JPH04218366A - メトラクロルの免疫学的検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、メトラクロルに対する
高い選択性および親和性により区別され、そしてそれ故
にメトラクロルの迅速で効果的な検出のためのイムノア
ッセイにおける使用に極めて適しているモノクローナル
抗体に関する。

【０００２】本発明のもう一つの面は、上記モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系、上記モノク
ローナル抗体を用いてメトラクロルを検出するための免
疫学的方法、およびこれらの検出方法の範囲内で使用さ
れ得る試験キットに関する。

【０００３】

【従来の技術】植物保護のための合成除草剤の使用およ
びそれと関連した環境汚染の問題は人々の論議の的とな
ることが近年頻繁になってきている。

【０００４】メトラクロルは広く用いられている除草剤
であり、これは植物保護の目的で、特にトウモロコシ、
ワタ、ジャガイモ、モロコシおよびテンサイ等の栽培植
物の種々の野生雑草を選択的に防除するために使用され
るいる。

【０００５】化学的な観点からいうとメトラクロルは２
−クロロ−６’−エチル−Ｎ−（２−メトキシ−１−メ
チルエチル）アセト−Ｏ−トルイジンである〔殺虫剤年
鑑（Ｔｈｅ　Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｍａｎｕａｌ），第
８版，シー．アール．ワージングおよびエス．ビー．ウ
ォーカー（Ｃ．Ｒ．Ｗｏｒｔｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓ．Ｂ
．Ｗａｌｋｅｒ）　編集，ザ・ブリティッシュ・クロッ
プ・プロテクション・カウンシル（Ｔｈｅ　Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ　Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｃｏｕｎｃｉ
ｌ）　，英国　　シーアール４　　７キュービー　　ト
ロントン・ヒース，１９８７年刊，第５６８および５６
９頁参照〕。

【０００６】メトラクロルは主としてガスまたは液体ク
ロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）により土壌および
水の試料中に広く検出される〔４，１４；以下〔〕内の
数字は本明細書末尾にまとめて示す表３の参考文献の番
号と一致する〕。

【０００７】しかしながら、合成除草剤を検出するため
の上記方法は多くの欠点を有する。例えば、土壌の試料
中のメトラクロルをガスクロマトグラフィーまたはＨＰ
ＬＣにより検出するために、実際にクロマトグラフィー
分析する前に複雑な精製および濃縮段階をさしはさむこ
とが必要である。これらの方法のその他の欠点は、例え
ば、特定元素の検出器がガスクロマトグラフィーにおい
て使用され、一方比較的非特異的である光度検出器がＨ
ＰＬＣにおいて使用されることであるとみなされてもよ
い。質量スペクトル検出を除いて、クロマトグラフィー
分析の基本は特定物質の保持時間の決定である。しかし
ながら、これらの値は相対的であり、それ故に構造に特
異的ではない。

【０００８】確立された分析法の上記欠点を解消するた
め、広範囲の抗原を検出するための臨床的な治療に既に
日常使用されているものに加えて、農業分野、特に土壌
、水または空気の試料中の農薬の定量および定性分析の
ための免疫学的方法を開発することが最近の試みである
。

【０００９】このようにして、例えば、ある種の除草剤
例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸〔３〕またはク
ロルスルフロン〔６〕ならびに種々の殺虫剤例えばジフ
ルベンズロン〔１５〕、メタラキシル〔１０〕、アラク
ロル〔２〕またはパラチオン〔１〕の検出のための免疫
学的方法の開発が開始された。アトラジンの免疫学的検
出のためのある方法は既に記載されているが（ＵＳ−Ｐ
４５３０７８６）、しかしこの方法は上記の方法のよう
に、適当な抗原で予め免疫感作された動物から得られた
ポリクローナル抗血清の使用に基づいている。

【００１０】ポリクローナル抗血清は非常に不均一な組
成物であり、すなわちそれらは特定の抗原の異なるエピ
トープと反応する極めて多くの異種抗体を含有する。実
験動物が特定の抗原で免疫感作されるとき、種々の抗体
産生細胞クローンを同時に刺激し、そのクローンの各々
が抗原分子上の異なるエピトープを認識し、それ故に異
なる抗体が刺激された細胞クローンにより産生されるか
ら、ポリクローナル抗血清の不均一な組成物が生じる。

【００１１】これが、免疫感作された動物からの血清が
常にポリクローナルであり、それ故にそれらの特異性お
よび免疫グロブリンの個々のクラスの構成に関して不均
一である理由である。

【００１２】従って、ポリクローナル抗血清の組成物に
おける不均一性は、これらのポリクローナル抗体がイム
ノアッセイにおいて使用される場合に、構造的に極めて
近似の化合物、例えばメトラクロルとアラクロルを十分
な程度まで識別することを不可能にする。ポリクローナ
ル抗血清のこれらの欠点を克服するために、農業分野で
もモノクローナル抗体の開発に多くの努力がはらわされ
ている。そして、酵素結合イムノアッセイにおけるアト
ラジンおよびヒドロキシアトラジンに対するモノクロー
ナル抗体の調製および使用が報告されている〔１２〕。 これに対し、標的物質に十分に高い親和性を有し、それ
故に公知イムノアッセイの一つにおいて本発明に従って
使用するのに適当なメトラクロルに対するモノクローナ
ル抗体の調製は未だ成功していない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明が解決
しようとする課題は、土壌、水および空気の試料中、お
よび生体物質の抽出物中のメトラクロルの迅速で信頼で
きる検出のための、操作が容易で、効率的で、そして選
択性の高いイムノアッセイを提供することを第一とする
。

【００１４】

【課題を解決するための手段】とりわけ、それ自体公知
のハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術を使用する
ことによりメトラクロルに対する高い特異性および親和
性を有するモノクローナル抗体を提供することにより、
上記本発明の課題が解決されることが驚くべきことに今
可能になった。

【００１５】非常に特定された抗原に対する抗体の供給
源としてのハイブリッド体細胞系（ハイブリドーマ）の
使用はケーラーおよびミルシュタインの研究〔７〕に由
来する。

【００１６】これに記載された方法により得ることがで
きる抗体は、通常の免疫感作動物の抗血清から得られた
ものとは全く異なる。

【００１７】ハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術
の原理は、２種の体細胞の融合から生じるハイブリッド
細胞が両方の親タイプの特徴を有するという観察に基づ
いている。

【００１８】モノクローナル抗体産生の場合には、特定
の抗体を合成する能力は、予め免疫感作された供与動物
から採取された免疫適格Ｂ細胞（通常脾臓細胞）に由来
し、一方、細胞が培養液中で連続的に分裂する能力は他
方の融合相手である腫瘍細胞系（しばしばミエローマ）
により付与される。

【００１９】これらのハイブリッド細胞系の各々は、抗
原に応答して動物により生体内で合成され得る多くの可
能な抗体の単一の代表種だけを提示する均一な免疫グロ
ブリンを合成する。

【００２０】各々の免疫グロブリン産生クローンは単一
型の抗体を特徴とするから、モノクローナル抗体という
用語が通常使用される。

【００２１】モノクローナル抗体のポリクローナル抗体
に対する利点を以下に示す： ａ）モノクローナル抗体は数多く、そして高純度で得ら
れる、 ｂ）モノクローナル抗体の調製は抗原反応性に関して均
一であり、経時的に変化しない、 ｃ）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそ
れらの特異性、すなわちそれによる特定のモノクローナ
ル抗体の産生能を失うことなく数年および数十年間貯蔵
できる、 ｄ）ポリクローナル抗血清は例えば以下の点：α）抗血
清を得るための免疫感作動物からの血液採取β）追加の
免疫感作のための材料の一定の入手可能性γ）供与動物
の限定された寿命 に関する広範囲の変動により悪影響を受けるから、モノ
クローナル抗体は標準試薬として使用するのにポリクロ
ーナル抗血清に比べより適当である。

【００２２】非常に多くの抗原に対して今調製されたモ
ノクローナル抗体は主として医学的治療において十分に
確立され、そしてもはやそれなしで済ますことはできな
い。

【００２３】本発明は、それ自体公知でありそして簡単
に上記したハイブリドーマ／モノクローナル抗体技術を
用いることにより、除草剤メトラクロルに対して高い特
異性および親和性を有し、そしてその高い特異性および
それから生じる構造的に関連した化合物との低い交差反
応性により、メトラクロルの迅速で信頼できる検出に対
するイムノアッセイにおける使用に極めて適していて、
そのために構造的に関連した化合物または不活性の中間
代謝物とメトラクロルとの区別にも使用され得るモノク
ローナル抗体を供給することに、今初めて成功した。

【００２４】本発明はメトラクロルに対する高い特異性
および親和性を有し、そして最もよく知られたメトラク
ロル類似体、特にアラクロルとは交差反応性を実質的に
示さないモノクローナル抗体およびその誘導体に主とし
て関する。

【００２５】メトラクロルに対する高い特異性および親
和性を有し、そして公知の構造的に関連する化合物とは
１０％未満、好ましくは２％未満、特に０．１％未満の
交差反応性を示すモノクローナル抗体およびその誘導体
が本発明の範囲内で特に好ましい。

【００２６】本発明の範囲内でモノクローナル抗体の誘
導体とは、例えば、メトラクロルの抗原決定基に対する
高い特異性および親和性を依然有する抗体断片、さらに
例えば放射性ヨウ素（１２５　Ｉ，　１３１Ｉ）、炭素
（１４Ｃ　　）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（　３Ｈ
）等で標識される放射標識モノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体とビオチンまたはアビジン、酵素例えば西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
マレートデヒドロゲナーゼまたはグルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼとの複合体、モノクローナル
抗体と生物発光剤（例えばルシフェラーゼ）、化学発光
剤（例えばアクリジンエステル）または蛍光剤（例えば
フィコビリタンパク質）との複合体を意味する。二重特
異性の、そしていわゆる交差結合抗体も同様に本発明に
包含される。ここに挙げた抗体の例は本発明を説明する
ためのものであり、これにより本発明の対象をなんら限
定しようとするものではない。

【００２７】「交差反応性を実質的に示さない」という
用語は本発明の範囲内ではメトラクロルに対して特異的
なモノクローナル抗体とその他の化合物、特に構造的に
関連した化合物の非特異的エピトープとの反応性が１０
％未満、好ましくは２％未満、そして特に０．１％未満
であることを意味することを意図する。

【００２８】％交差反応性は本発明の範囲内では以下の
関係により規定されるべきである：（５０％阻害のため
のメトラクロル濃度／５０％阻害のためのメトラクロル
類似体の濃度）×１００。

【００２９】５０％阻害は、例えば競合エリザアッセイ
（実施例８参照）によって決定され得る。この際にこの
値は担体結合抗原に結合する抗体の５０％阻害を導く抗
原濃度に相当する。

【００３０】本発明はまた、上で詳細に特徴づけられた
モノクローナル抗体を合成し、そして好ましくは周囲の
培地に分泌するハイブリドーマ細胞系にも関する。

【００３１】本発明は特に、メトラクロルに対する高い
特異性および親和性を有し、そして公知の構造的に関連
するメトラクロル類似体、とりわけアラクロルとは交差
反応性を実質的に示さないモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞系に関する。

【００３２】メトラクロルに対する高い特異性および親
和性を有し、そして公知の構造的に関連するメトラクロ
ル類似体とは１０％未満、好ましくは２％未満、特に０
．１％未満の交差反応性を示すモノクローナル抗体を合
成し、周囲の培地に分泌するハイブリドーマ細胞系が特
に好ましい。

【００３３】特に好ましいハイブリドーマ細胞系は、Ｅ
ＣＡＣＣ９００２　　１７０１の特徴を有する細胞系、
およびそれらのクローンおよびサブクローンである。

【００３４】自然に生じるか、または公知方法により人
工的に製造され得、そして出発物の特性を依然有する、
すなわち本発明に係る抗体またはそれらの誘導体を産生
し、そして周囲の培地中に分泌することが依然としてで
きる、上で詳細に特徴づけられたハイブリドーマ細胞系
の変種および突然変異体も同様に本発明に包含される。

