JPH04228089A - 高カルシウム血症治療・予防剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗ヒト副甲状腺ホルモン
関連タンパクモノクローナル抗体（以下、抗ＰＴＨｒＰ
モノクローナル抗体とする）を有効成分とする抗高カル
シウム血症治療・予防剤に関する。さらに詳細には、本
発明は医療分野において副甲状腺ホルモン関連タンパク
（以下、ＰＴＨｒＰとする）の産生により発症する高カ
ルシウム血症の治療および予防、さらには再発の防止に
用いられる抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体を有効成分
とする治療・予防剤に関する。本発明はさらに、上記モ
ノクローナル抗体の可変部領域のＨ鎖をコードする遺伝
子断片およびＬ鎖をコードする遺伝子断片；げっ歯類由
来の上記可変部領域とヒト由来の定常部領域とを有する
キメラモノクローナル抗体、該キメラモノクローナル抗
体を含有する高カルシウム血症治療・予防剤；および該
キメラモノクローナル抗体をコードする融合遺伝子に関
する。本発明は、さらに上記モノクローナル抗体を産生
するセルラインに関する。

【０００２】

【従来の技術】高カルシウム血症は、医療分野において
しばしば見い出される電解質異常症であり、患者に種々
の苦痛を与えるのみならず、重篤な場合は生命を脅かす
おそれがある。高カルシウム血症を惹起する原因疾患は
多様であるが、高頻度でかつ重篤な高カルシウム血症を
引き起こす原因疾患としては、悪性腫瘍および副甲状腺
ホルモン（以下、ＰＴＨとする）の過剰産生による副甲
状腺機能亢進症が挙げられる。

【０００３】このうち、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血
症は、その発生機序から、腫瘍細胞の骨への浸潤により
骨溶解が亢進し高カルシウム血症がもたらされる症例（
Ｌｏｃａｌ　Ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｈｙｐｅｒｃａｌ
ｃｅｍｉａ）と、腫瘍から産生される体液性因子が全身
性に作用し高カルシウム血症が惹起される症例（Ｈｕｍ
ｏｒａｌ　Ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ　ｏｆ　Ｍａｌ
ｉｇｎａｎｃｙ，以下、ＨＨＭとする）との２つに大別
される。その代表的な前者の例としては、多発性骨髄腫
、乳癌などの骨転移などによる高カルシウム血症が挙げ
られ、後者（ＨＨＭ）の例としては、偏平上皮癌、腎尿
路系の癌などに伴う高カルシウム血症などが挙げられる
。

【０００４】このうち、ＨＨＭは、悪性腫瘍に伴う高カ
ルシウム血症の８０％以上を占める最も頻度の高い腫瘍
随伴性症候群である。このＨＨＭは、悪性腫瘍患者の末
期に急速に発症し進展することが多く、さらに特異的治
療法が存在しないことから多くの患者の死亡原因となっ
ている。

【０００５】ＨＨＭの発症原因となる体液性因子につい
ては、多くの研究者により種々の研究がなされてきた。 Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．らは、ＨＨＭ患者の血漿中に
ＰＴＨとは異なるがＰＴＨ類似の作用を示す物質の存在
を証明し、かつ、ＨＨＭを惹起する悪性腫瘍細胞がこの
物質を産生していることを明らかにした（Ｓｔｅｗａｒ
ｔ，Ａ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８０巻，１４５４頁（１９８３）；および
Ｇｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，５３巻，８９９頁（１９８
１））。

【０００６】Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．のグループは、高
カルシウム血症を呈した肺癌患者の癌細胞（ＢＥＮ細胞
）の培養上清からＰＴＨ様活性を有する物質を単離し、
該物質のＮ末端の一次構造を明らかにした。さらに、該
細胞のｍＲＮＡを用いてＰＴＨ様物質のｃＤＮＡを単離
し、ＰＴＨ様物質の前駆体の全一次構造を決定した（Ｍ
ｏｓｅｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻，５０４８頁（１９８７
）；およびＳｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３７巻，８９３頁（１９８７））。そこではＰＴＨ様物
質はＰＴＨｒＰと称され、３６個のシグナルペプチドに
続く１４１個のアミノ酸残基よりなること、そして、Ｃ
末端の一次構造はＰＴＨと殆ど類似性がないが、Ｎ末端
の１−１３位のアミノ酸のうち８個は同一のアミノ酸か
らなると報告されている。ＰＴＨがその受容体と結合す
る機能；ＰＴＨが腎原性サイクリックＡＭＰの産生を亢
進する機能など、ＰＴＨがその生理活性を発現するには
Ｎ末端部分が不可欠であるとされている。従って、ＰＴ
ＨｒＰがＰＴＨと類似のＮ末端アミノ酸構造を有してい
るためにＰＴＨ様活性を有すると考えられる。

【０００７】Ｈｏｒｉｕｃｈｉ　Ｎ．らは、ＰＴＨｒＰ
の１−３４位のペプチドを化学合成しラットに投与する
と、高カルシウム血症状態を示すことを報告している（
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８巻，５６６頁（１９８７））。 さらに、Ｋｕｋｒｅｊａ，Ｓ．Ｃ．らは、高カルシウム
血症を呈した肺癌患者および喉頭癌患者のそれぞれの癌
細胞を無胸腺マウスに移植し、高カルシウム血症を示し
た時点でＰＴＨｒＰ（１−３４）およびＰＴＨｒＰ（１
−１６）ペプチドに対するウサギ抗血清を投与すると、
一部のマウスで血中カルシウムが正常レベルに減少した
ことを報告している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８
２巻，１７９８頁（１９８８））。このように、悪性腫
瘍に伴う高カルシウム血症の原因物質としてＰＴＨｒＰ
が重要な役割を果していることが知られている。

【０００８】ところで、従来、悪性腫瘍に伴う高カルシ
ウム血症の治療には補液、およびフロセミドもしくはエ
タクリン酸を併用するが、一般にはこれだけでは不充分
であり、さらにカルシトニン、ミスラマイシンなどの追
加投与を必要とする。しかし、カルシトニンは連続投与
により効果が低下すること、そして、ミスラマイシンは
重篤な副作用を惹起するなどの欠点があり、充分な効果
を発揮するには至っていない。このような悪性腫瘍に伴
う高カルシウム血症の治療には、上記のようにＰＴＨｒ
Ｐ活性を特異的に阻害する薬剤が好ましいと考えられる
。ＰＴＨｒＰ活性だけを特異的に抑制する方法としては
、上記のＫｕｋｒｅｊａ，Ｓ．Ｃ．らの研究例があるが
、報告されている方法はウサギ抗血清あるいはそれを精
製して得られるポリクローナル抗体を用いているため、
治療成績が悪く、かつ、有効症例においてもその有効期
間は非常に短いという欠点がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
問題点を解決するものであり、その目的とするところは
、高カルシウム血症に有効な治療・予防剤を提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、悪性腫瘍に伴う高カル
シウム血症に有効な治療・予防剤を提供することにある
。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点を克服するため鋭意研究を重ねた結果、ヒトＰＴＨ
ｒＰに対して特異性を有するモノクローナル抗体を取得
することに成功し、該モノクローナル抗体を用いること
により、高カルシウム血症を高成績で、かつ比較的長期
間にわたり治療し得ることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

【００１１】本発明の高カルシウム血症治療・予防剤は
、抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノクローナル
抗体およびその関連物質でなる群から選択される少なく
とも１種を有効成分として含有し、そのことにより上記
目的が達成される。

【００１２】本発明は、抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タ
ンパクモノクローナル抗体のＨ鎖可変部領域をコードす
る遺伝子断片であって、配列番号１に記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子配列を少なくともその一部に有す
る遺伝子断片を包含する。

【００１３】本発明は、抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タ
ンパクモノクローナル抗体のＬ鎖可変部領域をコードす
る遺伝子断片であって、配列番号２に記載のアミノ酸配
列をコードする遺伝子配列を少なくともその一部に有す
る遺伝子断片を包含する。

【００１４】本発明は、抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タ
ンパクモノクローナル抗体であって、その可変部領域の
少なくとも一部に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
するモノクローナル抗体を包含する。

【００１５】本発明は、抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タ
ンパクモノクローナル抗体であって、その可変部領域の
少なくとも一部に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有
するモノクローナル抗体を包含する。

【００１６】本発明は、げっ歯類由来の可変部領域およ
びヒト由来の定常部領域からなり、ヒトの副甲状腺ホル
モン関連タンパクを認識するげっ歯類／ヒトキメラモノ
クローナル抗体、およびその誘導体を包含する。

【００１７】本発明は、前記キメラモノクローナル抗体
をコードする融合遺伝子を包含する。

【００１８】本発明は、上記キメラモノクローナル抗体
およびその誘導体の少なくとも１種を有効成分として含
有する高カルシウム血症治療・予防剤を包含する。

【００１９】本発明は、上記モノクローナル抗体を産生
するセルラインを包含する。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体を調製するた
めには、従来からのモノクローナル抗体調製法を用いる
ことができる。つまり、抗原で免疫した動物から得られ
る抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合により
ハイブリドーマを調製し、得られたハイブリドーマの中
からＰＴＨｒＰ活性を特異的に阻害する抗体を産生して
いるクローンを選択することによって調製される。

