つのｃＤＮＡクローンを操作
して、形成期ヒトプロテインＣのコード化配列とさらに
そのコード化領域の５’および３’末端における非翻訳
ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ部分をも含有しているＤＮ
Ａ分子を構築した。このＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩ部位に挿入し、プラスミドｐＨＣ７を
構築した。 したがって、プラスミドｐＨＣ７は上記のコード化配列
を含有しており、さらに形成期ヒトプロテインＣコード
化配列の暗号鎖における５’および３’末端にそれぞれ
以下に記載の配列を付加的に含有している（ここでもそ
の分子の一方のストランド（鎖）のみを記載する）：【
化８】 【００１１】ＤＮＡ塩基対の相補性により、２本鎖ＤＮ
Ａ分子の一方の鎖の配列を描けば、反対の鎖の配列を決
定するのに十分である。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザ
ン・リージォナル・リサーチ・ラボラトリー（ＮＲＲＬ
）［ペオリア、イリノイ］に寄託されており、そのパー
マネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部
を構成している菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌） Ｋ１２
ＲＲ１／ｐＨＣ７から常法に従って単離することがで
きる。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＲ１／ｐＨＣ７の培養
物は、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６の下に入手可
能である。プラスミドｐＨＣ７の制限部位および機能地
図を添付の図２に示す。 【００１２】形成期プロテインＣは以下のように模式図
的に表すことができる： 【化９】 プレ−プロ−プロテインＣの分泌およびγ−カルボキシ
ル化の指令にとって重要である、シグナルペプチドおよ
びヒトプロテインＣのプロ−ペプチドをコードしている
形成期ヒトプロテインＣの１−４２のアミノ酸残基であ
る。 ＬＣ−翻訳後修飾を受けるとプロテインＣの２鎖チモー
ゲン（以下に記載するように、ＫＲジペプチドの除去に
より１鎖チモーゲンから形成される）および活性型の両
方の軽鎖（ＬＣ）を構成する形成期プロテインＣの４３
−１９７アミノ酸残基である。 【００１３】ＫＲ−形成期ヒトプロテインＣの１９８−
１９９アミノ酸残基である。これらの残基は、まず（１
９７−１９８または１９９−２００残基間のいずれかが
）開裂され、次いでカルボキシペプチダーゼまたはアミ
ノペプチダーゼ作用を受けるという２段階反応によって
おそらくは除去される（これはウシプロテインＣとの相
同性に基づいている）と考えられ、それにより２鎖プロ
テインＣが生成される。 ＡＰ−チモーゲン型プロテインＣから除去されて活性化
プロテインＣを生成させる、活性ペプチドを構成してい
る形成期プロテインＣの２００−２１１アミノ酸残基で
ある。 ＡＨＣ−翻訳後修飾を受けると活性プロテインＣの活性
化重鎖（ＡＨＣ）を構成する形成期プロテインＣの２１
２−４６１アミノ酸残基である。 ＨＣ−翻訳後修飾を受けると２鎖型プロテインＣチモー
ゲンの重鎖を構成するアミノ酸残基２００−４６１のＡ
ＰおよびＡＨＣである。 【００１４】ヒトプロテインＣチモーゲンは、肝臓で合
成され、血中に存在しているセリンプロテアーゼ前駆体
である。プロテインＣが完全な生物学的活性を発現する
ためには、ビタミンＫを要する翻訳後修飾が必要とされ
る。成熟した２鎖のジスルフィド連結したプロテインＣ
チモーゲンは１鎖のチモーゲンから限定タンパク質分解
によって生成される。この限定タンパク質分解は、１９
８および１９９アミノ酸残基の開裂および除去を包含し
ていると考えられる。この活性セリンプロテアーゼへの
２鎖チモーゲンの活性化はＡＲＧ−ＬＥＵペプチド結合
（２１１および２１２残基）のタンパク質分解的開裂を
包含する。この後者の開裂により、２鎖チモーゲン分子
の比較的大きい（重）鎖のアミノ末端を構成する活性ペ
プチド、ドデカペプチド（２００−２１１残基）が遊離
される。プロテインＣは有意にグリコシル化されている
。すなわち、血漿由来のその成熟酵素は１５−２３％の
炭水化物を含有していると言われる。プロテインＣはさ
らに、γ−カルボキシグルタミン酸およびβ−ヒドロキ
シアスパラギン酸（エリスロ−Ｌ−β−ヒドロキシアス
パルテート）などの、普通のアミノ酸でないものを多く
含有している。γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）
は、コファクター（補酵素）としてビタミンＫを必要と
する肝ミクロゾームのカルボキシラーゼによるグルタミ
ン酸残基のγ−グルタミルカルボキシル化によって産生
される。 【００１５】ヒトプロテインＣの活性化も模式図的に表
すことができるので、それを以下に記載する。当業者で
あれば、この模式図で示された工程の順序がインビボに
おける経路順を必ずしも反映していないことは理解され
よう。 【化１０】 【００１６】本発明は、新規なプロテインＣチモーゲン
の新規化合物、ベクター、形質転換体、およびそれを組
換え的に発現させる方法を提供するものである。本明細
書に記載している本発明の目的に沿って、以下のように
用語を定義する。 【００１７】Ａｄ２ＬＰ−２型アデノウイルスの主要な
後期プロモーター。 タンパク質またはペプチド中におけるアミノ酸残基は本
明細書においては以下の表１に記載する略語を使用して
いる： 【表１】 【００１８】ＡｐＲ−アンピシリン耐性表現型またはそ
れを付与する遺伝子。 ＢＫ−ＢＫウイルス由来のＤＮＡ。 Ｅｎｈまたはエンハンサー−ＢＫウイルスのエンハンサ
ー。 ｅｐまたはＳＶ４０ｅｐ−Ｔ−抗原遺伝子のＳＶ４０初
期プロモーター、Ｔ−抗原結合部位、ＳＶ４０エンハン
サー、およびＳＶ４０複製起点を含有するＤＮＡセグメ
ント。 γ−カルボキシル化−グルタミン酸のγ−炭素にカルボ
キシ基を付加する反応。 γ−カルボキシル化タンパク質−幾つかのグルタミン酸
残基がγ−カルボキシル化を受けているタンパク質。 ＧＢＭＴ転写ユニット−アデノウイルスの主要な後期プ
ロモーターの上流調節要素に近づいて配置しているＢＫ
ウイルスのＰ２エンハンサー（ＭＬＴＦ）、アデノウイ
ルス−２の主要な後期プロモーター、該プロモーターを
刺激する位置にあるポリ−ＧＴ要素、およびアデノウイ
ルスのスプライスされたトリパータイト（ｔｒｉｐａｒ
ｔｉｔｅ）リーダー配列を含むＤＮＡ配列を含有してい
る修飾された転写制御ユニット。このＧＢＭＴ転写ユニ
ットはプラスミドｐＧＴ−ｈの約９００塩基対のＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限フラグメント上に見いだされる。 【００１９】ＩＶＳ−イントロンをコードしているＤＮ
Ａであって、介在配列とも呼ばれる。 ＭＭＴｐｒｏ−マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子のプ
ロモーター。 形成期タンパク質−ｍＲＮＡ転写物の翻訳の際に生成さ
れるポリペプチドであって、翻訳後修飾を受ける前のも
の。しかし、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化お
よびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化などの翻訳後
修飾は、タンパク質がｍＲＮＡ転写物から完全に翻訳さ
れる前に起こり始めている場合がある。 ＮｅｏＲ−ネオマイシン耐性付与遺伝子であり、これは
抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するのにも使用す
ることができる。 【００２０】ｐＡ−ポリアデニル化シグナルをコードし
ているＤＮＡ配列。 プロモーター−ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配列
。 プロテインＣ活性−タンパク質分解的、アミド分解的、
エステル分解的および生物学的（抗凝血またはプロフィ
ブリン分解的）な活性に関与しているヒトプロテインＣ
の性質。タンパク質の抗凝血活性の試験方法は当業界周
知であり、グリンネル（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ）らのＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１１８９（１９８７）に記載
されている。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ以
上の付加的なＤＮＡセグメントを追加できるか、または
既に追加されているＤＮＡ分子を含有する物質であって
、例えば染色体に組込む因子、自律的に複製するプラス
ミド、およびファージがあるが、これらに限定されない
。 【００２１】組換えＤＮＡ発現ベクター−プロモーター
が組み込まれており、それが遺伝子産物を発現するよう
に配置されている組換えＤＮＡクローニングベクター。 組換えＤＮＡベクター−組換えＤＮＡクローニングまた
は発現ベクター。 レプリコン−プラスミドまたは他のベクターの自律的複
製を行わしめ、それを制御しているＤＮＡ配列。 制限フラグメント−１つまたはそれ以上の制限エンドヌ
クレアーゼ酵素の作用によって生成される線状ＤＮＡ配
列。 感受性宿主細胞−特定の抗生物質または他の毒性化合物
の存在下では、それらの耐性を付与するＤＮＡセグメン
トが無いために増殖することができない宿主細胞。 【００２２】ＴｃＲ−テトラサイクリン耐性表現型また
はそれを付与する遺伝子。 形質転換−受容宿主細胞の表現型を変化させるその受容
細胞へのＤＮＡの導入。 形質転換体−形質転換を受けた受容宿主細胞。 翻訳活性化配列−ｍＲＮＡ転写物をペプチドまたはポリ
ペプチドに翻訳させるＤＮＡ配列であって、５’−ＡＴ
Ｇ−３’などの翻訳開始コドンおよびリボソーム結合部
位をコードしているＤＮＡ配列を含有するもの。 チモーゲン（酵素前駆体）−タンパク質分解酵素の酵素
学的に不活性な前駆体。本明細書で使用しているプロテ
インＣチモーゲンとは、分泌された不活性型の１鎖また
は２鎖いずれかのプロテインＣを意味する。 【００２３】本明細書に添付の図面はすべて正確な縮尺
で描いていない。図１はプラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７
、図２はｐＬＰＣ−Ｑ２４８、図３はｐＬＰＣ−Ｑ３１
３、図４はｐＬＰＣ−Ｑ３２９、図５はｐＧＴＣ、図６
はｐＧＴ−ｄ、図７はｐＧＴ−ｈの制限部位および機能
地図をそれぞれ示している。 【００２４】本発明は新規なチモーゲン型ヒトプロテイ
ンＣの発現をコードしているＤＮＡ化合物を提供するも
のである。天然のヒトプロテインＣチモーゲンおよび天
然のヒトプロテインＣの生産方法はいくつか開示されて
いる［１９８８年１０月４日発行のバングらの米国特許
第４，７７５，６２４号および欧州特許公開第２１５５
４８号を参照のこと］。これらの従来の方法では、ヒト
の血中に存在するヒトプロテインＣのチモーゲン型とは
アミノ酸配列が相違していないヒトプロテインＣチモー
ゲン型を発現することができる。ヒト腎２９３セルライ
ンなどの特定の真核生物セルラインで発現させた場合、
ヒト血中に見いだされるチモーゲン型とは類似していな
い新規なグリコシル化パターンを有する天然ヒトプロテ
インＣチモーゲンが分泌される。 【００２５】本発明は、アミノ酸残基配列における部位
−特異的な変化によってグリコシル化パターンが改変さ
れたチモーゲン型ヒトプロテインＣを提供するものであ
る。これらチモーゲン型を活性化した場合、天然のヒト
プロテインＣと比較してアミド分解活性および抗凝血活
性が増大している。本発明はさらに、これら新規チモー
ゲン型プロテインＣのＤＮＡ化合物、組換えＤＮＡ発現
ベクター、形質転換されたセルライン、およびこれらを
組換え的に発現させる方法を提供するものである。本発
明のチモーゲン型ヒトプロテインＣを産生するための方
法は下記の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる方
法である： （Ａ）真核生物宿主細胞を形質転換するに当たり、（ｉ
）アミノ末端からカルボキシ末端にかけてアミノ酸配列
： 【化１１】 ［配列中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮま
たはＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮ
またはＧＬＮである］ を含有するアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ配
列、および （ｉｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるよう配置されている
プロモーターを含有する組換えＤＮＡベクターを使用し
、（Ｂ）工程Ａによって形質転換された該宿主細胞を該
ＤＮＡ配列が発現され得る条件下で培養し、そして（Ｃ
）得られた培養物から該プロテインＣチモーゲン型を回
収すること。この方法およびこの方法に有用な化合物に
ついては以下でより詳細に説明する。 【００２６】本発明はさらに、これら新規なチモーゲン
型ヒトプロテインＣを生産するための方法に有用である
ＤＮＡ化合物を提供するものである。これら新規な化合
物はすべて、分泌を促すシグナルペプチド、および（ビ
タミンＫ依存性カルボキシラーゼの作用により）γ−カ
ルボキシル化されたタンパク質由来のプロペプチドを含
有するプレ−プロペプチドをコードしている。このよう
なプロペプチド配列は当業界周知である。例えば、シュ
ッティー（Ｓｕｔｔｉｅ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６３４−６３７