【００３５】上記ハイブリドーマ細胞系を調製する方法
および上記モノクローナル抗体を産生する方法も本発明
により同様に包含される。

【００３６】ハイブリドーマ細胞系のクローンおよびサ
ブクローンは、最初のクローンからの反復クローニング
から生じ、そして本発明に必須である最初のクローンの
特徴を依然有するハイブリドーマを意味する。

【００３７】本発明は、本発明に係るモノクローナル抗
体を用いることによる、例えば土壌、水または空気の試
料中および生体物質例えば植物または動物抽出物中のメ
トラクロルの免疫学的検出方法にも関する。

【００３８】これに関して、直接または間接イムノアッ
セイとして使用され得る競合エリザが特に好ましい。

【００３９】同様に、本発明の一部は、使用のために調
整されており、試薬として本発明に係るモノクローナル
抗体を少なくとも１種含有し、そしてメトラクロルの迅
速で信頼できる検出のために野外条件下での使用に適し
ている試験キットの形態にあるメトラクロルの定性およ
び定量分析のための手段である。

【００４０】本発明に係るモノクローナル抗体はそれ自
体公知の方法により調製され、ケーラーおよびミルシュ
タインにより開発された方法〔７〕に本質的に基づいて
いる。

【００４１】分析されるべき、そしてそれに対する抗体
が開発されるべきである標的物質メトラクロルは比較的
小さく、そしてそれを実験動物に投与した後に適当な免
疫応答を誘導することができない単純な分子であるから
、実際の免疫感作の前に予備手段を施すことが最初に必
要である。

【００４２】この種の化合物は、それらの大きさと単純
な構造のために免疫学的反応を誘導できず、ハプテンま
たは不完全抗原と呼ばれ、それ故に抗原として作用し、
そして免疫応答を誘導し得る完全抗原（＝免疫原）と対
比される。この種のハプテン分子は、それらの特性を完
全抗原の特性にする高分子化合物（担体分子）と複合さ
れ得、その時ハプテン分子は免疫応答を誘導する能力を
有する。

【００４３】免疫感作反応の間に形成される抗体のいく
つかは、ハプテン分子がそれ自体の上にあるか、または
担体分子に結合されたままであるかにかかわらず、次に
ハプテン分子上の特定のエピトープと反応し得る。

【００４４】以下に頻繁に使用されるハプテンという用
語は本発明の範囲内で、免疫感作に使用されるメトラク
ロル分子を主として意味することを意図する。

【００４５】従って、本発明の範囲内で、ハプテンとし
て作用するメトラクロルは免疫感作の前に、該メトラク
ロルに完全抗原活性を付与するのに適当な高分子担体に
結合される。

【００４６】本発明の範囲内で適当な担体分子は主とし
て、ハプテンとのカップリング反応に自由に利用され、
そして該ハプテンに結合することによりそれに免疫原性
を付与するか、または既に存在するそれらの免疫原性を
高め得る反応基を有する巨大分子化合物である。

【００４７】自由に利用可能な反応性アミノ基を含む巨
大分子化合物が本発明の範囲内で特に好ましい。

【００４８】分子量が１００００と１５０００００の間
のリシンに富むタンパク質、例えば市販のものが入手さ
れ得、それ故にあらゆる所望量で利用できるウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：分子量６６２００）、ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ：分子量５８０００）、またはキーホー
ルカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ：分子量＞１００００
００）が本発明に係る使用に適した担体分子として特に
好ましい。

【００４９】その他の巨大分子化合物が上記の要求に合
致しさえすれば、それらを担体分子として使用すること
は本発明の範囲内でもちろん可能であり、そのような化
合物には例えばブタチログロブリン、Ｂ２ミクログロブ
リン、ヘモシアニン、免疫グロブリン、毒素（コレラ毒
素、破傷風毒素、ジフテリア毒素その他）、多糖、リポ
多糖、天然または合成ポリアデニル酸およびポリウリジ
ル酸、ポリアラニルおよびポリリシンポリペプチド、ま
たは細胞膜成分例えばホルマリンまたはグルタルアルデ
ヒド処理赤血球細胞膜がある。

【００５０】例えば、エイチ．カワムラおよびジェイ．
エイ．ベルゾフスキーにより記載された方法〔５〕に従
ってウサギからのマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する精製
またはＩｇＧ画分も同様に本発明に係る方法において担
体分子として使用するのに適当である。

【００５１】担体分子に対するハプテンの複合は直接、
または好ましくは適当である場合にハプテン分子に最初
に付着される架橋成分を介して行われ得る。

【００５２】分析すべき物質は、標的物質の関連構造成
分が自由に利用可能のままであり、そしてそれ故に特異
的な免疫応答を誘導し得る、すなわち特異的な抗体の産
生を誘導するように、この目的のために担体分子に結合
されなければならない。

【００５３】ハプテン（メトラクロル）の担体分子への
複合のための架橋成分として主に適当である化合物は、
担体分子の自由に利用可能な反応基と相互作用し得る少
なくとも１種または数種の反応基を含むものである。

【００５４】反応基として１個またはそれ以上の反応基
例えばアミノ基、カルボキシル基またはＳＨ基を有する
３個と１０個の間の架橋性炭素原子を含む架橋成分を使
用することが本発明の範囲内で特に好ましい。これらの
反応基はそれ自体公知の方法によりハプテンおよび担体
の反応基と反応してハプテン−担体複合体を形成し得る
。

【００５５】例えば、架橋成分は反応性アミノ基を介し
てジアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）により担
体分子の遊離アミノ基の一つに結合することも可能であ
る。

【００５６】架橋成分が反応性ＳＨ基を有する場合、ハ
プテンの担体分子への複合は担体上の遊離ＳＨ基と酸化
により行われ得る。

【００５７】担体分子の遊離アミノ基に水結合性剤、例
えばカルボジイミド、好ましくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドによって連結され得るカルボキシ
ル基を有する架橋成分を使用することが本発明の範囲内
で特に好ましい。

【００５８】抗原を担体タンパク質にカップリングする
ために、このカップリングし得るメトラクロル誘導体を
製造することがまず必要である。

【００５９】本発明の範囲内で使用され得るメトラクロ
ル誘導体は特に次式Ｉ（化５）：

【化５】 （式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ２　またはＳＨを表すが、
しかし特にＣＯＯＨを表し、そしてｎは１ないし１０、
好ましくは１ないし６の整数を表す）で表され、メトラ
クロルのアミノ官能基に対して４位にＲ−（ＣＨ２　）
ｎ　−Ｏ−基を有する化合物である。

【００６０】担体分子にカップリングし得る式Ｉで表さ
れるメトラクロル誘導体は次式ＩＩ（化６）：

【化６】 （式中、Ｒおよびｎは式Ｉに示したものと同じ意味を表
す）で表される化合物を、好ましくは温和な条件下−１
０℃ないし＋３０℃の温度で、反応に不活性である溶媒
中で好都合にＮ−アシル化し得るクロロ酢酸誘導体での
Ｎ−アシル化により製造され得る。

【００６１】適当なＮ−アシル化剤は、反応性クロロ酢
酸誘導体、特に酸ハロゲン化物（例えばクロロアセチル
クロリドおよびブロミド）、エステルおよび無水物であ
る。適当なバインダーにより遊離された酸を集めること
はこの反応において有利である。例えば、有機塩基例え
ばトリアルキルアミン（トリメチルアミン、トリエチル
アミン等）、ピリジンおよびピリミジン塩基または無機
塩基例えばアルカリ金属およびアルカリ土類金属のオキ
シド、ヒドロキシド（例えばＮａＯＨまたはＫＯＨ）、
ビカーボネート、カーボネートまたはヒドリドが適当で
ある。２当量の結合剤（式Ｉで表される化合物に基づい
て）の存在下で反応を行うのが有利である。この目的に
使用され得る触媒は４−ジアルキルアミノピリジンであ
る。

【００６２】式ＩＩで表される化合物は下に模式的に示
したＮ−クロロアセチル−Ｎ−（１−メチル−２−メト
キシエチル）−２−メチル−４−（４’−ヒドロキシカ
ルボニルブトキシ）−６−エチルアニリンの製法と同様
に製造される。

【００６３】担体分子へのカップリングに適したメトラ
クロル誘導体の好ましい例は、下に詳細に記載されてい
るような３−エチル−４−ニトロソ−５−メチルフェノ
ールから出発して６段階で製造され得るＮ−クロロアセ
チル−Ｎ−（１−メチル−２−メトキシエチル）−２−
メチル−４−（４’−ヒドロキシカルボニルブトキシ）
−６−エチルアニリンである。最初のフェノールは公知
であるか、または類似の構造の公知のフェノールと同様
に製造され得る。

【００６４】カップリングし得る生成するメトラクロル
誘導体は新規であり、そしてこの特異的なカップリング
能のために、メトラクロルに対する特異性を有するモノ
クローナル抗体の製造のための貴重な出発材料であるこ
とを示している。それ故にこの誘導体は本発明の重要な
一部である。

【００６５】実際のカップリング反応は活性エステル法
を用いて行われるのが好ましい。これは適当な溶媒中で
最初に可溶化されるメトラクロル誘導体を必要とする。 低い蒸発率を有する非プロトン性溶媒、例えばＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）が特に適当である。

【００６６】予め可溶化されたメトラクロル誘導体を例
えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシス
ルホスクシンイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカル
ボジイミドもしくはＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾー
ルまたはこれら化合物の誘導体と反応させることにより
、カルボキシル基は活性エステルに引き続いて誘導され
る。

【００６７】活性エステルを次に反応混合物から取り出
し、そしてＢＳＡまたはＫＬＨに添加する。０．１ない
し１２時間、好ましくは３ないし５時間保温した後、沈
殿を除去する。上澄みは次いで、適当である場合にさら
に精製段階を挿入した後、実際の免疫感作反応に使用さ
れ得る。

【００６８】本発明の範囲内で好ましい活性エステル法
の他に、ハプテンの担体分子へのカップリングのための
その他の方法、例えば混合無水物法を用いることも可能
である。これは無水酢酸またはカルボジイミド誘導体１
−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドの使用により担体分子に連結される架橋成分
のカルボキシル基を必要とする。

【００６９】供与動物は、高分子量の担体分子と結合し
ているハプテンを１回またはそれ以上の投与により免疫
感作される。２ないし３回の免疫感作が特に好ましく、
７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で行われる
。

【００７０】静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行われ得
る注射が本発明の範囲内での好ましい投与形態である。 皮下注射と腹膜腔内注射との組合せが好ましい。この場
合に抗原（メトラクロル複合体）は適当な緩衝液、例え
ば慣用のアジュバントの１種を含有するＰＢＳ緩衝液中
に存在する。フロイントのアジュバントを使用すること
が本発明の範囲内で特に好ましい。

【００７１】０．５ないし４ヵ月間処置せずに放置した
後、１００μｇないし１０００μｇの投与量でもう１回
の投与が行われる。

【００７２】最後の投与の１ないし６日後に供与動物は
殺され、そして脾臓細胞懸濁液が調製される。

【００７３】これは、適当な緩衝液（例えばＢＳＳ緩衝
液）中に懸濁され、そしてそれらが適当なミエローマ細
胞と融合されるまで細胞懸濁液の形態で保存される単離
された脾臓細胞であることを必要とする。

【００７４】これらの融合は、ミエローマ細胞系もまた
モノクローナル抗体を合成し、結果としてハイブリッド
は２種のモノクローナル抗体、１つはミエローマ細胞に
由来し、第２は免疫適格細胞の遺伝情報により決定され
る、という事実により最初は複雑だった。

【００７５】従って、本発明の範囲内で好ましく使用さ
れる腫瘍細胞はそれ自体モノクローナル抗体を産生でき
ないもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４〔１３〕または
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３であり、これらは生成する融合
物の分析を極めて単純にする。脾臓細胞がミエローマ細
胞に対して２ないし２０倍過剰に存在するならば融合の
成功のために有利である。