【００２１】上記免疫に用いられる抗原としては、組換
えＤＮＡ法または化学合成法により調製したＰＴＨｒＰ
のアミノ酸配列の全部または一部のペプチドや、高カル
シウム血症を惹起した癌細胞の培養上清液由来のＰＴＨ
ｒＰなどが利用可能である。ＰＴＨｒＰのアミノ酸配列
の一部を含有するペプチドとしては、例えばＰＴＨｒＰ
のＮ末端部分に位置する、次の配列（配列番号７に示す
）を有するペプチドが挙げられる：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉ
ｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉ
ｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ。 抗体産生細胞は、例えばＰＴＨｒＰまたはその一部に相
当するペプチド（同等の作用を有する物質）によってイ
ンビボあるいはインビトロで免疫された動物あるいはヒ
トの脾細胞由来のあるいはリンパ節細胞由来のＢリンパ
球や、患者末梢血由来のＢリンパ球が使用できる。

【００２２】細胞融合に用いるミエローマ細胞としては
、マウス、ラット、ヒト、およびその他の動物由来のミ
エローマ細胞を用いることができる。細胞融合は、例え
ばポリエチレングリコールを用いる方法（岩崎辰夫ら、
「単クローン抗体、ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」講談
社発行（１９８３）参照）により行うことができる。細
胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニン
グ（例えば、酵素抗体法）に付され、抗体を産生するハ
イブリドーマが選択される。得られた抗体産生ハイブリ
ドーマはクローニング（例えば、限界希釈法）に付され
る。得られたクローンは、次いでスクリーニングに付さ
れ、目的とするモノクローナル抗体を産生するクローン
が選択される。例えば、ラット骨芽腫細胞ＲＯＳ１７／
２．８細胞またはＵＭＲ１０６細胞にＰＴＨｒＰを添加
することにより、アデニレートサイクレース活性が向上
する（アデニレートサイクレース促進活性が得られる）
が、これに対して、抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体が
存在すると、その活性が阻害されることによってスクリ
ーニングが行われる。

【００２３】得られたハイブリドーマのうちＥＶＯ３４
Ｂ１ＧおよびＥＶＯ１４１１Ｇの２種は、微生物工業技
術研究所特許微生物寄託センターにそれぞれ微工研菌寄
第１１４２９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４２９）および第１
１４３０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１４３０）として寄託さ
れている。ＥＶＯ３４Ｂ１Ｇは、ＰＴＨｒＰの１−３４
アミノ酸残基のペプチドを抗原として調製され、目的と
する抗体を産生するハイブリドーマクローンである。Ｅ
ＶＯ１４１１Ｇは、組換えＤＮＡ法により得られたＰＴ
ＨｒＰ（以下、ｒＰＴＨｒＰとする）を抗原として調製
され、目的抗体を産生するハイブリドーマクローンであ
る。

【００２４】得られたハイブリドーマによる抗ＰＴＨｒ
Ｐモノクローナル抗体の産生量は、該ハイブリドーマを
培養し、その培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法
で測定することによって検定することができる。得られ
たハイブリドーマから抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体
を得るには、例えば、該ハイブリドーマを培養し、その
培養上清から適切な方法により抗体を分取するか、また
は、ハイブリドーマをあらかじめプリスタン処理したマ
ウスの腹腔内に移植し、増殖させた後、そのマウスの腹
水から抗体を分取する。抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗
体の調製には、組換えＤＮＡ法を用いた動物細胞または
微生物を用いることも可能である。上記抗体の精製は、
通常の生化学的手法を組み合わせることによって行われ
得る。例えば、硫安沈澱分画法、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過法、ＰＥＧ分画法、アフィニティー
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電
気泳動などを適宜組み合わせることによって行われ得る
。精製されたモノクローナル抗体は、生物学的製剤の製
剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。例え
ば、メンブランフィルターなどによる濾過除菌操作を行
った後に、安定化剤と共に滅菌バイアルに凍結乾燥され
る。

【００２５】このようにして得られた抗ＰＴＨｒＰ抗体
の、高カルシウム血症の治療・予防効果は、高カルシウ
ム血症モデル動物に、抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体
を投与し、血中カルシウムレベルの低下の有無によって
調べる実験系を用いることにより確認される。上記高カ
ルシウム血症モデル動物としては、例えば、発病の原因
等であるＰＴＨｒＰあるいはＰＴＨｒＰ（１−３４）ペ
プチドを１日当り約６ナノモル連続投与することによっ
て作製した高カルシウム血症モデル動物、あるいはＰＴ
ＨｒＰを産生するヒト癌細胞（例えばＰＣ−３細胞）を
ヌードマウスに移植することによって得られる担癌高カ
ルシウム血症モデル動物がある。本発明の抗ＰＴＨｒＰ
モノクローナル抗体は、このいずれの方法においても血
中カルシウムレベルを正常レベルまで下げることが確認
された。従って、本発明の抗ＰＴＨｒＰモノクローナル
抗体は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療・予防
剤として非常に好適であり、産業上の利用価値がきわめ
て高い。

【００２６】さらに、モノクローナル抗体そのものに限
定されず、その関連物質、つまり該モノクローナル抗体
の免疫学的特性を有するフラグメント、例えば、Ｆ（ａ
ｂ’）フラグメント、さらに、該フラグメントを含むペ
プチドを含有する製剤も高カルシウム血症治療・予防剤
として使用され得る。

【００２７】発明者らは、さらに、上記抗ＰＴＨｒＰモ
ノクローナル抗体の抗原認識部位に関する検討を行った
。発明者らは、上記モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ
鎖の可変部領域の遺伝子配列を明かにすることを試みた
。上記Ｈ鎖の可変部領域をコードする遺伝子（ＶＤＪＨ
）およびＬ鎖の可変部領域をコードする遺伝子（ＶＪＬ
）は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
から、下記のようにｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成
して、これを用いたＰＣＲ法を行うことにより決定され
得る。

【００２８】まず、本発明のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞、例えば、前記のＥＶＯ３４Ｂ
ＩＧまたはＥＶＯ３４ＢＩＧから、一般的手法により全
ＲＮＡを抽出する。さらに抽出された全ＲＮＡから、常
法により、例えば、市販のキットであるオリゴテックス
−ｄｔ３０（宝酒造社製）を用いて、ｍＲＮＡの単離を
行う。次いで、得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し
、これをＰＣＲの鋳型とする。

【００２９】次に，ＩｇＧの可変部領域中に存在する保
存的な配列をＫａｂａｔらのデータファイル（Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．
　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍｍａｎ　Ｓｅｒ
ｖｉｃｅｓ，　ＵＳ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎ
ｔｉｙ　Ｏｆｆｉｃｅ　（１９８７）から採用し、この
配列からプライマーを設計する。上記配列は成熟タンパ
ク質のアミノ末端付近に対応するＤＮＡ配列であり、シ
グナル配列が含まれていない。この配列の一部をＰＣＲ
に用いるプライマーとして選択する（プライマーの配列
を配列番号８〜１１に示す）。ＰＣＲにより得られる可
変部領域遺伝子の塩基配列を、例えば、Ｓａｎｇｅｒ，
　Ｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．
　ＵＳＡ　７４巻，５４６３頁　（１９７７））のジデ
オキシ法あるいはそれを改変した方法により決定する。

【００３０】このようにして得られたＤＮＡ配列を配列
番号５（Ｈ鎖）および配列番号６（Ｌ鎖）に示す。プラ
イマー部分の配列を考慮すると、Ｈ鎖の可変部領域をコ
ードする遺伝子は、配列番号５の３４番目のＣから３５
４番目のＴまでのＤＮＡ配列を有することがわかる。プ
ライマー部分を除いた目的のＤＮＡ配列に対応するアミ
ノ酸配列を配列番号１に示す。Ｌ鎖の可変部領域をコー
ドする遺伝子は、配列番号６の３２番目のＣから３４０
番目のＡまでのＤＮＡ配列を有する。このＤＮＡ配列に
対応するプライマー部分を除いた目的のアミノ酸配列を
配列番号２に示す。

【００３１】ところで、上記ハイブリドーマＥＶＯ３４
ＢＩＧ，ＥＶＯ１４１１Ｇなどにより産生される抗ＰＴ
ＨｒＰモノクローナル抗体は、高カルシウム血症の治療
・予防剤として有用であるが、これらのハイブリドーマ
はげっ歯類であるマウス由来であるため、これをヒトに
長期間投与するとアレルギー反応が起こる場合がある。 上記のように、このモノクローナル抗体の可変部領域の
配列が明かになったため、次に発明者らは、これをヒト
抗体の定常部領域に結合させたげっ歯類／ヒトキメラモ
ノクローナル抗体の調製を試みた。