（１９８７）を参照のこと。好ましくは、また簡便に構
築するには、シグナルペプチドコード化配列およびプロ
ペプチドコード化配列の両者をγ−カルボキシル化タン
パク質のプレ−プロペプチドのアミノ酸残基配列から誘
導する。このようなγ−カルボキシル化タンパク質とし
ては、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロ
ンビン、プロテインＳ、プロテインＺ、およびプロテイ
ンＣが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の
ベクターに使用するには、ヒトプロテインＣのプレ−プ
ロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が最も好ましい
。 【００２７】本発明のＤＮＡ化合物はさらに、プレ−プ
ロペプチドコード化配列の下流に隣接して位置し、かつ
それとの翻訳解読枠内にあるヒトプロテインＣの軽鎖を
コードするコード化配列を含有している。このヒトプロ
テインＣの軽鎖は、上記従来技術の項で説明した形成期
プロテインＣの４３から１９７個のアミノ酸残基をすべ
て含有している。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のア
ミノ末端部分、例えばプロテインＣの軽鎖のアミノ末端
部分はカルシウム結合部位を有している。第ＶＩＩ因子
、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびプロテ
インＳなどのこれら血漿タンパク質のカルシウム結合ド
メインは、ヒトプロテインＣの軽鎖のカルシウム結合ド
メインと同等の態様で使用することができる［欧州特許
公開第０２１５５４８Ａ１号の１２頁および１３頁を参
照のこと］。本発明の新規なチモーゲン型の１つ（Ｑ０
９７）は、軽鎖内の１３９位におけるアスパラギン残基
がグルタミン残基に変化していることから、そのグリコ
シル化部位が除去されている。 【００２８】本発明のＤＮＡ化合物はさらに、その軽鎖
コード化配列の下流に隣接して位置し、かつそれとの翻
訳解読枠内にあるジペプチド、ＬＹＳ−ＡＲＧ（ＫＲ）
をコードしているコード化配列をも含有している。ＬＹ
Ｓ−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドが形成期タンパク
質内における軽鎖のカルボキシ−末端側に配置されてい
る。ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドの発現タンパク質内にお
ける方向性は、本発明では問題でない。ＬＹＳ−ＬＹＳ
またはＡＲＧ−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドも本発
明では、ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドと同様に使用できる
。しかし、天然のヒトプロテインＣ内のジペプチドであ
るＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドが本発明にとっては好まし
い。 【００２９】ＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドのコドンの直ぐ
下流は、活性ペプチドのコード化配列である。当業者で
あれば、本発明のチモーゲン型は、以下に説明するよう
に天然のヒトプロテインＣチモーゲン型とは本来的に異
なっていることは理解されよう。 【００３０】軽鎖の１３９位における置換に加えて他の
アミノ酸の置換も、得られたチモーゲンのアミド分解活
性および抗凝血活性を増大させ得る。この「得られたチ
モーゲン」なる用語では、形成期ヒトプロテインＣ内に
おけるアミノ酸の位置を引用して置換を表しているが、
（アミノ酸残基１から４２の除去の結果として）第１に
分泌されてチモーゲン型になっていなければならない形
成期ヒトプロテインＣ、を示すために用いている。した
がって、（形成期ヒトプロテインＣ内の）１３９位のア
スパラギン残基をグルタミン残基と置換すると、本発明
の新規なチモーゲンが得られる。２９０、３５５または
３７１位のアスパラギン残基をグルタミン残基と置換さ
せても、本発明の新規なチモーゲン型が得られる。 【００３１】このように本発明の好ましい新規チモーゲ
ン型ヒトプロテインＣは、以下の（化１２）で示される
アミノ酸残基配列を有する形成期ヒトプロテインＣ分子
の分泌およびプロセッシングの結果として得られる：【
化１２】 ［配列中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮま
たはＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮ
またはＧＬＮである］。 【００３２】新規チモーゲンＱ０９７は、１３９位のア
スパラギン残基がグルタミン残基と置換している。チモ
ーゲンＱ２４８は、２９０位のアスパラギン残基がグル
タミン残基と置換している。チモーゲンＱ３１３は３５
５位のアスパラギン残基がグルタミン残基と置換してお
り、チモーゲンＱ３２９は３７１位のアスパラギン残基
がグルタミン残基と置換している。 【００３３】当業者ならば、遺伝子コードの同義性によ
り、種々のＤＮＡ化合物が上記のポリペプチドをコード
することができることを理解するであろう。したがって
、以下に記載する構築方法、および本発明の好ましいＤ
ＮＡ化合物、ベクターおよび形質転換法に対応する実施
例は単なる例示であって、本発明の範囲を限定するもの
ではない。さらに、ＡＳＮに代わってＧＬＮを置換する
ことは例示であり、本発明の範囲を限定するものではな
く、ＣＹＳまたはＰＲＯを除く他の置換を使用すること
もできるであろう。また、当業者ならば、本発明の種々
の単一アミノ酸置換を組み合わせれば、他の新規チモー
ゲンが作成されることは理解されよう。 【００３４】本発明のＤＮＡ化合物はすべて、ヒトプロ
テインＣ遺伝子の部位特異的突然変異によって調製した
。そして、突然変異チモーゲンをコードしている分子を
真核生物発現ベクター中にそのチモーゲン遺伝子がアデ
ノウイルス−２の主要な後期プロモーターによって発現
されるように挿入した。このベクターは、そのプロモー
ターからの発現を増強するよう配置されているＢＫウイ
ルスのＰ２エンハンサー要素をも含有している。その得
られたベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）Ｋ１２ ＡＧ１細胞に導入し、ノーザン・リー
ジォナル・リサーチ・ラボラトリー［イリノイ６１６０
４、ペオリア］に１９９０年１月９日に寄託してそのパ
ーマネント・ストック・カルチャー・コレクションを形
成させた。具体的な培養物および受託番号を以下の表２
に示す。 【００３５】 【表２】 培養物
受託番号 Ｅ．ｃ
ｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７
ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０８
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰ
Ｃ−Ｑ２４８ ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０９
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２ Ａ
Ｇ１／ｐＬＰＣ−Ｑ３１３ ＮＲＲＬ Ｂ−
１８６１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌
）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ３２９ Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８６１１ 【００３６】それ
らの培養物を入手し、常法によってプラスミドを単離し
、次いでそれを直接真核生物宿主細胞にトランスフェク
トすれば、チモーゲン型のヒトプロテインＣを産生させ
ることができる。アデノウイルスＥ１Ａ即時型（ｉｍｍ
ｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子産物を発現する宿主
細胞内にプラスミドを導入することは、そのベクター上
に見いだされるＢＫエンハンサーがＥ１Ａの存在下に発
現性を最も効率的に増大させるので、好ましい。当業者
ならば、多くの宿主細胞が大きなＤＮＡウイルスの即時
型遺伝子産物を発現し、またはそれを発現するように調
製できることは十分に理解されよう。好ましいセルライ
ンはヒト腎２９３セルライン（アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５７３の下に入手可能である）またはシリアンハム
スターセルラインＡＶ１２（ＡＴＣＣ９５９５）である
。ヒト胚腎セルライン２９３が最も好ましいのである。 【００３７】より高いレベルの発現を得るためには、種
々のチモーゲン型プロテインＣをコードしている遺伝子
をその寄託されているベクターから切り出し、ＧＢＭＴ
転写制御ユニットを含有するベクター中に連結すればよ
い。具体的には、そのＧＢＭＴユニットによって駆動さ
れる天然ヒトプロテインＣ遺伝子を含有するプラスミド
ｐＧＴ−ｈを受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２の下に
ＮＲＲＬから（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＡＧ１として）
入手すればよい。ＧＭ４８（ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５
）などの、Ｅ．ｃｏｌｉ のｄａｍ￣メチラーゼ菌株中
からプラスミドＤＮＡを単離した後に制限酵素ＢｃｌＩ
でそのプラスミドを消化することによって、プラスミド
バックボーンを開裂させる。得られた個々のプラスミド
からＢｃｌＩ消化によって新規チモーゲン遺伝子をそれ
ぞれ取り出すことができる。そのベクターバックボーン
を精製し、脱リン酸化し、次いで本発明の新規チモーゲ
ン遺伝子をＢｃｌＩ部位に連結する。次いで、発現され
るようにＧＢＭＴ転写ユニットの後方に配置している新
規チモーゲン遺伝子を含有するプラスミドを２９３細胞
中に導入し、培養し、得られた培養物から当業界周知の
方法によって新規チモーゲンを精製すればよい。ヒトプ
ロテインＣを細胞培養物から精製する１つの方法は、１
９９０年４月１１日公開のヤン（Ｙａｎ）の欧州特許公
開第０３６３１２６号に開示されている。 【００３８】本発明の化合物はさらに本発明の形成期タ
ンパク質の分泌の際に生成されるチモーゲン型をも包含
している。したがって、本発明の化合物には、ＤＮＡコ
ード化配列、この配列を発現させる発現ベクター、この
コード化配列から生成されるｍＲＮＡ転写物の翻訳の際
に生成される形成期タンパク質、この形成期タンパク質
の分泌の際に生成されるチモーゲン、およびそのチモー
ゲンの特定のものの活性化誘導体が包含される。 【００３９】本発明のＤＮＡ化合物は化学的に、または
制限フラグメントを結合させて、または当業界既知の方
法を組み合わせて合成することができる。ＤＮＡの合成
装置も入手可能であり、それを使用して本発明の化合物
を構築することができる。 【００４０】本発明の例示ベクターは、本発明のコード
化配列のアデノウイルス主要後期プロモーターによる転
写を刺激する位置にあるＢＫエンハンサーを含有してい
る。当業者は、大多数の真核生物プロモーター、エンハ
ンサー、および発現ベクターが当業界周知であり、それ
らが本発明の方法に使用できることを認識している。当
業者はさらに、真核生物発現ベクターはエンハンサー要
素が無くても機能できることを認識している。本発明の
重要な局面は、プロテインＣチモーゲンを発現させるた
めに使用する特定のエンハンサー、またはプロモーター
にあるのではなく、本発明の新規コード化配列およびそ
の配列から生成される対応タンパク質にある。 【００４１】しかし、プロモーター、エンハンサーおよ
び選択マーカーなどのベクター要素の選択性は、真核生
物宿主細胞によって産生されるタンパク質の最終レベル
に対して多大の影響を与える。１９８７年１１月１９日
公開の欧州特許公開第０２４５９４９号には、形成期ヒ
トプロテインＣを発現させる位置にある真核生物プロモ
ーターを刺激するためのＢＫエンハンサーを利用する、
天然チモーゲンプロテインＣのための多くの発現ベクタ
ーが開示されている。これらのベクターは、アデノウイ
ルスのＥ１Ａ遺伝子産物のような大きなＤＮＡウイルス
の即時型遺伝子産物をも発現させる真核生物細胞内に導
入した場合に特に高いレベルで発現させる。本明細書に
開示する例示ベクターｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ−
Ｑ２４８−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈ、およびｐＧＴ−
３２９−ｈから明らかなように、ＧＢＭＴ−Ｅ１Ａ遺伝
子産物の発現方法は本発明のベクターを用いて行う場合
に特に好ましい。 【００４２】本発明の用途は特定の真核生物宿主細胞に
限定されるものではない。種々の真核生物宿主細胞がア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）［ＭＤ２０８５２，ロックビル］などの寄託機関か
ら入手可能であり、本発明のベクターに使用するのに適
している。 具体的な宿主細胞の選択性の幅は、本発明のプロテイン
Ｃコード化ＤＮＡ化合物を発現させるのに使用される特
定の発現ベクターによってある程度左右される。しかし
、形成期ヒトプロテインＣおよび本発明の形成期ヒトプ
ロテインＣ誘導体は実質的に翻訳後修飾を受けるので、
宿主細胞の中には本発明のベクターに使用する上で比較
的好ましいものがある。欧州特許公開第０２４５９４９