【００７６】脾臓細胞とミエローマ細胞との融合は意図
される細胞融合に最適である条件を提示する組成を有す
る特別な融合培地中で行われる。

【００７７】該融合培地は、細胞を融合するために慣用
の融合促進剤の一つ、例えば適当である場合には紫外線
不活性の形態にあるセンダイウイルスまたはその他のパ
ラミクソウイルス、カルシウムイオン、表面活性脂質例
えばリゾレシチン、またはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）特に平均分子量６００ないし６０００で濃度が３
０％ないし６０％のＰＥＧを含有する緩衝液が好ましい
。４０％ないし５０％のＰＥＧ濃度が特に好ましい。 最適融合温度は１８℃と３９℃の間である。３７℃の温
度が特に好ましい。

【００７８】免疫適格脾臓細胞とミエローマ細胞との融
合の後、融合された抗体産生ハイブリッド細胞はそれ自
体公知の方法により選択される。融合が成功したもの（
ハイブリッド細胞）を２種の親細胞から選択するための
種々の手段が存在する。１００万またはそれ以上の各親
細胞が融合プロトコルにおいて通常使用されている。 融合率が１００％でないから、大過剰の未融合または自
己融合細胞から融合物を分離することは困難な仕事であ
るかもしれない。

【００７９】上記したように、ハイブリドーマ細胞は短
寿命の抗体産生（脾臓）Ｂ細胞と長寿命のミエローマ細
胞の融合により製造される。必要な結果は抗体を産生す
る長寿命の細胞系である。脾臓細胞は培養液中では限ら
れた寿命を有するから、未融合または自己融合脾臓細胞
が死滅するまでただ待つことは原理的には可能である。 しかしながら、この後に、抗体を産生しない長寿命の細
胞から長寿命の抗体産生細胞を分離する仕事が残ってい
る。

【００８０】通常の選択系は酵素ヒポキサンチン−グア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）
が利用可能かまたは利用不可能かに基づいている。この
酵素は哺乳類細胞中のプリン再利用経路の構成要素であ
る。これらの細胞はまたさらにプリンを生体内で合成す
ることができる。

【００８１】通常の環境中ではおそらく両方の合成経路
はある範囲まで平行に作用する。しかしながら、細胞が
ＨＧＰＲＴを有しない場合、再利用経路はブロックされ
、そしてプリンは非プリン物質から製造されなければな
らない。プリンであるグアニンに非常に類似の構造を有
し、それ故にいくつかの通常の反応においてプリンを代
替する８−アザグアニンのようないわゆるプリン抗代謝
物質が、ＨＧＰＲＴ陰性のミエローマ細胞の選択のため
に一般に使用される。

【００８２】アザグアニンがＤＮＡ中に取り込まれると
、それは通常の成長反応に関与し、最終的に細胞の死を
導く。アザグアニンは再利用経路を介して置換されなけ
ればならないから、ＨＧＰＲＴ活性を有しないそれら全
ての細胞はアザグアニンを利用することができず、それ
故にその存在下で成長する。

【００８３】同じ酵素に作用するが、しかし反対の徴候
を示す選択系はジェイ．ダブリュ．リトルフィールドに
より報告されている

〔９〕が、この場合にはＨＧＰＲＴ
陽性細胞が選択される。

【００８４】この選択系は、特にヒポキサンチン、アミ
ノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を構成要素と
して含有するいわゆるＨＡＴ培地の使用に基づいている
。アミノプテリンは生体内でのプリン合成ならびにデオ
キシウリジレートのチミジレートへのメチル化を阻害す
る抗代謝物質である。ヒポキサンチンはアミノプテリン
が生体内でのプリン合成を阻害し、一方でチミジンが不
要なデオキシウリジレートのメチル化を行う場合におけ
る別のプリンとして作用し得る。従って、アミノプテリ
ンの存在下では全てのＨＧＰＲＴ陽性細胞が増殖し、一
方ＨＧＰＲＴ陰性細胞が死滅するであろう。

【００８５】本発明の範囲内での選択のために使用され
るハイブリッド系において、ミエローマ細胞はアザグア
ニンに対して耐性であり、アミノプテリンに対して感受
性である、すなわちそれらがＨＧＰＲＴ陰性であること
が好ましい。抗体産生細胞はこれに対してＨＧＰＲＴ陽
性である。

【００８６】細胞の融合およびＨＡＴ培地中での培養に
より、増殖に関与するミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ活性
の存在下でのみ成長し、そしてこの活性はＨＧＰＲＴ陽
性細胞系により提供されるはずであるから、成功裏に融
合した細胞を選択することは可能である。

【００８７】ＨＧＰＲＴ陽性抗体産生細胞系がこの培地
中で死滅しないことは真実である。しかしながら、それ
らはある一定の期間だけ生き残り、そして増殖すること
ができない。

【００８８】ＨＡＴ培地中での細胞の融合は、ミエロー
マ細胞と抗体産生細胞とはハイブリッド細胞の製造に十
分である期間成長することができるが、ハイブリッド細
胞だけが生き残り、そして増殖し得る系を提供する。

【００８９】本発明の特定の実施態様において、融合さ
れたハイブリッド細胞は、未処理の非免疫感作実験動物
の腹膜から予め単離されたマクロファージ、いわゆる食
細胞の存在下で培養される。融合されたハイブリッド細
胞の培養および選択のために、細胞懸濁液は少量ずつい
くつかに分けられ、そして個々の部分がハイブリッド細
胞培養物の開発および抗体の産生のために連続的に調べ
られる。

【００９０】ミクロタイタープレート上で融合ハイブリ
ッド細胞を培養することが本発明の範囲内で特に好まし
い。

【００９１】これは、ミクロタイタープレートの個々の
ウエルにわたり分配され、そして融合ハイブリッド細胞
の成長を促進する適当な条件下（例えばＨＡＴ／ＨＴ培
地）で７ないし３０日の期間培養される融合の後に得ら
れる細胞懸濁液を必要とする。成長したハイブリッド培
養物の上澄みは抗体の産生を連続的に調べる。

【００９２】陽性ハイブリッド細胞培養物は次に公知の
方法、好ましくは限界希釈法を用いて選び出され、そし
て引続き適当な培養培地中でクローン化される。成長し
た細胞クローンからの上澄みも同様に抗体の産生を調べ
る。

【００９３】上記のように製造された本発明に係るハイ
ブリドーマ細胞クローンは、好ましくはこの目的のため
に慣用のイムノアッセイの一つ、例えば酵素結合イムノ
アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて適当なモ
ノクローナル抗体の産生に対してスクリーニングされる
。

【００９４】酵素結合イムノアッセイにおいて、上に詳
細に特徴づけたハプテン複合体をまず固体支持材に吸着
させる。担体分子を添加することにより残りの遊離結合
部位を次に飽和させ、それによりブロックする。

【００９５】モノクローナル抗体を検出するために、上
記ハイブリドーマ細胞クローンの上澄みの一部を担体結
合ハプテン複合体と保温する。

【００９６】本発明はさらに、本発明に係る抗体を合成
しそして周囲の培地中に分泌する上で詳細に特徴づけら
れた本発明に係るハイブリドーマ細胞系またはそれらの
クローンもしくはサブクローンが公知の方法により試験
管内または生体内で培養されることを特徴とする、それ
自体公知の方法を用いることによるモノクローナル抗体
の製造に関する。

【００９７】本発明に係るハイブリドーマ細胞の試験管
内培養は適当な培養培地、特に慣用の標準化培養培地例
えば適当である場合には哺乳類の血清、例えばウシ胎児
血清の添加、成長促進添加剤または微量成分により補足
されてもよいダルベッコの変形イーグル培地（ＤＭＥＭ
）またはＲＰＭＩ１６４０培地中で行われる。

【００９８】モノクローナル抗体の単離はハイブリドー
マ培養液の特定の上澄みからの免疫グロブリン画分の、
例えば硫酸アンモニウムを用いることによる沈殿で始め
るのが好ましい。次いで仕上げ、および当業者には公知
であり、例えばクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過
、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース
クロマトグラフィー、プロテインＡまたはイムノアフィ
ニティクロマトグラフィーの使用を包含する精製段階を
行う。

【００９９】しかしながら、生体内法を用いて本発明に
係るモノクローナル抗体を大量に得ることをまた可能で
ある。

【０１００】従って、例えば、抗体産生ハイブリドーマ
細胞クローンを適当な哺乳類に注射することが可能であ
るが、これは処置動物中に抗体産生腫瘍の進展を誘導す
る。１ないし３週間の後、抗体はこの方法で処置された
動物の体液から単離され得る。

【０１０１】本発明の特定の実施態様において、適当で
ある場合には炭化水素例えばプリスタンで前処理された
メスのＢａｌｂ／ｃマウスが本発明に係るハイブリドー
マ細胞クローンの腹膜腔内注射を受容する。ハイブリド
ーマ細胞クローンの注射の１なしい３週間後、腹水を集
め、そしてさらに処理するまで保存する。

【０１０２】試験管内で培養されたハイブリドーマの上
澄みからの上記単離と同様の方法でモノクローナル抗体
を単離する。

【０１０３】本発明はさらに、メトラクロルを検出する
、および構造的に関連する化合物、特に土壌、空気また
は水の試料中および適当である場合には植物またはその
他の生体材料中のメトラクロル類似体アラクロルとメト
ラクロルを識別するための通常のイムノアッセイの一つ
に本発明に係る抗体を使用することに関する。

【０１０４】本発明に係るモノクローナル抗体は従って
、抗原と相当するモノクローナル抗体との特異的結合に
基づいた全ての公知イムノアッセイ、例えばラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（エリ
ザ）、免疫蛍光試験その他に使用され得る。

【０１０５】本発明に係るモノクローナル抗体はＲＩＡ
試験における放射標識誘導体の形態で使用され得る。こ
れに関連して、本発明の範囲内に関する標的物質を検出
するためのＲＩＡ試験のこれまで公知の全ての変形、例
えば均質または固相でのＲＩＡ試験および抗原の直接ま
たは間接（競合）検出を伴う単一または二重（サンドイ
ッチ）ＲＩＡ試験を使用することも可能である。同様の
ことが酵素結合イムノアッセイの使用にも当てはまる。

【０１０６】メトラクロルを検出するための競合イムノ
アッセイにおいて本発明に係るモノクローナル抗体を使
用することは本発明の範囲内で好ましい。

【０１０７】競合イムノアッセイの原理は標識抗原また
は固体支持材に結合される抗原と、抗体分子上の関連結
合部位のための遊離抗原との競合に基づいている。

【０１０８】検出はこの競合イムノアッセイを行うため
の２つの可能性の間で原理的になされる：ａ）第１の方
法は固体支持材に結合される抗原と標識が施されている
抗体上での遊離結合部位への遊離抗原との競合に基づい
ている。これに関連して、固体支持材への抗原の結合は
直接、または担体分子を介して起こり得る。この場合、
遊離抗原の濃度は支持材上に固定された抗原に結合され
る標識抗体中での減少を通じて決定される。この減少は
試料中に含まれていた遊離抗原の量に比例する。ｂ）別
の方法は遊離および標識抗原は、ある場合には固体支持
材に結合される抗体上の関連結合部位に対して互いに競
合するという事実に基づいている。抗原の濃度は、遊離
抗原の濃度の関数として変化する標識抗原中の減少を通
じて決定される。

【０１０９】抗原または抗体の結合に適当である固体支
持材の例はミクロタイタープレートまたは試験管のプラ
スチック表面、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩
化ビニル、ガラスまたはプラスチック等からなるビーズ
表面、濾紙、デキストラン、セルロースもしくはニトロ
セルロースまたはその他の類似の材料の細片の表面であ
る。最後に記載した細片の表面は、単純吸着等により生
じる支持材への結合が可能である、本発明に係るモノク
ローナル抗体の一種で、または抗原で被覆され、そして
適当である場合にはこの被覆操作は予め例えばグルタル
アルデヒドまたは臭化シアンでの支持材の活性化を行っ
た後に行う。