【００３２】本発明のげっ歯類／ヒトキメラモノクロー
ナル抗体を作製するために必要なヒト免疫グロブリン定
常部領域遺伝子（Ｈ鎖の定常部領域に対応する遺伝子：
Ｃγｌ、およびＬ鎖の定常部領域に対応する遺伝子：Ｃ
к）は、例えば、ヒト免疫グロブリン産生ガン細胞ＡＲ
Ｈ−７７［ＡＴＣＣ（アメリカン　　タイプカルチャー
　　コレクション）より入手可能である］から得られう
る。 　　まず、ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ　　ＣＲＬ−１６２
１）を培養し、得られた細胞からゲノムＤＮＡを得る。 このゲノムＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を得るため
に必要とされる制限酵素を用いて完全に分解した後、ア
ガロースゲル電気泳動で分子量分画し、該目的のＤＮＡ
断片（Ｃγｌを含むＤＮＡ断片およびＣкを含むＤＮＡ
断片）を得る。

【００３３】このようにして得られるＤＮＡ断片は、適
当なクローニングベクターに組み込まれて、ＤＮＡライ
ブラリーが構築される。例えば、ヒトＩｇＧのＣγｌを
含むＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩで切断したラムダクロー
ニングベクターＥＭＢＬ４（ストラタジーン社製）にク
ローニングし、Ｈ鎖ファージライブラリーが構築される
。一方、ヒトＩｇＧのＣкを含むＤＮＡ断片は、Ｅｃｏ
ＲＩで切断したラムダクローニングベクターλｇｔ１０
（ストラタジーン社製）にクローニングし、同様にして
、Ｌ鎖ファージライブラリーが構築される。

【００３４】このようにして増幅されたＤＮＡ断片から
、目的とするＣγｌおよびＣк断片を、プローブを用い
たハイブリダイゼーション法によりスクリーニングする
。上記プローブは、Ｅｌｌｉｓｏｎ　Ｊ．Ｗら（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１０巻、
４０７１頁（１９８２）が明かにしたＣγｌおよびＣк
の配列に基づいて作製される。例えばＣγｌの遺伝子か
ら２個のプローブ（プローブＨ１およびＨ２；それぞれ
配列番号１２および１３に示される）が設計される。プ
ローブＨ１およびＨ２は、ＡＲＨ−７７のＪＨ領域（Ｋ
ｕｄｏｕ　Ａ．　Ｊ．　Ｉｍｎ．　１３５巻、６４２頁
（１９８５））およびフレームワーク領域に対応する遺
伝子配列である。他方、Ｃк遺伝子からプローブＬ１（
配列番号１４に示す）が設計される。

【００３５】上記ヒトＩｇＧ定常部領域遺伝子のスクリ
ーニングは、常法に従って、プラークハイブリダイゼー
ション法により行われる。まず上記各々のファージライ
ブラリーを適切な株に感染させ、上記プローブとハイブ
リダイズするプラークをスクリーニングする。次にジデ
オキシ法で塩基配列の決定を行い、タンパク質をコード
する部分の遺伝子が、すでに明かになっているＣγｌま
たはＣкの配列と一致することを確認する。それぞれの
挿入断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、サブクロ
ーニングする。例えば、Ｃγｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩと
ＸｂａＩとで切り出し、ｐＵＣ１９にサブクローニング
し、Ｃγｌ断片を有するベクターであるｐＵＣ−Ｃγｌ
を得る。同様にＣк断片をＥｃｏＲＩで切り出し，ｐＵ
Ｃ１９にサブクローニングし、Ｃкを有するベクターで
あるｐＬ１４−２を得る。

【００３６】上記抗ＰＴＨｒＰ抗体のＨ鎖の可変部領域
をコードするマウス由来のＤＮＡ配列、抗ＰＴＨｒＰ抗
体のＬ鎖の可変部領域をコードするマウス由来のＤＮＡ
配列、ヒトＩｇＧのＨ鎖の定常部領域をコードするＤＮ
Ａ発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して
得られる形質転換体により、上記マウス由来の抗ＰＴＨ
ｒＰ抗体の可変部領域とヒトＩｇＧの定常部領域とを有
するキメラモノクローナル抗体が生産され得る。

【００３７】上記発現ベクターの構築を行うために、ま
ず、上記マウスＶＤＪＨ遺伝子の修飾を行い、タンパク
質の分泌に不可欠なシグナル配列を付加する。例えば、
Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓらの報告（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　８１巻、３２７２頁（１９８
４））にある抗ＰＴＨｒＰ抗体（Ａｎｔｉ−ＣＥＡ　　
ＭｏＡｂ）のＨ鎖のシグナル配列の一部に対応する部分
を含む遺伝子を合成する。これをプライマー（配列番号
１５に示す）とし、上記ＶＤＪＨ遺伝子を鋳型としたＰ
ＣＲを行い、シグナル配列が付加されたＬＶＤＪＨ遺伝
子が得られる。同様に、マウスＶＪＬ遺伝子についても
上記Ａｎｔｉ−ＣＥＡ　　ＭｏＡｂのＬ鎖のシグナル配
列の一部に対応する部分を含む遺伝子を合成し、これを
プライマー（配列番号１６に示す）としてＰＣＲを行い
、シグナル配列が付加されたＬＶＪＬ遺伝子が得られる
。

【００３８】本発明のキメラ抗体発現ベクターを調製方
法の一例を次に説明する。

【００３９】まず、ｐＳＶｅＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
（ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．０４２０５０２をＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断して、平滑末端化し、ｐＸｂａＩリン
カーを付加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状化するとｐＳ
ＶｅＸｂａＩが得られる（図２）。このベクターにはＸ
ｂａＩ認識部位の上流にＳＶ４０の複製起点を含む初期
プロモーター領域が存在している。次に、上記ヒトＨ鎖
Ｃγｌ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ−Ｃγ１から切り
出した、Ｃγｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片と；上記マウス
Ｈ鎖のＬＶＤＪＨ遺伝子断片を含む断片と；ｐＳＶｅＸ
ｂａＩをＸｂａＩで切断したベクターとを連結すること
によりｐＳＶｅＨ２６が構築される（図２参照）。

【００４０】これとは別に、Ｃк遺伝子をｐＵＣ１９に
サブクローニングして得られるベクターｐＬ１４−２（
前出）由来のＣк遺伝子を含む断片；およびｐＳＶｅＸ
ｂａＩの切断断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結すること
により、ｐＳＶｅＬ２６が得られる（図３）。

【００４１】上記ｐＳＶｅＬ２６由来のｍＬＶＪＬ遺伝
子およびＣк遺伝子を有するＤＮＡ断片；およびｐＳＶ
ｅＨ２６由来のｍＬＶＤＪＨ遺伝子およびＣγｌ遺伝子
とを有するＤＮＡ断片とを連結することにより、これら
４種の遺伝子を有する発現ベクターであるｐＳＶｅＨＬ
２６が構築される（図４）。さらに、この発現ベクター
を動物細胞に導入することを考慮し、該ベクターに適当
な薬剤耐性遺伝子、例えば、ＤＨＦＲおよびＥｃｏ−ｇ
ｐｔが導入され、ｐＳＶｅＨＬ２６−ＤＭが構築される
（図５）。

【００４２】このようにして得られた発現ベクターは、
適当な宿主、例えば、マウス骨髄腫細胞あるいは、ハム
スター細胞株に導入される。例えば、マウス骨髄腫細胞
であるＦＯ細胞にＤＥＡＥ−デキストラン法で発現ベク
ターが導入され得る（高井俊行、細胞工学、９巻、６５
２頁（１９９０））。あるいは、ハムスター細胞である
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ
　　ＣＣＬ−６１）にリン酸カルシウム法で、Ｃｈｅｎ
ら、（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　７巻、２
７４５頁　　（１９８７）の方法により、発現ベクター
が導入され得る。

【００４３】宿主に発現ベクターが導入されたか否かは
、該ベクターが有する薬剤耐性マーカーを利用して調べ
ることが可能である、このようにして得られた形質転換
体が産生する抗体は、ＰＴＨｒＰに対する結合能を調べ
ることにより抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体であるこ
とが確認される。産生された抗体量は、例えば、ＥＬＩ
ＳＡ法により測定され得る。本法により得られた代表的
な形質転換体の名称を後述の実施例１０の表２に示す。

【００４４】このような形質転換体を適当な培地で培養
することにより抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクを
認識するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体が生産
される。このモノクローナル抗体は、上記マウス由来の
モノクローナル抗体と同等の性能を有し、高カルシウム
血症の治療・予防剤として好適に利用され得る。さらに
、このモノクローナル抗体をヒトに長期間にわたり投与
した場合もマウス由来のモノクローナル抗体の場合とは
異なり、アレルギー反応を引き起こすことがない。

【００４５】上記組み換えによるキメラ抗体発現ベクタ
ーの構築において、例えばマウスモノクローナル抗体遺
伝子の可変部領域遺伝子の特定部位を変異することによ
り、生成する抗体の１個または数個のアミノ酸の置換、
欠失、付加あるいは転位を起こさせることが可能であり
、よりＰＴＨｒＰに対して特異性や親和性の高い抗体に
改良することができる。

【００４６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４７】［実施例１］（ｒＰＴＨｒＰの調製）Ｍａ
ｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６４巻，１４８０６頁（１９８９））の方法に準じ、次
のようにＰＴＨｒＰ遺伝子を合成し、大腸菌に組み込ん
で発現させてｒＰＴＨｒＰを得、これを後述の実施例４
で得られた抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体で精製した
。