号、およびグリンネル（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ）らのＢｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９（１９８７）に
は、ヒトプロテインＣのようなγ−カルボキシル化タン
パク質の組換え的生産に使用するには、アデノウイルス
により形質転換されたヒト胚腎セルラインが特に好まし
いことが開示されている。このようなアデノウイルス形
質転換ヒト胚腎セルラインの１つは、受託番号ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３の下にＡＴＣＣから入手され得る２
９３セルラインである。この２９３セルラインも本発明
のベクターと共に使用するのに好ましい。 【００４３】しかしながら、ヒトプロテインＣチモーゲ
ンなどのγ−カルボキシル化タンパク質をアデノウイル
ス−形質転換セルラインにおいて産生させる利点が、ア
デノウイルス形質転換ヒト胚腎細胞に限定されるもので
はない。事実、アデノウイルス形質転換細胞は一般にγ
−カルボキシル化ヒトプロテインＣ生産のための宿主と
して普通よりも優れたものである。このタイプの１つの
特に好ましいセルラインは、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ
９５９５の下にＡＴＣＣから入手され得るＡＶ１２−
６６４（以下「ＡＶ１２」と呼称する）セルラインであ
る。 ＡＶ１２セルラインは、シリアン（Ｓｙｒｉａｎ）ハム
スターの首筋にヒトアデノウイルス１２を注射し、得ら
れた腫瘍から細胞を単離することによって構築した。以
下に記載の実施例３は、例示ベクターｐＧＴ−Ｑ０９７
−ｈを使用して２９３およびＡＶ１２セルラインの両者
を形質転換する方法を説明するものである。 【００４４】本発明のベクターは種々の真核生物、特に
哺乳動物の宿主細胞を形質転換でき、そして発現させる
ことができる。安定な真核生物形質転換体を単離して同
定するための選択マーカーを保持していない本発明のベ
クターは、一時検定の目的ばかりでなく、同時形質転換
（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［１９８３年８
月２６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号に記載
されている操作］にとっても有用である。本発明のベク
ターはさらにＥ．ｃｏｌｉ での複製を可能にする配列
をも含有しており、それは他の宿主生物よりもＥ．ｃｏ
ｌｉ においてプラスミドＤＮＡを調製するうえで効率
的なのが通常である。 【００４５】本発明のベクターに含有されているヒトプ
ロテインＣのコード化配列は、その構造遺伝子に付随す
る特定のプロモーターが機能する宿主細胞内で発現され
る。本発明に使用するのに適している宿主細胞を以下の
表３に例示する。適当な脚注も記載している。 【００４６】 【表３】 宿主細胞 起源
供給元
脚注ＨｅｐＧ−２ ヒト肝臓肝
芽腫 ＊ＡＴＣＣ ＃ ＨＢ ８０６
５ 米国特許第４，３９３，
１３３号
にはこのセ
ルラインの使用が
記載されているＣＶ−１ アフリ
カミドリザル腎臓 ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ７０ＬＬ
Ｃ−ＭＫ２原体 アカゲザル腎臓
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ７ＬＬＣ−ＭＫ２誘導体
アカゲザル腎臓 ＡＴＣＣ ＃
ＣＣＬ ７．１ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７より
も速く増殖する３Ｔ３
マウス胚線維芽細胞 ＡＴＣＣ ＃ ＣＣ
Ｌ ９２ＣＨＯ−Ｋ１ チャイニーズ
ハムス ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ６１
プロリン要求性。 ター卵巣
この宿主からは、
ｄｈｆｒ−誘導化Ｄ
ＸＢ１１
などのＣＨＯ−Ｋ１の誘
導体を生成させる
ことができる。 ＨｅＬａ ヒト子宮頚上皮様
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ ２ＲＰＭＩ８２２
６ ヒト骨髄腫
ＡＴＣＣ ＃ ＣＣＬ １５５ ＩｇＧλ−型
軽鎖分泌
性。 Ｈ４ＩＩＥＣ３ ラット肝癌
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １６００
この宿主からは、
８−アザグアニン耐
性のＦＡＺＡ宿主細胞
などの誘
導体を生
成させることがで
き
る。 Ｃ１２７Ｉ マウス線維芽細胞
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １６１６ＨＳ−Ｓ
ｕｌｔａｎ ヒト形質細胞腫
ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ １４８４ＢＨＫ−２１
幼若ハムスター腎臓 ＡＴ
ＣＣ ＃ ＣＣＬ １０
＊：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、メリーランド２０８５２−１７７６、ロック
ビル、パークローン・ドライブ１２３０１番 【００４７】上記表３に示しているように、多くの哺乳
動物宿主細胞は、本発明の形成期タンパク質のシグナル
ペプチドを認識し、適切にプロセッシングするための必
須細胞メカニズムを有しており、また血漿中に存在する
ヒトプロテインＣで観察されるような、グリコシル化、
γ−カルボキシル化およびβ−ヒドロキシル化などの翻
訳後修飾を行うことができる。しかし、既述したように
、ＨＰＣの最適の翻訳後プロセッシングはアデノウイル
ス−形質転換細胞にて起こる。以下に記載する広範なベ
クターが上記の真核生物宿主細胞の形質転換用に存在す
るが、例示しているベクターは本発明の範囲の限定を意
図するものではない。 【００４８】ｐＳＶ２型ベクターは、規定された真核生
物転写ユニット、すなわちプロモーター（ｅｐ）、介在
配列（ＩＶＳ）およびポリアデニル化（ｐＡ）部位を構
成するＳＶ４０ゲノムのセグメントを含有している。Ｓ
Ｖ４０のＴ−抗原が存在しない場合は、プラスミドｐＳ
Ｖ２型のベクターは哺乳動物および他の真核生物宿主細
胞をそれら宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みによって
形質転換する。種々のプラスミドｐＳＶ２型ベクター、
例えばＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子を転写させる
ものであるプラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ、ｐＳＶ２−ｎ
ｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＳＶ２−ｈｙｇ、および
ｐＳＶ２−β−グロビンが構築されている［コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コールド・スプ
リング・ハーバー，ニューヨークによって発行されたグ
ルッツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編のＥｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（１９８２）を参照の
こと］。これらのベクターは、本発明のコード化配列に
使用するのに適しており、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）またはノーザン・リー
ジォナル・リサーチ・ラボラトリー（ＮＲＲＬ）のいず
れかから入手可能である。 【００４９】プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下
にあるネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺
伝子を含有している。適切な条件下では、ｄｈｆｒ遺伝
子は宿主の染色体において増幅し、または複製すること
が知られている。シムケ（Ｓｃｈｉｍｋｅ）のＣｅｌｌ
３７：７０３−７１３（１９８４）によって概説され
ているこの増幅法は、ｄｈｆｒ遺伝子に近接するＤＮＡ
配列、例えば本発明の形成期ヒトプロテインＣをコード
している配列などに適用することができ、したがって本
発明のプロテインＣチモーゲンの生産性を増大させるた
めに使用することができる。 【００５０】本発明の形成期プロテインＣおよびプロテ
インＣチモーゲンを哺乳動物および他の真核生物宿主細
胞内で発現させるために構築したプラスミドは、広範な
範囲のプロモーターを利用することができる。本発明は
、本明細書に例示している特定の真核生物プロモーター
の使用に限定されるものではない。ＳＶ４０後期プロモ
ーター、またはブッチャー（Ｂｕｃｈｅｒ）らのＮｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． １４（２４）：１００９（
１９８６）に開示されている真核生物プロモーター、ま
たは例えばエストロゲン−誘発性ニワトリオバルブミン
遺伝子、インターフェロン遺伝子、糖質コルチコイド誘
発性チロシン・アミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミ
ジンキナーゼ遺伝子、および主要な初期および後期アデ
ノウイルス遺伝子などの真核生物遺伝子由来のプロモー
ターは容易に単離することができ、真核生物宿主細胞に
おいてヒトプロテインＣチモーゲンを産生するように設
計した組換えＤＮＡ発現ベクター上に使用できるよう修
飾することが可能である。真核生物プロモーターは直列
して（タンデムとして）、本発明のコード化配列を発現
させるために使用することができる。さらには、広範な
真核生物宿主細胞を感染する多くのレトロウイルスが知
られている。そのレトロウイルスＤＮＡ内の長い末端反
復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ
）はプロモーター活性をコードしていることが多く、し
たがってそれも本発明のコード化配列を発現させるため
に使用することができる。 【００５１】プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３
７１５２）は、ニワトリおよび他の宿主細胞を感染する
ことで知られている、ロウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（
Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）の長い末端反復
配列を含有している。このＲＳＶの長い末端反復配列は
、プラスミドｐＲＳＶｃａｔの〜０．７６ｋｂ Ｎｄｅ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント上に単離すること
ができる。ＲＳＶの長い末端反復配列［ゴールマン（Ｇ
ｏｒｍａｎ）らのＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７９：６７７７（１
９８２）］は、本発明のベクターに使用するのに適して
いる。プラスミドｐＭＳＶｉ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２
９）は、マウスおよび他の宿主細胞を感染することで知
られているネズミ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）の長い末端反
復配列を含有している。これらの反復配列は、本発明の
ベクターにおけるプロモーターとして使用するのに適し
ている。マウスメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモータ
ーも真核生物宿主細胞で使用できるものとして十分に特
性化されており、本発明のベクター内で使用するのに適
している。このＭＭＴプロモーターは、本発明の他のプ
ラスミドを構築するための出発物質として使用できる、
１５ｋｂ のプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（Ａ
ＴＣＣ ３７２２４）内に存在している。 【００５２】本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミド
には多くの修飾および改変が可能である。例えば、遺伝
子コードの同義性により、コードされているポリペプチ
ドのコード化配列は変化させないで、ポリペプチドコー
ド化領域の全域にわたってのヌクレオチド、および翻訳
終止シグナル内のヌクレオチドを置換することができる
。このような置換可能な配列は、ヒトプロテインＣの既
知のアミノ酸またはＤＮＡ配列から推定することができ
、そしてそれらは以下に記載の常法である合成法または
部位−特異的突然変異法によって構築することができる
。合成法は、イタクラらのＳｃｉｅｎｃｅ １９８：１
０５６（１９７７）およびクレア（Ｃｒｅａ）らのＰｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７
５：５７６５（１９７８）に実質的にしたがって実施す
ればよい。このように、本発明は、例示している特定の
ＤＮＡ配列およびプラスミドに限定されるものではない
。 【００５３】本発明のベクターを真核生物宿主細胞内に
導入した後では、選択可能な表現型に基づいて形質転換
体を選択することができる。この選択可能な表現型は、
発現ベクター上または宿主細胞内にその発現ベクターと
一緒に同時形質転換した他のベクター上に存在している
、いずれかの選択マーカーによって付与することができ
る。形質転換体を選択したなら、望ましくは、いずれの
形質転換体がその発現ベクターによってコードされてい
る所望のタンパク質を最も高いレベルで発現しているか