【０１１０】酵素結合イムノアッセイ（エリザ；酵素結
合イムノソルベントアッセイ）において本発明に係るモ
ノクローナル抗体を使用することが本発明の範囲内で特
に好ましい。これは、そのまま、または酵素結合誘導体
の形態で使用される本発明に係るモノクローナル抗体を
必要とする。

【０１１１】エリザアッセイは本発明に係る抗体の酵素
結合誘導体またはその他のそれ自体公知でありそして本
発明に係る抗体のエピトープを認識し結合する酵素結合
抗体の使用のいずれかに基づいている。

【０１１２】支持材の一つが抗原、特にハプテンと高分
子担体分子例えばＢＳＡまたはＫＬＨとの複合体で上記
のようにまず被覆される間接エリザアッセイを用いるこ
とが本発明の範囲内で特に好ましい。複合体の濃度は１
０ｎｇ／μｌ（緩衝液）ないし２００ｎｇ／μｌ（緩衝
液）、好ましくは３０ｎｇ／μｌないし１００ｎｇ／μ
ｌ（緩衝液）、特に４０ｎｇ／μｌないし６０ｎｇ／μ
ｌ（緩衝液）が本発明の範囲内で好ましい。

【０１１３】担体結合抗原は次に、検出すべき抗原およ
び本発明に係る抗体の一種を含有する試験溶液と保温さ
れる。検出すべき抗原はこの際に遊離の形態で、または
水もしくは土壌の試料の構成成分として存在し得る。

【０１１４】１０分ないし２時間の保温時間の後に、完
全混合物は、本発明に係るモノクローナル抗体を認識し
、そして結合する酵素標識抗体と保温される。この種の
酵素標識抗体の一例はホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツジ
免疫グロブリン、または相当するヤギ抗マウス抗体であ
り、両方とも市販されている。

【０１１５】結合された抗体タンパク質の量は酵素−基
質反応、例えば分光法を用いて決定される。

【０１１６】上記の支持材の一つに結合した抗体に対す
る標識および遊離抗原の競合に基づいた直接エリザ試験
も同様に本発明の範囲内で好ましい。

【０１１７】抗原は免疫学的診断に慣用の標識を用いる
公知方法により標識され得る。検出すべき抗原に結合さ
れる酵素標識例えばアルカリホスファターゼの使用が本
発明の範囲内で好ましい。

【０１１８】特定の試料中に存在する抗原の比率は標識
抗原における減少に基づいて非常に簡単に決定され得る
。この減少は試料中に含有される遊離抗原の量が多い程
多い。

【０１１９】本発明はさらに、本発明に係るモノクロー
ナル抗体および／またはそれらの誘導体の他に、適当で
ある場合にはさらにその他のモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体、特に標識モノクローナルまたはポリク
ローナル抗体、およびその他の添加剤を含有し得る試験
キットの形態にあるメトラクロルの定性および定量試験
のための手段に関する。

【０１２０】ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノア
ッセイおよび化学発光アッセイからなる群から選択され
る慣用のイムノアッセイの一つに基づいた試験キットが
本発明の範囲内で特に好ましい。本発明の範囲内で特に
好ましい試験キットはメトラクロルの検出が競合イムノ
アッセイ、特に酵素結合直接または間接イムノアッセイ
（エリザ）に基づいたものである。

【０１２１】メトラクロルの放射免疫学的検出のための
試験キットは、例えば以下の構成成分を含有し得る：（
ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体の
一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当な
支持材、 （ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／またはそれらの
放射標識誘導体または放射標識抗原の適当な場合には凍
結乾燥または濃縮された溶液または抗原の標準化溶液、
（ｃ）緩衝液、 （ｄ）適当である場合には、例えば非特異的吸着および
凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面活性剤およ
びその他の添加剤、および （ｅ）ピペット、反応容器、計算プロット、バッケージ
挿入物その他。

【０１２２】酵素結合イムノアッセイ（エリザ）に基づ
いたメトラクロルの免疫学的検出のための試験キットは
、例えば以下の構成成分を含有し得る：（ａ）被覆され
ていなくても、または本発明に係る抗体の一つもしくは
抗原複合体で被覆されていてもよい適当な支持材、 （ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび／または決定すべ
き抗原に対して反応するか、または抗原を認識する抗体
に対して反応する第２の酵素標識モノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の適当な場合には凍結乾燥または濃
縮された溶液、 （ｃ）固体または溶解した形態の酵素基質、（ｄ）抗原
または抗原の標準化溶液、 （ｅ）緩衝液、 （ｆ）適当である場合には、例えば非特異的吸着および
凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面活性剤およ
びその他の添加剤、および （ｇ）ピペット、反応容器、計算プロット、カラーテー
ブル、バッケージ挿入物その他。

【０１２３】化学発光試験に基づいたメトラクロルの検
出のための試験キットは、例えば以下の構成成分を含有
し得る： （ａ）被覆されていなくても、または本発明に係る抗体
の一つもしくは抗原複合体で被覆されていてもよい適当
な支持材、 （ｂ）本発明に係る抗体の一つおよび本発明に係る第１
の抗体を認識し得そして化学発光標識に結合される第２
のポリクローナル抗体の適当な場合には凍結乾燥または
濃縮された溶液、 （ｃ）光放射を誘導する成分、例えばＨ２　Ｏ２　また
はＮａＯＨを含有する溶液、 （ｄ）緩衝液、 （ｅ）適当である場合には、例えば非特異的吸着および
凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面活性剤およ
びその他の添加剤、および （ｆ）ピペット、反応容器、バッケージ挿入物その他。

【０１２４】本発明の範囲内で使用され得る支持材は、
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエ
ステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロース、架橋デキストラン
、フッ化樹脂、アガロース、架橋アガロース、多糖その
他からなる群から選択される不溶性ポリマー材料から主
として構成される。しかしながら、これらの他に、例え
ばガラス、ナイロンベースネット繊維その他も使用し得
る。

【０１２５】上記の特定の支持材は非常に広範囲のデザ
インを有し、そして使用の特に意図された特定の目的に
応じて非常に異なる形状を有し得る。それらは例えば皿
、球、プレート、ロッド、セル、バイアル、チューブ、
ファイバー、ネットその他からなる。

【０１２６】被覆されていなくても、または本発明に係
る抗体の一つ、遊離抗原もしくは抗原複合体で被覆され
ていてもよい透明プラスチック材料、例えばポリ塩化ビ
ニルまたはポリスチレンからなるミクロタイタープレー
トが試験キットを製造するために頻繁に使用される。ポ
リスチレンおよびポリスチレンラテックス（この場合に
は周囲のラテックス材料は遠心分離によりポリスチレン
粒子から分離されてもよい）のビーズ、チューブまたは
ロッドもまた使用され得る。

【０１２７】本発明に係る試験キットのもう一つの成分
は、複合体形成性反応、特に免疫学的反応の存在の検出
を可能にする、好ましくは抗原抗体複合体またはリガン
ドレセプター複合体を生じ、その場合に適当であるなら
ば定性情報の他に定量情報が検出されるべき抗原につい
て得られるであろう標識またはインジケータからなる。 適当な標識またはインジケータは、検出可能な信号を直
接または間接的に生じ得る単一の原子および分子である
。これらの標識またはインジケータは検出すべき抗原ま
たは本発明に係るモノクローナル抗体に直接結合してい
るか、または後者のモノクローナル抗体に包含されてい
てもよい。しかしながら、それらは単一物質の形態であ
っても、またはそれ自体検出すべき抗原でも本発明に係
るモノクローナル抗体の一つでもないがレセプター分子
と反応できる分離した化合物の成分の形態、例えば複合
体形成物であってもよい。

【０１２８】これらの分離化合物は好ましくは、ストレ
プトコッカス・アウレウスプロテインＡその他の補体タ
ンパク質またはそれらの断片に由来するモノクローナル
およびポリクローナルであり得る第２の抗体分子の形態
を採る。これらの分離化合物はレセプター分子、例えば
検出すべき抗原または本発明に係るモノクローナル抗体
の一つ、特に複合体の形態で存在するレセプター分子を
特異的に認識し、結合する。多くの場合において、次い
で標識と協調してのみ検出可能な信号を導くさらに別の
試薬に対する要求がある。このことは、酵素が含まれる
ときに特に当てはまる。

【０１２９】本発明の範囲内で使用され得る標識または
インジケータは、免疫学および免疫化学の分野の熟練者
には非常によく知られている。それらは、例えば放射性
標識元素もしくは物質、酵素または化学発光物質からな
る。可能な標識またはインジケータの以下のリストは、
実施例により使用され得る広範囲の物質および試薬を説
明するためのものであり、これにより本発明の対象物質
を制限するものではない。

【０１３０】適当な標識またはインジケータの例は放射
性元素の群の中に見出され得る。これに関連する特に好
ましい元素はそれ自体γ線を放射するもの、例えば１２
４　Ｉ、１２５　Ｉ、１２８　Ｉ、　１３２Ｉまたは５
１Ｃｒ、これらの線の放射を誘導するもの、例えば１１
Ｃ、１８Ｆまたは、１３Ｎである。いわゆるβ放射体、
例えば　１１１Ｉｎ、１４Ｃおよび　３Ｈも同様に適当
である。

【０１３１】その他の適当な標識は、化学的手段により
非常に簡単に抗原に、または抗原を変性させることなく
抗体に連結され得る、化学発光物質、特に蛍光物質から
なる。生成するフルオロクロムは蛍光定量法を用いて容
易に検出され得る。フルオレセインイソシアネート、フ
ルオレセインイソチオシアネート、５−ジメチルアミノ
−１−ナフタレンスルホニルクロリド、テトラメチルロ
ーダミンイソチオシアネート、リザミン、ローダミン８
２００スルホニルクロリドその他がこの点において特記
する価値がある。

【０１３２】その他の蛍光剤および分析技術の記載は、
デルカ（ＤｅＬｕｃａ）編『免疫蛍光分析』（Ｉｍｍｕ
ｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　
ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉ
ｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｌｔｄ．）　刊（１９８２年
）の第１８９−２３１頁の「道具としての抗体」マルシ
ャロニス等に見出される。

【０１３３】標識用またはインジケータ物質として酵素
を使用することは本発明の範囲内で特に好ましい。例え
ば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、炭酸デヒドラターゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、グル
コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等である。 酵素が標識用物質として使用される場合、酵素活性を通
して続けられる免疫複合体の形成を可能にする追加の試
薬、および適当である場合には酵素反応が停止され得る
停止試薬を添加することが必要である。

【０１３４】呈色反応を生じる試薬が本発明の範囲内で
特に好ましい。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合には
、この点に関して記載され得る例は過酸化水素であり、
これは追加の酸化された顔料前駆体例えばジアミノベン
ジジンまたはｏ−フェニレンジアミンと組み合わさって
褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼが標
識用物質として使用される場合、例えば２，２’−アジ
ド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）（ＡＢＴＳ）を基質として使用することができる。

【０１３５】本発明はさらに、メトラクロルの迅速で効
率的な定性および／または定量分析のために、およびメ
トラクロルを最もよく知られた構造的に関連する化合物
、特にメトラクロル類似体アラクロルと識別するために
、試薬として本発明に係るモノクローナル抗体少なくと
も１種を含む試験キットの使用に関する。

【０１３６】

【実施例】次に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。Ｉ．実験操作実施例１：メトラクロル誘導体の合成１
．１：担体タンパク質にカップリングし得るＮ−クロロ
アセチル−Ｎ−（１−メチル−２−メトキシエチル）−
２−メチル−４−（４’−ヒドロキシカルボニルブトキ
シ）−６−エチルアニリンの製造段階１：３−エチル−
４−ニトロソ−５−メチルフェノールの製造３−エチル
−５−メチルフェノール１０２ｇ（７４９ミリモル）を
エタノール６００ｍｌ中に導入する。激しく攪拌しなが
ら濃塩酸６００ｍｌを滴下し、冷却することにより反応
容器を室温に保つ。反応混合物を次に０℃まで冷却する
。この温度で脱イオン水７８ｍｌ中の亜硝酸ナトリウム
７７．５ｇ（１１２３．５ミリモル）を滴下する。生成
する混合物を次に５℃で２時間攪拌し、そして次に氷水
３リットル中に注ぐ。この時表題化合物が晶出する。 それを濾別し、氷水で数回洗浄し、そしてメタノールか
ら再結晶させる。収量８８．７ｇ（理論値の７１．８％
）；融点１３８℃（分解）。