【００４８】まず、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシ
ステムス社製）を用いて、約１１０ｍｅｒの大きさのＤ
ＮＡ（いずれもＰＴＨｒＰの１〜１４１位のＤＮＡのう
ちの一部）を８本合成し、各ＤＮＡをＯＤＳカラム（山
村化学研究所製）を用いた高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所社製）で精製し、次いでアニールを行った
。その後、各ＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）により連結させ、目的とするＰＴＨｒＰ
（１−１４１）遺伝子を得た。このＰＴＨｒＰ遺伝子を
ベクターｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）に組み
込んで発現ベクターを得た。これを大腸菌ＪＭ１０５に
導入して形質転換体を得た。このｒＰＴＨｒＰ発現大腸
菌を大量調製した後、超音波処理により大腸菌を溶菌さ
せた後、ｒＰＴＨｒＰを抽出した。ｒＰＴＨｒＰ抽出物
をセファクリルＳ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）を
用いてゲル濾過し、分子量１万５千〜３万付近を分画し
た。この画分を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）と、後述の実施例４で精製して得た抗
ＰＴＨｒＰ（１−３４）モノクローナル抗体とをカップ
リングさせた（５ｍｇ／担体）抗体カラムにチャージし
て精製した。一回の精製で取得されたｒＰＴＨｒＰは約
１０ｍｇであった。

【００４９】［実施例２］（抗ＰＴＨｒＰモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの調製）ＰＴＨｒＰのＮ末端
部分のペプチドであるＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチ
ド研究所製）、または実施例１で得られたｒＰＴＨｒＰ
ペプチド５０μｇをフロイント完全アジュバントと混合
した後、８〜１２週令のＢａｌｂ／ｃマウスの皮下へ免
疫した。初回免疫後、３週間間隔で計３回の追加免疫を
行った。細胞融合に供する７日、５日、３日、２日、お
よび１日前に、マウス尾静脈より一匹当り５μｇの上記
ペプチドを投与した。その後、マウス脾を摘出し、免疫
脾細胞を得た。

【００５０】次に、免疫脾細胞とマウスミエローマ細胞
（ＦＯ）とを２：１の割合で混合し、ポリエチレングリ
コール１５００の存在下で融合させ、１０％ＦＢＳを含
むイスコフ改変ダルベッコ培地に、脾細胞が２×１０６
個／ｍｌになるように調整し、９６穴マイクロプレート
に０．１ｍｌ／ウェルの割合で分注した。翌日、ＨＡＴ
培地を０．１ｍｌ／ウェルの割合で加え、以後１日おき
に培地の半量を新しいＨＡＴ培地と交換した。約２週間
後、ハイブリドーマのコロニーの形成が見られた。この
コロニーをさらに２４穴プレートで培養し、ＰＴＨｒＰ
（１−３４）由来のハイブリドーマクローン４２０株お
よびｒＰＴＨｒＰ由来のハイブリドーマクローン６１７
株を得た。

【００５１】これらのハイブリドーマクローンの培養上
清中に抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体が産生されてい
るか否かを、次のように酵素抗体法により検討した。ま
ず、ｒＰＴＨｒＰを用い、１００ｎｇ／ウェルの割合で
コーティングした９６穴プレートにハイブリドーマの培
養上清を加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄した後
、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを加え
た。さらに洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン液を加
え、室温にて２０分間発色させた。４Ｎ硫酸を加えて反
応を停止させた後、４９２ｎｍで吸光度を測定した。

【００５２】以上の操作により、抗原としてＰＴＨｒＰ
（１−３４）を用いた場合には１９１株の、またｒＰＴ
ＨｒＰを用いた場合には３５８株の抗ＰＴＨｒＰモノク
ローナル抗体を産生しているハイブリドーマクローンが
得られたことがわかった。

【００５３】次に、これらのハイブリドーマクローンの
培養上清を用いて、ｒＰＴＨｒＰに対する抗ＰＴＨｒＰ
モノクローナル抗体の中和活性能について検討した。Ｇ
ｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｇ．Ｅ．ら（Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６２巻，１５８４５頁（１９８７））の方法に
準じて、次の方法により、〔Ｈ〕アデニンを取り込ませ
た、ＲＯＳ１７／２．８細胞またはＵＭＲ１０６細胞に
おける〔Ｈ〕ＡＴＰから〔Ｈ〕ｃＡＭＰへの変換を指標
として測定した。まず、４８穴マルチウェルプレートに
２．５×１０４個／ウェルのＲＯＳ１７／２．８細胞ま
たはＵＭＲ１０６細胞を接種し、ＦＢＳを１０％の割合
で添加したＤＭＥ培地中で３日間培養した。 培養液を除去した後、Ｈａｎｋｓの平衡塩類液で２回洗
浄し、新しい培地および１μＣｉ／ｍｌの〔Ｈ〕アデニ
ンを加え、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を
さらに２回洗浄した後、１ｍＭ３−イソブチル−１−メ
チルキサンチン（ＩＢＭＸ；シグマ社製）を含み、ＦＢ
Ｓを２％の割合で添加したＤＭＥ培地５０μｌを加え３
７℃で５分間インキュベートした。次いでハイブリドー
マ培養上清２５μｌおよびｒＰＴＨｒＰ溶液（最終濃度
１０−７〜１０−１Ｍ）２５μｌを加え、さらに１０分
間インキュベートした。次いで、トリクロル酢酸（最終
濃度０．１２Ｍ）１ｍｌを加えて反応を終了させ、４Ｎ
　ＮａＯＨ　２０μｌで中和した。合成されたｃＡＭＰ
は、Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｙ．ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５８巻，５４１頁（１９７４））の方法にしたが
って分離した後、その放射活性を測定し、ｒＰＴＨｒＰ
に対する抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体の中和活性能
を評価した。

【００５４】以上の操作により、抗原としてＰＴＨｒＰ
（１−３４）を用いた場合には１０８株が、そしてｒＰ
ＴＨｒＰを用いた場合には３５株が、ｒＰＴＨｒＰを中
和する活性を有する抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体を
産生しているハイブリドーマクローンであることがわか
った。

【００５５】［実施例３］（ハイブリドーマにより産生
された抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体のイムノグロブ
リンクラスおよびサブクラス）実施例２で得られた中和
活性能のある抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株が産生する抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗
体のイムノグロブリンクラスおよびサブクラスについて
検討した。イムノグロブリンクラスおよびサブクラスの
検討は、免疫グロブリンサブクラスポリクローナル抗体
を用い、実施例２で用いた酵素抗体法に従って行った。 代表例としてＰＴＨｒＰ（１−３４）由来およびｒＰＴ
ＨｒＰ由来の各々５株、計１０株の結果を表１に示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】［実施例４］（抗ＰＴＨｒＰモノクローナ
ル抗体の調製）実施例３のハイブリドーマクローン１０
株の細胞を各々、２週間前にプリスタン０．５ｍｌを腹
腔内投与した１０〜１２週令Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔
内に、５×１０６個／匹の割合で接種した。腹水が充分
に生産された後、この腹水を回収した。腹水中のモノク
ローナル抗体は、硫安塩析し、さらに１０ｍＭリン酸二
水素カリウム（ｐＨ６．０）で透析した後、ベーカーボ
ンドＡＢＸカラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社製）を用いて２
５０ｍＭリン酸二水素カリウム（ｐＨ６．８）のグラジ
エントにより精製した。得られた抗ＰＴＨｒＰモノクロ
ーナル抗体は２０．５〜５８．７ｍｇであった。

【００５８】［実施例５］（抗ＰＴＨｒＰモノクローナ
ル抗体の高カルシウム血症動物モデルでの特性）実施例
４で得られた抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体の高カル
シウム血症動物モデルでの治療・予防効果を、浸透圧ポ
ンプ（アルザ社製；モデル２００２）を用いた系で検討
した。まず、浸透圧ポンプに１％牛血清アルブミンを含
む生理食塩水に溶解させたｒＰＴＨｒＰ（１．７５ｍｇ
／ｍｌ）２００μｌを充填し、その浸透圧ポンプを１０
週令のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に埋め込み、２日毎
に尾静脈より血液を５０μｌずつ採取し、血清中のＣａ
レベルを原子吸光度計（日立製作所：モデルＺ６１００
）を用いて測定した。

【００５９】予備実験で浸透圧ポンプをマウス生体内に
埋め込んだ後、約５〜６日目で血清中のＣａレベルが１
９〜２０ｍｇ／ｄｌになることが判明したので、浸透圧
ポンプを埋め込んでから６日目に、実施例４で精製した
抗ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体３００μｇをマウス尾
静脈内へ投与してその効果を検討した。その結果を図１
に示す。図１に示すように、実施例４で得られた精製抗
ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体は高カルシウム血症治療
・予防剤として有効であることが判明した。

【００６０】［実施例６］（抗ＰＴＨｒＰモノクローナ
ル抗体のＦ（ａｂ’）２断片の調製）０．０５Ｍクエン
酸ナトリウム／０．１５Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）の
緩衝液に実施例４で得られた精製抗ＰＴＨｒＰモノクロ
ナール抗体を溶解させ、これをペプシン（シグマ社製）
を用いて３７℃で５分間消化した。上記ペプシンは該抗
ＰＴＨｒＰモノクローナル抗体の３５分の１重量の量を
使用した。次いで、３Ｍ　トリス（ｐＨ８．６）を１／
３容量添加して反応を停止させた。