を同定する。このような同定法は、選択マーカーを含有
しているプラスミドのみを含有しており発現ベクターを
含有していない多くの形質転換体が生成される方法であ
る、同時形質転換法の場合には特に重要である。以下に
記載の実施例４では、所望のタンパク質を発現し、かつ
分泌する細胞を同定するためばかりでなく、分泌された
タンパク質の量をその方法によって他の細胞との比較に
おいて定量するためのプロトコールについて、説明して
いる。このプロトコールは所望のタンパク質を最も高い
レベルで分泌している生細胞を単離するのにも使用する
ことができる。 【００５４】チモーゲン型ヒトプロテインＣを活性化プ
ロテインＣ（ＡＰＣ）に活性化するための活性化方法は
従来技術であり、当業者には周知である。プロテインＣ
の活性化はトロンビン単独で、またはトロンビン／トロ
ンボモジュリン複合体によって、またはラッセルのヘビ
毒液（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ ｖｉｐｅｒ ｖｅｎｏｍ）
によって、または広範な他の手段によって行うことがで
きる。プロテインＣチモーゲンの活性は全アミド分解検
定または抗凝血検定のいずれかに基づいてトロンビン活
性化を追跡することによって測定することができる。ト
ロンビンの活性化およびプロテインＣ活性検定（アミド
分解および抗凝血性）をグリンネンらのＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ５：１１８７−１１９２（１９８７）の
教示通りに行った。ヒトプロテインＣ炭水化物突然変異
体の特定のアミド分解活性を以下の表４に示す。 【００５５】 【表４】 アミド分解活性
抗凝血活性ａ） 機能的活性の ＡＰ
Ｃ型 （Ｕ／ｍｇ）
（％） 相対的レベルｃ）
天然ＡＰＣ ３２±１０
１１９±２４ １ Ｑ０９７
８０±１０ １１８±１１
２．５ Ｑ２４８
ＮＤｂ） ＮＤ
ＮＤ Ｑ３１３
５２±８ ９８±８
１．４ Ｑ３２９ １１６±
１６ １２８±２１ ３
．９ ａ）ＡＰＴＴ検定によって測定した活性化プロテイ
ンＣの量をアミド分解検定によって測定した量で割り算
する。 ｂ）測定せず。 ｃ）天然ＡＰＣと比較した相対的アミド分解活性と相対
的抗凝血活性との積。 【００５６】表４の検定で使用しているチモーゲン分子
の定量はＥＬＩＳＡ検定によって行ったが、その検定に
は、野生型分子と同じ程度で上記突然変異体または誘導
体と反応することができないモノクローナル抗体であっ
て、その野生型分子によって惹起させたものを使用した
。したがって、タンパク質含量に基づいてさらに精製し
、定量することにより、以下の表５に示すデータを得た
。 【００５７】 【表５】
機能的活性（単位／ｍｇ）
アミド分解活性
抗凝血活性 ＨＰＣ型
（対−野生型ＨＰＣ） （対
−血漿野生型ＨＰＣ） 血漿−由来
ＮＤ
２５０（１） 野生型ＡＰＣ
３５ ± ５ （１）（ｎ＝７）
３２５ ± ６５ （１．３）（ｎ＝５）
Ｑ０９７ ３２ ± ４ （
０．９）（ｎ＝１０） ３０３ ±
３３ （１．２）（ｎ＝３） Ｑ２４８
６３ ± １２ （１．８）（ｎ＝８）
６６９ ± １７２ （２．７）（ｎ
＝３） Ｑ３１３ ５２ ±
７ （１．５）（ｎ＝９） ６２
７ ± ９９ （２．５）（ｎ＝３） Ｑ３２９
４７ ± ６ （１．４）（ｎ＝
９） ５１６ ± ２９ （２．１
）（ｎ＝３） 最初の括弧内の数字は、血漿由来のＨＰＣの活性に
対する倍率である。２番目の括弧は、二重試験または３
重試験で測定した独立した試料数（ｎ）を示している。 【００５８】上記表５に示した誘導体の増大した抗凝血
活性に加えて、突然変異Ｑ３１３は、増大されたトロン
ビンに対する親和性を示し、トロンビン単独による、ま
たはコファクターであるトロンボモジュリンとの複合体
としての活性化速度を約３倍増大せしめた。この速度の
増大は、より感受性の高い臨床用のチモーゲン型プロテ
インＣを作成するうえで有用であり、かつチモーゲン型
プロテインＣを開裂して活性化プロテインＣを作成する
ための産生方法を改良するうえでも有用である。チモー
ゲンＱ３１３の活性化の速度論的パラメーターを以下の
表６に示す。 【００５９】 【表６】 基質 Ｋｍ
ｋｃａｔ ｋｃａｔ／Ｋｍ
（μＭ）
（分−１） （分−１ｍＭ−
１） 野生型ＨＰＣ ６．１ ± ０．４５ ｎ＝３
４８０±１４ ７９Ｑ３１３
１．９ ± ０．５０ ｎ＝４
３８０±１４ ２００ 上記の結果は、３つの独立した測定値の平均である
。 それぞれの値は、非直線回帰分析で測定した。 【００６０】活性化プロテインＣは、静脈内血栓の広が
りを防止し、動脈血栓の形成を予防し、そしてグラム陰
性敗血症、内毒血症および散在性血管内凝血に由来する
死および器官損傷を予防するための抗−血栓特性を本質
的に有している。特に重要なことは、本発明の活性化プ
ロテインＣ誘導体の増大した機能的活性により、安全性
の幅が拡大されると共に、上記の臨床適応症に投与する
投与量を減少させることができることである。 【００６１】本発明の活性化組換えプロテインＣチモー
ゲンは、深部静脈血栓、肺動脈塞栓症、末梢動脈血栓、
心臓または末梢動脈に起因する塞栓症、急性心筋梗塞、
血栓性発作、および播種性（散在性）血管内凝血などの
、血管内凝血に関連した広範な範囲の後天性疾患を処置
および予防するのに有用である。これらプロテインＣ誘
導体はさらに、再発性深部静脈血栓を提示するヘテロ接
合性プロテインＣ欠乏症に罹患した顕著に多い患者を処
置する場合、および電撃性紫斑病を伴ったホモ接合性プ
ロテインＣ欠乏症患者の場合にも効率的に使用すること
ができる。活性化プロテインＣの治療上魅力的な適応例
は、低用量のヘパリンで処理するのが普通である深部静
脈血栓および肺動脈塞栓の予防である。 【００６２】同様に、本発明のプロテインＣ誘導体は、
血小板機能を抑制できる薬物、経口用抗凝血物質または
それらの併用療法など、現在使用されている処置法では
満足できるほどに処置または予防できていない、けい動
脈において最も顕著な、末梢動脈の血栓に由来する塞栓
の処置にも使用することができる。 【００６３】本発明の活性化誘導体は一旦活性化される
とプロ−フィブリン溶解性を有するので、急性の心筋梗
塞の処置に対しても有用である。これらの活性化誘導体
は急性期の心筋梗塞では組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと共に投与することができる。閉塞性の冠状動脈
血栓が溶解した後に、本発明の活性化誘導体をさらに数
日投与すれば、急性心筋梗塞の再発を予防することがで
きる。 【００６４】活性化プロテインＣは散在性血管内凝血の
処置に有用である。散在性血管内凝血症（ＤＩＣ）に罹
患した患者に対しては膨大な臨床試験としてヘパリンお
よび経口用抗凝血物質が投与されてきたが、その成績は
期待はずれであった。散在性血管内凝血症では、活性化
プロテインＣは、本発明のチモーゲンと同様に従来の抗
凝血物質よりも遥かに有用であった。 【００６５】従来の抗凝血薬、特にワーファリンは侵食
性悪性腫瘍の処置に有用である。多くの腫瘍細胞は、局
所のフィブリン沈着をもたらす凝血系の活性化を誘発さ
せる物質を産生する。これらのフィブリン沈着は、癌細
胞が分裂して転移性損傷を形成し得る「病巣」として機
能する。しかし、ワーファリンまたは他の従来から抗凝
血物質療法は血小板数を著しく下落させ、かつ血小板減
少症はワーファリン療法と相俟って重篤な出血合併症の
許容できない高い危険性を患者に招来するので、これら
を投与することはできない。従来の抗凝血物質よりも選
択的であり、かつヘパリンまたは経口用抗凝血物質のい
ずれよりも治療指数の高い本発明のプロテインＣ誘導体
は活性化プロテインＣと同様に、血小板減少症の患者に
比較的安全に投与することができ、したがって本発明の
活性化プロテインＣ誘導体を併用した効果的かつ集中的
な治療法を侵食癌の患者に施すことができる。 【００６６】本発明のチモーゲンおよびその活性化体は
周知の方法にしたがって製剤化でき、本発明のヒトプロ
テインＣチモーゲンまたは活性化プロテインＣを医薬的
に許容できる担体ビヒクルを含有する混合物と混合する
ことによって、医薬的に有用な組成物とすることができ
る。適当な担体ビヒクルおよび他のヒトタンパク質、例
えばヒト血清アルブミンを含有するその製剤は、例えば
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６版，１９８０［Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，オソル（Ｏｓｏｌ）ら編
］に記載されている。 このような組成物は、適量の担体ビヒクルと共に有効量
のプロテインＣチモーゲンまたはその活性化体を含有し
、宿主に効率的に投与するのに適している医薬的に許容
し得る組成物である。プロテインＣ組成物は非経口的に
、またはその有効な形態で血流に供給できる他の方法に
よって投与することができる。 【００６７】以下に実施例を記載し、方法、ならびに本
発明の代表的化合物、ベクターおよび形質転換体の構築
プロトコールについて説明するが、これらは本発明の範
囲を限定するものではない。 【００６８】 実施例１ プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７の単離 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ
−Ｑ０９７の凍結乾燥品をノーザン・リージォナル・リ
サーチ・ラボラトリー［イリノイ６１６０４，ペオリア
］から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８６０８の下に入手す
る。その凍結乾燥品を、ＬＢ培地［１リットル当たりバ
クト（Ｂａｃｔｏ）−トリプトン１０ｇ、バクト−酵母
エキス５ｇおよびＮａＣｌ １０ｇ；ｐＨを７．５に調
節］１０ｍｌ を入れた試験管中にデカントし、３２℃
で２時間インキュベートし、得られた培養物をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ に調整し、次いで３７℃で一晩イ
ンキュベートする。 【００６９】その一晩培養物を少量、５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含有するＬＢ−寒天（１５ｇ／Ｌバクト
−寒天を含むＬＢ培地）平板上に入れ、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７の単一のコロニー
単離物が得られるようにする。得られた単一コロニーを
５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＬＢ培地１０
ｍｌ に接種し、激しく振盪させながら３７℃で一晩イ
ンキュベートした。その一晩培養物１０ｍｌ を５０μ
ｇ／ｍｌ アンピシリンを含有するＬＢ培地５００ｍｌ
中に接種し、激しく振盪させながらインキュベートし
てその培養物を定常期に至らしめた。 【００７０】以下の操作法は、マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）（１９
８２）を改作したものである。 【００７１】４℃における４０００Ｇ、１０分の遠心に
よって細胞を採取し、上清を捨てた。得られた細胞ペレ
ットを氷冷ＳＴＥ緩衝液［０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８、および１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ］１００ｍｌ 中で洗浄した。洗浄後、細胞ペレッ
トを５ｍｇ／ｍｌ リゾチームを含有する溶液１［５０
ｍＭ グルコース、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８
．０、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ］１０ｍｌ 中に再懸
濁し、次いで室温に１０分間放置した。 次いで、溶液２［０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ
］２０ｍｌ をリゾチーム処理細胞に加え、得られた溶
液を反転させて穏やかに混合した。この混合物を氷上で
１０分間インキュベートした。 【００７２】氷冷５Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ４．８）１
５ｍｌ を上記の細胞溶解−細胞混合物に加え、反転さ
せて溶液を混合した。その溶液を氷上で１０分間インキ
ュベートした。氷酢酸１１．５ｍｌ を水２８．５ｍｌ
および５Ｍ 酢酸カリウムに加え、５Ｍ 酢酸カリウ
ム溶液を調製した（得られた溶液は、カリウムについて
は３Ｍ、酢酸については５Ｍ である）。 【００７３】その細胞溶解混合物をベックマンＳＷ２７
（またはそれと同等の装置）によって４℃で２０，００
０ｒｐｍ、２０分間遠心した。得られた細胞ＤＮＡおよ
び残骸は管の底にペレットを形成した。上清約３６ｍｌ
を回収し、０．６容量のイソプロパノールを加え、混
合し、得られた溶液を室温で１５分間放置した。そのプ
ラスミドＤＮＡを１２，０００Ｇ、３０分（室温）の遠
心によって採取した。上清を捨て、ＤＮＡペレットを７
０％エタノールで洗浄した（室温）。エタノール洗液を
デカントし、得られたペレットを真空乾燥機中で乾燥さ
せた。次いで、そのペレットをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、および１ｍＭ ＥＤＴＡ
］８ｍｌ 中に再懸濁した。 【００７４】ＣｓＣｌ（８ｇ）をそのＤＮＡ溶液に加え
た。 臭化エチジウムの１０ｍｇ／ｍｌ 水溶液約０．８ｍｌ
を各ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液１０ｍｌ に加えた。この
溶液の最終密度は約１．５５ｇ／ｍｌ であり、臭化エ
チジウム濃度は約６００μｇ／ｍｌ であった。この溶
液をベックマン５０型遠心管に移し、パラフィン油で上