【０１３７】段階２：３−エチル−４−アミノ−５−メ
チルフェノールの製造段階１で製造した３−エチル−４
−ニトロソ−５−メチルフェノール８８．７ｇ（５３７
．６ミリモル）をテトラヒドロン（ＴＨＦ）１リットル
中、２０−２５℃で５バールの下で水素分子により接触
水素添加する。活性炭上の５％パラジウム（Ｐｄ−Ｃ）
１０ｇを触媒として使用する。水素取込みは理論値の７
７％である。触媒を濾別し、濾液を蒸発させ、そして残
渣をメタノールから再結晶させる。収量５１．２ｇ（理
論値の６３．２％）；融点１６７−１７０℃。

【０１３８】段階３：２−メチル−４−（４’−エトキ
シカルボニルブトキシ）−６−エチルアニリンの製造ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５００ｍｌを室温で導
入し、そして激しく攪拌しながら段階２で製造した３−
エチル−４−アミノ−５−メチルフェノール５２．１ｇ
（３３８．６ミリモル）を少量ずつ添加する。混合物を
１５℃まで冷却する。次いで強度８５％の水酸化カリウ
ム水溶液３３．５ｇ（５０７．９ミリモル）を反応温度
が２０℃を越えないように滴下する。次にエチル−５−
ブロモバレレート８２．７ｍｌ（５０７．９ミリモル）
を２５℃の反応温度に維持しながら７０分間かけて滴下
する。均質な溶液形成後、それを４Ｍ塩酸１３０ｍｌと
氷の混合物に添加し、そして十分に攪拌する。水性混合
物をジエチルエーテルで洗浄する。水相を次に２Ｍ　　
ＮａＯＨでアルカリ性にし、そしてジエチルエーテルで
抽出し、そしてエーテル相を水で２回洗浄し、次に飽和
塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして濃縮
する。粘性の油状物６７．５ｇを得、そして真空蒸留に
より精製する。収量３１．７ｇ（理論値の３３．７％）
；沸点１５１−１５２℃／１０−２トール。

【０１３９】段階４：Ｎ−（１−メチル−２−メトキシ
エチル）−２−メチル−４−（４’−エトキシカルボニ
ルブトキシ）−６−エチルアニリンの製造段階３で製造
した２−メチル−４−（４’−エトキシカルボニルブト
キシ）−６−エチルアニリン３０．４ｇ（１０８．８ミ
リモル）をメタノール３００ｍｌ中に溶解し、そして濃
硫酸０．３ｇを添加する。メタノール１００ｍｌ中の強
度７２％のメトキシアセトン２０ｇ（１６３．２ミリモ
ル）を室温（ＲＴ）下で攪拌溶液に添加する。次に水素
分子で接触水素添加する。活性炭上のパラジウム５％１
．５ｇが触媒として使用される。５バールおよび４０−
４５℃の温度で８時間後の水素取込みは理論値の１０６
％である。触媒を濾別し、残渣をジエチルエーテル中に
採取し、エーテル相を炭酸水素ナトリウム溶液、氷水お
よび飽和塩水で連続的に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾
燥し、そして蒸発させる。粘性淡褐色油状物の形態で収
量２９ｇ（理論値の７５．９％）。

【０１４０】段階５：Ｎ−（１−メチル−２−メトキシ
エチル）−２−メチル−４−（４’−ヒドロキシカルボ
ニルブトキシ）−６−エチルアニリンの製造段階４で製
造したＮ−（１−メチル−２−メトキシエチル）−２−
メチル−４−（４’−エトキシカルボニルブトキシ）−
６−エチルアニリン１９ｇ（５４ミリモル）を室温で２
Ｍ水酸化カリウム１５０ｍｌと混合する。生成する乳濁
液を室温で約２０時間攪拌することにより完全に反応さ
せる。反応混合物を次に塩酸でｐＨ７に調整し、そして
ジエチルエーテルで２回抽出する。エーテル相を一緒に
し飽和塩水で数回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、
そして蒸発させる。収量１２．９ｇ（理論値の７３．９
％）、ｎＤ　２３＝１．５１７、粘性油状物。

【０１４１】段階６：Ｎ−クロロアセチル−Ｎ−（１−
メチル−２−メトキシエチル）−２−メチル−４−（４
’−ヒドロキシカルボニルブトキシ）−６−エチルアニ
リンの製造段階５で製造したＮ−（１−メチル−２−メ
トキシエチル）−２−メチル−４−（４’−ヒドロキシ
カルボニルブトキシ）−６−エチルアニリン９．９ｇ（
３０．６ミリモル）を塩化メチレン４００ｍｌ中に溶解
させ、そして室温で攪拌しながら１Ｍ水酸化ナトリウム
溶液３０．６ｍｌ（３０．６ミリモル）を添加する。攪
拌しながら２０ないし２５℃の温度で塩化クロロアセチ
ル２．７ｍｌ（３３．６７ミリモル）をゆっくり滴下す
る。反応混合物をさらに約２時間攪拌する。引続き、上
記条件下で再び、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液１０．２ｍ
ｌおよび次に塩化クロロアセチル０．９ｍｌを添加し、
そして混合物をさらに室温で約１２時間攪拌する。生成
する混合物を塩基性とし、そしてジエチルエーテルで抽
出し、エーテル相を捨て、そして水相を塩酸でｐＨ３に
調整する。水相を再びジエチルエーテルで抽出し、氷水
および飽和塩水で数回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、そして蒸発させる。収量７．２ｇ（理論値の５９％
）粘性油状物、ｎＤ　２３＝１．５１５。化合物６の構
造は質量スペクトル法により確認される〔直接露出プロ
ーブ（ＤＥＰ）を用いるフィネガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ
）４５００〕。

【０１４２】担体タンパク質にカップリングし得るＮ−
クロロアセチル−Ｎ−（１−メチル−２−メトキシエチ
ル）−２−メチル−４−（４’−ヒドロキシカルボニル
ブトキシ）−６−エチルアニリン製造のスキームをした
の化７に示す。

【化７】

【０１４３】１．２：メトラクロル−タンパク質複合体
実施例１のようにして製造したメトラクロル誘導体を活
性エステル法〔８〕によりウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
；フルカ）か、キーホールカサガイヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ；カルビオケム）に複合させる。

【０１４４】この特異性は室温でＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）（８ｍｇ／２００μｌ）中に可溶化
され、そして次に４モル過剰のα−ヒドロキシスクシン
イミド（９．１ｍｇ／２００μｌＤＭＦ）およびＮ，Ｎ
’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６ｍｇ／２０
０μｌＤＭＦ）と混合される誘導体のカルボキシル基を
必要とする。反応混合物を最初に２２℃で１時間攪拌し
、次に４℃で１８時間攪拌する。

【０１４５】反応中に形成された白色沈殿を１２０００
ｇおよび室温で３分間の遠心分離により除去し、そして
次に活性エステルを、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ緩衝
液，０．０１Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１４５Ｍ　
　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）５．４ｍｌ中に前もって可溶
化されたＢＳＡまたはＫＬＨ（２４ｍｇ）に添加する。 〔誘導体〕：〔ＢＳＡ〕のモル比はこの場合には約５５
：１（誘導体８ｍｇ：ＢＳＡ２４ｍｇ）である。

【０１４６】４℃で４時間の保温後、形成された沈殿は
２０００ｇおよび４℃で１０分間の遠心分離により除去
し、そしてタンパク質複合体を含む残りの上澄みは、そ
れを免疫感作実験に使用する前に、ＰＢＳ（ＮａＮ３　
３ｍＭ含有）に対して徹底的に透析される。

【０１４７】カップリング反応の範囲はＳＤＳゲル電気
泳動および２８０ｎｍでの吸収スペクトルにより決定さ
れる。２８０ｎｍはＢＳＡおよび化合物６（Ａｍａｘ　
＝２７４ｎｍ）の両方の紫外線ピークに相当する。メト
ラクロル：ＢＳＡのモル比は約２３：１である。

【０１４８】１．３：ハプテンのアルカリホフファター
ゼへの複合実施例１．２で製造したＮ−クロロアセチル
−Ｎ−（１−メチル−２−メトキシエチル）−２−メチ
ル−４−（４’−ヒドロキシカルボニルブトキシ）−６
−エチルアニリンを子牛の腸からのアルカリホフファタ
ーゼ４０μｌ（１５３μｇ／２３０Ｕ）（カルビオケム
、ＥＩＡ規格）に添加する。４℃での４時間の保温の後
、反応混合物を３ｍＭＮａＮ３　含有のＰＢＳに対して
徹底的に透析する。複合体の酵素活性はｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートを基質として使用することにより決定
される。酵素の活性はハプテン複合の後に未変化のまま
である。

【０１４９】実施例２：免疫感作４週齢と６週齢の間で
あるメスのＢａｌｂ／ｃマウス〔チエルファルム・ズィ
ゼルン（Ｔｉｅｒｆａｒｍ　Ｓｉｓｓｅｌｎ），スイス
国〕各群５匹はＫＬＨ複合メトラクロル（５０μｇ／注
射）での３回の腹膜腔内または皮下注射を受容する。第
１の注射はＰＢＳ中に複合体０．１ｍｌを含み、完全フ
ロイントのアジュバント０．１ｍｌと１：１の比率で混
合されている。この注射液５０μｌは腹膜腔内に注射さ
れ、そして残りの１５０μｌは皮下に注射される。第２
および第３の注射はそれぞれ第１の投与の１４日および
３０日後に行われ、完全フロイントのアジュバントの代
わりに不完全フロイントのアジュバントを用いる。最後
の注射の１週間後、血清を実験動物から採取し、そして
血液滴定は、ＢＳＡ複合ハプテン（項６参照）で予め被
覆したミクロタイタープレートを用いるエリザ試験によ
り決定される。２ヵ月の放置期間の後に、ＫＬＨ複合体
のもう１回の腹膜腔内注射が３７０μｇ／２００μｌＰ
ＢＳの投与量で行われる。

【０１５０】実施例３：融合プロトコル３．１．食細胞
（腹膜マクロファージ）の入手約６週齢ないし８週齢の
未処置Ｂａｌｂ／ｃマウスを融合１日前に殺し、そして
強度７０％のアルコール中に浸漬することにより殺菌す
る。次に殺菌切開は腹膜を傷つけることなく柔毛および
上部腹皮になされる。滅菌５ｍｌシリンジおよび滅菌１
８ゲージ注射針がＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なし
）４ｍｌおよび空気１ｍｌを腹腔内に注射するために使
用される。腹部をゆるやかに揉んだ後（シリンジおよび
針は腹腔内に残っている）、前に注射されたＢＳＳ緩衝
液を腹膜腔内から再び引き出し、そして滅菌ファルコン
チューブ中に入れる。この操作をさらに２回繰り返す。 この方法で得られたマクロファージは氷中で冷し、そし
て引続きＢＳＳ各回２０ｍｌで２回洗浄する。これは３
００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠心分離されるマク
ロファージを必要とする。ペレットを次にＨＡＴ培地５
０ｍｌ中に再懸濁し、そして細胞懸濁液を全部で２４ウ
エルの４つのコスタープレートに分配する（０．５ｍｌ
／ウエル）。この方法で調製したマクロファージを３７
℃の温度および６％のＣＯ２　濃度でインキュベータに
保存する。約４×１０６　マクロファージが各融合操作
に必要である。

【０１５１】３．２．ミエローマ細胞系Ｓｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４の培養 上記ミエローマ細胞系Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４は、それ自
体抗体を分泌せず、そしてエム．シュルマン等〔１３〕
により記載されているミエローマ細胞系である。このミ
エローマ細胞系は米国メリーランドのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションから入手され得る。少な
くとも１０億個の細胞を含む十分に成長した培養液５０
ｍｌが各融合に必要である。ミエローマ細胞は好ましく
はＴ１７５ファルコンボトル（ベクトン・アンド・ディ
ケンソンにより供給される）中で培養される。融合１日
後、培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）を新鮮ＲＰＭＩ１６
４０に代える。融合１日目にＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞
を集め、５０ｍｌ滅菌プラスチックチューブに入れ、そ
して３００ｇおよび５℃の温度で１０分間遠心分離する
（ＭＳＥ遠心分離機，チルスピン型，英国）。遠心分離
後、上澄みを吸い出し、そして捨てる。細胞をＢＳＳ緩
衝液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なし）各回約３０ｍｌで
２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分）、そしてＢＳＳ
５ｍｌ中に再懸濁する。細胞懸濁液の一部を細胞数決定
のために除去し、そしてフルオレセインジアセテート（
ＦＤＡ）で染色する。さらに使用するまでミエローマ細
胞を氷上に保存する。

【０１５２】３．３．脾臓細胞懸濁液の調製実施例２に
記載されたように予め免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウ
スから滅菌条件下および氷上で冷却しながら脾臓を除去
する。予め免疫感作されたＢａｌｂ／ｃマウスを断頭に
より殺し、そして滅菌条件下で脾臓を除去する。このた
めにマウスは７０％強度のエタノール中に短時間浸漬さ
れ、滅菌器具で解剖される。脾臓を注意深く除去し、そ
して細かいナイロンネット上に置く。そこでハサミで小
片に切断され、次に５ｍｌのシリンジプランジャーを用
い、この操作であまりにも多くの細胞を破壊することな
く注意深くネットを通す。ネットはこの操作を通じてＢ
ＳＳですすがれる。この方法で得られた細胞懸濁液を５
０ｍｌのプラスチックチューブに入れ、そして３００ｇ
および５℃の温度で１０分間遠心分離する（ＭＳＥ遠心
分離機，チルスピン型，英国）。次に細胞をＢＳＳ各回
約２０ｍｌで２回洗浄し（３００ｇ，５℃で１０分，Ｍ
ＳＥ遠心分離機，チルスピン型）、そして遠心分離後の
細胞ペレットをＢＳＳ１０ｍｌ中に再懸濁する。脾臓細
胞はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合される
まで氷上に保持される。

【０１５３】３．４．融合：脾臓細胞とＳｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４ミエローマ細胞 融合のためのミエローマ細胞：脾臓細胞の比率は１：１
０にすべきである。脾臓細胞（ＢＳＳ緩衝液中）および
Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞（ＢＳＳ緩衝液中
）を上記比率で混合し、そして３００ｇおよび５℃の温
度で１０分間遠心分離する（ＭＳＥ遠心分離機，チルス
ピン型）。ペレットを再びＢＳＳ緩衝液中に再懸濁し、
そして次に懸濁液を再び遠心分離する。ペレットを注意
深く攪拌し、そして水浴中に３７℃で入れる。次いで予
備加熱した滅菌ＰＥＧ４０００（メルク）１ｍｌを６０
秒かけて細胞に滴下し、この間全体の混合物は絶えずか
き混ぜる。細胞を次にさらに３０秒間揺動した後、予め
加熱したＢＳＳ緩衝液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なし）
５ｍｌを同様に約５分かけて絶えず攪拌しながら滴下す
る。上記のようにして融合された細胞は次に遠心分離さ
れ（３００ｇ，２０℃で１０分，ＭＳＥ遠心分離機，チ
ルスピン型）、そして上澄みが吸い出され、廃棄される
。細胞ペレットをＨＡＴ培地５０ｍｌ中に再懸濁し、そ
してこのようにして得られた細胞懸濁液は準備された４
つコスタープレート（各ウエルの直径２４ｍｍの２４ウ
エルのミクロタイタープレート；細胞成長のための全領
域２．０ｃｍ２　）に分配される（０．５ｍｌ／ウエル
）。コスタープレートを３７℃の温度および６％のＣＯ
２　濃度で保温する。

【０１５４】実施例４：ハイブリッド細胞の培養細胞融
合１日後、ＨＡＴ培地１ｍｌを培養プレートの各ウエル
に添加する。細胞融合３ないし４日後、顕微鏡下で融合
された細胞を調べる。同時に使用された培地を吸い出し
、そして新鮮ＨＡＴ培地１ｍｌに置き換える。さらに３
日後（細胞融合６−７日後）、培養培地を再び変える。 細胞融合７ないし１０日後、各ウエルを顕微鏡下でハイ
ブリッドを求めて追跡し、そして培地を１週間に２また
は３回交換する。ハイブリッドがウエル中で成長すると
すぐ、その中のＨＡＴ培地はＨＴ培地に代えてもよい。 洗浄されたハイブリッド培養液からの上澄み（ウエルの
少なくとも１０％）が滅菌パスツールピペットで除去さ
れ、そして抗体の存在に対して試験される。ウエルが陽
性ハイブリッドコロニーの成長により被覆されるとすぐ
に、該ハイブリッドコロニーをＲＰＭＩ１６４０培地中
の新たなコスタープレートに移してもよく、このとき成
長して被覆されている１つのウエルの内容物は新たな２
または３個のウエルに分配される。

【０１５５】実施例５：陽性ハイブリッド細胞のクロー
ニング ピペットを用いて陽性ウエル中の細胞を溶解させ、そし
てチューブ内の培地１ｍｌ中に移す。細胞数の決定のた
めに一部を次に除去し、そしてＦＤＡで染色する（ＦＤ
Ａで希釈１：２，細胞５０μｌ＋顔料５０μｌ）。好ま
しい細胞数は１０５　ないし１０６　細胞／ｍｌである
。ハイブリッド細胞を次にＨＴ培地で１：１００の比率
で希釈する（例えば細胞１００μｌ＋ＨＴ培地９．９ｍ
ｌ）。ＨＴ培地２５ｍｌを２本の５０ｍｌファルコンチ
ューブに入れ、各々のチューブをマクロファージ懸濁液
５ｍｌで全量３０ｍｌとする。マクロファージをマウス
から予め単離し、そしてＨＴ培地１０ｍｌ中に再懸濁す
る（項３．１参照）。細胞濃度が（ｉ）２７０細胞／３
０ｍｌまたは（ｉｉ）９０細胞／３０ｍｌに達するまで
ハイブリッド細胞をマクロファージ含有ファルコンチュ
ーブ中で希釈する。これらの混合物を次にコスタープレ
ート（９６ウエルのミクロタイタープレート）上に、各
ウエルが２００μｌとなるように分配する。これは細胞
数（ｉ）１．８細胞／ウエルまたは（ｉｉ）０．６細胞
／ウエルに相当する。１．５ミクロタイタープレートが
各希釈のためのこの方法において必要とされる。７日後
、個々のウエルを顕微鏡下で調べ、そして細胞クローン
を含むウエルに注意する。ウエルの約５０％が細胞クロ
ーンを含む希釈がエリザ試験のために用いられる。これ
は一般に０．６細胞／ウエルの希釈であることが望まし
い。約７−１０日後、陽性細胞の上澄み（クローンと共
に）がモノクローナル抗体の存在に対してエリザ試験で
試験され、そして陽性クローンをＲＰＭＩ１６４０培地
中コスタープレート（２４ウエル）上で成長させる。 これら陽性クローンの一部は液体窒素中に保存される。

【０１５６】実施例６：ハイブリドーマスクリーニング
（エリザ試験） 炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．６）中のＢ
ＳＡ複合ハプテン溶液１００μｌを最初にミクロタイタ
ープレートの個々のウエル中に入れ、そしてこの混合物
を湿度室中４℃で一晩保温する。次いでウエルを０．１
％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄する。ミクロタイタ
ープレート上の未占有結合部位をブロックするために、
ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液（１％）２００μｌを各ウエル中に
入れる。この混合物を室温で１−２時間保温し、次に０
．１％強度のＰＢＳツイーン緩衝液で洗浄する。ＰＢＳ
ツイーン緩衝液（０．１％）で１：２の比率に希釈した
ハイブリドーマ上澄み２００μｌを次に各ウエル中に入
れ、そして完全混合物を室温で２時間保温する。次いで
ウエルを０．１％ＰＢＳツイーン緩衝液で５回洗浄する
。この次にホスファターゼ複合ヤギ抗マウス抗体（キル
ケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー）と保温する
。アフィニティークロマトグラフィーにより精製され、
そしてＰＢＳツイーン（０．１％）（キルケガード・ア
ンド・ペリー・ラボラトリー）中１：１５００の希釈の
形態にあり、そしてアルカリホスファターゼで標識され
ているマウスＩｇＧに対するヤギ抗体１００μｌを最初
に各ウエルに添加する。保温時間は室温で１．５時間で
ある。個々のウエルを次に再び０．１％ＰＢＳツイーン
緩衝液で５回洗浄する。基質含有溶液（１ｍｇ／ｍｌ　
　ｐ−ニトロフェニルホスフェート）１５０μｌを各ウ
エル中に入れる。暗所中２時間の保温の後、４０５ｎｍ
での分光分析を行う。特異的な抗体を分泌する陽性ハイ
ブリドーマ細胞は選択された波長で強い陽性信号を与え
る。

【０１５７】実施例７：ハイブリドーマ細胞のマウス中
での増殖 腹水産生を刺激するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス
（２０ｇ−２５ｇ）（チエルファルム・ズィゼルン，ス
イス国）を腹膜腔内注射によりプリスタン油（アルドリ
ッチ・ケミカル）０．３ｍｌで前処理する。プリスタン
投与の１ないし３週間後、マウスに第２の注射（プリス
タン油０．２ｍｌ）を行う。該第２の注射と同時に、動
物はＰＢＳ０．２ｍｌ中の２×１０６　のハイブリドー
マ細胞を受容する。この処置から生じる腹水を集め、８
００ｇで遠心分離し、そして−２０℃の温度で保存する
。 解凍後、腹水を３０００ｇで１時間遠心分離する。主に
脂質を含む上層を廃棄する。次いでタンパク質濃度を決
定し、ＰＢＳを添加することにより１０ｍｇ／ｍｌの値
に調整する。免疫グロブリンＧ画分（ＩｇＧ）を飽和ア
ンモニウム溶液０．９容量部の滴下により沈殿させる。 １時間後、ＩｇＧ画分を２２０００ｇで１時間遠心分離
することによりペレット化する。次いでペレットを５０
ｍＭ　　ＮａＣｌ含有の２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐ
Ｈ７．９中に溶解させ、そして同様の緩衝液に対して４
℃で透析する。ＩｇＧ画分の引き続く仕上げはＤＥ−５
２ジエチルアミノエチルセルロース（ホワットマン）上
での陰イオン交換クロマトグラフィーにより行う。試料
は、ＮａＣｌ濃度が２５ｍＭになるまで２０ｍＭトリス
ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．９で１：２（ｖ／ｖ）に希釈され
、そしてタンパク質１０ｍｇ／ゲルｍｌをカラムに注入
する。溶出はＮａＣｌ濃度を２５ｍＭないし２００ｍＭ
まで増加させる（リニアグラジエント）ことにより行わ
れる。モノクローナル抗体は一般に８０ｍＭ　　ＮａＣ
ｌの領域に溶出される。その画分をＰＢＳに対して４℃
で一晩透析し、そして−７０℃で保存する。純度をドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および等電点電気泳動により決定す
る。この場合の純度は９０％を越えている。