【００６１】消化物を１０ｍＭ　　リン酸二水素カリウ
ム（ｐＨ６．０）で透析した後、ベーカーボンドＡＢＸ
カラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社製）を用いて、２５０ｍＭ
リン酸二水素カリウム（ｐＨ６．８）のグラジエントに
よるイオン交換クロマトグラフィーを行い、精製Ｆ（ａ
ｂ’）２断片を回収した。非還元条件下でのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル電気泳動により検討したところ、分子量１２
２，０００ダルトンの単一バンドが得られた。

【００６２】このＦ（ａｂ’）２断片精製物は、酵素抗
体法、アデニレートサイクレース促進活性の阻害活性お
よび高カルシウム血症動物モデルにおいて、消化前のＩ
ｇＧと同一の特異性および反応性を有していることが確
認された。

【００６３】［実施例７］（抗ＰＴＨｒＰモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマからの該モノクローナル抗体
可変部領域遺伝子［ＶＤＪＨ（Ｈ鎖）およびＶＪＬ（Ｌ
鎖）］の単離）以下のように、抗ＰＴＨｒＰモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマからｍＲＮＡを単離しｃＤ
ＮＡを合成後、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクシ
ョン）法を用いて、ＶＤＪＨ遺伝子およびＶＪＬ遺伝子
のクローニングを行った。

【００６４】７−１．全ＲＮＡの抽出 ハイブリドーマ細胞ＥＶＯ３４ＢＩＧの培養液を遠心分
離（１２００ｒｐｍ）にかけ、該ハイブリドーマ細胞を
約３Ｘ１０８個得た。これを、リン酸緩衝化生理食塩水
（以下ＰＢＳと略す）で洗浄し、この細胞からトータル
ＲＮＡセパレーター（クローンテック社製）を用いて全
ＲＮＡを抽出した。その方法は添付されたプロトコール
に従った。得られたＲＮＡをトリスーＥＤＴＡ緩衝液（
以下ＴＥと略す）（ｐＨ７．５）に溶解させて全ＲＮＡ
サンプルとした。

【００６５】７−２．ｍＲＮＡの精製 上記７−１項で抽出した全ＲＮＡからのｍＲＮＡの精製
は、オリゴテックスーｄｔ３０（宝酒造社製）を用いて
行った。方法は添付されたプロトコールに従い、フェノ
ールで抽出して、エタノール沈澱後、ＴＥに溶解させて
、ｍＲＮＡサンプルを得た。

【００６６】７−３．ｃＤＮＡの合成 可変部領域の遺伝子（ＶＤＪＨおよびＶＪＬ）をＰＣＲ
法によってクローニングするため、７ー２項で得られた
ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成はｃＤＮＡ合成
試薬（ファルマシア社製）を使用し、付属のプロトコー
ルに従った。このプロトコールはＧｕｂｌｅｒ，Ｕ．ら
（Ｇｅｎｅ、２５巻、２６３頁（１９８３）），Ｈａｎ
ａｈａｎ．Ｄ．（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ（Ｇｌｏｖｅｒ
，Ｄ．Ｍ．，編），ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
，１巻，１０９頁（１９８５）），Ｓｃａｌｅｎｇｈｅ
，Ｆ．ら（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ　　８２巻，２０５頁
（１９８５））、Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ら（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１５４巻，３頁
（１９８７））などの文献を参考にしている。得られた
ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、スパン
カラムで精製することによりｃＤＮＡサンプルを得た。

【００６７】７−４．可変部領域遺伝子（ＶＤＪＨおよ
びＶＪＬ）のクローニング ＩｇＧの可変部領域中の保存的なＤＮＡ配列を、Ｋａｂ
ａｔ　らのデータファイル（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ
　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉ
ｎｔｅｒｅｓｔ，　ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　ｏｆ　Ｈｅａｌ
ｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　ＵＳ
　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆｆｉ
ｃｅ，（１９８７））から採用した。このヌクレオチド
配列は、成熟タンパク質のアミノ末端から始まるアミノ
酸配列をコードしており、このタンパクのシグナル配列
は含まない。このＤＮＡ配列をもとにし、ＰＣＲに用い
る次の４種のプライマー（配列番号８〜１１に塩基配列
を示す）を作成した。これらのプライマーは、ＤＮＡ合
成機（アプライドバイオシステムズ社製　Ｍｏｄｅｌ　
３８１Ａ）にて合成した：ＶＤＪＨ５’５’ＴＣＴＡＧ
ＡＡＴＧＣ　ＡＧＧＴ（ＣＴ）ＣＡＧＣＴ　Ｇ（ＡＣ）
ＡＧＣＡＧＴＣ（ＡＴ）　ＧＧ　３’ＶＤＪＨ３’５’
ＧＧＴＧＴＴＣＣＴＣ　ＧＡＧＧＴＣＴＡＧＴ　ＧＡＣ
ＣＧＴＧＧＴＣ　ＣＣＴ（ＧＴ）（ＣＧ）（ＧＡ）ＣＣ
ＣＣ　ＡＧ　３’ＶＪＬ５’５’ＣＧＴＧＧＣＴＣＴＡ
　ＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧ　ＴＧ（ＡＣ）ＴＧＡＣＣＣＡ
　ＧＴＣＴＣＣＡ　３’ＶＪＬ３’５’ＡＡＣＴＣＧＡ
ＧＣＣ　ＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ　Ｃ（ＣＡ）（ＣＧ）Ｃ
（ＡＴ）ＣＣＧＡＡ　ＣＧＴＧ　３’。

【００６８】上記ＶＤＪＨ５’およびＶＤＪＨ３’また
はＶＪＬ５’およびＶＪＬ３’をプライマーとし、上記
ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより抗体可
変部領域の特異的な配列（Ｈ鎖またはＬ鎖の）が増幅さ
れる。ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅についてはＥｒｌｉｃ
ｈ，Ｈ．Ａ．編（　ＰＣＲ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，　Ｓ
ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載され
ている。本実施例においては遺伝子増幅試薬（宝酒造社
製）を用いて上記ＰＣＲを行った。ｃＤＮＡクローニン
グに用いた上記プライマーは制限酵素切断部位を有して
いるので、ｃＤＮＡクローニングおよび増幅の結果、Ｖ
ＤＪＨおよびＶＪＬのそれぞれ５’側にＸｂａＩ或いは
３’側にＸｈｏＩが導入される。

【００６９】７−５．可変部領域遺伝子の塩基配列７−
４でクローニングした可変部領域遺伝子の塩基配列をＳ
ａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４巻，５４６３頁（１９７７）
）のジデオキシ法を改変した試薬（東洋紡績社製）を用
いて塩基配列を決定した。その結果を配列番号５および
配列番号６に示す。さらに、それらの塩基配列から推定
されるアミノ酸配列を配列番号３および配列番号４に示
す。

【００７０】［実施例８］（ヒト免疫グロブリン定常部
領域遺伝子（Ｃγ１（Ｈ鎖）および、Ｃκ（Ｌ鎖））の
クローニング）マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体
を作成するために必要なヒトのＣγ１およびＣκをヒト
免疫グロブリン産生癌細胞ＡＲＨー７７からクローニン
グした。

【００７１】８−１．　　染色体ＤＮＡの分離ヒト免疫
グロブリン産生癌細胞ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ　　ＣＲ
Ｌ−１６２１）を、１０％牛胎児血清（以下ＦＣＳと略
する、大日本製薬社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（
大日本製薬社製）で培養した。得られた細胞をＰＢＳで
洗浄し、ＴＮＥ溶液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），０．１Ｍ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ］
に均一に懸濁した。そこに、プロテイナーゼＫ（ベーリ
ンガー社製）を、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌにになる
ように、そしてＳＤＳを、その最終濃度が０．３％にな
るようにそれぞれを加えて攪拌後、６０℃に４時間保っ
た。等量のフェノールを加えて２時間攪拌した後、３０
００ｒｐｍで，１０分間遠心分離して水層を回収し、も
う１度フェノール抽出を繰り返した。水層に等量のクロ
ロホルムを加えて緩やかに浸盪後、３０００ｒｐｍで，
５分間遠心分離した。これに０．１容量の３Ｍ酢酸ナト
リウムおよび等容量のイソプロパノールを加えて、繊維
状になった染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き取り、エタノ
ールで洗浄した後、風乾し、適当量のＴＥに溶解した。 １０分間煮沸した１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを１／５０
量加えて１時間３７℃でインキュベートした後、再びフ
ェノール抽出、エタノール沈澱を行って精製した。最終
的にＴＥに溶解することにより染色体ＤＮＡを約３ｍｇ
得た。

【００７２】８−２．Ｃγ１を含むＤＮＡ断片およびＣ
кを含むＤＮＡ断片の調製 ８−１項で得られた染色体ＤＮＡを、次のように制限酵
素で完全分解した後、アガロースゲル電気泳動で分子量
分画した。まず、染色体ＤＮＡ３００μｇを１０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　　塩
化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム中で３００ｕ
ｎｉｔのＥｃｏＲＩとともに１晩３７℃に保持し、完全
切断した。これをフェノール抽出し、エタノール沈澱後
、ＴＥに溶解させた。このサンプルを０．７５％アガロ
ース電気泳動で、１００Ｖで，３時間泳動後、同時に泳
動した分子量マーカーをもとに約２ｋｂおよび約１５ｋ
ｂと思われる位置のゲルに切れ込みを入れた。そこにＤ
ＥＡＥペーパー（東洋濾紙社製ＤＥＡＥイオン交換フィ
ルター）を差し込み泳動を続けることで２ー４ｋｂおよ
び１５ー３０ｋｂのＤＮＡをペーパーに吸着させた。目
的のＤＮＡを吸着させた後、ゲルからペーパーを取り出
し１．５Ｍ　　塩化ナトリウム溶液中でペーパーからＤ
ＮＡを溶出し、フェノール抽出およびエタノール沈澱を
行い、ＴＥに溶解させた。このようにしてＣγｌを含む
ＤＮＡ断片またはＣкを含むＤＮＡ断片が溶解したＴＥ
溶液が得られた。

【００７３】８−３．染色体ＤＮＡファージライブラリ
ーの調製 ８−２項で得られたＣγｌを含むＤＮＡ断片（１５−３
０ｋｂのＤＮＡ）１μｇと、ＥｃｏＲＩで切断したラム
ダクローニングベクターＥＭＢＬ４（ストラタジーン社
製）２．５μｇとをライゲーション試薬（宝酒造社製）
を用い、２６℃で１０分間反応させて連結した。このよ
うにして、Ｃγｌを含むＤＮＡ断片のクローニングを行
った。その後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　パッケージング試薬
（ストラタジーン社製）のプロトコールに従ってパッケ
ージングしてＨ鎖ファージライブラリーとした。

【００７４】これとは別に、８−２項で得られたＣкを
含むＤＮＡ断片（２−４ｋｂのＤＮＡ）１μｇとを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断したラムダクローニングベクターλｇｔ
１０（ストラタジーン社製）２．５μｇとをライゲーシ
ョン試薬（宝酒造社製）を用いて、２６℃で１０分間反
応して連結した。このようにＣкを含むＤＮＡ断片のク
ローニングを行った。

【００７５】８−４．ヒトＩｇＧ定常部遺伝子のプロー
ブの作製 Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０巻、４０７１頁（１９８
２））が明らかにしたＡＲＨ−７７由来のＣγ１の配列
から次に示すプローブＨ１およびプローブＨ２を設計し
た。 　　　　　　プローブＨ１（配列番号１２に示す）　　
　　　　　　　　　　　５’　ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡ
ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡ
ＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡ　　３’　　　　　　プロー
ブＨ２（配列番号１３に示す）　　　　　　　　　　　
　　５　’ＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣ
ＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡ
ＣＣＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＣＴＣＣ
ＴＣＡ　　３’これらのプローブは、ＤＮＡ合成機で合
成された。これらのプローブはそれぞれＡＲＨー７７の
ＪＨ領域およびフレームワーク領域の遺伝子配列である
。

【００７６】これとは別に、Ｅｌｌｉｓｏｎ，　Ｊ．Ｗ
．　（前出）のＣκ遺伝子から次に示すプローブＬ１を
設計した。 　　　　　　プローブＬ１（配列番号１４に示す）　　
　　　　　　　　　５　’ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣ
ＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣ
ＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴ　　３’このプローブもＤＮ
Ａ合成機で合成された。この配列はＣκ遺伝子の５’末
端側５０ｂｐの配列である。プローブの標識は、ＤＮＡ
５’末端標識用試薬（宝酒造社製）を用いて行った。６
５℃で１０分加熱して酵素を失活させた後、セファデッ
クスＧ−５０を詰めたカラム（ファルマシア社製）で精
製して使用した。

【００７７】８−５．ヒトＩｇＧ定常部領域遺伝子のス
クリーニング ＣγｌおよびＣκ遺伝子のスクリーニングは常法に従っ
てプラークハイブリダイゼーション法で行った。８ー２
項で作製したファージライブラリーのうちＣγｌを含む
ＤＮＡを有するλＥＭＢＬ４は大腸菌Ｐ２−３９２株に
、Ｃкを含むＤＮＡを有するλｇｔ１０はＮＭ５１４株
に感染させ、８ー４項で作製したプローブとハイブリダ
イズするプラークをスクリーニングした。その結果、プ
ローブＨ１およびＨ２とハイブリダイズする株Ｈ１−８
、そして、プローブＬ１とハイブリダイズする株Ｌ１４
−２を得た。それらから得られた挿入断片の塩基配列を
ジデオキシ法で決定した。タンパク質をコードする部分
の遺伝子は、どちらにおいても既知の配列と一致するこ
とを確認した。それぞれの挿入断片を制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＸｂａＩ、あるいはＥｃｏＲＩを用いて切
り出し、ｐＵＣ１９にサブクローニングし、ｐＵＣーＣ
γ１あるいはｐＬ１４−２を得た。

【００７８】［実施例９］（キメラ抗体発現ベクターの
作製）キメラ抗体発現ベクターは以下のようにして作製
した。

【００７９】９−１　　マウス遺伝子の修飾７−４項で
クローニングしたマウスＶＤＪＨ遺伝子にはタンパク質
の分泌に不可欠なシグナル配列が含まれていない。従っ
て、Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓ．らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１巻，３２７２頁
（１９８４））にある抗体（Ａｎｔｉ−ＣＥＡ　ＭｏＡ
ｂ）のシグナル配列に対応する部分を含む遺伝子を合成
し、これをプライマー（プライマーＬＨ）としてＰＣＲ
を行った。その結果、該抗体のシグナル配列がＶＤＪＨ
遺伝子に付加されたＬＶＤＪＨ遺伝子を得た。そのプラ
イマーＬＨの配列を以下に示す。さらに、配列番号１５
に示す。 　　プライマーＬＨ　５’ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣ
ＴＴＣＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＡＣＣＴＴＧ
ＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＧＴ
ＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣ　　　　３
’そして得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＸｂａＩー
ＳａｌＩ部位にサブクローニングした。

【００８０】同様にマウスＶＪＬ遺伝子にも次のように
してシグナル配列を付加した。まず、Ａｎｔｉ−ＣＥＡ
　ＭｏＡｂのＬ鎖シグナル配列に対応する部分を含む遺
伝子を合成し、これをプライマーとしてＰＣＲを行い、
シグナル配列がＶＪＬ遺伝子に付加されたＬＶＪＬ遺伝
子を得た。これをｐＵＣ１９のＸｂａＩ−ＳａｌＩ部位
にサブクローニングした。プライマーＬＬの配列を以下
に示す。さらに配列番号１６に示す： 　　プライマーＬＬ　５’　　ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧ
ＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡ
ＧＧＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＣＡ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣ
ＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧ
ＡＣＣＣＡＧＴＣＴ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＣＣＡＣＴＣＴＣＣ　　　　３’。

【００８１】９ー２．キメラ抗体発現ベクターの調製ま
ず、ｐＳＶｅＳａｌＩ（特開昭６２ー１４７８３）を制
限酵素ＮｃｏＩで切断し、大腸菌内での複製起点（ｏｒ
ｉ）及びアンピシリン耐性を付与する約４．７ｋｂの断
片を単離した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてこれを環状
化し、ｐＳＶｅＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ヨーロッパ
特許出願公開Ｎｏ．０４２０５０２）を作成した。これ
を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに導入して増幅させ
た。このベクターを図２に示すように、ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断、平滑末端化し、ｐＸｂａＩリンカーを付加し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで環状化しｐＳＶｅＸｂａＩを得た
。これを大腸菌ＤＨ５αに導入して増幅させた。図２に
示すように、このベクターｐＳＶｅＸｂａＩにはＸｂａ
Ｉ認識部位の上流にＳＶ４０の複製起点を含む初期プロ
モーター領域が存在している。次に、実施例８で得られ
たプラスミドｐＵＣーＣγ１（ヒトＨ鎖Ｃγ１遺伝子を
含む制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩ断片約６ｋｂが
サブクローニングされている）からＨｉｎｄＩＩＩとＸ
ｂａＩとでＣγｌ遺伝子を切り出した。このＣγ１遺伝
子と、上記９ー１項で得られたマウスＨ鎖のＬＶＤＪＨ
遺伝子断片と、ｐＳＶｅＸｂａＩをＸｂａＩで切断した
ベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結してｐＳＶｅＨ
２６を構築した。その工程を図２に示す。

【００８２】次に、実施例８で得られたｐＬ１４−２（
ヒトＣк遺伝子をｐＵＣ１９にサブクローニングして得
られる）の５’末端に近いＥｃｏＲＩ部位のみを部分分
解し、さらにｐＨｉｎｄＩＩＩリンカーを用いてＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に変換した（図３参照）。これをＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してＣκ遺伝子を含む領
域を切り出した。次に、ｐＵＣ１９にサブクローニング
したマウスＬＶＪＬ遺伝子を、ＸｂａＩ並びにＨｉｎｄ
ＩＩＩで切り出した。上記ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片と、ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と、ｐＳＶｅＸ
ｂａＩをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断して得られる
断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結して、ｐＳＶｅＬ
２６を作製した（第３図）。ｐＳＶｅＬ２６は、図３に
示すようにｍＬＶＪＬ遺伝子とヒトＣк遺伝子とを有す
る。

【００８３】次に、このｐＳＶｅＬ２６のＴｔｈ１１１
Ｉ部位を平滑末端にし、ｐＢａｍＨＩリンカーを利用し
てＢａｍＨＩ認識部位を導入した（図４）。そしてＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断することによってｍＬＶ
ＪＬ遺伝子およびヒトＣк遺伝子を含む断片を切り出し
た。得られた断片とｐＳＶｅＨ２６をＢａｍＨＩおよび
ＥｃｏＲＩで切断して得られる断片とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結することにより、キメラ抗体発現ベク
ターであるｐＳＶｅＨＬ２６を得た。上記工程を図４に
示す。

【００８４】このキメラ抗体発現ベクターを動物細胞へ
導入するこも考慮し、次のようにして、このベクターに
薬剤耐性遺伝子を導入した。まず、Ｙａｍａｓｈｉｔａ
，Ｋ．らのｐＳＶｅＬＴｄｈ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，５４巻，２８０１頁（１９９０））のＴｔ
ｈ１１１Ｉ部位をＢａｍＨＩ認識部位に変換し、Ｂａｍ
ＨＩで切断することによって大腸菌キサンチンーグアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏ−ｇｐｔ
）およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の、それぞ
れ発現ユニットを含む遺伝子をＢａｍＨＩ断片として単
離した（図５）。この遺伝子断片をｐＳＶｅＨＬ２６の
ＢａｍＨＩ部位へ挿入、連結してｐＳＶｅＨ２６−ＤＭ
を得た。この工程を図５に示す。

【００８５】［実施例１０］（キメラ抗体発現ベクター
の動物細胞への導入および選択）実施例９ー２で作製し
たｐＳＶｅＨＬ２６−ＤＭをマウス骨髄腫細胞株、ある
いはハムスター細胞株に導入した。

【００８６】１０ー１．マウス骨髄腫細胞への遺伝子導
入 マウス骨髄腫細胞である、ＦＯ細胞に、ＤＥＡＥーデキ
ストラン法で発現ベクターを導入した。上記方法は、高
井ら（高井俊行、細胞工学、９巻，６５２頁（１９９０
））に従った。形質転換株の選択は、１０％ＦＣＳを含
むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）にセ
レクション試薬（最終濃度：２００μｇ／ｍｌキサンチ
ン、５μｇ／ｍｌアデニン、５μｇ／ｍｌチミジン、２
．５μｇ／ｍｌミコフェノール酸、０．１μｇ／ｍｌア
ミノプテリン）を加えた培地で行った。

【００８７】得られた形質転換株の抗体産生量を、次の
ようにＥＬＩＳＡ法で測定した。まず、９６穴プレート
に抗ヒトＩｇＧを入れて４℃で１晩コートした後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。次に１
％ゼラチンを含むＰＢＳで非特異的反応をブロックした
。上記形質転換株の培養上清を各ウエルに入れて３７℃
に１時間保ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗
体（抗ヒトＩｇＧＦｃ断片、あるいは抗ヒトＩｇＧκ鎖
）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。その後
、発色液（０．０４％ο−フェニレンジアミン、０．０
３３％過酸化水素、２５ｍＭクエン酸、５０ｍＭリン酸
水素２ナトリウム（ｐＨ５．０））を加えた。２０分後
に、４Ｎ硫酸を添加することで反応を停止し、４９２ｎ
ｍの吸光度を測定して、精製ヒト抗体を標準として生産
量を決定した。その結果、表２にその代表例を示すよう
に、抗体を発現している細胞が得られた。これらの株の
産生するキメラ抗体を用い、実施例２に従ってＰＴＨｒ
Ｐに対する結合能および中和能を調べたところ、マウス
モノクローナル抗体の場合といずれも同等の結果が得ら
れた。

【００８８】１０−２．ハムスター細胞への遺伝子導入
ハムスター細胞であるチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）（市販されている
）にＣｈｅｎ，Ｃ．ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
，７巻．２７４５頁（１９８７））に従って、リン酸カ
ルシウム法で発現ベクターを導入した。形質転換株の選
択は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにセレクション試薬
（最終濃度：２００μｇ／ｍｌキサンチン、５μｇ／ｍ
ｌアデニン、５μｇ／ｍｌチミジン、２５μｇ／ｍｌミ
コフェノール酸、０．１μｇ／ｍｌアミノプテリン）を
加えた培地で培養して行った。得られた形質転換株の抗
体産生量を、１０−１項と同様にＥＬＩＳＡ法で測定し
た。抗体を産生する株の代表例を表２に示す。これらの
株の産生するキメラ抗体を用い、実施例２に従ってＰＴ
ＨｒＰに対する結合能および中和能を調べたところ、マ
ウスモノクローナル抗体の場合といずれも同等の結果が
得られた。

【００８９】１０−３．キメラ抗体産生細胞の育種上記
１０−１項および１０−２項で得られたキメラ抗体発現
ベクターを含む形質転換株を、５０ｎＭから２００ｎＭ
のメソトレキセート（ＭＴＸ　　武田薬品工業社製）を
含む培地で約１月間培養を続け、ＭＴＸ耐性を示す株（
ＤＨＦＲ遺伝子を有する株）を分離した。その結果得ら
れた株の代表例を表２に示す。

【００９０】

【表２】

【００９１】１０−４　　形質転換細胞の培養および抗
体の精製 実施例１０ー３で得られた細胞のうち抗体生産量の高い
Ｆ２６−１０２株およびＦ２６−１０３株について、そ
れぞれ培養を行った。培養は、イスコフ改変ダルベッコ
培地（ＩＭＤＭ）に５μｇ／ｍｌトランスフェリンと１
ｍｇ／ｍｌＢＳＡを添加した無血清培地で行った。５％
ＣＯ２下で３７℃にて５日間培養して、約４リットルの
培養上清を得た。この培養上清からの抗体の精製は実施
例４と同様に行い、キメラ抗体をそれぞれ約１２ｍｇ得
た。

【００９２】［実施例１１］（キメラ抗体の高カルシウ
ム血症動物モデルでの特性）実施例１０−４で精製した
キメラ抗体を用いて実施例５と同様に高カルシウム血症
動物モデルでの治療および予防効果を測定した。その結
果、キメラ抗体はマウスモノクローナル抗体と同程度の
効果があり、高カルシウム血症の治療・予防剤として非
常に有効であることが明らかになった。

【００９３】さらに、ＰＴＨｒＰを産生する前立腺癌細
胞ＰＣ−３（大日本製薬より購入）をヌードマウスに移
植し、血中カルシウムレベルが１８〜２０ｍｇ／ｄｌに
なった時点で、実施例４または１０−４で調製した抗体
をそれぞれ３００μｇ尾静脈より投与（各ｎ＝５）し、
高カルシウム血症治療・予防効果を検討した。その結果
、各抗体投与区のマウスはすべて生存しており、１週間
以上にわたり正常カルシウムレベルが維持された。これ
に対して、対照区のマウスのカルシウムレベルは１８〜
２０ｍｇ／ｄｌと不変であり、平均３〜４日後にはほと
んどのマウスが死亡した。

【００９４】

【発明の効果】本発明によれば、このように抗ヒト副甲
状腺ホルモン関連タンパクモノクローナル抗体またはそ
れらのフラグメントを含む高カルシウム血症治療・予防
剤が得られる。これを用いると、従来の抗血清あるいは
ポリクローナル抗体を用いた方法に比べ、高成績でかつ
比較的長期間にわたり高カルシウム血症を治療すること
が可能となる。

【００９５】さらに、本発明においては、上記抗体の可
変部領域の配列を解明させた。これを利用して、遺伝子
操作の技術により、ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパク
を認識するげっ歯類／ヒトキメラモノクローナル抗体が
調製される。これを主成分とする高カルシウム血症予防
・治療剤を投与するとアレルギー反応がより低くおさえ
られるため、充分な治療効果が得られる。

【００９６】

【配列表】

【００９７】

【配列番号：１】配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅ
ｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ｓｅｒ
　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｍ
ｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ
　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　
Ｇｌｙ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌ
ａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓ
ｅｒ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８０Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅ
ｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ
　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　
　　　　　　　　　　９５Ｐｈｅ　Ｇｌｙ 　　　　　９８

【００９８】

【配列番号：２】配列の長さ：９２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌ
ｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　
Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　
Ｖａｌ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ
　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　
Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌ
ｅｕ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８０Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙ
ｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　
　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９
０　　　　　　９２

【００９９】

【配列番号：３】配列の長さ：１１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇ
ｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　
Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅ
ｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ
　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｔｒｐ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　
Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａ
ｌａ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８０Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　
Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　
　　　　　　　　　　９５Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈ
ｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ
　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　
　　１１０Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＴＨｒ 　　　　　　　　１１５

【０１００】

【配列番号：４】配列の長さ：１１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ｌｅｕ
　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　
Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓ
ｅｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６０Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ
　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８０Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅ
ｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　
　　　　　　　　　　９５Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈ
ｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　
　　１１０Ａｒｇ １１３

【０１０１】

【配列番号：５】配列の長さ：３５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　　ｔｏ　　ｍＲＮＡフラグメン
ト型：中間部フラグメント 配列 ＴＣＴＡＧＡ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＣＴ
Ｇ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＧＡＧ
　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　　　　５１ＧＧＧ
　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＴＣＣ　
ＴＧＣ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡＣ　Ｔ
ＣＡ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　　　　　　　９９ＧＧＣ　ＴＡ
Ｃ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＡＣ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ
　ＣＡＧ　ＡＧＣ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＡＧＣ　
ＣＴＴ　ＧＡＧ　　　　　　１４７ＴＧＧ　ＡＴＴ　Ｇ
ＧＡ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＴＡＣ　ＡＡ
Ｔ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＴＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡＣ
　ＣＡＧ　　　　　　１９５ＡＡＧ　ＴＴＣ　ＡＡＧ　
ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＧＣＣ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＡＣＴ　Ｇ
ＴＡ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＴＣＣ　ＴＣＴ　ＡＧＣ　ＡＣ
Ａ　　　　　　２４３ＧＣＣ　ＣＡＣ　ＡＴＧ　ＧＡＧ
　ＣＴＣ　ＣＧＧ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　
ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＧＴＣ　ＴＡＴ　　
　　　　２９１ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧ
Ｇ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＡＧ　ＴＴＴ
　ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　　　　　
　３３９ＧＧＧ　ＡＣＣ　ＡＣＧ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　Ａ
Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５
６

【０１０２】

【配列番号：６】配列の長さ：３４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ　　ｔｏ　　ｍＲＮＡフラグメン
ト型：中間部フラグメント 配列 Ｔ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＧ
　ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＣＴＣ　ＴＣＣ　
ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＧＴＣ　ＡＧＴ　　　　　４９ＣＴＴ
　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＣＣ　ＴＣＣ　ＡＴＣ　
ＴＣＴ　ＴＧＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　Ａ
ＧＣ　ＡＴＴ　ＧＴＡ　　　　　　　９７ＣＡＴ　ＡＧ
Ｔ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＡＣ　ＡＣＣ　ＴＡＴ　ＴＴＡ
　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　
ＣＣＡ　ＧＧＣ　　　　　　１４５ＣＡＧ　ＴＣＴ　Ｃ
ＣＡ　ＡＡＧ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡ
Ａ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＣＧＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ
　ＧＧＧ　　　　　　１９９ＧＴＣ　ＣＣＡ　ＧＡＣ　
ＡＧＧ　ＴＴＣ　ＡＧＴ　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　Ｔ
ＣＡ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＴＴＣ　ＡＣＡ　ＣＴ
Ｃ　　　　　　２４１ＡＡＧ　ＡＴＣ　ＡＧＣ　ＡＧＡ
　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　
ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＴＡＣ　ＴＧＣ　ＴＴＴ　　
　　　　２８９ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＣＡＴ　ＧＴ
Ｔ　ＣＣＧ　ＴＡＣ　ＡＣＧ　ＴＴＣ　ＧＧＴ　ＧＣＴ
　ＧＧＧ　ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　　　　　
　３３７ＣＧＡ　Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３４
１

【０１０３】

【配列番号：７】配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラブメント型：中間部フラグメント 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　　
Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ　　
Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　
Ｇｌｎ　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１５Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　
Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ｈｉｓ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０Ｔｈｒ
　　Ａｌａ 　　　　　　　　　　３４

【０１０４】

【配列番号：８】配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣ　　ＡＧＧＴＹＣＡＧＣＴ　　Ｇ
ＭＡＧＣＡＧＴＣＷ　　ＧＧ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３２

【０１０５】

【配列番号：９】配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＴＧＴＴＣＣＴＣ　ＧＡＧＧＴＣＴＡＧＴ　ＧＡＣ
ＣＧＴＧＧＴＣ　ＣＣＴＫＳＲＣＣＣＣ　ＡＧ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【０１０６】

【配列番号：１０】配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＣＴＣＴＡ　　ＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧ　　Ｔ
ＧＭＴＧＡＣＣＣＡ　　ＧＴＣＴＣＣＡ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３７

【０１０７】

【配列番号：１１】配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣ　　ＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ　　Ｃ
ＭＳＣＷＣＣＧＡＡ　　ＣＧＴＧ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３４

【０１０８】

【配列番号：１２】配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴ　ＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧ　ＧＧＣ
ＧＣＡＧＧＡＣ　ＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣ　ＴＴＣＧＧＡ
ＧＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４８

【０１０９】

【配列番号：１３】配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡ　　ＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣ　　Ｇ
ＴＣＴＧＧＧＧＣＣ　　ＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣ　　ＧＧ
ＴＣＡＣＣＧＴＣ　　ＴＣＣＴＣＡ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　６６

【０１１０】

【配列番号：１４】配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧ　　ＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴ　　Ｃ
ＴＴＣＡＴＣＴＴＣ　　ＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧ　　ＡＴ
ＧＡＧＣＡＧＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５０

【０１１１】

【配列番号：１５】配列の長さ：８９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧ　ＡＡＣＴＴＣＧＧＧＣ　ＴＣＡ
ＧＣＴＴＧＡＴ　ＴＴＡＣＣＴＴＧＴＣ　ＣＴＧＧＴＴ
ＴＴＡＡ　ＡＡＧＴＴＧＴＣＣＡ　　　　　６０ＧＴＧ
ＴＣＡＧＧＴＴ　ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ　ＡＧＴＣＴＧ
ＧＡＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８９

【０１１２】

【配列番号：１６】配列の長さ：１０９配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＧ　ＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡ　ＴＧＧ
ＡＧＡＣＡＣＡ　ＴＴＣＴＣＡＧＧＴＣ　ＴＴＴＧＴＡ
ＴＡＣＡ　ＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧ　　　　　６０ＧＴＴ
ＧＴＣＴＧＧＴ　ＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧ　ＡＡＡＴＴＧ
ＴＧＡＴ　ＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ　ＣＣＡＣＴＣＴＣＣ
　　　　　　　　　　　　　　　　１０９

【図面の簡単な説明】

【図１】高カルシウム血症動物モデルを用いた、抗ＰＴ
ＨｒＰ　モノクローナル抗体の高カルシウム血症に対す
る治療・予防効果を示すグラフである。

【図２】本発明のキメラモノクローナル抗体をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターを調製するために用いら
れるｐＳＶｅＨ２６の構築を示す説明図である。

【図３】本発明のキメラモノクローナル抗体をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターを調製するために用いら
れるｐＳＶｅＬ２６の構築を示す説明図である。

【図４】本発明のキメラモノクローナル抗体をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターであるｐＳＶｅＨＬ２６
の構築を示す説明図である。

【図５】本発明のキメラモノクローナル抗体をコードす
る遺伝子を有する発現ベクターであるｐＳＶｅＨＬ２６
−ＤＭの構築を示す説明図である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノ
   クローナル抗体およびその関連物質でなる群から選択さ
   れる少なくとも１種を有効成分として含有する高カルシ
   ウム血症治療・予防剤。
2. 【請求項２】前記モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）フ
   ラグメントおよび／または該フラグメントを含むペプチ
   ドを含む請求項１に記載の治療・予防剤。
3. 【請求項３】ハイブリドーマＥＶＯ３４Ｂ１ＧまたはＥ
   ＶＯ１４１１Ｇの産生するモノクローナル抗体の群から
   選択されるモノクローナル抗体を含有する請求項１に記
   載の治療・予防剤。
4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）フ
   ラグメントおよび／または該フラグメントを含むペプチ
   ドを含む請求項３に記載の治療・予防剤。
5. 【請求項５】抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノ
   クローナル抗体のＨ鎖可変部領域をコードする遺伝子断
   片であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコード
   する遺伝子配列を少なくともその一部に有する遺伝子断
   片。
6. 【請求項６】抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノ
   クローナル抗体のＬ鎖可変部領域をコードする遺伝子断
   片であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコード
   する遺伝子配列を少なくともその一部に有する遺伝子断
   片。
7. 【請求項７】抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノ
   クローナル抗体であって、その可変部領域の少なくとも
   一部に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、モノ
   クローナル抗体。
8. 【請求項８】抗ヒト副甲状腺ホルモン関連タンパクモノ
   クローナル抗体であって、その可変部領域の少なくとも
   一部に配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、モノ
   クローナル抗体。
9. 【請求項９】げっ歯類由来の可変部領域およびヒト由来
   の定常部領域を有し、ヒトの副甲状腺ホルモン関連タン
   パクを認識するげっ歯類／ヒトキメラモノクローナル抗
   体、またはその誘導体。
10. 【請求項１０】前記キメラモノクローナル抗体が高カル
    シウム血症の治療効果を有する、請求項９に記載のモノ
    クローナル抗体またはその誘導体。
11. 【請求項１１】請求項９に記載のキメラモノクローナル
    抗体をコードする融合遺伝子。
12. 【請求項１２】請求項１０に記載のキメラモノクローナ
    ル抗体およびその誘導体の少なくとも１種を有効成分と
    して含有する高カルシウム血症治療・予防剤。
13. 【請求項１３】請求項１、３、７、９または１１のいず
    れかに記載のモノクローナル抗体を産生するセルライン
    。