端まで満たし、栓をし、２０℃で２４時間４５，０００
ｒｐｍで遠心した。遠心後、ＤＮＡの２つのバンドが普
通光で観察された。その遠心管から栓をとり、次いで２
１番皮下注射針を遠心管の側面から挿入して低いほうの
ＤＮＡバンドを取り出した。 【００７５】水−飽和１−ブタノールで数回抽出するこ
とにより臭化エチジウムを除去した。ＴＥ緩衝液に対し
て透析し、ＣｓＣｌを除去した。緩衝化フェノールで、
次いでクロロホルムで抽出した後、沈殿させ、得られた
ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。プラス
ミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７約１ｍｇが入手され、それを濃
度約１μｇ／μｌ でＴＥ緩衝液中に４℃で保存した。 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７の制限部位および機能地
図を添付の図１に示す。同様にして、プラスミドｐＬＰ
Ｃ−Ｑ２４８、ｐＬＰＣ−Ｑ３１３、およびｐＬＰＣ−
Ｑ３２９も、ＮＲＲＬから入手可能なそれらの対応宿主
細胞から単離される。それらプラスミドの制限部位およ
び機能地図を添付の図面にそれぞれ示す。 【００７６】 実施例２ プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈの構築 プラスミド
ｐＬＰＣ−Ｑ０９７、ｐＬＰＣ−Ｑ２４８、ｐＬＰＣ−
Ｑ３１３およびｐＬＰＣ−Ｑ３２９は、ヒトプロテイン
Ｃチモーゲンを高レベルで産生させるためには、真核生
物宿主細胞（好ましくは２９３細胞）に直接導入すれば
よい。この突然変異チモーゲンをコードしている遺伝子
がＧＢＭＴ転写ユニットから駆動されるようなベクター
にその遺伝子を連結させれば、タンパク質の発現性およ
び分泌性を極めて高くすることができる。 【００７７】プラスミドｐＧＴＣは、野生型ヒトプロテ
インＣチモーゲン遺伝子がＧＢＭＴ転写ユニットによっ
て駆動されているベクターの１つである。野生型のプロ
テインＣ遺伝子は、そのベクターのＢｃｌＩ制限フラグ
メント上から容易に取り出すことができ、本発明の遺伝
子はいずれもそのベクターのＢｃｌＩ制限フラグメント
上に挿入することができる。プラスミドＤＮＡのＢｃｌ
Ｉによる消化は、配列５’−ＧＡＴＣ−３’のアデニン
位のメチル化によって阻害される。したがって、プラス
ミドｐＧＴＣは、ｄａｍ遺伝子によってコードされてい
るような、配列５’−ＧＡＴＣ−３’のアデニン残基を
メチル化する産物であるアデニンメチラーゼを欠いてい
る大腸菌宿主細胞から調製した。大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４
８（ＮＲＲＬＢ−１５７２５）は機能的ｄａｍメチラー
ゼを欠いており、したがってこれは、プラスミド誘導体
を構築する際の出発物質として使用できるプラスミドｐ
ＧＴＣのＤＮＡを調製する目的として適切な宿主である
。 【００７８】大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８細胞を培養し、形
質転換に対して感受性（コンピーテント）にし、実施例
１に記載の操作法に実質的に従ってプラスミドｐＧＴＣ
を使用して大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８細胞を形質転換した
。 得られた形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬ−寒
天上にプレートし、アンピシリン耐性の大腸菌Ｋ１２
ＧＭ４８／ｐＧＴＣ形質転換体がコロニーを形成したな
ら、実施例１の操作法に実質的に従って、その１つを使
用してプラスミドｐＧＴＣ ＤＮＡを調製した。プラス
ミドｐＧＴＣ ＤＮＡ約１ｍｇを入手し、ＴＥ緩衝液約
１ｍｌ 中に懸濁した。同様に、プラスミドｐＧＴ−ｈ
およびｐＧＴ−ｄからプラスミドＤＮＡを調製した。プ
ラスミドｐＧＴ−ｄは、ＢｃｌＩ部位に遺伝子を有さな
いでＧＢＭＴ転写ユニットを含有しており、したがって
あらゆる遺伝子を容易に挿入することができる。プラス
ミドｐＧＴ−ｄはさらにネズミｄｈｆｒ遺伝子を含有し
ているので、メトトレキサート耐性表現型を使用してあ
らゆる形質転換体を選択でき、または増幅することがで
きる。プラスミドｐＧＴ−ｈは、ＧＢＭＴ転写ユニット
、目的遺伝子を容易に挿入できるＢｃｌＩ部位およびハ
イグラマイシン耐性付与遺伝子を含有している。これら
プラスミドのいずれかを含有する大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１
株は１９９０年１月１８日にＮＲＲＬに寄託した。それ
ら菌株は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９１（大腸菌Ｋ
１２ ＡＧ１／ｐＧＴ−ｄについて）、ＮＲＲＬ Ｂ−
１８５９２（大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴ−ｈについ
て）、およびＮＲＲＬ Ｂ−１８５９３（大腸菌Ｋ１２
ＡＧ１／ｐＧＴＣについて）の下に入手できる。これ
らプラスミドの制限部位および機能地図を添付の図面に
示す。 【００７９】ＧＭ４８細胞から調製したプラスミドｐＬ
ＰＣ−Ｑ０９７ ＤＮＡ約１０μｌ を、１０×Ｂｃｌ
Ｉ制限緩衝液［１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
４、１．５Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、およ
び１０ｍＭ ＤＴＴ］２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
２０μｌ、制限酵素ＢｃｌＩ［ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＢＲＬ）により規定され
た〜５０単位。以下、本明細書で使用するすべての制限
酵素はここから入手した。］５μｌ、および水１４５μ
ｌ と混合し、得られた反応物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。本明細書に記載している制限酵素反応は
、フェノール次いでクロロホルム抽出するという常法に
よって停止させ、次いでＤＮＡを沈澱させてエタノール
洗浄し、そして得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液中に再懸濁
している。次に、得られた消化ＤＮＡを１％アガロース
調製用ゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｐｒｅｐ ｇｅｌ）の電
気泳動に付し、次いでバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ キットをその製造元の教示に従っ
て使用し、突然変異遺伝子を含有する約１４００塩基対
の制限フラグメントを精製する。 【００８０】次いで、実施例１の教示に実質的に従って
プラスミドｐＧＴ−ｈを大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴ
Ｃ（ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２）から単離し、実施例２
のようにしてＧＭ４８中で増殖させて単離した。次いで
、プラスミドｐＧＴ−ｈ ＤＮＡを上記のようにして制
限酵素ＢｃｌＩで消化した後、大きなベクターフラグメ
ントを単離し、精製した。このベクターフラグメントを
ＴＥ（ｐＨ８．０）を用いて９０μｌ 容量にし、次い
で子牛腸内アルカリホスファターゼ１０μｌ（０．０５
単位）を加え、そのベクターの末端を脱リン酸化した。 得られた混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、
次いで５００ｍＭ ＥＧＴＡ（１０μｌ）を加え、得ら
れた反応物を６５℃で４５分間インキュベートしてその
酵素を不活化した。次いで、その反応物をフェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、洗浄し、水２
０μｌ 中に再懸濁した。 【００８１】次に、そのＢｃｌＩ消化ベクターのバック
ボーン約７μｌ（１０ｎｇ）をプラスミドｐＬＰＣ−Ｑ
０９７の約１４００塩基対ＢｃｌＩ制限フラグメント約
１μｌ（１００ｍｇ）、１０×リガーゼ緩衝液［０．５
Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１００ｍＭ ＤＴＴおよび５００μｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ］１μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ と
混合した。次いで、この連結反応物を１６℃で１２〜１
６時間インキュベートした。この連結反応により、ＧＢ
ＭＴ転写ユニットからの転写用に適して配向した突然変
異チモーゲン遺伝子を含有するプラスミド、またはその
遺伝子が反対の配向性で連結されたプラスミドが導かれ
得る。転写に対して適切な配向性の遺伝子を含有するプ
ラスミドをプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈと命名した
。 【００８２】凍結したコンピーテントな大腸菌Ｋ１２
ＡＧ１細胞をストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）
［カリフォルニア９２１２１，サンジェゴ，タンセイ・
ロード３７７０番］から入手した。連結反応物約５μｌ
をコンピーテント細胞１００μｌ と混合した後、得
られた細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベー
トし、４２℃で４５秒間熱−ショックを与え、次いで氷
上で約２分間冷蔵した。得られた細胞−ＤＮＡ混合物を
、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５９管中、ＳＯＣ培
地１．０ｍｌ に希釈し、３７℃で１時間インキュベー
トした。その１００μｌをアンピシリンを含有するＬＢ
寒天平板上にプレートし、コロニーが現れるまで３７℃
でインキュベートした。 【００８３】得られたコロニーを個々に培養し、それぞ
れのコロニーのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によっ
て調査した。プラスミドＤＮＡの単離法は実施例１の操
作に実質的に従って行うが、それよりも小規模であり、
またＣｓＣｌ工程は、適切な大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐ
ＧＴ−Ｑ０９７−ｈ形質転換体が同定されるまで省いた
。同定された時点で、高度に精製されたプラスミドの調
製を大規模に行った。実施例１および２の教示に従えば
、あらゆる突然変異チモーゲン遺伝子を容易にあらゆる
ＧＢＭＴベクターにクローンすることができ、それによ
りプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ２４８
−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈおよびｐＧＴ−Ｑ３２９−
ｈを作成することができる。 【００８４】 実施例３ アデノウイルス−形質転換ヒト胚腎セルライン２９３お
よびアデ ノウイルス−形質転換シリアンハ
ムスター セルラインＡＶ１２ の形質転換
体のプラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈを使用する構築法
ヒト胚腎セルライン２９３は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから、受託番号ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３の下で入手できる。また、アデノウイ
ルスで形質転換されたシリアンハムスター セルライン
ＡＶ１２も、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９５９５の下
で入手できる。以下に説明する形質転換操作法は宿主セ
ルラインとして２９３細胞について言及するものである
が、この操作法は、ＡＶ１２セルラインなどのほとんど
の真核生物セルラインに、および本発明の発現ベクター
に一般的に適用可能である。 【００８５】受託番号ＣＲＬ １５７３の下で２９３細
胞をＡＴＣＣから入手し、それを、１０％の熱−不活化
ウマ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必須培地
（Ｇｉｂｃｏ）中に全面単層の約５．５×１０６個の細
胞を含む２５ｍｍ２フラスコとした。このフラスコを３
７℃でインキュベートし、培地を週２回交換した。培地
は、１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイ
シンおよび１０μｇ／ｍｌ ＡｑｕａＭＥＰＨＹＴＯＮ
Ｒ フィトナジオン ビタミンＫ１［メルク・シャープ
・アンド・ドーム（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ａｎｄ
Ｄｏｈｍｅ， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．
，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ， ＰＡ１９４８６）］を追加
したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）であった。培地を除き、ハ
ンクのバランス塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅ
ｄ Ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）［Ｇｉｂｃｏ］で
すすぎ、０．２５％トリプシン（０．２ｇ／Ｌ ＥＤＴ
Ａを含む）を１〜２分間加え、新鮮な培地ですすぎ、ア
スピレーター処理を行い、そして継代培養比１：５また
は１：１０で新しいフラスコに分けることにより、細胞
を継代培養した。 【００８６】形質転換する前日に、細胞を１００ｍｍ皿
あたり０．７×１０６細胞の割合で接種した。ＴＥ緩衝
液に溶解し、滅菌したエタノール沈澱プラスミドＤＮＡ
を使用し、２５μｇ／ｍｌ の形質転換用プラスミドＤ
ＮＡおよび２５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する２×ＤＮ
Ａ−ＣａＣｌ２溶液を調製した。２８０ｍＭ ＮａＣｌ
、５０ｍＭ ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）および１．５ｍＭ
リン酸ナトリウムを含有する、ｐＨを７．０５〜７．１
５に調節した２×ＨＢＳＳを調製した。前記２×ＤＮＡ
−ＣａＣｌ２溶液を等量の滅菌２× ＨＢＳＳに滴加し
た。２×ＨＢＳＳを入れた混合管に綿プラグ付きの１ｍ
ｌ の滅菌プラスチック製ピペットを挿入し、ＤＮＡを
加えながら、気泡を吹き込んだ。撹拌することなく室温
で３０〜４５分間、カルシウム−リン酸塩−ＤＮＡ 沈
澱物を形成させた。 【００８７】次に、プラスチック製ピペットで穏やかに
ピペッティングすることによりその沈澱物を混合し、受
容細胞を覆う増殖培地１０ｍｌに平板１個あたり１ｍｌ
の沈澱物を直接加えた。３７℃で４時間インキュベー
トした後、その培地を新鮮な培地と取り替え、選択圧を
かける前に細胞をさらに７２時間インキュベートした。 真核生物細胞内で機能する選択マーカーを含んでいない
プラスミドに対しては、プラスミドの混合物、即ち、選
択マーカーを欠いている本発明の発現ベクターおよび真
核生物細胞内で機能する選択マーカーを含んでいる発現
ベクターの混合物、を形質転換法に用いる。このような
同時形質転換系で使用できるベクターは多種あり、それ
にはプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１４９）、
ｐＳＶ２−ｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１４５）、およびｐ
ＳＶ２−ｈｙｇ（ＮＲＲＬ Ｂ−１８０３９）がある。 プラスミドｐＳＶ２−ｈｙｇは真核生物宿主細胞にハイ
グロマイシンＢ耐性を付与する。この同時形質転換法に
よれば、選択マーカーを持つプラスミドを含んでいる細
胞を選択することができる。これらの細胞をさらに試験
して形質転換用プラスミドの両方を含んでいる細胞を同
定する。当然ながら、本発明は、真核生物細胞用の選択
マーカーを含んでいるために、同時形質転換法を必要と
しない発現ベクターをも包含している。 【００８８】ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を
含んでいる、プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈなどのプ
ラスミドでトランスフェクトされた細胞に対しては、最
終濃度が約２００μｇ／ｍｌ となるようにハイグロマ
イシンＢをその増殖培地に加える。次いで、３〜４日毎
に培地を交換しながら、２〜４週間、３７℃で細胞をイ
ンキュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコ
ロニーを、その特徴を調べるため別々の培養フラスコに
移した。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏはネオマイシン（
Ｇ４１８をネオマイシンの代わりに用いることもできる
）に対する耐性を付与し、Ｇ４１８を最終濃度３００μ
ｇ／ｍｌ で加えること以外は実質的にハイグロマイシ
ン耐性細胞の選択法に従って、Ｇ４１８耐性コロニーの
選択を行った。 【００８９】ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺
伝子あるいはメトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ
遺伝子の誘導体（ｄｈｆｒ−ｍｔｘ）を、ｄｈｆｒ−欠
損セルラインに遺伝子あるいはプラスミドを導入するた
めの選択マーカーとして用いること、ならびに、次にプ
ラスミドのコピー数を増幅するためにメトトレキサート
を用いることは、文献において十分に確立されている。 ２９３細胞はｄｈｆｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子
を含むプラスミドを含有している２９３形質転換体は、
ｄｈｆｒ陽性の表現型（ヒポキサンチンとチミジンを欠
く培地で増殖する能力）に基づいてのみでは選択されな
い。機能的なｄｈｆｒ遺伝子を欠き、ｄｈｆｒを含有す
るプラスミドで形質転換されたセルラインは、ｄｈｆｒ
＋の表現型に基づいて選択することができる。ｄｈｆｒ
を産生する細胞において選択および増幅マーカーとして
ｄｈｆｒを用いることは十分に研究されてはいないが、
文献中の証拠により、ｄｈｆｒ産生細胞中での遺伝子増
幅用に、および選択マーカーとしてｄｈｆｒを使用し得
ることが示唆されていると考えられる。本発明は、発現
ベクターに用いる選択マーカーによって限定されるもの
ではない。さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノシ
ン デアミナーゼ遺伝子、またはＰ−糖タンパク質遺伝
子で例示される多遺伝子耐性族の一員などの増幅マーカ
ーを用いることもできる。 【００９０】プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、ｐＧＴ
−Ｑ２４８−ｈ、ｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈおよびｐＧＴ−
Ｑ３２９−ｈを使用して２９３セルラインを形質転換し
、多くの形質転換体を得た。これらの形質転換体を実施
例４に記載のようにして分析した。 【００９１】 実施例４ ヒトプロテインＣチモーゲン突然変異体を分泌する細胞
の選択 実施例３で得られたハイグロマイシン耐性の形質転
換体を１００ｍｍ２組織培養皿上において、組織培養皿
１個あたり数百の細胞クローンの密度で増殖させた。こ
の培地をデカントし、細胞をハンクのバランス塩溶液（
Ｇｉｂｃｏ）５ｍｌ ずつで２回すすいだ。滅菌した０
．４５％寒天［Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ４ アガロース
；カタログ番号Ａ３６４３；シグマ・ケミカル（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
１４５０８， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１７８）
］の溶液を、１．８％寒天（４７℃）１ｍｌ をダルベ
ッコの改変イーグル（ＤＭＥ）塩（Ｇｉｂｃｏ）（３７
℃）３ｍｌ と混合することによって調製し、この０．
４５％寒天溶液２ｍｌ を細胞上に重層した。 【００９２】ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｉｎｃ．，
Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ ０３４３１）を煮沸し、次いで２
時間オートクレーブ処理し、細胞にとって毒性である浸
潤性物質を除去した。次に、このフィルターを寒天層の
上に置き、気泡を除去した後、得られた平板を３７℃で
１〜３時間インキュベートした。次いで、後に行うコロ
ニーの同定を容易にするため、皿上のフィルターの最初
の方向がわかるように、あらかじめ印をつけておいたフ
ィルターを取り出し、ＰＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ＝７．２および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に入れ
た。 【００９３】フィルターの分析の間、皿上の細胞を生き
たままに保つため、１．８％寒天（４７℃）２ｍｌ、Ｄ
ＭＥ塩（３７℃）２ｍｌ、および２０％ウシ胎仔血清を
含むＤＭＥ塩（３７℃）４ｍｌからなる混合物８ｍｌ
を細胞上に重層した。次に、この細胞を３７℃のインキ
ュベーター内に入れた。 【００９４】フィルターで行う洗浄および反応はすべて
、フィルターを振動台（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏ
ｒｍ）の上に置いて行った。始めにこのフィルターを、
５％のミルクを含むＰＢＳ中、室温でインキュベートす
ることによってブロックした。次に、このフィルターを
ＰＢＳ中で４回すすいだ（１回のすすぎは５分間）。２
．５％ウシ血清アルブミン中の１０μｇ／ｍｌビオチン
化ヤギ抗−ヒトプロテインＣポリクローナル抗体を、フ
ィルターを覆うに十分な量でフィルターに加え、次いで
これを３７℃で１時間インキュベートした。 【００９５】プロテインＣに対する抗体を調製するため
に後に使用するプロテインＣの精製は、キシール（Ｋｉ
ｓｉｅｌ）の Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ６４：
７６１（１９７９）に記載のようにして行うことができ
る。ポリクローナル抗体は、キャバット（Ｅ．Ａ．Ｋａ
ｂａｔ）の ”ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＣｏｎｃｅｐｔｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｈｏｌｄ，Ｒｈｉｎｅｈａｒ
ｔ，およびＷｉｎｓｔｏｎ出版（１９６８）］に開示さ
れている方法によって調製することができる。また、本
検定で用いるのに適したモノクローナル抗体は、コーラ
ーおよびミルシュタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６
：４９５］の記載のようにして、または米国特許第４，
６９６，８９５号、ＥＰＯ 公開番号第２０５０４６号
；ラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）らの ＦＥＢＳ１９１（
１）：７５（１９８５）；スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）らの
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９７：１２７−１３８（１９
８５）；およびＥＰＯ 公開番号第１３８２２２号に記
載されているようにして調製することができる。本検定
で用いるアビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴ
Ｍ キット［Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
， Ｉｎｃ．， ３０ Ｉｎｇｏｌｄ Ｒｏａｄ， Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ ９４０１０］から入手す
ることができる。また、ビオチンもＶｅｃｔｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得られる。 【００９６】フィルターを４℃のＰＢＳで４回すすいだ
。次に、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴＭ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）キット中の製造元の指示に従
って、アビジンＤおよびビオチン化西洋ワサビペルオキ
シダーゼを調製し、加えた。ＨＲＰとコンジュゲートし
たアビジンＤとともに４℃で１時間（タンパク質が少量
分泌されているときには、もっと長いインキュベート時
間、例えば一晩を用いることができる）、フィルターを
インキュベートし、次いで、このフィルターを４℃のＰ
ＢＳで４回すすいだ。 【００９７】フィルターの指示色を発色させるため、氷
冷の１００％メタノールに溶解したＨＲＰカラー発色剤
（４−クロロ−１−ナフトール；Ｓｉｇｍａ）（約３０
ｍｇ）をＰＢＳ（５０ｍｌ）および３０％Ｈ２Ｏ２（３
０μｌ）に加えた。 この混合物をニトロセルロースフィルターに加え、これ
を発色するまで室温でインキュベートした。本発明のヒ
トプロテインＣチモーゲンを最大量分泌しているコロニ
ーは、フィルターの最も早い発色によってだけでなく、
フィルター上の一段と暗いスポットによっても示される
。 【００９８】フィルターを発色させた後、もう一度この
フィルターを最初の平板と並べ、どのコロニーがフィル
ターのどのスポットと関係しているかを調べた。そして
、本発明のヒトプロテインＣチモーゲンを最大に分泌し
ているコロニーを選び、これを該チモーゲンの製造に使
用した。 【００９９】上記の検定が高分泌セルラインを同定する
ための単なる例示方法であるにすぎないことは当業者の
理解するところであろう。この方法において多種の検定
法を成功裏に用いることができる。例えば、ビオチン化
したヤギ抗プロテインＣ抗体を、ヤギ抗−プロテインＣ
抗体（ＩｇＧ）およびビオチン化した抗−ヤギＩｇＧ抗
体と置き換えた２重−抗体反応を用いることができる。 【０１００】チモーゲン突然変異体は細胞培養物から精
製することができる。その上清を組換え産物を産生する
細胞から除去し、ファルマシア［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］
のＦａｓｔｆｌｏｗ−Ｑカラムで精製した。樹脂約１ｍ
ｌ を２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１