【０１５８】実施例８：メトラクロル検出８．１．間接
エリザ（アッセイＡ） メトラクロルは酵素標識された第２の抗体を使用するこ
とにより２段階競合エリザ試験により検出される。５０
ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のＢＳＡ複
合ハプテン（ＢＳＡ複合ハプテン２００ｎｇ／炭酸ナト
リウム緩衝液１００μｌ）をマイクロタイタープレート
（例えばダイナテック，タイプＭ１２９Ａ）上に最初に
吸着させ、そして４℃で一晩保温する。複合体（ＢＳＡ
／ハプテン）濃度を２００ｎｇ／炭酸ナトリウム緩衝液
１００μｌから５０ｎｇ／炭酸ナトリウム緩衝液１００
μｌに減らすことにより被膜が改善されるのでアッセイ
の感度が高まり得ることを確認した。プレートを次に０
．１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（ツイーン２０）
を補足したＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−ツイーン）で５回洗
浄する。ＢＳＡを１％溶液の形態で添加することにより
、固体支持材上に残る遊離結合部位を次にブロックする
。２２℃で２時間保温した後、プレートをＰＢＳ−ツイ
ーン（０．１％）で再び洗浄する。予め精製した抗体（
０．２μｇ／ｍｌ）または細胞クローンの上澄み（１：
１５の希釈）５０μｌをａ）メトラクロルまたはメトラ
クロル類似体の増加する含量を含む標準溶液９５０μｌ
、ｂ）メトラクロル含有水試料、またはｃ）メトラクロ
ル含有土壌抽出物と保温する。（ＰＢＳ−ツイーンが全
ての希釈のために使用される）室温（２２℃）で１時間
の保温後、抗原／抗体混合物２００μｌをミクロタイタ
ープレートの各ウエルに添加し、そして全体の混合物を
さらに１時間保温する。ウエルを次にＰＢＳ−ツイーン
（０．１％）で５回洗浄し、アルカリホスファターゼ（
希釈１：１５００）に複合されているヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体１００μｌ／ウエルを入れ、そして１．５時間保
温する。新たに洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌジエタノール
アミン緩衝液（１ｍＭ，ｐＨ９．８，０．５ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２　×６Ｈ２　Ｏで補足）中に溶解された基質ｐ
−ニトロフェニルホスフェート１５０μｌ／ウエルをウ
エルに添加する。２２℃の温度で２時間保温した後、固
相に結合した抗原と反応した抗体量に比例する色変化を
観察することができる。起こった呈色反応の強度は４０
５ｎｍの波長で決定される。個々の試料の希釈は、０．
３と０．５の間の範囲の吸収が阻害剤（Ｂｏ）を添加せ
ずに得られるように選択される。０．００５未満のＲ値
が対照（抗体を含まず検出不可能な抗原を含む）に対し
て見出される。全ての試料が３回測定される。

【０１５９】８．２．直接エリザ（アッセイＢ）マイク
ロタイタープレート（ダイナテックＭ１２９Ａ）をモノ
クローナル抗体（例えばＭＡｂ４０８２−２５−４；７
５ｎｇ／炭酸ナトリウム緩衝液１００μｌ，ｐＨ９．６
）で被覆し、そして４℃で一晩保温する。プレートを次
に０．１％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ−ツイーンで５回洗浄し、
次に依然遊離のままである結合部位をブロックするため
に１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで補足したＰＢＳと２時間保温
する。新たに洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ−
ツイーン中に増加する量でメトラクロルを含むマイクロ
タイタープレートのウエルの各々に標準液１５０μｌを
添加する。次に２２℃で１時間保温する。次いでハプテ
ン−酵素（アルカリホスファターゼ）複合体（２μｇ／
ｍｌ）５０μｌを各ウエルに添加し、そして保温をさら
に１時間続ける。新たに洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌジエ
タノールアミン緩衝液（１ｍＭ，ｐＨ９．８，０．５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　×６Ｈ２Ｏで補足）中に溶解された
基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート１５０μｌ／ウエ
ルをウエルに添加する。暗所中２２℃で２時間保温した
後、４０５ｎｍでの吸収を測定する。

【０１６０】８．３．メトラクロル含量の決定試料中に
含まれるメトラクロルの量の決定のために、Ｂ／Ｂｏ×
１００が阻害剤の濃度に対してプロットされている計算
プロットを最初に作成する（図１）。（Ｂｏは抗体に対
してメトラクロル阻害剤を添加せずに計算された吸収を
示し、そしてＢはメトラクロル阻害剤の種々の濃度で測
定された吸収を示す）Ｉ５０値は固相に結合している抗
体が５０％に阻害されている抗原の濃度を示す。 Ｉ５０値は本発明の条件に特に適格化され、そして記号
論理的プロットエンブレース４パラメータ〔１１〕に基
づいたＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（レザーバロー，エルゼビー
ル−バイオソフト）プロット計算プログラムを用いて計
算される。エリザの範囲内での土壌または水の試料中の
メトラクロルの定量測定はまた、各マイクロタイタープ
レート上に含まれる標準に基づいたプロットを適合して
ＥＮＺＦＩＴＴＥＲプログラムを用いて行われる。

【０１６１】実施例９：土壌試料の分析種々の供給源の
土壌試料の一部（２ｇ）をメタノール／水〔８０／２０
（ｖ／ｖ）〕混合物２０ｍｌで抽出器中４時間抽出する
。メタノールによるモノクローナル抗体の変性の可能性
を排除するために、土壌抽出物は競合エリザのためのＰ
ＢＳ−ツイーン（０．１％）中に１：４０の比率で希釈
する。希釈土壌試料（９５０μｌ）を次に特異的抗メト
ラクロル抗体（ＭＡｂ４０８２−８５−４）（５０μｌ
）と混合し、次いで上記したように、担体結合ハプテン
と保温するか（間接エリザ）、または担体結合抗メトラ
クロル抗体と直接反応させ次いで酵素標識抗原と保温す
る（直接エリザ）。

【０１６２】実施例１０：水試料の分析競合エリザのた
めに、１０倍濃縮ＰＢＳ−ツイーン緩衝液１００μｌを
水試料８５０μｌに添加する。メトラクロル測定は上記
と同様の操作と同様に行われ得る（実施例９参照）。

【０１６３】ＩＩ．結果 ａ）モノクローナル抗体の調製 ミエローマ細胞とＫＬＨメトラクロルで免疫感作された
Ｂａｌｂ／ｃマウスから予め単離された脾臓細胞との２
４の細胞融合が行われる。融合率は約９０％である。こ
のように得られる細胞コロニーのうち７つはエリザ試験
で強い反応を示すモノクローナル抗体を産生する。これ
らは限界希釈法（項５参照）を用いてクローン化される
。

【０１６４】上記７つの１つがメトラクロルに対して非
常に高い親和性を示し〔ＭＡｂ４０８２−２５−４；（
ＩｇＧ１サブクラス）〕、その他の６つがメトラクロル
誘導体に対して限定されたままである、７つのモノクロ
ーナル抗体を得ることが可能だった。この抗体が２つの
競合イムノアッセイを開発するために使用された。これ
らのアッセイの一つはＢＳＡ−ハプテン複合体で被覆さ
れるミクロタイタイタープレートおよび酵素標識ヤギ／
抗マウス抗体の使用に基づいている（間接エリザ）。 第２のアッセイはハプテン−酵素複合体および抗体被覆
ミクロタイタイタープレートを使用する（直接エリザ）
。

【０１６５】両方のアッセイはｐｐｂ範囲でメトラクロ
ルを検出することができる。直接エリザは間接エリザよ
り感度がわずかに低いが、しかしより速いことにより償
われている。Ｉ５０値は直接エリザに対して１．０ｎｇ
／ｍｌであり、そして間接エリザに対して０．６ｎｇ／
ｍｌである。緩衝液中のメトラクロルに対する検出範囲
は０．１ｎｇ／ｍｌと１０ｎｇ／ｍｌの間の範囲である
が、最低検出限界は、ブランクの標準偏差の２倍に相当
する結合抗体における％増加を達成するのに必要な濃度
として規定される。１ｐｐｂ範囲の反復測定に対する偏
差の係数は１１％である（２０回の測定）。

【０１６６】ＭＡｂ４０８２−２５−４の交差反応性は
間接競合エリザにより決定され得る。表１から、メトラ
クロルの構造的に非常に近似する関連ヒドロキシル代謝
中間体（化合物Ａ）と１．４％の弱い交差反応性である
ことがわかる。その他の代謝中間体は交差反応性を示さ
ない（０．１％未満）。モノクローナル抗体はその他の
クロロアセトアニリド除草剤および関連化合物例えばア
ラクロル、フルフラキシルおよびメタラキシルとは結合
しない（０．１％未満）。

【０１６７】寄託：本発明の範囲内で製造されそして使
用されるハイブリドーマ細胞系（４０８２−２５−４）
は国際寄託機関に認められている英国サリスバリィにあ
るヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル
・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に、特許手続上の微生物
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の要求に従
って、寄託番号ＥＣＡＣＣ９００２　　１７０１の下に
寄託された。寄託した試料の生存の証明書は上記国際寄
託機関により作成されている。

【０１６８】ＩＩＩ．培地および緩衝液（Ａ）ＲＰＭＩ
１６４０培地 ＲＰＭＩ１６４０（セロメド）は以下の添加剤を含む：
子牛血清　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５％
Ｌ−グルタミン　　　　　　　　　　　　４ｍＭゲンタ
マイシン　　　　　　　　　　　　０．０１％ピルビン
酸ナトリウム　　　　　　１ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール　　５０μＭインシュリン　　　　　　　　　　　
　　　５μＭトランスフェリン　　　　　　　　　　５
μＭセレニウム（ＩＴＳ）　　　　　　５μＭ（Ｂ）Ｈ
ＡＴ培地 ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０　　　　　　５．０ｍｇ／ｌアミ
ノプテリン　　　　　　　　　　　　８．８ｍｇ／ｌチ
ミジン　　　　　　　　　　　　　　１９３．８ｍｇ／
ｌ（Ｃ）ＨＴ培地 ベーリンガーからのＨＡＴ濃厚液（５０倍）２０ｍｌを
添加したＲＰＭＩ１６４０培地１リットルで以下の組成
を有する： ヒポキサンチン６８０　　　　　　５．０ｍｇ／ｌチミ
ジン　　　　　　　　　　　　　　１９３．８ｍｇ／ｌ
（Ｄ）ＢＳＳ緩衝液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まな
いイーグル食塩水，ｐＨ７．４） ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７．３ｍＭＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１１６．０ｍＭＮａＨＣＯ３　　　　　　　　
　　　　　　　　　２６．０ｍＭＮａＨ２　ＰＯ４　・
２Ｈ２　Ｏ　　　　　　１．０ｍＭグルコース　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　５．５ｍＭフェノー
ルレッド　　　　　　　　　　　　４８．０μＭペニシ
リン／ストレプトマイシン溶液（セロメド）の１％添加
（ｖ／ｖ）（ペニシリン１００００Ｕ，１０ｍｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン） （Ｅ）炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）Ｎａ２　Ｃ
Ｏ３　　　４７７．０ｍｇ ＮａＨＣＯ３　　　８７９．０ｍｇ ＮａＮ３　　　　　　　　　　　１．８ｍｇＨ２　Ｏ　
　　　　　　　　　　　３００ｍｌ添加（Ｆ）ＰＢＳ緩
衝液（ｐＨ７．０） ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．５
ｇＮａ２　ＨＰＯ４　・２Ｈ２　Ｏ　　１．２８ｇＮａ
Ｈ２　ＰＯ４　・２Ｈ２　Ｏ　　０．４３６ｇＨ２　Ｏ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍ
ｌ添加（Ｇ）ＰＢＳ−ツイーン２０（０．１％）ツイー
ン２０（セルバ）１ｍｌ＋ＰＢＳ１０００ｍｌ（Ｈ）Ｐ
ＢＳ−ＢＳＡ（１％） ＢＳＡ　　　　５．０ｇ ＮａＮ３　　　３．０ｍｌ ＰＢＳ　　　　５００ｍｌ添加 （Ｉ）基質緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液，ｐＨ９
．８） ジエタノールアミン　　　　　　９７．０ｍｌＮａＮ３
　（０．５Ｍ）　　　　　　６．０ｍｌＭｇＣｌ２　・
６Ｈ２　Ｏ　　１００．０ｍｇＨ２　Ｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ添加濃ＨＣｌでｐ
Ｈ９．８に調整 基質の調製：使用直前に、ｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート基質（シグマ１０４）の基質タブレット１個（＝５
ｍｇ）を基質緩衝液５ｍｌ中に溶解する。

【０１６９】

【表１】公知メトラクロル類似体とＭＡｂ４０８２−２
５−４との交差反応性（メトラクロル類似体ＡないしＮ
は表２まとめて示してある） ＊Ｉ５０＝競合エリザにおける５０％阻害のための阻害
剤濃度 ＃交差反応性＝５０％阻害のためのメトラクロル濃度／
５０％阻害のためのメトラクロル類似体濃度×１００

【
０１７０】

【表２】表１に示した公知のメトラクロル類似体の構造

【０１７１】

【表３】ＩＶ．参考文献

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして公知の構造的に関連するメトラ
   クロル類似体とは交差反応性を実質的に示さないモノク
   ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
2. 【請求項２】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして構造的に近似の関連するアラク
   ロルとは交差反応性を実質的に示さないモノクローナル
   抗体を産生する請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
3. 【請求項３】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして公知の構造的に関連するメトラ
   クロル類似体とは１０％未満の交差反応性を示すモノク
   ローナル抗体を産生する請求項１または２記載のハイブ
   リドーマ細胞系。
4. 【請求項４】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして公知の構造的に関連するメトラ
   クロル類似体とは２％未満の交差反応性を示すモノクロ
   ーナル抗体を産生する請求項１または２記載のハイブリ
   ドーマ細胞系。
5. 【請求項５】　　ＥＣＡＣＣ９００２　　１７０１の特
   徴を有する請求項４記載のハイブリドーマ細胞系。
6. 【請求項６】　　出発物の特性を依然有する、すなわち
   メトラクロルに対する高い特異性および親和性を有しそ
   して公知の構造的に関連するメトラクロル類似体とは交
   差反応性を実質的に示さないモノクローナル抗体の合成
   および周囲の培地中への分泌が依然可能である請求項１
   ないし５のいずれか１項に記載のハイブリドーマ細胞系
   の突然変異体および変種。
7. 【請求項７】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして公知の構造的に関連するメトラ
   クロル類似体とは交差反応性を実質的に示さないモノク
   ローナル抗体およびそれらの誘導体。
8. 【請求項８】　　メトラクロルに対する高い特異性およ
   び親和性を有し、そして構造的に近似の関連するアラク
   ロルとは交差反応性を実質的に示さないモノクローナル
   抗体およびそれらの誘導体。
9. 【請求項９】　　公知の構造的に関連するメトラクロル
   類似体とは１０％未満の交差反応性を示す請求項７また
   は８記載のモノクローナル抗体およびそれらの誘導体。
10. 【請求項１０】　　公知の構造的に関連するメトラクロ
    ル類似体とは２％未満の交差反応性を示す請求項９記載
    のモノクローナル抗体およびそれらの誘導体。
11. 【請求項１１】　　請求項１ないし６のいずれか１項に
    記載のハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクロ
    ーナル抗体およびそれらの誘導体。
12. 【請求項１２】　　ＥＣＡＣＣ９００２　　１７０１の
    特徴を有するハイブリドーマ細胞系により産生される請
    求項７記載のモノクローナル抗体。
13. 【請求項１３】ａ）適当なメトラクロル誘導体を合成し
    、そして該誘導体を担体分子と複合し、ｂ）該複合体で
    供与動物を免疫感作し、ｃ）免疫感作された供与動物か
    ら免疫適格Ｂ細胞を単離し、ｄ）該免疫適格Ｂ細胞を連
    続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞系と融合し、ｅ）生成す
    る融合物を単離し、該融合物を適当な培養培地中で培養
    し、そして引き続いて陽性ハイブリッド細胞をクローニ
    ングし、そしてｆ）モノクローナル抗体を産生するクロ
    ーン化ハイブリッド細胞をスクリーニングし、そして所
    望の特性を示すハイブリッド細胞を選択する、ことから
    なる請求項１記載のハイブリドーマ細胞系の製造方法。
14. 【請求項１４】　　メトラクロル誘導体が次式Ｉ（化１
    ）： 【化１】 （式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ２　またはＳＨを表し、そ
    してｎは１ないし１０の整数を表す）で表され、メトラ
    クロルのアミノ官能基に対して４位にＲ−（ＣＨ２　）
    ｎ　−Ｏ−基を有する化合物である請求項１３記載の方
    法。
15. 【請求項１５】　　適当なメトラクロル誘導体とのカッ
    プリング反応に自由に利用され、そして該メトラクロル
    に免疫原性を付与し得る反応基を有する巨大分子化合物
    が担体分子として使用される請求項１３記載の方法。
16. 【請求項１６】　　分子量が１００００と１５００００
    ０の間のリシンに富むタンパク質が使用される請求項１
    ５記載の方法。
17. 【請求項１７】　　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キ
    ーホールカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清ア
    ルブミン（ＨＳＡ）、ブタチログロブリン、Ｂ２ミクロ
    グロブリン、ヘモシアニン、免疫グロブリンからなる群
    から選択されるタンパク質；毒素；多糖；リポ多糖；天
    然または合成ポリアデニル酸およびポリウリジル酸；ポ
    リアラニルおよびポリリシンポリペプチド；または細胞
    膜成分が使用される請求項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】　　メトラクロルの担体分子への直接複
    合が行われる請求項１３記載の方法。
19. 【請求項１９】　　メトラクロルが担体分子に架橋成分
    （スペーサー）を介して複合される請求項１３記載の方
    法。
20. 【請求項２０】　　架橋成分が担体分子の反応基と相互
    作用し得る反応基を１個またはそれ以上有する請求項１
    ９記載の方法。
21. 【請求項２１】　　反応基がカルボキシル基、アミノ基
    またはＳＨ基である請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】　　カップリング反応が活性エステル法
    により行われる請求項１３記載の方法。
23. 【請求項２３】　　供与動物が担体結合メトラクロルの
    １回またはそれ以上の投与により免疫感作される請求項
    １３記載の方法。
24. 【請求項２４】　　投与が静脈内注射、腹膜腔内注射も
    しくは皮下注射またはそれらの組合せの形態で行われる
    請求項２３記載の方法。
25. 【請求項２５】　　それ自体モノクローナル抗体を産生
    しない腫瘍細胞系が供与動物からの免疫適格細胞との融
    合に使用される請求項１３記載の方法。
26. 【請求項２６】　　Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４またはＸ６３
    −Ａｇ８．６５３の特性を有するミエローマ細胞系が使
    用される請求項２５記載の方法。
27. 【請求項２７】　　使用される融合培地が、センダイウ
    イルスまたはその他のパラミクソウイルス、カルシウム
    イオン、表面活性脂質およびポリエチレングリコールか
    らなる群から選択される細胞を融合するために慣用の融
    合促進剤の一つを含有する緩衝液である請求項１３記載
    の方法。
28. 【請求項２８】　　融合促進剤が平均分子量６００ない
    し６０００のポリエチレングリコールからなる請求項２
    ７記載の方法。
29. 【請求項２９】　　融合培地中のポリエチレングリコー
    ルの濃度が３０％ないし６０％である請求項２８記載の
    方法。
30. 【請求項３０】　　ＨＡＴ選択培地が融合されたハイブ
    リッド細胞の選択のために使用される請求項１３記載の
    方法。
31. 【請求項３１】　　ハイブリッド細胞が単離されたマク
    ロファージ（食細胞）の存在下で培養される請求項１３
    記載の方法。
32. 【請求項３２】　　モノクローナル抗体を産生する陽性
    ハイブリッド細胞培養物が限界希釈法を用いて選び出さ
    れ、そして次に適当な培養培地中でクローン化される請
    求項１３記載の方法。
33. 【請求項３３】　　請求項３１記載のクローン化された
    ハイブリドーマ細胞クローンがイムノアッセイによる適
    当なモノクローナル抗体の産生に対して試験される請求
    項１３記載の方法。
34. 【請求項３４】　　酵素結合イムノアッセイまたはラジ
    オイムノアッセイが用いられる請求項３３記載の方法。
35. 【請求項３５】　　請求項１３ないし３３のいずれか１
    項に記載の方法により製造されたハイブリドーマ細胞系
    が公知方法を用いて生体内または試験管内で培養され、
    そして産生されたモノクローナル抗体が単離されるモノ
    クローナル抗体の製造方法。
36. 【請求項３６】　　試験管内培養が適当な培養培地中で
    行われる請求項３５記載の方法。
37. 【請求項３７】　　適当である場合には哺乳類の血清の
    添加、成長促進添加剤または微量成分により補足されて
    もよいダルベッコの変形イーグル培地（ＤＭＥＭ）およ
    びＲＰＭＩ１６４０からなる群から選択される標準化培
    養培地が使用される請求項３６記載の方法。
38. 【請求項３８】　　モノクローナル抗体が請求項１３な
    いし３４のいずれか１項に記載の方法により製造された
    ハイブリドーマ細胞系の増殖により生体内で産生される
    請求項３５記載の方法。
39. 【請求項３９】　　請求項７ないし１２のいずれか１項
    に記載のモノクローナル抗体が公知のイムノアッセイの
    一つにおいて使用されるメトラクロルの免疫学的検出方
    法。
40. 【請求項４０】　　ＥＣＡＣＣ９００２　　１７０１の
    特徴を有するハイブリドーマ細胞系またはそれらのクロ
    ーンもしくはサブクローンにより産生されるモノクロー
    ナル抗体が公知のイムノアッセイの一つにおいて使用さ
    れる請求項３９記載のメトラクロルの免疫学的検出方法
    。
41. 【請求項４１】　　イムノアッセイが競合イムノアッセ
    イである請求項３９または４０記載の方法。
42. 【請求項４２】　　イムノアッセイがラジオイムノアッ
    セイ（ＲＩＡ）、酵素結合アッセイ（エリザ）または化
    学発光アッセイである請求項３９または４１記載の方法
    。
43. 【請求項４３】　　酵素結合アッセイが間接エリザであ
    る請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】　　酵素結合アッセイが直接エリザであ
    る請求項４２記載の方法。
45. 【請求項４５】　　慣用の支持材の他に、試薬およびそ
    の他の添加剤、請求項７ないし１２のいずれか１項に記
    載の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、
    使用のために調整されている試験キットの形態にあるメ
    トラクロルの免疫学的検出用組成物。
46. 【請求項４６】　　慣用の支持材の他に、試薬およびそ
    の他の添加剤、ＥＣＡＣＣ９００２　　１７０１の特徴
    を有するハイブリドーマ細胞系またはそれらのクローン
    もしくはサブクローンにより産生される少なくとも１種
    のモノクローナル抗体を含有する、請求項４５記載の使
    用のために調整されている試験キットの形態にあるメト
    ラクロルの免疫学的検出用組成物。
47. 【請求項４７】　　次式Ｉ（化２）： 【化２】 （式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ２　またはＳＨを表し、そ
    してｎは１ないし１０の整数を表す）で表され、メトラ
    クロルのアミノ官能基に対して４位にＲ−（ＣＨ２　）
    ｎ　−Ｏ−基を有する、担体分子にカップリングするた
    めのメトラクロル誘導体。
48. 【請求項４８】　　次式ＩＩ（化３）：【化３】 （式中、ＲはＣＯＯＨ、ＮＨ２　またはＳＨを表し、そ
    してｎは１ないし１０の整数を表す）で表される化合物
    を、温和な条件下−１０℃ないし＋３０℃の温度で、反
    応に不活性である溶媒中でＮ−アシル化し得るクロロ酢
    酸誘導体でＮ−アシル化することからなる次式Ｉ（化４
    ）： 【化４】 （式中、Ｒおよびｎは上記と同じ意味を表す）で表され
    、メトラクロルのアミノ官能基に対して４位にＲ−（Ｃ
    Ｈ２　）ｎ　−Ｏ−基を有し、担体分子にカップリング
    し得るメトラクロル誘導体の製造方法。