JPH04229190A - セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 - Google Patents
セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、セファロスポリン誘導体をグル
タリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転
化する方法に関する。
タリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転
化する方法に関する。
【０００２】セファロスポリンＣ（３−アセトキシメチ
ル−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン
アミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸）を酵母トリ
ゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の透過性化された細胞により
酸化してα−ケトアジピニル−７−アミノセファロスポ
ラン酸となし、次いで過酸化水素による酸化脱カルボキ
シル化を行ってグルタリル−７−アミノセファロスポラ
ン酸を得ることができる（ドイツ特許出願公開第２
２１９ ４５４号明細書）。そこに記載される条件下
では、０．５−３時間の反応時間が必要であり、６０−
７３％の収率が達成される。
ル−７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン
アミド）セフ−３−エム−４−カルボン酸）を酵母トリ
ゴノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の透過性化された細胞により
酸化してα−ケトアジピニル−７−アミノセファロスポ
ラン酸となし、次いで過酸化水素による酸化脱カルボキ
シル化を行ってグルタリル−７−アミノセファロスポラ
ン酸を得ることができる（ドイツ特許出願公開第２
２１９ ４５４号明細書）。そこに記載される条件下
では、０．５−３時間の反応時間が必要であり、６０−
７３％の収率が達成される。
【０００３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼＥ．Ｃ．１．４
．３．３（以下、ＤＡＯと呼ぶ）は、Ｄ−アミノ酸から
α−ケト酸、アンモニアおよび過酸化水素への酸化的脱
アミノ化を触媒する。
．３．３（以下、ＤＡＯと呼ぶ）は、Ｄ−アミノ酸から
α−ケト酸、アンモニアおよび過酸化水素への酸化的脱
アミノ化を触媒する。
【０００４】市販されるブタ腎臓からのＤＡＯのほかに
、この酵素は細菌、酵母および菌類により合成される。 これらのうちトリゴノプシス・バリアビリスは良好なＤ
ＡＯ産生体として著名である。この酵素はＤ，Ｌ−アミ
ノ酸のラセミ体分割および各種溶液中のＤ−アミノ酸の
定量的検出に用いられるほか、セファロスポリンＣの酸
化的脱アミノ化に対する効力に特に注目すべきである。
、この酵素は細菌、酵母および菌類により合成される。 これらのうちトリゴノプシス・バリアビリスは良好なＤ
ＡＯ産生体として著名である。この酵素はＤ，Ｌ−アミ
ノ酸のラセミ体分割および各種溶液中のＤ−アミノ酸の
定量的検出に用いられるほか、セファロスポリンＣの酸
化的脱アミノ化に対する効力に特に注目すべきである。
【０００５】ベルギー特許第７３６ ９３４号明細書
によれば、ＤＡＯは菌類（ｆｕｎｇｉ）から得られ、上
記セファロスポリンＣ酸化のためには細胞溶解によって
放出されなければならない。
によれば、ＤＡＯは菌類（ｆｕｎｇｉ）から得られ、上
記セファロスポリンＣ酸化のためには細胞溶解によって
放出されなければならない。
【０００６】ドイツ特許出願公開第２ ２１９ ４
５４号（米国特許第３ ８０１ ４５８号）明細書
には、トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の
活性化細胞を用いるセファロスポリンＣ誘導体の製造が
記載されている。これに関して″活性化″は、酵母細胞
が物理的および／または化学的処理を受けて、細胞中に
含まれるＤＡＯがセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）酸化を
触媒しうる状態になされているが、実質的に放出されて
はいないことを意味する。
５４号（米国特許第３ ８０１ ４５８号）明細書
には、トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の
活性化細胞を用いるセファロスポリンＣ誘導体の製造が
記載されている。これに関して″活性化″は、酵母細胞
が物理的および／または化学的処理を受けて、細胞中に
含まれるＤＡＯがセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）酸化を
触媒しうる状態になされているが、実質的に放出されて
はいないことを意味する。
【０００７】本発明の目的は、セファロスポリン誘導体
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に実質的に完全に転化する方法において、既知の
水溶液中におけるセファロスポリンの分解が実質的に防
止され、用いられるＤＡＯ含有触媒の安定性が改良され
、かつ高いグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
（Ｇ−７−ＡＣＡ）収率が達成される方法を見出すこと
であった。
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に実質的に完全に転化する方法において、既知の
水溶液中におけるセファロスポリンの分解が実質的に防
止され、用いられるＤＡＯ含有触媒の安定性が改良され
、かつ高いグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
（Ｇ−７−ＡＣＡ）収率が達成される方法を見出すこと
であった。
【０００８】セファロスポリン誘導体をグルタリル−７
−アミノセファロスポラン酸誘導体に実質的に完全に転
化しうる方法において、ＤＡＯ含有触媒により連続的に
反応を行い、適切である場合には次いで過酸化水素を添
加することよりなる方法が見出された。
−アミノセファロスポラン酸誘導体に実質的に完全に転
化しうる方法において、ＤＡＯ含有触媒により連続的に
反応を行い、適切である場合には次いで過酸化水素を添
加することよりなる方法が見出された。
【０００９】意外にもプロセスを連続的に実施すること
により、″バッチ（ｂａｔｃｈ）″法と比較して触媒の
利用率を実質的に改良することができた。さらに基質を
連続添加した場合、ＤＡＯ含有触媒の有効寿命がバッチ
法と比較して顕著に延長される。反応器内におけるＣＰ
Ｃ滞留時間の短縮も可能となった。
により、″バッチ（ｂａｔｃｈ）″法と比較して触媒の
利用率を実質的に改良することができた。さらに基質を
連続添加した場合、ＤＡＯ含有触媒の有効寿命がバッチ
法と比較して顕著に延長される。反応器内におけるＣＰ
Ｃ滞留時間の短縮も可能となった。
【００１０】従って本発明は、セファロスポリン誘導体
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に転化する方法において、ＤＡＯ含有触媒により
連続的に反応を行い、適切な場合には次いで過酸化水素
を添加することよりなる方法に関する。
を対応するグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸
誘導体に転化する方法において、ＤＡＯ含有触媒により
連続的に反応を行い、適切な場合には次いで過酸化水素
を添加することよりなる方法に関する。
【００１１】本発明方法には、セファロスポリン環の位
置７にＤ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド
基をもつセファロスポリン誘導体をすべて用いることが
できる。式ＩＩのセファロスポリン誘導体
置７にＤ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド
基をもつセファロスポリン誘導体をすべて用いることが
できる。式ＩＩのセファロスポリン誘導体
【００１２】
【００１３】（式中、Ｘはアセテート基、求核体の残基
（ｒａｄｉｃａｌ）、複素環、ヒドロキシル基または水
素である）および式ＩＩのセファロスポリン誘導体の塩
類が、好ましくは式Ｉの化合物
（ｒａｄｉｃａｌ）、複素環、ヒドロキシル基または水
素である）および式ＩＩのセファロスポリン誘導体の塩
類が、好ましくは式Ｉの化合物
【００１４】
【００１５】（式中、Ｘは前記の意味を有し、Ｒはカル
ボキシル基またはケトカルボキシル基である）および式
Ｉのセファロスポリン誘導体の塩類に転化される。
ボキシル基またはケトカルボキシル基である）および式
Ｉのセファロスポリン誘導体の塩類に転化される。
【００１６】式ＩＩの化合物は比較的不純な状態および
予備精製された状態の双方で用いることができる。
予備精製された状態の双方で用いることができる。
【００１７】求核体（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）という
語は、たとえばピリジン類または第三アミンなどの化合
物を意味する。複素環という語は、たとえばチアゾリル
誘導体、ピリミジン類、６，７−ジヒドロシクロペンタ
［ｂ］ピリジン、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、
チアゾリニル、ピラジニル、インドリニルまたはインダ
ゾリルを意味する。式ＩまたはＩＩの化合物の塩類は、
たとえば亜鉛塩、アンモニウム塩、またはアルカリ金属
もしくはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリ
ウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩類である。 ″ＤＡＯ含有触媒″という語は、固定化されたＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼ、粗製酵素、透過性化もしくは活性化
されたＤＡＯ含有細胞、粗く破壊されたＤＡＯ含有細胞
、または単離精製されたＤＡＯを意味する。活性化また
は透過性化は、米国特許第３ ８０１ ４５８号明
細書の記載に従って、または既知の物理的もしくは化学
的方法により行われる。
語は、たとえばピリジン類または第三アミンなどの化合
物を意味する。複素環という語は、たとえばチアゾリル
誘導体、ピリミジン類、６，７−ジヒドロシクロペンタ
［ｂ］ピリジン、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、
チアゾリニル、ピラジニル、インドリニルまたはインダ
ゾリルを意味する。式ＩまたはＩＩの化合物の塩類は、
たとえば亜鉛塩、アンモニウム塩、またはアルカリ金属
もしくはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリ
ウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩類である。 ″ＤＡＯ含有触媒″という語は、固定化されたＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼ、粗製酵素、透過性化もしくは活性化
されたＤＡＯ含有細胞、粗く破壊されたＤＡＯ含有細胞
、または単離精製されたＤＡＯを意味する。活性化また
は透過性化は、米国特許第３ ８０１ ４５８号明
細書の記載に従って、または既知の物理的もしくは化学
的方法により行われる。
【００１８】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）は多
数の生物から、たとえば微生物、植物、菌類、またはブ
タ腎臓のような動物器官から得られる。トリゴノプシス
からのＤＡＯが本発明方法に特に好適であることが証明
された。特にトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０
９５からのＤＡＯを本方法に用いることができる。
数の生物から、たとえば微生物、植物、菌類、またはブ
タ腎臓のような動物器官から得られる。トリゴノプシス
からのＤＡＯが本発明方法に特に好適であることが証明
された。特にトリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０
９５からのＤＡＯを本方法に用いることができる。
【００１９】トリゴノプシス・バリアビリスからのＤＡ
Ｏの調製は、たとえば米国特許第３８０１ ４５８号
明細書に記載される発酵法により行われる。細胞はグル
コース、酵母エキス、リン酸カリウム、慣用される塩類
および微量元素、ならびに窒素源としてのメチオニンま
たはアラニンを含有する複雑な栄養培地中で培養される
。
Ｏの調製は、たとえば米国特許第３８０１ ４５８号
明細書に記載される発酵法により行われる。細胞はグル
コース、酵母エキス、リン酸カリウム、慣用される塩類
および微量元素、ならびに窒素源としてのメチオニンま
たはアラニンを含有する複雑な栄養培地中で培養される
。
【００２０】ＤＡＯは、精製された酵素、分離された粗
製抽出物、細胞抽出物として、粗く破壊された細胞の形
で、または他の酵素と共に、固定化することができる。 トリゴノプシス・バリアビリス細胞は、たとえば培養後
に化学的または物理的方法（米国特許第３ ８０１
４５８号明細書）により破壊し、次いで既知の方法で
固定化することができる。たとえば固定化は多糖類、た
とえばアルギナート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、寒天、キト
サンまたはカラジーナン内にトラップすることにより、
またはポリマー、たとえばアクリルポリマー、たとえば
ポリアクリルアミド、もしくは架橋ポリアミン内にトラ
ップすることにより行われる。架橋ポリアミンは、好ま
しくはジ−またはポリアルデヒド、たとえばグルタルア
ルデヒドにより架橋した不活性蛋白質、たとえばアルブ
ミンまたはゼラチンである。ジ−もしくはポリアルデヒ
ドまたはポリリン酸により架橋した多糖類、たとえばキ
チンまたはキトサンを用いることもできる。
製抽出物、細胞抽出物として、粗く破壊された細胞の形
で、または他の酵素と共に、固定化することができる。 トリゴノプシス・バリアビリス細胞は、たとえば培養後
に化学的または物理的方法（米国特許第３ ８０１
４５８号明細書）により破壊し、次いで既知の方法で
固定化することができる。たとえば固定化は多糖類、た
とえばアルギナート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、寒天、キト
サンまたはカラジーナン内にトラップすることにより、
またはポリマー、たとえばアクリルポリマー、たとえば
ポリアクリルアミド、もしくは架橋ポリアミン内にトラ
ップすることにより行われる。架橋ポリアミンは、好ま
しくはジ−またはポリアルデヒド、たとえばグルタルア
ルデヒドにより架橋した不活性蛋白質、たとえばアルブ
ミンまたはゼラチンである。ジ−もしくはポリアルデヒ
ドまたはポリリン酸により架橋した多糖類、たとえばキ
チンまたはキトサンを用いることもできる。
【００２１】ＤＡＯを含有する精製された、部分精製さ
れた、または粗製の細胞抽出物の固定化に適した方法は
、たとえばキャリヤー結合固定化法である。たとえばＤ
ＡＯは触媒反応に本質的でないリジン残基を介して共有
結合により高分子キャリヤーに結合させることができる
。他の方法はＤＡＯをキャリヤーに吸着させ、次いでた
とえばグルタルアルデヒドにより架橋する方法である。
れた、または粗製の細胞抽出物の固定化に適した方法は
、たとえばキャリヤー結合固定化法である。たとえばＤ
ＡＯは触媒反応に本質的でないリジン残基を介して共有
結合により高分子キャリヤーに結合させることができる
。他の方法はＤＡＯをキャリヤーに吸着させ、次いでた
とえばグルタルアルデヒドにより架橋する方法である。
【００２２】適切な酵素キャリヤーは、高分子多孔質キ
ャリヤー、たとえばセルロース、たとえばＤＥＡＥ−も
しくはＣＭ−セルロース、セファロース、たとえばＢｒ
ＣＮもしくはジビニルスルホンにより活性化されたセフ
ァロース、アミノ基もしくはヒドロキシル基を含む改質
ポリアクリルアミドゲル、またはアクリルアミド、メタ
クリレートもしくはメタクリルアミドおよび無水マレイ
ン酸の各種有機コポリマーである。さらに酵素キャリヤ
ーとして、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジ
ルエーテル、メチレンビスメタクリルアミドおよびメタ
クリルアミドのコポリマー、たとえばユーペルギット（
Ｅｕｐｅｒｇｉｔ、登録商標）を用いることもできる。
ャリヤー、たとえばセルロース、たとえばＤＥＡＥ−も
しくはＣＭ−セルロース、セファロース、たとえばＢｒ
ＣＮもしくはジビニルスルホンにより活性化されたセフ
ァロース、アミノ基もしくはヒドロキシル基を含む改質
ポリアクリルアミドゲル、またはアクリルアミド、メタ
クリレートもしくはメタクリルアミドおよび無水マレイ
ン酸の各種有機コポリマーである。さらに酵素キャリヤ
ーとして、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジ
ルエーテル、メチレンビスメタクリルアミドおよびメタ
クリルアミドのコポリマー、たとえばユーペルギット（
Ｅｕｐｅｒｇｉｔ、登録商標）を用いることもできる。
【００２３】好ましい酵素キャリヤーは、ドイツ特許出
願公開第３ ３４４ ９１２号明細書によるポリビ
ニルエステルおよびポリビニルアルコールを基礎とする
架橋ポリマーである。ＤＡＯと酵素キャリヤー間の固着
反応（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、
たとえばドイツ特許第２ ２１５ ６８７号明細書
に記載の既知方法により行われる。この反応は通常は室
温で、または＋４０℃もしくはそれ以下の温度で、特に
＋１０℃以下の温度、好ましくは０−＋５℃で行われる
。固着反応は好ましくは中性ｐＨ付近、たとえば５−９
のｐＨ値で行われる。マクロ多孔質粒状ポリマーは中性
領域でもＤＡＯと速やかに反応するので、原則としてよ
り強い酸性またはアルカリ性の条件を維持する必要はな
い。これにより得られる結合によって、長期貯蔵に十分
な安定性および高い操作安定性が得られる。
願公開第３ ３４４ ９１２号明細書によるポリビ
ニルエステルおよびポリビニルアルコールを基礎とする
架橋ポリマーである。ＤＡＯと酵素キャリヤー間の固着
反応（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、
たとえばドイツ特許第２ ２１５ ６８７号明細書
に記載の既知方法により行われる。この反応は通常は室
温で、または＋４０℃もしくはそれ以下の温度で、特に
＋１０℃以下の温度、好ましくは０−＋５℃で行われる
。固着反応は好ましくは中性ｐＨ付近、たとえば５−９
のｐＨ値で行われる。マクロ多孔質粒状ポリマーは中性
領域でもＤＡＯと速やかに反応するので、原則としてよ
り強い酸性またはアルカリ性の条件を維持する必要はな
い。これにより得られる結合によって、長期貯蔵に十分
な安定性および高い操作安定性が得られる。
【００２４】本発明方法を実施するために最良の方法は
、互いに接続した１、２またはそれ以上の反応容器にＤ
ＡＯ含有触媒を充填し、反応容器に基質を連続的に導通
することである。容器は基質および生成物と反応しない
不活性材料から構成される。容器はたとえば撹拌槽、バ
ブルカラムまたはループ反応器であり、冷却／加熱ジャ
ケット内に収容することができる。容器は基質および生
成物流のための入口および出口開口を備え、反応容器内
で十分な混合が行われるように調整される。容器には他
の開口から酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば空
気、Ｏ２富化空気または窒素／酸素混合物を供給するこ
ともできる。反応液は適宜、撹拌機により混合すること
ができる。反応容器は、ＤＡＯ含有触媒が流出するのを
実質的に防止すべく透過性が選ばれた適宜な保持装置、
たとえば焼結ディスク、メンブレンまたはフィルタース
クリーンを備えている。反応容器は未使用ガスの排出を
可能にする適宜な開口をも備えている。さらに反応容器
は反応過程を監視するための測定点、たとえばｐＨまた
は酸素分圧の測定点を備えている。
、互いに接続した１、２またはそれ以上の反応容器にＤ
ＡＯ含有触媒を充填し、反応容器に基質を連続的に導通
することである。容器は基質および生成物と反応しない
不活性材料から構成される。容器はたとえば撹拌槽、バ
ブルカラムまたはループ反応器であり、冷却／加熱ジャ
ケット内に収容することができる。容器は基質および生
成物流のための入口および出口開口を備え、反応容器内
で十分な混合が行われるように調整される。容器には他
の開口から酸素または酸素含有ガス混合物、たとえば空
気、Ｏ２富化空気または窒素／酸素混合物を供給するこ
ともできる。反応液は適宜、撹拌機により混合すること
ができる。反応容器は、ＤＡＯ含有触媒が流出するのを
実質的に防止すべく透過性が選ばれた適宜な保持装置、
たとえば焼結ディスク、メンブレンまたはフィルタース
クリーンを備えている。反応容器は未使用ガスの排出を
可能にする適宜な開口をも備えている。さらに反応容器
は反応過程を監視するための測定点、たとえばｐＨまた
は酸素分圧の測定点を備えている。
【００２５】基質溶液は第１反応容器へ送入される。こ
れは、ＤＡＯにより触媒されてセファロスポリン誘導体
と酸素が反応し、対応するα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体、アンモニアおよび過酸
化水素になる場所である。得られた生成物および未反応
セファロスポリン誘導体は次の反応容器へ送入される。 セファロスポリン誘導体が実質的に転化されるまでこの
操作が反復される。さらにα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体（ＫＡ−７−ＡＣＡ）は
、反応容器内で生成した過酸化水素により酸化的脱カル
ボキシル化を受けてグルタリル−７−アミノセファロス
ポラン酸となる。ＫＡ−７−ＡＣＡが完全には転化され
ない場合、下流の反応容器内へ過酸化水素を制御された
様式で計量装入し、これによりＧ−７−ＡＣＡへの反応
を実質的に完全に行わせることができる。過酸化水素の
添加により反応容器内のレドックス電位が変化する。 連続操作においては、完全な転化に必要な過酸化水素含
量はレドックス電極により測定され、次いで適宜な制御
装置によって過酸化水素を計量装入することにより一定
に維持することができる。この操作により過剰供給が避
けられる。さもなければ副反応、たとえばイオウの酸化
が起こる可能性がある。
れは、ＤＡＯにより触媒されてセファロスポリン誘導体
と酸素が反応し、対応するα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体、アンモニアおよび過酸
化水素になる場所である。得られた生成物および未反応
セファロスポリン誘導体は次の反応容器へ送入される。 セファロスポリン誘導体が実質的に転化されるまでこの
操作が反復される。さらにα−ケトアジピニル−７−ア
ミノセファロスポラン酸誘導体（ＫＡ−７−ＡＣＡ）は
、反応容器内で生成した過酸化水素により酸化的脱カル
ボキシル化を受けてグルタリル−７−アミノセファロス
ポラン酸となる。ＫＡ−７−ＡＣＡが完全には転化され
ない場合、下流の反応容器内へ過酸化水素を制御された
様式で計量装入し、これによりＧ−７−ＡＣＡへの反応
を実質的に完全に行わせることができる。過酸化水素の
添加により反応容器内のレドックス電位が変化する。 連続操作においては、完全な転化に必要な過酸化水素含
量はレドックス電極により測定され、次いで適宜な制御
装置によって過酸化水素を計量装入することにより一定
に維持することができる。この操作により過剰供給が避
けられる。さもなければ副反応、たとえばイオウの酸化
が起こる可能性がある。
【００２６】セファロスポリン誘導体は反応混合物に固
体状で、または適宜追加の緩衝剤成分を含む水溶液とし
て添加することができる。セファロスポリン誘導体の濃
度は広範に、たとえば０．００１−１Ｍ、好ましくは０
．０１−０．１Ｍの範囲に及びうる。酸素の導入量は、
毎時、反応液の体積リットル当たり１−５００ｌのＯ２
、好ましくは毎時、反応液の体積リットル当たり１０−
１００ｌのＯ２である。用いられるＤＡＯ濃度は、反応
液の体積リットル当たり１０−５０００単位（Ｕ）であ
る。ＤＡＯ含有触媒は０．１−９５重量％、好ましくは
０．５−５０％、特に１−２０％の量で用いられる。
体状で、または適宜追加の緩衝剤成分を含む水溶液とし
て添加することができる。セファロスポリン誘導体の濃
度は広範に、たとえば０．００１−１Ｍ、好ましくは０
．０１−０．１Ｍの範囲に及びうる。酸素の導入量は、
毎時、反応液の体積リットル当たり１−５００ｌのＯ２
、好ましくは毎時、反応液の体積リットル当たり１０−
１００ｌのＯ２である。用いられるＤＡＯ濃度は、反応
液の体積リットル当たり１０−５０００単位（Ｕ）であ
る。ＤＡＯ含有触媒は０．１−９５重量％、好ましくは
０．５−５０％、特に１−２０％の量で用いられる。
【００２７】５−９、好ましくは６．０−８．５のｐＨ
を用いるのが有利である。反応を４−６５℃、特に１０
−５０℃の温度範囲で行うことも適切である。最適な方
法は用いられる個々のＤＡＯ含有触媒に依存し、簡単な
予備試験によって容易に確立される。
を用いるのが有利である。反応を４−６５℃、特に１０
−５０℃の温度範囲で行うことも適切である。最適な方
法は用いられる個々のＤＡＯ含有触媒に依存し、簡単な
予備試験によって容易に確立される。
【００２８】容器内における反応液の滞留時間は５−８
００分、好ましくは２０−１２０分である。この方法は
無菌条件下または非−無菌条件下で行うことができる。
００分、好ましくは２０−１２０分である。この方法は
無菌条件下または非−無菌条件下で行うことができる。
【００２９】反応生成物は精製後、または未精製状態で
、既知の化学的または酵素による転化法によって７−ア
ミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）に転化すること
ができる。７−ＡＣＡは多数の半合成抗生物質の出発物
質である。
、既知の化学的または酵素による転化法によって７−ア
ミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）に転化すること
ができる。７−ＡＣＡは多数の半合成抗生物質の出発物
質である。
【００３０】以下、本発明を例によってより詳細に説明
する。％のデータは重量基準である。
する。％のデータは重量基準である。
【００３１】例１
トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５を下記の
栄養素溶液中で前培養として培養した：グルコース
２０ ｇ／ｌ
（別個にオートクレーブ処理）Ｄ，Ｌ−メチオニン
４ ｇ／ｌ（別個にオート
クレーブ処理）ＫＨ２ＰＯ４
２ ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４
０．２ｇ／ｌＭｇＳＯ４
× ７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌＣａＣｌ２
× ６Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌＮａＣｌ
０．１
ｇ／ｌ微量元素溶液
１０ ｍｌビタミン溶液
１ ｍｌ（オートクレーブ処理後
に添加） ｐＨ６．０ ビタミン溶液： ビオチン ２
０ ｍｇ／ｌチアミン
１００ ｍｇ／ｌ エタノールに
溶解（５０％） 微量元素溶液： ホウ酸
５ ｇ／ｌＭｎＣｌ２ × ４Ｈ２Ｏ
２ ｇ／ｌＣｕＣｌ２ × ３Ｈ
２Ｏ ２ ｇ／ｌＺｎＳＯ４ ×
７Ｈ２Ｏ １ ｇ／ｌＦｅＣｌ３
× ６Ｈ２Ｏ ３．４ｇ／ｌ２回蒸留水
に溶解斜面培養試験管からのＮａＣｌ懸濁液、ＯＤ５７
８ｎｍ＝１８、を１％接種物として用いた。前培養は３
０℃および１９０ｒｐｍで２４時間行われた。
栄養素溶液中で前培養として培養した：グルコース
２０ ｇ／ｌ
（別個にオートクレーブ処理）Ｄ，Ｌ−メチオニン
４ ｇ／ｌ（別個にオート
クレーブ処理）ＫＨ２ＰＯ４
２ ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４
０．２ｇ／ｌＭｇＳＯ４
× ７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／ｌＣａＣｌ２
× ６Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌＮａＣｌ
０．１
ｇ／ｌ微量元素溶液
１０ ｍｌビタミン溶液
１ ｍｌ（オートクレーブ処理後
に添加） ｐＨ６．０ ビタミン溶液： ビオチン ２
０ ｍｇ／ｌチアミン
１００ ｍｇ／ｌ エタノールに
溶解（５０％） 微量元素溶液： ホウ酸
５ ｇ／ｌＭｎＣｌ２ × ４Ｈ２Ｏ
２ ｇ／ｌＣｕＣｌ２ × ３Ｈ
２Ｏ ２ ｇ／ｌＺｎＳＯ４ ×
７Ｈ２Ｏ １ ｇ／ｌＦｅＣｌ３
× ６Ｈ２Ｏ ３．４ｇ／ｌ２回蒸留水
に溶解斜面培養試験管からのＮａＣｌ懸濁液、ＯＤ５７
８ｎｍ＝１８、を１％接種物として用いた。前培養は３
０℃および１９０ｒｐｍで２４時間行われた。
【００３２】発酵は下記の条件下で行われた：栄養素溶
液： 前培養に用いたものに相当するが、下記の量となるよう
に供給された：グルコース
３０ ｇ／ｌ Ｄ，Ｌ−メチオニン ６
ｇ／ｌデスモフェン
０．１％ （所望により） （Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ、登録商標） 発酵条件： 接種量
２．５−５％温度
２８℃発酵時間
５０−６０時間ＤＡＯ
を測定するために、０．４ｇの細胞を凍結し、次いで酸
性ｐＨ、たとえば約３−４で融解した；凍結は−１０℃
以下の温度、たとえば約−２０℃で実施しうる。 凍結はＤＡＯを細胞から放出させるのに十分なほど、た
とえば−２０℃で少なくとも１時間持続すべきである。
液： 前培養に用いたものに相当するが、下記の量となるよう
に供給された：グルコース
３０ ｇ／ｌ Ｄ，Ｌ−メチオニン ６
ｇ／ｌデスモフェン
０．１％ （所望により） （Ｄｅｓｍｏｐｈｅｎ、登録商標） 発酵条件： 接種量
２．５−５％温度
２８℃発酵時間
５０−６０時間ＤＡＯ
を測定するために、０．４ｇの細胞を凍結し、次いで酸
性ｐＨ、たとえば約３−４で融解した；凍結は−１０℃
以下の温度、たとえば約−２０℃で実施しうる。 凍結はＤＡＯを細胞から放出させるのに十分なほど、た
とえば−２０℃で少なくとも１時間持続すべきである。
【００３３】活性は測光法により、下記のアッセイ混合
物を用いて測定された： 溶液： １）緩衝液
１００ ｍＭ ＫＰＰ；ｐＨ７．３；空気飽和２）
ｏ−フェニレンジアミン ０．０２ ％、Ｈ２
Ｏ中３）ペルオキシダーゼ １
ｍｇ／ｍｌ、緩衝液中４）酵素
最適量：０．５−１．０ 単
位／ｍｌ５）基質
１５０ ｍＭ Ｎａ−ＣＰＣ（１００％
）、緩
衝液中アッセイ法： λ＝４０５ ｎｍ（最大） ε＝４０２０ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ υ＝３０℃ 容量：
最終濃度：１）２．００ ｍｌ
８３ ｍＭ２）０．５０ ｍｌ
０．００３４ ％３）０．１０ ｍ
ｌ ０．０３４ ｍｇ／ｍｌ ４）０．０５ ｍｌ ２分間待つ ５）０．３０ ｍｌ １５．
２５ ｍＭ２．９５ ｍｌ 計算： 単位 ＿ △Ｅ・希釈度・全容量 ｍｌ 分・ε・ｄ・試料容量上記の条件下で
発酵槽中において２００ Ｕ／ｌの酵素活性に達した
。
物を用いて測定された： 溶液： １）緩衝液
１００ ｍＭ ＫＰＰ；ｐＨ７．３；空気飽和２）
ｏ−フェニレンジアミン ０．０２ ％、Ｈ２
Ｏ中３）ペルオキシダーゼ １
ｍｇ／ｍｌ、緩衝液中４）酵素
最適量：０．５−１．０ 単
位／ｍｌ５）基質
１５０ ｍＭ Ｎａ−ＣＰＣ（１００％
）、緩
衝液中アッセイ法： λ＝４０５ ｎｍ（最大） ε＝４０２０ ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ υ＝３０℃ 容量：
最終濃度：１）２．００ ｍｌ
８３ ｍＭ２）０．５０ ｍｌ
０．００３４ ％３）０．１０ ｍ
ｌ ０．０３４ ｍｇ／ｍｌ ４）０．０５ ｍｌ ２分間待つ ５）０．３０ ｍｌ １５．
２５ ｍＭ２．９５ ｍｌ 計算： 単位 ＿ △Ｅ・希釈度・全容量 ｍｌ 分・ε・ｄ・試料容量上記の条件下で
発酵槽中において２００ Ｕ／ｌの酵素活性に達した
。
【００３４】例２
不均質−架橋−粒状共重合反応を実施するために、８０
ｇの酢酸ビニル、２０ｇのジビニルエチレン尿素、１ｇ
のアゾイソブチロニトリルおよび２００ｇのｎ−ヘプタ
ノールの溶液を、水５００ｍｌ中の０．１７５ｇのＮａ
Ｈ２ＰＯ４、３ｇのＮａ２ＨＰＯ４および５ｇのポリビ
ニルピロリドンの溶液中で分散および重合させた。４時
間後に、希釈剤を水蒸気蒸留により除去し、生成物を単
離した。収量は完全に丸い透明な粒状ポリマー７７．７
ｇであった。平均粒子直径は約３０μｍであった（撹拌
速度４６０ｒｐｍ）。
ｇの酢酸ビニル、２０ｇのジビニルエチレン尿素、１ｇ
のアゾイソブチロニトリルおよび２００ｇのｎ−ヘプタ
ノールの溶液を、水５００ｍｌ中の０．１７５ｇのＮａ
Ｈ２ＰＯ４、３ｇのＮａ２ＨＰＯ４および５ｇのポリビ
ニルピロリドンの溶液中で分散および重合させた。４時
間後に、希釈剤を水蒸気蒸留により除去し、生成物を単
離した。収量は完全に丸い透明な粒状ポリマー７７．７
ｇであった。平均粒子直径は約３０μｍであった（撹拌
速度４６０ｒｐｍ）。
【００３５】生成物は嵩容量１．５５ｍｌ／ｇを有して
いた。加水分解生成物は嵩容量１．５４ｍｌ／ｇを有し
、水中で膨潤して５ｍｌ／ｇとなった。
いた。加水分解生成物は嵩容量１．５４ｍｌ／ｇを有し
、水中で膨潤して５ｍｌ／ｇとなった。
【００３６】２０ｇの加水分解した粒状共重合体を２０
０ｍｌのエピクロルヒドリン中、室温で２４時間膨潤さ
せた。次いで徐々に撹拌しながら温度を１１３−１１５
℃に上昇させ、４時間維持した。冷後、共重合体を吸引
ろうとにより濾別し、アセトン中で数回、１時間ずつ撹
拌することにより抽出した。アセトン含有共重合体を真
空オーブン中で５０℃において一定重量になるまで乾燥
させた。エポキシド当量は２４４であった（アキセン（
Ａｘｅｎ）：Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ２
９（１９７５）Ｎｏ．４の方法により測定）。
０ｍｌのエピクロルヒドリン中、室温で２４時間膨潤さ
せた。次いで徐々に撹拌しながら温度を１１３−１１５
℃に上昇させ、４時間維持した。冷後、共重合体を吸引
ろうとにより濾別し、アセトン中で数回、１時間ずつ撹
拌することにより抽出した。アセトン含有共重合体を真
空オーブン中で５０℃において一定重量になるまで乾燥
させた。エポキシド当量は２４４であった（アキセン（
Ａｘｅｎ）：Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ２
９（１９７５）Ｎｏ．４の方法により測定）。
【００３７】例３
５００μｌのＤＡＯ含有溶液（２０Ｕ／ｍｌ）を例２と
同様にして調製した１００ｍｇのキャリヤーに添加した
。１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を添加して酵素液をｐＨ
７．８に調整した。キャリヤーへの酵素の固定化には２
５℃で７２時間を要した。次いで、キャリヤーに共有結
合しなかったＤＡＯをガラス濾過器により吸引除去し、
残渣を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で数回、次いで緩衝液で
洗浄した。吸引濾過器からの湿潤物質の収量は３２４ｍ
ｇであった。例１に示したと同様に活性を測定し、湿潤
状態で１８Ｕ／ｇの値を得た。
同様にして調製した１００ｍｇのキャリヤーに添加した
。１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を添加して酵素液をｐＨ
７．８に調整した。キャリヤーへの酵素の固定化には２
５℃で７２時間を要した。次いで、キャリヤーに共有結
合しなかったＤＡＯをガラス濾過器により吸引除去し、
残渣を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で数回、次いで緩衝液で
洗浄した。吸引濾過器からの湿潤物質の収量は３２４ｍ
ｇであった。例１に示したと同様に活性を測定し、湿潤
状態で１８Ｕ／ｇの値を得た。
【００３８】例４
トリゴノプシス・バリアビリスＣＢＳ４０９５の細胞を
例１に示した条件下で培養し、凍結乾燥により透過性化
した。次いで湿潤重量１ｇの細胞を１０ｍｌの１％濃度
キトサン水溶液と混合し、混合物を２％濃度のトリポリ
リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０；２５℃）に滴加
することにより固定化した。２．５Ｕ／ｇ（触媒の湿潤
重量）のＤＡＯ活性が得られた。
例１に示した条件下で培養し、凍結乾燥により透過性化
した。次いで湿潤重量１ｇの細胞を１０ｍｌの１％濃度
キトサン水溶液と混合し、混合物を２％濃度のトリポリ
リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０；２５℃）に滴加
することにより固定化した。２．５Ｕ／ｇ（触媒の湿潤
重量）のＤＡＯ活性が得られた。
【００３９】例５
Ａ．１個の反応容器内での酵素による転化ＤＡＯを例３
に記載したと同様に固定化し、撹拌機およびジャケット
付きの１．５ｌガラス容器内でセファロスポリンＣと共
にインキュベートした。下記の反応パラメーターを採用
した： 作業容量
１ ｌ温度
２５℃ＤＡＯ濃度
４ ％、固定化したもの（例
３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素
５０ ｌ／時ｐＨ
７．０セファロスポリンＣ
３０ ｍＭ撹拌機速度
３００ ｒｐ
ｍ反応時間
１１０分１１０分後に、用いたセファロスポリンＣ
の８５％が転化された。反応液を固定化ＤＡＯから分離
し、酵素に新鮮な基質溶液を供給した。３２時間後に、
転化率は５０％未満に低下した。
に記載したと同様に固定化し、撹拌機およびジャケット
付きの１．５ｌガラス容器内でセファロスポリンＣと共
にインキュベートした。下記の反応パラメーターを採用
した： 作業容量
１ ｌ温度
２５℃ＤＡＯ濃度
４ ％、固定化したもの（例
３） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素
５０ ｌ／時ｐＨ
７．０セファロスポリンＣ
３０ ｍＭ撹拌機速度
３００ ｒｐ
ｍ反応時間
１１０分１１０分後に、用いたセファロスポリンＣ
の８５％が転化された。反応液を固定化ＤＡＯから分離
し、酵素に新鮮な基質溶液を供給した。３２時間後に、
転化率は５０％未満に低下した。
【００４０】Ｂ．連結した反応容器内での酵素による転
化ＤＡＯを例３に記載したと同様に固定化し、撹拌機お
よびジャケット付きの１ｌガラス容器２個に充填した。 セファロスポリン溶液を第１反応容器に連続的に送入し
、ここから第２反応容器に導通した。下記のパラメータ
ーを採用した： 作業容量／容器 ０．
５ ｌ温度
２５℃ＤＡＯ濃度
４ ％、固定化したもの（例３
） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素
３０ ｌ／時ｐＨ
７．０セファロスポリンＣ
３０ ｍＭ撹拌機速度
３００ ｒｐ
ｍ滞留時間／容器 ５
０分全滞留時間
１００分１００分後に、用いたセファロスポリンＣ
の８５％が転化された。触媒の交換は４８時間後に必要
となったにすぎない。この時点で、転化率が用いたセフ
ァロスポリンＣの８５％未満に低下したからである。
化ＤＡＯを例３に記載したと同様に固定化し、撹拌機お
よびジャケット付きの１ｌガラス容器２個に充填した。 セファロスポリン溶液を第１反応容器に連続的に送入し
、ここから第２反応容器に導通した。下記のパラメータ
ーを採用した： 作業容量／容器 ０．
５ ｌ温度
２５℃ＤＡＯ濃度
４ ％、固定化したもの（例３
） ７２０ Ｕ／ｌ 酸素
３０ ｌ／時ｐＨ
７．０セファロスポリンＣ
３０ ｍＭ撹拌機速度
３００ ｒｐ
ｍ滞留時間／容器 ５
０分全滞留時間
１００分１００分後に、用いたセファロスポリンＣ
の８５％が転化された。触媒の交換は４８時間後に必要
となったにすぎない。この時点で、転化率が用いたセフ
ァロスポリンＣの８５％未満に低下したからである。
【００４１】表１は方法Ａと本発明による方法Ｂの比較
を示す。
を示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】方法Ａ 本発
明による方法Ｂ 収率
１．０ １．０ 触媒利用率 １．
０ １．５ 反応時間 １
．０ ０．９ 空間−時間収率 １．０
１．１
明による方法Ｂ 収率
１．０ １．０ 触媒利用率 １．
０ １．５ 反応時間 １
．０ ０．９ 空間−時間収率 １．０
１．１
Claims (9)
- 【請求項１】 セファロスポリン誘導体を対応するグ
ルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に転化
する方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｅ．Ｃ
．１．４．３．３．）含有触媒の存在下で連続的に反応
を行い、適切である場合には次いで過酸化水素を添加す
ることよりなる方法。 - 【請求項２】 反応液が反応器カスケードに導通され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 菌類からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ
が使用される、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 式ＩＩのセファロスポリン誘導体（式
中、Ｘはアセテート基、求核体の残基、複素環、ヒドロ
キシル基または水素である）および式ＩＩのセファロス
ポリン誘導体の塩類が、好ましくは式Ｉの化合物（式中
、Ｘは前記の意味を有し、Ｒはカルボキシル基またはケ
トカルボキシル基である）および式Ｉのセファロスポリ
ン誘導体の塩類に転化される、請求項１ないし３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項５】 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが多糖類に
より固定化される、請求項１ないし４のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項６】 アルギナート、カラジーナンまたはキ
トサンが使用される、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 ポリビニルエステルおよびポリビニル
アルコールの、またはグリシジルメタクリレート、アリ
ルグリシジルエーテル、メタクリルアミドおよびメチレ
ンビスメタクリルアミドのコポリマーよりなる酵素キャ
リヤーが使用される、請求項１ないし６のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項８】 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含有する
活性化または透過性化された細胞が使用される、請求項
１ないし７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 過酸化水素が連続的に添加される、請
求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028119A DE4028119C1 (ja) | 1990-09-05 | 1990-09-05 | |
| DE4028119:1 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04229190A true JPH04229190A (ja) | 1992-08-18 |
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Family
ID=6413630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03226000A Expired - Fee Related JP3117092B2 (ja) | 1990-09-05 | 1991-09-05 | セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5284754A (ja) |
| EP (1) | EP0474211B1 (ja) |
| JP (1) | JP3117092B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE133204T1 (ja) |
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| DE (2) | DE4028119C1 (ja) |
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| ES (1) | ES2083495T3 (ja) |
| FI (1) | FI103806B (ja) |
| GR (1) | GR3018713T3 (ja) |
| IE (1) | IE70755B1 (ja) |
| IL (1) | IL99382A (ja) |
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| NZ (1) | NZ239651A (ja) |
| PT (1) | PT98863B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| IT1247964B (it) * | 1991-06-03 | 1995-01-05 | Ministero Dell Uni E Della | Processo per la preparazione enzimatica di derivati cefalosporanici |
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