５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび４ｍＭ ベン
ズアミジンで平衡化した。上記の培養上清をトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび４ｍＭ ベ
ンズアミジンの添加によってｐＨ７．４に調節した。上
清をカラム中の樹脂に入れ、３カラム容量のトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡで、次いで３カラム容量の２０ｍＭ トリス（Ｈ
Ｃｌ）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ ベンズアミン
で洗浄した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２を２０ｍＭ トリス
−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ベンズアミンに含有する溶出緩衝液を使用し、そのカ
ラムから組換え産物を溶出させた。 【００９９】その産物の比活性をグリンネル（Ｇｒｉｎ
ｎｅｌｌ）らのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１
８９−１１９２（１９８７）の操作法にしたがって以下
のようにして測定した。カラム溶出液を濃縮し、透析し
て得た産物を固定化トロンビン−トロンボモジュリン複
合体によってまず始めに活性化し、次いでその産物のア
ミド分解活性を、トリペプチド基質Ｓ−２３６６［ヘレ
ナ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ）から入手］の加水分解に
よって測定した。この産物の抗凝血活性は、ヘレナから
得た試薬を使用し、活性化された部分的トロンボプラス
チン時間の延長度によって測定した。
【図１】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７の制限部位
および機能地図。
および機能地図。
【図２】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ２４８の制限部位
および機能地図。
および機能地図。
【図３】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ３１３の制限部位
および機能地図。
および機能地図。
【図４】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ３２９の制限部位
および機能地図。
および機能地図。
【図５】 プラスミドｐＧＴＣの制限部位および機能
地図。
地図。
【図６】 プラスミドｐＧＴ−ｄの制限部位および機
能地図。
能地図。
【図７】 プラスミドｐＧＴ−ｈの制限部位および機
能地図。
能地図。
Claims (20)
- 【請求項１】 配列式： 【化１】 ［式中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮまた
はＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮま
たはＧＬＮである］ で示されるアミノ酸配列をアミノ末端からカルボキシ末
端の方向に含有するタンパク質をコードしているコード
化配列を含有する組換えＤＮＡ化合物。 - 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ化合物を含有
する組換えＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３】 Ｒ１がＧＬＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３が
ＡＳＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項２に記載のベクター
。 - 【請求項４】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ０９７または
プラスミドｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈである請求項３に記載
のベクター。 - 【請求項５】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＧＬＮ、Ｒ３が
ＡＳＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項２に記載のベクター
。 - 【請求項６】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ２４８または
プラスミドｐＧＴ−Ｑ２４８−ｈである請求項５に記載
のベクター。 - 【請求項７】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３が
ＧＬＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項２に記載のベクター
。 - 【請求項８】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ３１３または
プラスミドｐＧＴ−Ｑ３１３−ｈである請求項７に記載
のベクター。 - 【請求項９】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３が
ＡＳＮ、Ｒ４がＧＬＮである請求項２に記載のベクター
。 - 【請求項１０】 プラスミドｐＬＰＣ−Ｑ３２９また
はプラスミドｐＧＴ−Ｑ３２９−ｈである請求項９に記
載のベクター。 - 【請求項１１】 請求項２に記載のベクターによって
形質転換されている真核生物宿主細胞。 - 【請求項１２】 ２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７、２９
３／ｐＬＰＣ−Ｑ２４８、２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ３１３
、２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ３２９、２９３／ｐＧＴ−Ｑ０
９７−ｈ、２９３／ｐＧＴ−Ｑ２４８−ｈ、２９３／ｐ
ＧＴ−Ｑ３１３−ｈ、および２９３／ｐＧＴ−Ｑ３２９
−ｈの中から選ばれる請求項１１に記載の真核生物宿主
細胞。 - 【請求項１３】 真核生物宿主細胞から分泌させてチ
モーゲン型ヒトプロテインＣを組換え的に生産する方法
であって、 （Ａ）（ｉ）配列式： 【化２】 ［式中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮまた
はＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮま
たはＧＬＮである］ で示されるアミノ酸残基配列をアミノ末端からカルボキ
シ末端の方向に含有するアミノ酸残基配列をコードして
いるＤＮＡ配列、および （ｉｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるよう配置されている
プロモーター、を含有する組換えＤＮＡベクターによっ
て真核生物宿主細胞を形質転換し、 （Ｂ）工程Ａによって形質転換された該宿主細胞を該Ｄ
ＮＡ配列が発現され得る条件下で培養し、そして（Ｃ）
得られた培養物からチモーゲン型プロテインＣを回収す
ること、を特徴とする方法。 - 【請求項１４】 工程Ｂにおいて培養する宿主細胞が
、２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ０９７、２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ
２４８、２９３／ｐＬＰＣ−Ｑ３１３、２９３／ｐＬＰ
Ｃ−Ｑ３２９、２９３／ｐＧＴ−Ｑ０９７−ｈ、２９３
／ｐＧＴ−Ｑ２４８−ｈ、２９３／ｐＧＴ−Ｑ３１３−
ｈ、および２９３／ｐＧＴ−Ｑ３２９−ｈの中から選ば
れる請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 アミノ酸残基配列が、配列式：【化
３】 ［式中、Ｒ１はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ２はＡＳＮまた
はＧＬＮ、Ｒ３はＡＳＮまたはＧＬＮ、Ｒ４はＡＳＮま
たはＧＬＮである］ を含有するチモーゲン型ヒトプロテインＣ。 - 【請求項１６】 Ｒ１がＧＬＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３
がＡＳＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項１５に記載のチモ
ーゲン型ヒトプロテインＣ。 - 【請求項１７】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＧＬＮ、Ｒ３
がＡＳＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項１５に記載のチモ
ーゲン型ヒトプロテインＣ。 - 【請求項１８】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３
がＧＬＮ、Ｒ４がＡＳＮである請求項１５に記載のチモ
ーゲン型ヒトプロテインＣ。 - 【請求項１９】 Ｒ１がＡＳＮ、Ｒ２がＡＳＮ、Ｒ３
がＡＳＮ、Ｒ４がＧＬＮである請求項１５に記載のチモ
ーゲン型ヒトプロテインＣ。 - 【請求項２０】 請求項１３に記載の方法によって生
産される活性化されたチモーゲン型ヒトプロテインＣを
投与することを特徴とする、血管内凝血に関連した疾患
を処置するための方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48408190A | 1990-02-23 | 1990-02-23 | |
| US484081 | 1990-02-23 | ||
| US62806390A | 1990-12-21 | 1990-12-21 | |
| US628063 | 1990-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211380A true JPH04211380A (ja) | 1992-08-03 |
| JP3004375B2 JP3004375B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=27047851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3050646A Expired - Fee Related JP3004375B2 (ja) | 1990-02-23 | 1991-02-22 | ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5460953A (ja) |
| EP (1) | EP0443874B1 (ja) |
| JP (1) | JP3004375B2 (ja) |
| KR (1) | KR910021477A (ja) |
| CN (1) | CN1055560A (ja) |
| AT (1) | ATE153069T1 (ja) |
| AU (1) | AU645776B2 (ja) |
| CA (1) | CA2036894C (ja) |
| DE (1) | DE69126049T2 (ja) |
| DK (1) | DK0443874T3 (ja) |
| ES (1) | ES2101716T3 (ja) |
| FI (1) | FI910854A7 (ja) |
| GR (1) | GR3023756T3 (ja) |
| IE (1) | IE910611A1 (ja) |
| IL (1) | IL97311A0 (ja) |
| NO (1) | NO910719L (ja) |
| NZ (1) | NZ237199A (ja) |
| PT (1) | PT96853A (ja) |
| YU (1) | YU31891A (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY110664A (en) * | 1992-05-21 | 1999-01-30 | Lilly Co Eli | Protein c derivatives |
| SE9701228D0 (sv) * | 1997-04-03 | 1997-04-03 | Bjoern Dahlbaeck | Rekombinanta protein-C-och protein-S-varianter |
| US6153420A (en) * | 1997-04-24 | 2000-11-28 | Zymogenetics, Inc. | Serine protease polypeptides and materials and methods for making them |
| US7081519B1 (en) | 1997-04-24 | 2006-07-25 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies to serine protease polypeptides |
| US6998122B1 (en) | 1999-04-30 | 2006-02-14 | Eli Lilly And Company | Protein C derivatives |
| WO2001036462A2 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Eli Lilly And Company | Protein c derivatives |
| WO2001057193A2 (en) | 2000-02-02 | 2001-08-09 | Eli Lilly And Company | Protein c derivatives |
| CA2400187A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Eli Lilly And Company | Protein c derivatives |
| WO2002032461A2 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
| US6933367B2 (en) | 2000-10-18 | 2005-08-23 | Maxygen Aps | Protein C or activated protein C-like molecules |
| WO2006044294A2 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Eli Lilly And Company | Human protein c analogs |
| WO2007117330A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-10-18 | Biosite Incorporated | Latent protein c assays and their uses for diagnosis and/or prognosis in systemic inflammatory response syndromes |
| CA2654761A1 (en) * | 2006-06-09 | 2007-12-13 | The University Of British Columbia | Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects |
| WO2008048646A1 (en) * | 2006-10-18 | 2008-04-24 | Socratech L.L.C. | Use of human protein c with altered glycosylation and sialic acid content as a medicament |
| US20110171200A1 (en) * | 2008-01-15 | 2011-07-14 | Walley Keith R | Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound |
| ES2618899T3 (es) * | 2010-02-26 | 2017-06-22 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Zimógeno de proteína C y procedimientos de utilización del mismo para prevenir las metástasis del cáncer |
| WO2012068519A2 (en) | 2010-11-19 | 2012-05-24 | Sirius Genomics Inc. | Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652639A (en) * | 1982-05-06 | 1987-03-24 | Amgen | Manufacture and expression of structural genes |
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| US4968626A (en) * | 1985-08-15 | 1990-11-06 | Board Of Reagents Of The University Of Washington | DNA sequence coding for protein C |
| DE3688900T3 (de) * | 1985-06-27 | 1998-06-10 | Univ Washington | Expression von Protein C. |
| US4935349A (en) * | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
| WO1987004722A1 (en) * | 1986-01-31 | 1987-08-13 | Genetics Institute, Inc. | Novel thrombolytic proteins |
| US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| US4992373A (en) * | 1987-12-04 | 1991-02-12 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C |
| ZA889497B (en) * | 1987-12-28 | 1990-08-29 | Lilly Co Eli | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c |
| JP2728240B2 (ja) * | 1988-07-26 | 1998-03-18 | ヘキスト薬品工業株式会社 | ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法 |
| US5270178A (en) * | 1990-02-23 | 1993-12-14 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C |
-
1991
- 1991-02-20 IL IL97311A patent/IL97311A0/xx unknown
- 1991-02-22 ES ES91301446T patent/ES2101716T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-22 FI FI910854A patent/FI910854A7/fi unknown
- 1991-02-22 DK DK91301446.0T patent/DK0443874T3/da active
- 1991-02-22 JP JP3050646A patent/JP3004375B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-22 PT PT96853A patent/PT96853A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-02-22 AT AT91301446T patent/ATE153069T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-22 IE IE061191A patent/IE910611A1/en unknown
- 1991-02-22 KR KR1019910002897A patent/KR910021477A/ko not_active Withdrawn
- 1991-02-22 DE DE69126049T patent/DE69126049T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-22 EP EP91301446A patent/EP0443874B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-22 YU YU31891A patent/YU31891A/sh unknown
- 1991-02-22 AU AU71307/91A patent/AU645776B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-22 NO NO91910719A patent/NO910719L/no unknown
- 1991-02-22 NZ NZ237199A patent/NZ237199A/en unknown
- 1991-02-22 CA CA002036894A patent/CA2036894C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-23 CN CN91101201A patent/CN1055560A/zh active Pending
-
1993
- 1993-09-09 US US08/093,217 patent/US5460953A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-11 GR GR970401400T patent/GR3023756T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO910719D0 (no) | 1991-02-22 |
| DE69126049D1 (de) | 1997-06-19 |
| EP0443874A3 (en) | 1991-10-16 |
| NZ237199A (en) | 1993-04-28 |
| JP3004375B2 (ja) | 2000-01-31 |
| CN1055560A (zh) | 1991-10-23 |
| KR910021477A (ko) | 1991-12-20 |
| PT96853A (pt) | 1991-10-31 |
| AU645776B2 (en) | 1994-01-27 |
| IL97311A0 (en) | 1992-05-25 |
| CA2036894C (en) | 2002-01-15 |
| GR3023756T3 (en) | 1997-09-30 |
| AU7130791A (en) | 1991-08-29 |
| IE910611A1 (en) | 1991-08-28 |
| EP0443874B1 (en) | 1997-05-14 |
| FI910854A0 (fi) | 1991-02-22 |
| FI910854L (fi) | 1991-08-24 |
| FI910854A7 (fi) | 1991-08-24 |
| YU31891A (sh) | 1994-06-10 |
| DE69126049T2 (de) | 1997-09-25 |
| ATE153069T1 (de) | 1997-05-15 |
| US5460953A (en) | 1995-10-24 |
| DK0443874T3 (da) | 1997-11-17 |
| CA2036894A1 (en) | 1991-08-24 |
| ES2101716T3 (es) | 1997-07-16 |
| EP0443874A2 (en) | 1991-08-28 |
| NO910719L (no) | 1991-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0319312B1 (en) | Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C | |
| US5225537A (en) | Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins | |
| CA1340263C (en) | Expression of protein c analogues | |
| US5516650A (en) | Production of activated protein C | |
| US5270178A (en) | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C | |
| JPH04211380A (ja) | ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 | |
| US5358932A (en) | Hybrid protein C | |
| US5196322A (en) | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C | |
| JPS62111690A (ja) | ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子 | |
| HU225247B1 (en) | Factor x deletion mutants and analogues thereof | |
| CA2071630C (en) | Hybrid protein c | |
| EP0323149B1 (en) | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C | |
| US5510248A (en) | Stable recombinant meizothrombin-like polypeptides | |
| WO1991012320A1 (en) | Activated protein c with truncated light chain | |
| JP3153236B2 (ja) | 端が切り取られた軽鎖を有する組換えプロテインｃ | |
| WO1991002065A1 (en) | Cell culture methods for producing activated protein c | |
| MXPA99007768A (en) | Factor x analogues with a modified protease cleavage site |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991019 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |