JPH04230857A - 結合アッセイ法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、結合アッセイによる試
料中の分析対象物の存在または量を検出するための装置
および方法に関する。さらに詳しくは、結合体を検出す
るために捕捉部位および／または結合体回収部位にて二
重読み取りを行う試験装置に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生物
学的または非生物学的流体中に存在する目的物質または
臨床的に重要な物質の存在および／または量を決定する
ためのアッセイにおいて、種々の分析法および装置が一
般に用いられている。そのような物質は一般に「分析対
象物」と呼ばれ、抗体、抗原、薬物、ホルモンなどが含
まれる。

【０００３】目的分析対象物に特異的に結合する物質を
利用できるようになってから、結合アッセイの使用に基
づく躍進的診断装置市場が開かれた。結合アッセイは、
抗体および抗原免疫反応物によって代表される特異的結
合成分を含んでおり、この特異的結合ペアの一方の成分
はシグナル生成化合物（たとえば、酵素標識抗体、蛍光
化合物、化学発光化合物、放射性同位体、直接可視標識
など）で標識されている。たとえば、結合アッセイにお
いて、分析対象物を含有していると思われる試料を標識
抗分析対象物抗体（すなわち、結合体）と混合し、イン
キュベートして免疫反応を起こさせる。ついで、反応混
合物を分析して、抗体／分析対象物複合体（結合した結
合体）に結合した標識かまたは分析対象物と複合体を形
成しなかった標識抗体（遊離結合体）を検出し、一方の
化学種中の標識量を試料中の分析対象物の量と相関させ
る。

【０００４】固相アッセイが一般に用いられている結合
アッセイ法である。結合体および／または固相［ディッ
プスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、試験ストリップ、
フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）パッド、紙
、ファイバーマトリックスまたは他の固相物質］に結合
した固定化相補的結合成分への分析対象物の結合により
分析対象物の存在が示される多くのアッセイ装置および
方法が存在する。結合アッセイの結果、結合体は固相に
結合したものと遊離のまま残るものとの間で分布する。 一般に、試料中の分析対象物の存在または量は、結合体
が固相に固定化される程度により示される。

【０００５】特異的結合アッセイにおいて、試薬を含浸
させた試験ストリップを使用することもよく知られてい
る。そのような方法では、試験ストリップの一つの部分
に試料を適用し、ストリップ物質中を移動または毛管移
動（ｗｉｃｋ）させる。それゆえ、検出または測定しよ
うとする分析対象物は、通常、溶離溶媒（試料そのもで
あってもよいし、または別に添加した溶媒であってもよ
い）の助けを借りて該物質中を通過する。分析対象物は
、試験ストリップ上の検出ゾーン（分析対象物が結合す
ることのできる相補的結合成分を固定化してある）に到
達する。検出ゾーン中で分析対象物が結合する程度は、
結合体（試験ストリップ中に組み込んでいてもよいし、
別に適用してもよい）の助けを借りて決定することがで
きる。

【０００６】上記原理に基づいた装置の例は、下記特許
および特許出願に開示されている。試験ストリップは、
ドイチュ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）らの米国特許第４，０９４
，６４７号、同第４，２３５，６０１号および同第４，
３６１，５３７号各明細書に記載されている。一般に、
該装置は、毛管作用により溶液を移動させる（すなわち
、毛管移動）ことのできる物質を含んでいる。ストリッ
プの異なる領域またはゾーンには、分析対象物が該ゾー
ンに運ばれてきたとき、または該ゾーンを通過するとき
に、検出可能なシグナルを生成するのに必要な試薬が含
まれている。該装置は、化学アッセイおよび結合アッセ
イの両方に適しており、ストリップに沿って分析対象物
を運搬するために展開溶液を使用する。

【０００７】トム（Ｔｏｍ）ら（米国特許第４，３６６
，２４１号）は、試料を添加しアッセイ結果の読み取り
を行う免疫吸着ゾーンを有する吸湿性の支持体を開示し
ている。 ウエング（Ｗｅｎｇ）ら（米国特許第４，７４０，４６
８号）が開示している試験ストリップ装置は、吸湿性ス
トリップ上の小部位で標識特異的結合ペア成分が固定化
した第二の特異的結合ペア成分に結合することにより、
該小部位で検出可能なシグナルの観察が可能になるもの
であり、ただし、固定化した第二の特異的結合ペア成分
が標識特異的結合ペア成分に直接結合することができる
場合は、該標識特異的結合ペア成分に結合し得る分析対
象物類似体もまたストリップ上に存在し、小部位検出検
出部位に到達する前に遊離または未結合の結合体を除去
する。グリーンクイスト（Ｇｒｅｅｎｑｕｉｓｔ）（米
国特許第４，８０６，３１１号）は、検出ゾーンおよび
試薬ゾーン（遊離の一価標識結合成分を除去する）を有
するマルチゾーンまたは多層装置を開示している。

【０００８】ウエングら（米国特許第４，７４０，４６
８号）は、試料（分析対象物を含有していると思われる
）を含む被験溶液、および分析対象物に結合し標識して
ある第一の特異的結合成分とともに使用するための装置
を開示している。この装置は、小検出部位に固定化され
標識分析対象物に結合する第二の特異的結合成分を有す
る試験ストリップである。このストリップにはまた、分
析対象物類似体を含んでいて第一の特異的結合成分（分
析対象物の不在下で第二の特異的結合成分と結合し得る
）を結合させる。

【０００９】関連する他の試験ストリップの記載は、米
国特許第４，８６１，７１１号、ＥＰ２８２２３２号（
１９８８年９月２８日公開）、ＷＯ８８／０８５３４号
（１９８８年１１月３日公開）、およびＥＰ２８６，３
７１号（１９８８年１１月１２日公開）に示されている
。他の参照すべき開示はミッケルソン（Ｍｉｃｋｅｌｓ
ｏｎ）らの開示であり、固相装置を通過しない微細粒子
に遊離の標識試薬を結合させることにより標識試薬を分
離させる方法および試験装置に関するものである（ＥＰ
２９７，２９２号）。

【００１０】試験ストリップの分野においては製造業者
の活動は活発になってきている。というのは、アッセイ
を行うのに手動の工程を殆どまたは全く必要とせず、非
熟練者によって使用することができ、かつアッセイの作
動の仕方によってアッセイ結果の受ける影響が最小であ
るような装置に対する需要が大きくなってきてきるから
である。さらに考慮すべき問題は、観察されるシグナル
を容易に検出し得ること、および検出部位に固定化され
た結合体を該検出部位を通過した結合体から容易に識別
し得ることである。加えて、小さな検出可能なシグナル
の減少を一層容易に検出し得るシグナル表示に変えるこ
とができ、そのような両方のシグナルを検出することの
できるアッセイ態様に対する必要性が存在する。そのよ
うな態様はアッセイ感度をも高めることができる、すな
わち、少量の分析対象物を検出することができる。従っ
て、使用が容易で、正確かつ迅速であり、自動アッセイ
制御を含む新規な装置に対する必要性が依然存在する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の分析
対象物の存在または量を決定するための装置および方法
を提供する。本発明の装置は、その中を分析対象物およ
び結合体（たとえば、分析対象物に特異的な結合成分に
結合した標識など）が移動することのできる固相物質を
含む。本発明の固相は、連続流体流接触において結合体
またはその複合体を固定化および比較表示するための少
なくとも２つの定められ印を付けた検出部位を有する。 第一の検出部位は、結合体への結合に対して分析対象物
と競合し得る捕捉試薬を固定化した捕捉部位である。別
の態様では、該捕捉部位は、分析対象物および結合体が
競合的に結合する捕捉試薬を含む。

【００１２】第二の検出部位は、結合体かまたはその複
合体のいずれかと結合し得る、捕捉試薬とは異なる結合
体回収試薬を固定化した結合体回収部位である。結合体
回収部位は、捕捉部位を通ってきた分析対象物／結合体
複合体を結合させる。試料中の分析対象物の量が増加す
るにつれ、分析対象物分子により占拠される結合体の結
合部位は増加し、捕捉試薬に自由に結合できる結合体は
少なくなる。分析対象物／結合体複合体は捕捉部位を通
過してゆき、結合体回収部位へ移動してゆき、該部位に
て複合体は結合体回収試薬により固定化される。それゆ
え、分析対象物の濃度が増加するにつれ、捕捉部位に固
定化される結合体は減少し、回収部位で固定化される結
合体は増加する。

【００１３】本発明の装置の主要な利点は、結合体の使
用および／または二重読み取り態様の使用によるもので
ある。結合体は、検出可能な標識に結合した特異的結合
成分を含み、該結合成分は２以上の分析対象物と同時に
結合する。場合により、結合体は、検出可能な標識に結
合した２以上の特異的結合成分を含んでいてよい。いず
れの場合においても、結合体上の実質的にすべての結合
部位が分析対象物によって占拠され、その後、結合体は
捕捉試薬に結合することな捕捉部位を通って通過する。

【００１４】二重読み取り態様は、部位内に固定化され
る結合体を比較表示するため少なくとも２つの定められ
た部位を使用する。試料中の分析対象物との反応後に未
占拠の結合部位を有する標識−抗体結合体は、分析対象
物類似体捕捉部位で固定化され、一方、試料との反応後
に未占拠結合部位を実質的に有しない結合体は捕捉部位
を通過してゆき、結合体回収部位（固定化試薬は、結合
体の標識または特異的結合成分、結合体に特有のエピト
ープ、分析対象物、または補助特異的結合成分に結合す
ることができる）で固定化される。非反応性で移動し得
ない化学種は従来の装置と同様に産生されず、異なる反
応複合体の比較表示のために２つの結合部位を使用する
結果、高感度の結合アッセイが得られる。

【００１５】別の態様において、結合体は、分析対象物
に特異的な結合部位および捕捉試薬に特異的な結合部位
を有する特異的結合成分に結合した標識であって、結合
体への分析対象物の結合が結合体への捕捉試薬の結合を
抑制し、結合体の捕捉試薬への結合が結合体への分析対
象物の結合を抑制するものを含む。たとえば、結合体は
抗体に結合した標識であってよく、その際、分析対象物
は該抗体の定常領域に特異的であり、捕捉試薬は該抗体
の可変領域に特異的であり、分析対象物および捕捉試薬
の両者は結合体に同時に結合することが抑制されるもの
である。固相は、連続流体流接触において結合体または
その複合体の固定化および比較表示のための少なくとも
２つの定められ場合により印を付けた検出部位を組み込
んであり、結合体回収部位は、捕捉部位を通過してきた
分析対象物／結合体複合体を結合することのできる捕捉
試薬を含んでいる。

【００１６】加えて、本発明の装置には、フロースルー
パッドまたは層状（ｌａｙｅｒｅｄ）装置および１種ま
たは２種以上の異なる物質からなる試験ストリップ装置
も含まれる。本発明の装置の修飾としては、試料適用パ
ッドまたは層、フィルター、フローコントロール層、ブ
ロッキング層および吸着パッドなどを含めることが挙げ
られる。 結合体は、捕捉部位の上流の位置にて装置上または装置
中に含有させてよいし、捕捉試薬に可逆的に結合させて
もよいし、または個々にまたは試料と混合したときに試
験溶液として装置と接触させてもよい。同様に、検出可
能なシグナルを生成するのに必要なその他のいかなるシ
グナル生成成分も、装置上または装置中に含まれていて
よいし、または個々に加えることもできる。

【００１７】本発明のアッセイ法は、分析対象物を含有
していると思われる試料を上記固相装置と接触させ、つ
いで試料を該固相中を移動させ、捕捉部位および結合体
回収部位に順番に接触させる。分析対象物、結合体、捕
捉試薬および結合体回収試薬から、および場合により補
助特異的結合成分から、検出可能な複合体が生成する。 ついで、これら複合体を視覚による観察または器械によ
り捕捉部位と結合体回収部位のいずれかの部位または両
部位で検出する。これら部位からの相対的なシグナルを
用いて、試料中の分析対象物の存在または量を決定する
。結合体が捕捉試薬と前以て複合体を形成しているアッ
セイ法においては、試料中に存在する分析対象物は該結
合体と置き換わり、該結合体は結合体回収部位で結合体
回収試薬により再捕捉される。

【００１８】試料中の分析対象物の存在または量を検出
するために結合体および比較用結合部位を使用する利点
により、広範な動的アッセイ範囲が得られる。少量の分
析対象物も一層容易に検出することができ、大量の分析
対象物を含有する試料も希釈工程を使用することなくア
ッセイすることができる。さらに、本発明のアッセイ法
の新規態様により、マルチ分析対象物アッセイ装置を製
造することが可能になり、試料のまぜ物を検出するため
のアッセイ手順コントロールが得られる。

【００１９】以下でさらに詳しく記載するように、本発
明のアッセイ装置は、検出可能なシグナルを生成する、
少なくとも１つの捕捉部位および少なくとも１つの結合
体回収部位とを含む。捕捉部位および結合体回収部位に
は、不溶化または他の仕方で該部位から除去され得ない
固定化試薬をそれぞれ組み込んである。一般に、捕捉部
位中の捕捉試薬は、結合体（すなわち、標識した特異的
結合成分）への結合に対して試料の分析対象物と競合す
る。結合体は、分析対象物への結合に対して複数の部位
を提供するのが好ましい。結合体の実質的にすべての結
合部位が分析対象物によって占拠されると、分析対象物
／結合体複合体は、結合体が捕捉試薬に結合することな
く、また分析対象物／結合体複合体が捕捉試薬によって
固定化されることなく、捕捉部位を自由に通過する。つ
いで、捕捉部位を通過してきた分析対象物／結合体複合
体を結合体回収部位の試薬が結合し固定化する。各部位
での標識の存在または量の比較分析または測定により、
試料中の分析対象物の存在または量が示される。これら
２つの部位はまた、以下でさらに詳細に記載するように
、有利なアッセイ制御機能をも果す。

【００２０】本発明の特定の態様について記載する前に
、本明細書で使用する幾つかの語句を定義する。「試料
」とは、分析対象物を含有すると思われる物質をいい、
採取源から得て直接使用し、またはその特性を修飾する
ために前処理してから使用する。試料は、生理学的流体
などのあらゆる採取源からのものであってよく、たとえ
ば、血液、唾液、眼レンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、
腹水、粘液、滑液、腹腔液、羊水などが挙げられる。こ
れら流体は、血液から血漿を調製したり、粘性流体を希
釈したりして使用前に前処理してよい。処理方法として
は、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の添加
などが挙げられる。生理学的流体の他に、環境アッセイ
または食品アッセイおよび診断アッセイなどを行うため
に、水、食品などの他の液体試料を用いることもできる
。加えて、分析対象物を含有すると思われる固体物質も
、液体媒体を形成するかまたは分析対象物を放出するよ
うに修飾すれば用いることができる。

【００２１】「特異的結合成分」とは、特異的結合ペア
の成分、すなわち、２つの異なる分子のうちの一方が他
方に化学的または物理的手段により特異的に結合するよ
うなものをいう。抗原および抗体特異的結合ペア成分に
加えて、他の特異的結合ペアとしては、たとえば、ビオ
チンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオ
チド配列、相補的ペプテド配列、エフェクター分子とレ
セプター分子、補酵素と酵素、酵素インヒビターと酵素
、ペプテド配列と該配列または全タンパク質に特異的な
抗体、ポリマー酸および塩基、染料およびタンパク質結
合体、ペプテドおよび特異的タンパク質結合体（たとえ
ば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプテドおよびリボヌクレ
アーゼ　Ｓ−タンパク質）などが挙げられるが、これら
に限られるものではない。

【００２２】さらに、特異的結合ペアには、元々の特異
的結合成分の類似体である成分、たとえば分析対象物類
似体または組換え技術により製造した特異的結合成分な
ども含まれていてよい。特異的結合成分が免疫反応物で
ある場合は、特異的結合成分は、たとえば抗体、抗原、
ハプテン、またはそれらの複合体であってよく、抗体を
使用する場合は、抗体はモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体、組換えタンパク質または抗体、それら
の断片の混合物、および抗体と他の特異的結合成分との
混合物であってよい。そのような抗体の調製法および特
異的結合成分として使用するのに適していることは当業
者によく知られている。

【００２３】「分析対象物」とは、少なくとも１つのエ
ピトープまたは結合部位を有する、検出または測定しよ
うとする化合物または組成物をいう。分析対象物は、分
析対象物特異的結合成分が天然に存在するかまたは調製
することのできる、あらゆる物質である。分析対象物と
しては、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプテド、微
生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミ
ン、薬物（治療目的で投与されるものおよび不法目的で
投与されるものを含む）、およびこれら物質の代謝産物
またはこれら物質に対する抗体などが挙げられるが、こ
れらに限られるものではない。「分析対象物」にはまた
、抗原性物質、ハプテン、抗体、巨大分子およびそれら
の組み合わせも含まれる。

【００２４】「分析対象物類似体」とは、分析対象物特
異的結合成分と交差反応する物質であるが、その程度は
分析対象物自体に比べて大きくても小さくてもよい。分
析対象物類似体は、目的の分析対象物と共通するエピト
ープ部位を少なくとも１つ有している限り、修飾した分
析対象物および分析対象物分子の断片部分または合成部
分であってもよい。分析対象物類似体の一例は、分析対
象物類似体が分析対象物特異的結合成分と結合すること
ができるように、全分子の分析対象物と少なくとも１つ
のエピトープが重複する合成ペプテドである。

【００２５】「結合体」とは、特異的結合成分に共有結
合的または非共有結合的に結合した検出可能な標識から
なる物質をいう。この場合、結合法は本発明にとって重
要ではない。標識により結合体は、試料中の分析対象物
の量に直接または間接的に関連した検出可能なシグナル
を生成することが可能になる。結合体の特異的結合成分
は、分析対象物に直接結合するかまたは補助特異的結合
成分（詳細は以下に記載する）により分析対象物に間接
的に結合するように選択する。結合体は、捕捉部位の上
流部位にて試験ストリップまたは装置中に組み込むこと
もできるし、試料と混合して試験溶液とすることもでき
るし、試料とは別に試験ストリップまたは装置に添加す
ることもできるし、または捕捉部位に前以て沈積させる
かまたは可逆的に固定化することもできる。

【００２６】「標識」とは、視覚手段または器械手段に
より検出可能なシグナルを生成し得る物質をいう。本発
明での使用に適した種々の標識には化学的または物理的
手段のいずれかによりシグナルを生成し得る標識が含ま
れ、たとえば、酵素と基質；色原体；触媒；蛍光化合物
；化学発光化合物；放射性標識；直接視覚標識（金など
のコロイド状金属粒子、セレンなどのコロイド状非金属
粒子、染色プラスチックまたは染色微生物などの染色ま
たは着色粒子、直接目に見える物質を含有する有機ポリ
マーラテックス粒子およびリポソームまたは他のベシク
ルなどを含む）などが挙げられる。

【００２７】特定の標識を選択することは重要ではない
が、視覚的に検出可能な発色有機ポリマーラテックス粒
子または器械により検出可能な蛍光化合物などのように
それ自体で検出可能なシグナルを生成し得るか、または
酵素／基質シグナル生成系などのように１種または２種
以上の他のシグナル生成成分との組み合わせで検出可能
なシグナルを生成し得るであろう。標識かまたは特異的
結合成分のいずれかを変えることにより種々の異なる結
合体を生成させることができる。その選択が、検出しよ
うとする分析対象物および所望の検出手段を考慮するこ
とを包含することは当業者には理解されるであろう。

【００２８】「シグナル生成成分」とは、他のアッセイ
試薬または分析対象物と反応して、分析対象物の存在を
示し視覚的手段または器械的手段により検出可能な反応
生成物またはシグナルを生成し得る物質をいう。本明細
書において「シグナル生成系」とは、所望の反応生成物
またはシグナルを生成するのに必要なアッセイ試薬群を
いう。たとえば、１種または２種以上のシグナル生成成
分を標識と反応させて検出可能なシグナルを生成させる
。 たとえば、標識が酵素である場合は、該酵素を１種また
は２種以上の基質または他の酵素と反応させて検出可能
な反応生成物を生成させることにより、検出可能なシグ
ナルを増幅させることができる。

【００２９】標識として使用するのに適した多数の酵素
が、米国特許第４，２７５，１４９号明細書のコラム１
９〜２３（該文献を参照のため本明細書に引用する）に
開示されている。本発明に有用な酵素／基質シグナル生
成系の例としては、酵素がアルカリホスファターゼであ
り、基質がニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェートまたはその誘
導体またはその類似体であるものである。

【００３０】別のシグナル生成系においては、標識は蛍
光化合物であり、この場合は検出可能なシグナルを生成
させるのに標識の酵素的操作は必要でない。そのような
系において標識として使用するのに適しているものとし
ては、フルオレセイン、フィコビリンタンパク質、ロー
ダミンおよびその誘導体および類似体などの蛍光分子が
挙げられる。

【００３１】本発明の好ましい態様においては、結合体
の標識成分に視覚的に検出可能な粒子を使用することに
より、反応読み取り部位において別のシグナル生成成分
を使用する必要なく試料中の分析対象物の存在または濃
度を直接視覚によりまたは器械により読み取ることがで
きる。粒子／標識として使用する物質は、米国特許第４
，３１３，７３４号および同第４，３７３，９３２号各
明細書（これら文献を参照のため本明細書に引用する）
に開示されているように、金などのコロイド状金属、お
よび染料粒子である。

【００３２】コロイド状セレン粒子などの非金属コロイ
ドの調製および使用は、米国特許出願第０７２，０８４
号明細書（１９８７年７月９日出願；該文献を参照のた
め本明細書に引用する）に開示されている。試験ストリ
ップにコロイド粒子標識を使用することは、米国特許出
願第０７２，４５９号明細書（１９８７年７月１３日出
願；該文献を参照のため本明細書に引用する）に開示さ
れている。標識として使用するための有機ポリマーラテ
ックス粒子は、米国特許出願第２４８，８５８号明細書
（１９８８年９月２３日出願；該文献を参照のため本明
細書に引用する）に開示されている。

【００３３】「固相」とは、本発明の試験装置の基礎を
なす適当なクロマトグラフィー性、吸湿性、多孔性、等
方性または毛管性物質をいう。本発明のアッセイ装置は
多くの形態であってよく、その幾つかは固相用に選択し
た物質による。たとえば、本発明のアッセイ装置は、フ
ロー−スルーアッセイ装置、クロマトグラフィーカラム
、ディップスティックまたは試験ストリップに使用する
ように形成した固相物質を含む。複数の物質または複数
の層が互いに流体流接触をすることにより該物質または
層間で試料が通過できる限り、試験ストリップ装置は２
種以上の物質からできていてよく（たとえば、異なるゾ
ーンまたは部位は異なる物質でできていてよい）、また
フロー−スルー装置は２以上の層を有していてよい（そ
の場合、異なる層は異なる物質からできていてよい）。

【００３４】流体流接触により試料の少なくとも幾つか
の成分（たとえば、分析対象物）が装置のゾーンまたは
層間で通過することができ、流体流接触は、流体流ゾー
ンまたは層間での接触界面に沿って一様であるのが好ま
しい。本発明のフロー−スルー装置において、捕捉部位
と結合体回収部位の各部位で固定化された標識の存在ま
たは量を他の部位からのシグナルを妨害することなく別
々に検出および／または測定することができるように、
該捕捉部位と結合体回収部位との間にブロッキング層を
存在させてもよい。アッセイ試薬を含有する装置のゾー
ンまたは層は、各ゾーン、層または試薬部位が連続流体
流接触にある限り、試薬を含有しないゾーンまたは層と
分離されていてもよいことも理解されるであろう（これ
は、試薬含有ゾーンまたは層の間接流体流接触と称する
）。本明細書での開示を簡単にするため、本発明の試験
装置は、二重読み取りシステムを行うのに必要な固定化
結合試薬を少なくとも含む試験ストリップ構造からなる
ものとして主として記載することにする。

【００３５】「捕捉試薬」とは、固相の一部分内または
一部分上に固定化または非拡散的に結合させて「捕捉部
位」を形成する特異的結合成分をいう。この場合、結合
方法は本発明にとって重要ではない。捕捉試薬は、結合
体またはその複合体に結合するものを選択する。一般に
、捕捉試薬は、結合体への結合に対して分析対象物と競
合する。別の態様では、分析対象物と標識試薬（たとえ
ば、標識分析対象物）とが捕捉試薬（たとえば、分析対
象物特異的抗体など）への結合に対して競合する。捕捉
試薬は、結合体に直接結合するか、または結合体に結合
した補助特異的結合成分により結合体に間接的に結合す
るものを選択することができる。

【００３６】本発明の捕捉部位とは、捕捉試薬と分析対
象物または結合体との特異的結合反応を局所化または集
中させることにより該捕捉部位に固定化された標識の検
出が固相の他の部分と比較して容易になるように固相上
で境界を定めた部分である。捕捉試薬の固相への適用は
、米国特許出願第９３１，４７６号明細書（１９８６年
１１月１７日出願；該文献を参照のため本明細書に引用
する）に記載されているように、浸漬、ペンでの記載、
毛細管または試薬ジェットプリント（ｊｅｔ−ｐｒｉｎ
ｔｉｎｇ）の使用により行う。加えて、捕捉部位に標識
が固定化されていない場合でも固相上の該部位の位置を
視覚または器械により決定できるように、捕捉部位をた
とえば染料で印を付けることもできる。捕捉試薬は、分
析対象物の不在下で実質的にすべての結合体を結合また
は保持するのに充分な量で装置上に存在する。

【００３７】「結合体回収試薬」とは、捕捉部位の下流
に試験ストリップの一部分内または一部分上に固定化さ
れて「結合体回収部位」を形成する特異的結合成分をい
う。 すなわち、結合体回収部位とは、捕捉部位で固定化され
なかった結合体を移動流体または試料から回収する固相
上の領域である。結合体回収部位は、試料が捕捉部位中
または捕捉部位を通って拡散または浸透し、引き続き結
合体回収部位に通過できるように、捕捉部位と直接また
は間接的に流体流接触している。固相に結合体回収試薬
を結合させる方法は本発明にとって重要ではない。

【００３８】結合体回収試薬は、結合体またはその複合
体と結合し、結合することによって固定化するものを選
択する。たとえば、結合体回収試薬は、結合体の標識部
分、結合体の特異的結合成分または標識と特異的結合成
分との結合により形成されるエピトープ、および結合体
／補助特異的結合成分複合体または結合体／分析対象物
複合体と結合するものを選択する。捕捉部位と同様に、
本発明の結合体回収部位は、特異的結合反応を局所化ま
たは集中させることによって該部位に固定化された標識
の検出が固相上の他の部分と比較して容易にするように
固相上に境界を定められた部分である。結合体回収部位
は、該部位に標識が固定化されていない場合でも固相上
での該部位の位置を視覚または器械により決定できるよ
うに印を付けておいてもよい。

【００３９】結合体回収試薬の固相上への適用は、上記
捕捉試薬について記載したのと同様の方法により行うこ
とができる。結合体回収試薬は、捕捉部位から置き換え
られたまたは捕捉部位を通過してきた実質的にすべての
結合体と結合し保持するのに充分な量で装置上に存在す
るのが好ましい。すなわち、結合体回収試薬の量は、試
料中に存在することが通常予測される分析対象物の量に
少なくとも等しくなければならない。別の態様では、結
合体回収部位に固定化した結合体回収試薬は、試料中に
存在することが予測される分析対象物の量を越える量で
存在していてよい。米国特許出願第１５０，２７８号明
細書（１９８８年１月２９日出願；該文献を参照のため
本明細書に引用する）に開示されているように、移動性
の結合体回収試薬に特異的な結合成分を固相に結合させ
たり、または荷電物質などの反応性試薬を固相に結合さ
せ、該反応性試薬が、移動性結合体回収試薬に結合させ
た反対荷電物質を誘引・結合するようなどの分離工程を
行うために別法を使用することもできる。

【００４０】「補助特異的結合成分」とは、結合体、捕
捉試薬または結合体回収試薬の特異的結合成分の他にア
ッセイで使用する特異的結合ペアの成分をいう。１種ま
たは２種以上の補助特異的結合成分をアッセイに使用す
ることができる。たとえば、分析対象物自体が結合体に
直接結合できない場合に、補助特異的結合成分が該結合
体を該分析対象物に結合させることができるものであっ
てよいし、または結合反応において分析対象物と複合体
を形成することのできる結合体の量を増加させるために
補助特異的結合成分を使用することもできる。補助特異
的結合成分はアッセイ装置中に組み込むこともできるし
、または別の試薬溶液として装置に添加することもでき
る。

【００４１】「分析対象物誘導体」とは、試料またはア
ッセイ反応混合物中の濃度が分析対象物の濃度に正比例
する物質をいう。たとえば、誘導体は、分析対象物と補
助特異的結合成分（これが、今度は結合成分を結合する
）との複合体であってよい。他の例としては、誘導体は
分析対象物濃度と化学量論的関係で生成した反応生成物
であってよく、その際、該反応生成物が結合成分に結合
する。それゆえ、分析対象物誘導体は、分析対象物濃度
と定量的な関係を有する物質をいう。

【００４２】アッセイ法 　　本発明の方法の一態様は、まず試料と結合体（標識
した分析対象物特異的結合成分）とを混合することによ
り試験溶液を生成させて行う。この試験溶液を試験スト
リップなどの固相装置と接触させる。この試験ストリッ
プには、試験溶液を接触させる適用部位；結合体への結
合に対して分析対象物と競合し得る捕捉試薬（たとえば
、分析対象物類似体）を結合した捕捉部位；および該捕
捉部位を通過してきた結合体を固定化することのできる
結合体回収試薬を結合させた、該捕捉部位から下流にあ
る結合体回収部位が含まれている。

【００４３】これら捕捉部位および結合体回収部位の両
方の部位での検出可能なシグナルを観察し、アッセイ結
果を決定する。このアッセイでは、試料中に存在する分
析対象物が多いほど、捕捉部位に固定化される結合体は
少なくなり、結合体回収部位に固定化される結合体は多
くなる。これら二重検出部位により、両方の結果を観察
し、場合により定量することができる。捕捉部位での結
果と結合体回収部位での結果を比較することによりアッ
セイ感度が高められる。というのは、捕捉部位における
シグナルの比較的小さな減少が結合体回収部位（最初、
シグナルがなかった）でのシグナルの比較的大きな増加
として現れるからである。加えて、既知量の結合体を用
いれば、上記２つの検出部位に固定化された結合体の割
合を比較することにより比率が得られ、この比率から試
料中に存在する分析対象物の量を定量的または半定量的
に評価することができる。

【００４４】本発明の好ましい態様においては、多価結
合体を用いる。多価結合体は、２種以上の分析対象物分
子と同時に結合することができる。たとえば、複数の分
析対象物分子と結合できる複数結合部位を有する抗体の
ように、結合体の特異的結合成分が多価であってよい。 別の態様としては、標識を２種以上の一価または多価の
特異的結合成分に結合させてよく、たとえば、複数の一
価抗体（各抗体が分析対象物分子に結合する）を結合さ
せた直接目に見えるコロイド状粒子であってよい。多価
結合体上の実質的にすべての分析対象物結合部位が試料
からの分析対象物分子によって占拠されなければならず
、または結合体は捕捉部位で固定化されるであろう（た
とえば、結合体は分析対象物類似体捕捉試薬に結合する
）。それゆえ、本発明の多価結合体では、結合体が捕捉
部位を通って移動してゆき結合体回収部位まで通過する
前に、前以て決定した閾値量の分析対象物が試料中に存
在していなければならない。

【００４５】多価結合体の使用はまた、アッセイ法の動
的範囲を広げるのに役立つ。好ましい多価結合体として
は、多数の特異的結合成分を結合させたコロイド状粒子
標識が挙げられる。この多価結合体では、アッセイの動
的範囲は、コロイド状粒子に結合した特異的結合成分の
数により決定される。そのような結合体は、コロイド粒
子のサイズ（一層多くの特異的結合成分を収容できるよ
うに）およびコロイド粒子当たりの特異的結合成分の数
の両方を制御することにより、アッセイの動的範囲を調
節するのに使用することができる。分析対象物が飽和す
るのに充分なほど多くの結合部位が結合体上に存在する
場合は、捕捉部位から結合体を置換するためまたは結合
体が捕捉部位に結合するのを防ぐため、正比例して一層
多くの分析対象物が必要であり、結合体に対して分析対
象物と分析対象物類似体との間で競合が起こる範囲が増
加する。

【００４６】本発明の別の態様においては、試料と結合
体を個々に固相に接触させるか、または、これらを混合
して試験溶液とし、該溶液を固相に接触させる。本発明
の最も好ましい態様においては、試料を接触させさえす
ればアッセイを実質的に自動的に行うことができるよう
に、結合体を固相試験装置中に組み込んでおく。固相上
の適用部位は装置上で試薬の存在しない部分であっても
よいし、または適用部位は捕捉部位または移動性の結合
体の存在する部位であってもよい。それ自体で検出する
ことのできない標識を使用する方法では、試験溶液中に
含まれていないかまたは固相上に存在しないシグナル生
成系の残りの成分に固相を接触させる。別のやり方とし
ては、捕捉部位および結合体回収部位を残りのシグナル
生成成分に個々に接触させてもよい。

【００４７】本発明の各態様にはまた、補助特異的結合
成分の使用が含まれる。１種または２種以上の補助特異
的結合成分を装置中または装置上の適当な位置に置くか
、または装置に別々に加えて、捕捉部位および／または
結合体回収部位での分析対象物、結合体または分析対象
物／結合体複合体の結合を競合させる。補助特異的結合
成分には、２種またはそれ以上の特異的結合成分から生
成した複合体が含まれる。加えて、補助特異的結合成分
は、一層多量の結合体が結合することができるように、
分析対象物上の結合部位数を間接的に増加させるために
使用することができる。たとえば、抗体／ビオチン複合
体（すなわち、複数のビオチン分子に結合した抗体から
なる補助特異的結合成分）を用いて、一価分析対象物（
たとえば、単一の結合部位を有する抗原）を標識抗ビオ
チン抗体からなる複数の結合体分子に結合させることが
できる。

【００４８】本発明のさらに別の態様では、結合体置換
／再捕捉形態を使用する。たとえば、捕捉部位には、結
合体を可逆的に複合させた分析対象物類似体捕捉試薬が
含まれていてよい。試料中に分析対象物が存在しない場
合は検出可能なシグナルは捕捉部位でのみ認められる。 というのは、結合体と競合して結合する分析対象物が存
在せず、それゆえ捕捉部位から結合体を置換することが
ないからである。しかしながら、試料中に分析対象物が
存在する場合は、結合体は捕捉部位から置換されて分析
対象物に結合し、結合体回収部位（結合体またはその複
合体に直接または間接的に結合し得る特異的結合成分を
含有する）まで通過してゆく。それゆえ、試料中の分析
対象物の量が多くなればなるほど、捕捉部位から置換さ
れる結合体の量が多くなり、捕捉部位での検出可能なシ
グナルに比べて結合体回収部位での検出可能なシグナル
が大きくなる。

【００４９】前以て沈積した結合体（捕捉部位に可逆的
に結合させてある）の使用により、捕捉部位でのシグナ
ルの減少が単に捕捉部位における結合体捕捉の非特異的
抑制の結果ではないということが保証される。他の置換
／再捕捉形態の例においては、捕捉部位には結合体（た
とえば、標識した分析対象物類似体）を前以て複合させ
た分析対象物特異的結合成分捕捉試薬が含まれているか
、または捕捉部位には結合体（たとえば、標識した分析
対象物特異的結合成分）を可逆的に複合させた分析対象
物または分析対象物類似体が含まれていてよい。

【００５０】本発明の特に好ましい方法では、特異的結
合成分に結合させた直接視覚からなる結合体とともに置
換／再捕捉形態を使用する。直接視覚標識を使用するこ
とにより、別のシグナル生成試薬を添加する必要なく、
また読み取り装置を使用する必要なく、捕捉部位および
結合体回収部位の両方でのシグナル変化を検出すること
が可能となる。

【００５１】本発明のさらに別の態様では、結合体は特
異的結合成分に結合した標識からなり、該結合成分は分
析対象物に特異的な結合部位および捕捉試薬に特異的な
別の結合部位を有する。捕捉試薬は、結合体の特異的結
合成分部分上の部位（結合体上の特異的結合成分部分上
の分析対象物結合部位とは異なる）に結合するものを選
択し、捕捉試薬が結合すると結合体への分析対象物の結
合は妨害または抑制される。また、分析対象物の結合に
より結合体への捕捉試薬の結合が妨害または抑制される
。この態様では、捕捉試薬は分析対象物、分析対象物類
似体または分析対象物誘導体のいずれでもない。この競
合結合のひとつの説明は、立体障害である。たとえば、
リウマチ因子（ＩｇＭ）のアッセイにおいては、結合体
は標識した抗ビオチン抗体（標識ＩｇＧ）であり、捕捉
試薬はビオチンであり、分析対象物と捕捉試薬とは結合
体の抗体成分への結合に対して競合する。

【００５２】結合体抗体は、ある種の特異的結合成分が
結合する定常領域またはドメイン（アイソタイプフラグ
メント）、および異なる特異的結合成分が結合する少な
くとも１つの可変領域またはドメイン（イデオタイプフ
ラグメント）を有する。上記例では、ＩｇＭ分析対象物
（抗ＩｇＧ抗体である）は、ＩｇＧ分子のアイソタイプ
エピトープに結合し、一方、ビオチン捕捉試薬はＩｇＧ
分子のイデオタイプエピトープに結合する。分析対象物
の結合体への結合はＩｇＧ分子に影響を与え、該分子が
同時に捕捉試薬を結合できなくする。そのような結合妨
害の正確な原因は本発明にとって重要ではない。当業者
であれば分析対象物の結合体への結合がその後の結合体
の捕捉試薬への結合を抑制するかどうかを経験的に決定
することができる。

【００５３】本発明の上記態様はまた、本発明の二重読
み取り装置上で競合アッセイ／サンドイッチアッセイの
組み合わせを行うことをも可能にする。リウマチ因子の
例では、結合体回収試薬は分析対象物特異的結合成分で
あってよく、該結合成分は、捕捉部位を通過してきた分
析対象物／結合体複合体の分析対象物部分に直接結合し
、捕捉試薬／分析対象物／結合体サンドイッチを形成す
る。

【００５４】本発明の結合体および二重読み取り態様は
また、試料中の２種以上の分析対象物の存在または量を
検出するためのアッセイを行うに際しても有利である。 たとえば、マルチ薬物スクリーニングアッセイ法および
装置において、検出しようとする各異なる分析対象物に
対して捕捉部位が存在してよく、一つの捕捉部位にはコ
カイン分析対象物類似体が含まれ、２番目の捕捉部位に
はアヘン剤分析対象物類似体が含まれ、３番目の捕捉部
位にはアンフェタミン分析対象物類似体が含まれていて
よい。結合体（標識および適当な分析対象物特異的結合
成分からなる）を各捕捉部位において分析対象物類似体
と可逆的に複合体を形成させることができる。結合体回
収部位は特異的結合成分からなり、該結合成分は、分析
対象物の存在下で生成し捕捉部位を通過して該回収部位
まで移動してきた結合体／分析対象物複合体を固定化す
る。本発明の二重読み取りシステムは、１または２以上
の捕捉部位での標識の減少および結合体回収部位での標
識の増加により１種または２種以上の薬物の存在を示す
。

【００５５】マルチ分析対象物アッセイの修飾形として
は、複数の結合体回収部位の使用が挙げられる。どの薬
物が試料中に存在するかを知る必要がある場合は、各分
析対象物に対して異なる結合体回収試薬を別々の結合体
回収部位で使用し、所定の分析対象物がシステムの増加
および減少の両方により検出し得るようにすることがで
きる。別の態様として、幾つかの薬物のうちのいずれか
１種が存在することだけを知る必要がある場合は、単一
の結合体回収試薬（特異的結合成分部分が使用したいず
れの結合体とも結合する「包括的」結合体回収試薬）を
複数の部位で使用して、はしご状形態を形成させること
ができる（この態様については、以下でさらに詳細に説
明する）。標識を検出することのできる回収部位の数が
増加すればするほど、分析対象物の量または試料中の分
析対象物の合計量が増加する。

【００５６】本発明の装置および方法は、単一の分析対
象物に対して２つの異なる部位において減少シグナルお
よび増加したシグナルを検出および／または測定するこ
とができるので、アッセイの信頼性および感度を高める
ことができる。これら２つの異なる部位におけるアッセ
イ結果の検出は直接視覚で読み取ることにより行うこと
ができるし、または装置読み取りを行うこともできる。 捕捉部位および結合体回収部位の両部位におけるシグナ
ルの観察により、アッセイ結果の妥当性の二重チェック
が可能になる。

【００５７】適当な滴定量の結合体、捕捉試薬および結
合体回収試薬を用いた手順により、定量的または半定量
的アッセイにおける正確さの範囲が拡大される。低濃度
の分析対象物で結合体置換／再捕捉態様を使用する場合
には、捕捉部位では僅かなシグナルの減少しか認められ
ないが、結合体回収部位では、たとえ低いシグナルの出
現でも一層容易に観察することができ該部位での感度が
増大する。高濃度の分析対象物では、シグナルの減少は
大きいので捕捉部位での感度は大きく、結合体回収部位
での増加シグナルは一層容易に検出することができ、定
量結果を確認するのに役立つ。試薬濃度を適当に選択す
ることにより、上記２つの検出部位が部分重複しない最
適の感度を有するような装置を製造することができる。

【００５８】本発明の二重読み取りシステムの他の利点
は、試料の混ぜものを検出することができることであり
、これは乱用薬物の分野で特に重要な有利なアッセイ制
御となる。従来のイムノアッセイ法では、尿試料に漂白
剤、家庭で使う界面活性剤または酸または塩基などの物
質を混ぜると免疫反応は抑制され、サンドイッチアッセ
イ態様において検出部位で偽陰性の結果が観察される。 このような混ぜものは結合反応を抑制し、この抑制は分
析対象物の不在を示すアッセイ結果として示される。し
かしながら、二重読み取りシステムでは、試料の混ぜも
のは捕捉部位および結合体回収部位の両部位でのシグナ
ルの不在となって現れ、直ちに混ぜものが明らかとなる
。

【００５９】本発明の他のアッセイ制御機能は、従来の
装置の単一の検出部位と比較した二重読み取り態様によ
り得られる。従来の装置では、試料が異常に高含量の分
析対象物を含有している場合には捕捉部位は検出可能な
シグナルを示すことができない。すなわち、利用できる
結合体の結合部位に分析対象物が過剰負荷され、結合体
は捕捉部位に全く結合できない。しかしながら、本発明
では、結合部位が分析対象物によって完全に占拠された
結合体でも結合体回収部位に固定化される。それゆえ、
試料が異常に高含量の分析対象物を含有している場合で
も本発明の装置は該分析対象物の存在または量を検出す
ることができる。

【００６０】アッセイ装置 　　本発明のアッセイ装置は、その中を分析対象物を含
有する溶液または流体が移動することのできる、適当な
吸着性、多孔性、等方性または毛管性加工物質であって
よい。この溶液は、吸引、水圧、気圧、吸湿力または毛
管作用またはそれらの組み合わせにより固相中を引っ張
ったり押し出したりする。可能なアッセイ装置には、通
常のクロマトグラフィーカラム、細長いストリップ物質
（流体流は実質的に直線状である）、およびシート（流
体流は直線状または放射状である）などが含まれるが、
これらに限られるものではない。すでに記載したように
、フロー−スルー装置を製造する場合は、一般に捕捉部
位と結合体回収部位との間にブロッキング層を存在させ
ることにより、妨害シグナルを生じさせることなく各部
位で固定化された標識の存在または量を別々に検出およ
び／または測定することができる。たとえば、色原体標
識またはコロイド粒子標識に使用するのに適したブロッ
キング層成分としては、一方の部位のシグナルが他の１
または２以上の読み取り部位で検出されることを抑制す
る不透化物質が挙げられる。

【００６１】天然物質、合成物質、または合成的に修飾
した天然物質を使用することができ、その例としては、
紙、セルロースおよびセルロース誘導体（酢酸セルロー
ス、ニトロセルロースなど）などのセルロース物質の紙
（繊維状）または膜（微多孔性）；繊維ガラス；天然の
布（たとえば、綿など）および合成の布（たとえば、ナ
イロンなど）；シリカゲル、アガロース、デキストラン
およびゼラチンなどの多孔質ゲル；多孔質繊維マトリッ
クス；セファデックスブランドの架橋デキストラン鎖な
どのデンプンに基づく物質；セラミック物質；ポリ塩化
ビニル、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、
ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸ビニルと塩化ビ
ニルとのコポリマーおよびポリ塩化ビニル−シリカの組
み合わせなどを含むオレフィンまたは熱可塑性物質など
が挙げられる。固相物質は、検出可能なシグナルの産生
を妨害してはならない。ストリップまたはシートを用い
る場合は、それ自体妥当な強度を有しているか、または
補助的な支持体により強度を与え得る必要がある。

【００６２】好ましい固相物質はニトロセルロースであ
る。とりわけ膜状の固相物質を使用する場合には、固相
中で流体流を開始する前に試料と結合体を混合して、分
析対象物と結合体との間に制御された再現性のある結合
反応を生成させる。別の態様では、試験装置はさらに、
結合体を含有する前混合適用パッドを備えていてもよい
。そのような装置は、米国特許出願第２８２，９７８号
明細書（１９８８年１２月１４日出願；該文献を参照の
ため本明細書に引用する）に開示されている。適用パッ
ドに用いる物質は、試料と結合体とを前以て混合できる
能力により選択する。固相としてニトロセルロースを使
用する場合は、ポレックス（Ｐｏｒｅｘ）親水性ポリエ
チレンフリットまたはガラス繊維濾紙が適当な適用パッ
ド物質である。別の態様において、ガラス繊維濾紙など
の固相物質を使用する場合は、試料適用部位かまたは捕
捉部位の上流にある他の部位のいずれかにてストリップ
上で可逆的に結合体を固定化させることができる。さら
に他の装置および方法においては、結合体を別の試薬溶
液として試料に続いてまたは試料と同時に装置に添加す
ることができる。

【００６３】適用パッドは、試料が該パッドから試験ス
トリップに通過してゆくことのできる物質からできてい
てよい。適用パッドに使用するのに好ましい物質として
は、多孔質ポリエチレンフリットまたはパッドおよびガ
ラス繊維または濾紙などが挙げられる。該物質はまた、
分析対象物およびアッセイ試薬と適合し得るものを選択
しなければならない。

【００６４】加えて、適用パッドには、分散的または非
分散的に結合させた１種または２種以上のアッセイ試薬
が含まれていてよい。適用パッドに含ませることのでき
る試薬としては、結合体、補助特異的結合成分、試料前
処理試薬およびシグナル生成成分などが挙げられるが、
これらに限られるものではない。アッセイ試薬を適用パ
ッド中に隔離しておくことにより、相互反応性の試薬を
互いに分離し、製造工程を容易にすることができる。

【００６５】固相を特定の大きさにすることは都合上の
問題であり、試料のサイズ、アッセイプロトコール、シ
グナルの検出および測定手段などに依存するであろう。 たとえば、流体移動速度および固相により吸収させる試
料の量を制御するために大きさを選択する。

【００６６】捕捉部位および／または結合体回収部位は
、試験ストリップに適当な特異的結合成分を直接または
間接的に結合させることによって形成することができる
。直接結合の例としては、吸着または（ｉ）ハロゲン化
シアン（たとえば、臭化シアン）または（ｉｉ）グルタ
ルアルデヒドの使用などの共有結合が挙げられる。試験
ストリップがニトロセルロースでできている場合は吸着
によって所望の試薬を試験ストリップに直接固定化する
のが好ましい。

【００６７】捕捉試薬および結合体回収試薬を固相に直
接結合させる必要はない。特異的結合成分を他の物質に
結合させ、この物質を物理的手段、化学的手段または生
化学的手段により固相内に物理的に封じ込めたり保持お
よび固定化させることができる。たとえば、特異的結合
成分を不溶性の微細粒子に結合させ、この微細粒子を固
相に結合させる。試薬を微細粒子に結合させる手段とし
ては、共有結合的手段および非共有結合的手段の両方が
挙げられる。一般に、捕捉試薬および結合体回収試薬を
共有結合的手段により微細粒子に結合させるのが好まし
い。

【００６８】「保持および固定化」とは、粒子が一旦試
験ストリップ上に存在したら該ストリップ内のどこか他
の位置に実質的に移動することができないことをいう。 粒子は、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアク
リルアミド、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボ
ネート、ガラスまたは同様の物質からできた物質を含む
、あらゆる適当なタイプの微小粒子から当業者により選
択することができる。粒子のサイズは重要ではないが、
一般に粒子の平均直径は固相の平均孔径または毛管サイ
ズよりも小さいのが好ましい。

【００６９】粒子のサイズは、使用した固相物質の種類
および粒子の原材料物質の種類に依存して変わる。たと
えば、ガラス繊維アッセイ装置においては、ガラスおよ
びポリスチレン粒子は、固相物質の孔内に封じ込めまた
は固定化され、移動流体に直面したときに移動しないよ
うに充分なサイズを有していなければならない。同じガ
ラス繊維マトリックスにおいては、はるかに小さなラテ
ックス粒子を用いることができる。というのは、予期し
ないことに、ラテックス粒子は未知の機構によってガラ
ス繊維に結合するからである（米国特許出願第７８４，
４１６号明細書（１９８５年１０月４日出願）参照）。 それゆえ、孔のサイズに依存するガラスおよびプラスチ
ック粒子とは違って、ラテックス粒子は孔のサイズには
依存せず、固相の孔がロット毎に異なることは装置の性
能に悪影響を与えることはない。

【００７０】前以て決定した量のシグナル生成成分およ
び補助特異的結合成分を装置中に組み込むことができ、
このことにより別のプロトコール工程または試薬添加の
必要がなくなる。それゆえ、試験ストリップ内に固定化
するために２種以上の試薬を微細粒子に結合させること
は本発明の範囲に含まれる。たとえば、酵素／基質シグ
ナル生成系での検出可能な反応生成物の拡散を遅延また
は防ぐため、基質を試験ストリップ内に固定化すること
ができる。基質は当該技術分野でよく知られた方法によ
り試験ストリップに直接結合させることにより固定化す
ることもできるし、または基質を不溶性の微細粒子に共
有結合により固定化し、この不溶性の微細粒子を試験ス
トリップ中および／または試験ストリップ上に沈積させ
てもよい。

【００７１】捕捉試薬および結合体回収試薬は、種々の
形態の試験ストリップ上または試験ストリップ中に単独
または種々組み合わせて沈積させて、異なる検出または
測定態様とすることができる。たとえば、全試験ストリ
ップの面積よりも実質的に小さな別々の結合部位を形成
するように捕捉試薬および結合体回収試薬を沈積させる
ことができる。

【００７２】別の態様では、試験ストリップの広範な部
分にわたって上記試薬を実質的に均一に分布させて捕捉
部位および結合体回収部位を形成させることもできる。 捕捉部位および結合体回収部位の長さ方向に沿ってシグ
ナルが生成される程度が、試料中の分析対象物の量と相
関している。分析対象物の定量は、得られたシグナルの
長さまたは距離を、製造業者によって装置に備えられた
分析対象物の検量標準または他の検量スケールに対して
観察されるシグナルの長さまたは距離と比較することに
より行うことができる。

【００７３】別の態様としては、試薬を勾配パターンで
分布させる、すなわち捕捉部位および結合体回収部位の
いずれかまたは両部位の上流よりも下流において試薬の
量が少なくなるようにすること；数字、文字、点、およ
び「＋／−」、「％」などの記号を含むパターンを形成
するように適当なアッセイ試薬およびコントロール試薬
を分布させること；または試験ストリップの近位末端（
すなわち、試料適用末端）辺りから遠位末端辺りに間隔
を置いた一連の平行線として試薬を分布させて、はしご
状捕捉部位および／または結合体回収部位形態を生成さ
せること；またはシート様装置上の中央の試料または試
験溶液適用部位を囲んだ連続した環として試薬を分布さ
せることなどが挙げられるが、これらに限られるもので
はない。上記試薬の分布の仕方については、米国特許出
願第０７２，４５９号（１９８７年７月１３日出願）お
よび同第７８４，４１６号各明細書に開示されている（
該文献を参照のため本明細書に引用する）。

【００７４】上記種々のシグナル表示態様またはパター
ンにはまた、アッセイ試薬または装置の有効性、アッセ
イの完了またはアッセイ工程の適切な順番を確認するた
めのアッセイコントロールが含まれていてよい。試験ス
トリップの遠位末端に結アッセイの完了（すなわち、ア
ッセイ指示薬の終了）を示す試薬を用いることも本発明
の範囲に含まれる。たとえば、アッセイの終了は、試験
溶液、毛管溶液またはシグナル生成成分との接触により
指示薬が変色することにより示すことができる。水性の
試験溶液との接触で変色する試薬としては、ＣｕＳＯ４
、Ｃｏ（ＮＯ３）２などの脱水遷移金属塩が挙げられる
。ｐＨ指示薬染料を選択して緩衝毛管溶液のｐＨに応答
させることもできる。たとえば、フェノールフタレイン
は、８．０〜１０．０の範囲のｐＨを有する毛管溶液と
接触すると透明から濃いピンク色に変化する。

【００７５】試料を試験ストリップに接触させるには、
試料を適用部位に適用するか、または適用部位を試料中
に浸漬する。放射状の捕捉部位および結合体回収部位を
有するシート様の装置では、中央の適用部位に試料を適
用する。試験ストリップまたはカラムにおいては、捕捉
部位の上流にあるストリップのいかなる部分に試料を適
用することもできるし、適用部位が捕捉部位であっても
よい。試料を固相に接触させる前に、試料を結合体、緩
衝液または毛管試薬（すなわち、試料が固相中を移動す
るのを容易にする試薬）などの別の試薬と混合してもよ
い。さらに別の態様においては、捕捉部位の上流の試験
ストリップのある部分に試料を適用し、該試料適用部位
の上流の試験ストリップのさらに別の部分に１種または
２種以上の他の試薬を適用する。

【００７６】本発明の方法および装置は、濾過手段を付
加させることによりさらに修飾することができる。濾過
手段は、適用部位または適用パッドの上方に置いた別の
物質であってもよい、または適用パッドと試験ストリッ
プとの間に置いてもよい。別の態様においては、濾過能
を有する適用部位またはパッドを選択してもよい。濾過
手段としては、あるサイズよりも大きな粒子を試料から
除くために使用するフィルターまたはトラップ装置など
が挙げられる。たとえば、フィルター手段を用いて全血
試料から赤血球を除去し、血漿を試験ストリップに移す
ようにすることができる。そのようなフィルター手段は
、米国特許第４，４７７，５７５号およびＷＯ出願第８
６／０２１９２号明細書（１９８７年４月２３日公開）
に開示されている（該文献を参照のため本明細書に引用
する）。場合により、フィルター手段には試料から粒子
または妨害物質を除去するための１種または２種以上の
試薬が含まれていてもよい。

【００７７】本発明の別の態様では、適用部位またはパ
ッドから試験ストリップへの試料の流速を制御するため
に適用部位またはパッドと残りの試験ストリップとの間
に置いた物質の別のゾーン、１または２以上の層を使用
することが含まれる。そのような流れの制御は、適用部
位またはパッドでの試料と試薬との反応のために長いイ
ンキュベーション時間が望ましい場合に好ましい。別の
態様においては、そのようなゾーンまたは層には１種ま
たは２種以上の別の試薬が含まれていてもよく、該試薬
は試料を添加するまで適用部位またはパッドの試薬とは
分離されているのが好ましく、または該試薬は未反応の
試料またはアッセイ試薬が試験ストリップに通過するの
を防ぐように働く。

【００７８】さらに別の態様では、装置の結合体回収部
位の下流に吸着物質が含まれていてよい。吸着物質は、
固相上の捕捉部位および結合体回収部位を通過する試料
および結合体の量を増加させる働きをなし得ることが理
解されるであろう。

【００７９】少量の非水溶性または粘性試料を装置に適
用する場合には、装置中の試薬および試料の移動を容易
にするために毛管溶液、好ましくは緩衝毛管溶液を使用
する必要がある。水性試料を用いる場合は、毛管溶液を
用いる必要はないが、流れ特性を改善したり試料のｐＨ
を調節するために使用することもできる。イムノアッセ
イにおいては、毛管溶液は一般に約５．５〜約１０．５
、一層好ましくは約６．５〜約９．５のｐＨ範囲を有す
る。 特異的結合成分の間での結合親和性の有意レベルを維持
するためにｐＨを選択する。しかしながら、結合体の標
識成分が酵素である場合には、酵素シグナル生成系にお
ける発色のため、有意な酵素活性を維持するようにｐＨ
を選択しなければならない。代表的な緩衝液としては、
リン酸塩、炭酸塩、バルビツール、ジエチルアミン、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、２
−アミノ−２−メチル−１−プロパノールなどが挙げら
れる。毛管溶液と試料とは適用パッドに接触させる前に
混合してもよく、または適用パッドに順番に接触させて
もよい。

【００８０】結合体などのアッセイ試薬は、アッセイを
行っている間に装置に直接添加してよい。しかしながら
、本発明の好ましい態様においては、すべての必要な試
薬をアッセイ装置中に組み込んでおき、液体試料を装置
と接触させるだけでよいようにする。

【００８１】本発明はさらに結合アッセイを行うための
キットを提供する。たとえば、本発明のアッセイキット
は、試薬を組み込んだアッセイ装置からなっていてよく
、場合により上記毛管溶液および／または試料前処理試
薬をも含んでいる。当業者に知られた他のアッセイ成分
、たとえば緩衝液、安定化剤、界面活性剤、非特異的結
合抑制剤、細菌抑制剤などもアッセイ装置および毛管溶
液中に含んでいてよい。

【００８２】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１（アヘン剤アッセイ） （ａ）結合体の調製 直接視覚標識に結合させたモノクローナル抗体からなる
結合体を以下の手順に従って調製した。０．０３％コロ
イド状セレン（５．０ｍｌ；粒子サイズ　約１６０〜１
７０ｎｍ；２．０％炭酸カリウムでｐＨ６．５に調整）
をマウスモノクローナル抗モルヒネ抗体（５６μｇ；３
−β−Ｄ−グルクロニドモルヒネキーホールリンペット
ヘモシアニンに対して産生させたもの）と１０分間反応
させた。ついで、１０％ポリエチレングリコール（５０
μｌ；ＰＥＧ−２０，０００）を加えて反応をブロック
した。５分間撹拌した後、得られた結合体を希釈液（４
．０ｍｌ；４．０％ショ糖、２．０％カゼイン、１．０
％プルロニック１０４［ＢＡＳＦ、パーシッパニー、Ｎ
Ｊ］および５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６を含有）と混合
した。ついで、０．２ミクロンのフィルターを用いて結
合体を濾過した。

【００８３】（ｂ）試験ストリップの調製以下の手順に
従って試験ストリップを調製した。ニトロセルロースシ
ート（５ミクロンの孔サイズ、シュライヒャー・アンド
・シュエル、キーン、ＮＨ）の一方の端（すなわち、近
位末端）から１０ｍｍの位置に水平の線で、捕捉試薬で
ある３−β−Ｄ−グルクロニドモルヒネウシ血清アルブ
ミン［１．０ｍｇ／ｍｌ；２０％グリセリンおよび２．
０％ショ糖を含有する０．１Ｍ　ＭＥＳ（２−［Ｎ−モ
ルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ５．０）中
］を適用した。この捕捉試薬は、結合体への結合に対し
て試料中の分析対象物と競合することができた。

【００８４】上記シートの同じ末端から１５ｍｍの位置
に、結合体回収試薬であるヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５
ｍｇ／ｍｌ；２０％グリセリン、２．０％ショ糖および
１．０％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有する０．
１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中）を適用した。この
結合体回収試薬は、捕捉部位を通過してきた結合体と結
合し、それゆえ固定化することができた。このシートを
空気乾燥し、捕捉部位および結合体回収部位がストリッ
プの幅を横切り、ストリップの近位末端からそれぞれ１
０ｍｍおよび１５ｍｍの位置となるようにカッティング
した。

【００８５】（ｃ）アッセイプロトコール試料（１０μ
ｌ）と結合体（１０μｌ）とをウエル中で混合して試験
溶液とした。試験ストリップの近位末端をウエル中に入
れ、試験溶液をストリップ中、捕捉部位および結合体回
収部位まで移動させた。試験混合物がもう一方の端まで
到達したときにストリップを取り出し空気乾燥した。つ
いで、反射スキャナー［カマグ（Ｃａｍａｇ）ＴＬＣス
キャナーＩＩ、ムルテンツ、スイス］上、５４０ｎｍで
ストリップをスキャンした。

【００８６】試料中の分析対象物の量が少なければ少な
いほど捕捉部位で分析対象物類似体により捕捉される結
合体の量は多くなるので、結合体回収部位でのシグナル
に比べて捕捉部位でのシグナルは大きくなる。試料中の
分析対象物の量が増えると生成する分析対象物／結合体
複合体の量は多くなるので、捕捉部位を通過する結合体
は多くなって結合体回収部位で結合され、このため結合
体回収部位でのシグナルは大きくなる。アヘン剤の濃度
が１，０００ｎｇ／ｍｌ未満である場合に、捕捉部位ま
たは結合体回収部位のいずれかを観察することにより試
料中に存在するアヘン剤の量を定量または検出した。加
えて、分析対象物の濃度に依存して、装置の形態により
捕捉部位および回収部位の両部位でシグナルを観察する
ことができ、それゆえ分析対象物の濃度を非常に正確に
評価することができた。アヘン剤の濃度が１，０００ｎ
ｇ／ｍｌより大きい場合は、捕捉部位よりも結合体回収
部位において遥かに高いシグナルが検出された。この場
合は、試料を希釈してから再試験して濃度を評価した。 種々の濃度のアヘン剤分析対象物の試料についてアッセ
イした結果を表１に示す。

【００８７】 　　　　　　表１（アヘン剤のストリップアッセイ）　
　相対反射率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
アヘン剤試料濃度（ｎｇ／ｍｌ）　　（５４０ｎｍにお
ける単位）　　　０　　　　１００　　　　２００　　
　　３５０　　　　６００　　　　１０００　　　　捕
捉部位　　　　　　　　　　　　　　　　１１８　　　
　８２　　　　　６７　　　　　５６　　　　　５４　
　　　　３８　　　　結合体回収部位　　　　　　　　
　　　　０　　　　１３　　　　　２５　　　　　３８
　　　　　４２　　　　　５０

【００８８】実施例２（
ベンゾジアゼピンアッセイ）（ａ）結合体の調製 直接視覚標識に結合させた抗体からなる結合体を以下の
手順に従って調製した。０．０３％コロイド状セレン（
５．０ｍｌ；粒子サイズ　約１６０〜１７０ｎｍ；２．
０％炭酸カリウムでｐＨ７．７に調整）を脱イオン水（
５．０ｍｌ）で希釈し、アフィニティー精製ヒツジ抗ベ
ンゾジアゼピン抗体（７０μｇ；１−カルボメチル−７
−クロロベンゾジアゼピンチログロブリンに対して産生
させたもの）と約１０分間混合した。ついで、５．０％
ＢＳＡ（０．１Ｍトリス（ｐＨ８．２）中）を加えて反
応をブロックした。１０分後、２．０％炭酸カリウムで
結合体のｐＨを７．７に調節した。ついで、０．２ミク
ロンのフィルターを用いて結合体を濾過し、使用すると
きまで４°Ｃで貯蔵した。

【００８９】（ｂ）試験ストリップの調製１−カルボメ
チル−７−クロロベンゾジアゼピンウシ血清アルブミン
（１．０ｍｇ／ｍｌ　ＭＥＳ緩衝液）を用いて分析対象
物類似体捕捉部位を生成させ、ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体
（１．０ｍｇ／ｍｌ　トリス緩衝液）を用いて結合体回
収部位を生成させた他は、実質的に実施例１に記載の方
法に従って試験ストリップを調製した。

【００９０】（ｃ）アッセイプロトコール試料（１０μ
ｌ）、結合体（１０μｌ）およびリン酸緩衝食塩水（１
０μｌ；２．０％カゼイン、０．１％ポリオキシエチレ
ン［２０］ソルビタンモノラウレートおよび０．０５％
アジ化ナトリウムを含有、ｐＨ７．４）をウエル中で混
合して試験溶液とした。ストリップの近位末端をウエル
中に入れて試験溶液をストリップ中、捕捉部位および結
合体回収部位へ移動させた。試験混合物がストリップの
もう一方の端まで到達したとき、ストリップを取り出し
空気乾燥した。ついで、実施例１と同様にしてストリッ
プを読み取った。種々のベンゾジアゼピン（分析対象物
）濃度について、捕捉部位および結合体回収部位での相
対的なシグナルの差異を表２に示す。分析対象物の濃度
が大きくなればなるほど、捕捉部位に固定化される結合
体は少なくなり、結合体回収部位に固定化される結合体
は多くなった。

【００９１】 　　　　　　表２（ベンゾジアゼピンアッセイ）　　相
対反射率　　　　　　　　　　　　　　　　　ベンゾジ
アゼピン試料濃度（ｎｇ／ｍｌ）　　（５４０ｎｍにお
ける単位）　　　０　　　　　　２００　　　　　　８
００　　　　２４００　　　　捕捉部位　　　　　　　
　　　　　　　　１１１　　　　　８６　　　　　　　
　６７　　　　　　５１　　　　結合体回収部位　　　
　　　　　　　　５０　　　　　８０　　　　　　　　
９７　　　　１０３

【００９２】実施例３（テオフィリ
ンアッセイ）（ａ）結合体の調製 直接可視標識に結合させたモノクローナル抗体からなる
結合体を以下の手順に従って調製した。０．０３％コロ
イド状セレン（５．０ｍｌ；上記実施例１と同じ；２．
０％炭酸カリウムでｐＨ６．９に調節）を脱イオン水（
５．０ｍｌ）で希釈し、モノクローナル抗テオフィリン
抗体（２０μｇ；８−テオフィリン−ウシ血清アルブミ
ンに対して産生させたマウス抗体）と約１０分間混合し
た。ついで、５．０％カゼイン（１００μｌ；０．１Ｍ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．１５）中）を加えて反応を
ブロッキングした。５分後、０．２ミクロンフィルター
を用いて結合体を濾過し、使用のときまで４°Ｃで貯蔵
した。

【００９３】（ｂ）試験ストリップの調製試験ストリッ
プの調製は、８−（３’−カルボプロピル）−１，３−
ジメチル−キサンチン−ＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ、２
０％グリセロールおよび２．０％ショ糖を含有する０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中）を用い
て分析対象物類似体捕捉部位を生成し、ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（０．３ｍｇ／ｍｌ、２０％グリセロール、２
．０％ショ糖および１．０％ＢＳＡを含有する０．１Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）中）を用いて結合体回収部
位を生成した他は実質的に実施例１に記載の方法に従っ
た。 両部位の調製は、オートマイクロピペットを用いてニト
ロセルロース上に試薬の線を手で引くことにより行った
。

【００９４】（ｃ）アッセイプロトコール実質的に実施
例２に記載のプロトコールに従ってアッセイプロトコー
ルを行った。種々の濃度のテオフィリン（分析対象物）
について捕捉部位と結合体回収部位との相対シグナルの
差異を表３に示す。分析対象物の濃度が大きくなるにつ
れて捕捉部位に固定化される結合体は減少し、結合体回
収部位に固定化される結合体は多くなった。

【００９５】 　　　　　　表３（テオフィリンアッセイ）　　相対反
射率　　　　　　　　　　　　　　　　テオフィリン試
料濃度（μｇ／ｍｌ）　　（５４１ｎｍにおける単位）
　　　　０　　　　２．５　　　　１０　　　　４０　
　捕捉部位　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
８　　　８９　　　　６０　　　　４０　　結合体回収
部位　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　６１　
　　　７６　　　　８９

【００９６】実施例４（コカイ
ンアッセイ）コカインアッセイのため、標識抗コカイン
抗体および試験ストリップをそれぞれ実質的に実施例１
（ａ）および実施例１（ｂ）に記載の手順に従って調製
した。試験ストリップには、分析対象物類似体捕捉試薬
を含有する捕捉部位および抗−抗体結合体回収試薬を含
有する結合体回収部位とが含まれていた。アッセイプロ
トコールは実質的に実施例１（ｃ）に記載のプロトコー
ルに従い、１．０〜２５０μｇ／ｍｌのベンゾイルエク
ゴニンを含有する試料を用いて行った。種々の濃度の分
析対象物について捕捉部位と結合体回収部位との相対的
シグナルの差異を図１に示す。シグナルの測定は実施例
１と同様にして行った。

【００９７】図１に示したデータは、低濃度の分析対象
物では、分析対象物類似体捕捉試薬を含有する捕捉部位
は殆どの結合体を結合させるが、再捕捉または結合体回
収部位は、分析対象物と複合体を形成し捕捉部位を通過
してきた結合体を結合させたことを示している。しかし
ながら、たとえ低濃度の分析対象物でも０のバックグラ
ウンドを越える結合体回収部位での検出可能で識別し得
る標識の上昇があったこと、すなわち結合体回収部位の
感度が大きくて、たとえ低いシグナルの出現であっても
一層容易に観察し得ることをデータは示している。試料
中の分析対象物の濃度が増加すると、両方の反応性読み
取り部位で生成するシグナルは等しくなった。高濃度の
分析対象物では、捕捉部位でのシグナルは少なくなった
が、結合体回収部位は飽和に近付き、定量結果を確認す
るのに役立った。両方の反応性読み取り部位に適当な滴
定量の結合体および試薬を用いることにより、本発明の
装置は所定の濃度範囲で分析対象物の濃度を検出するこ
とが可能になる。

【００９８】実施例５（リウマチ因子サンドイッチアッ
セイ） （ａ）結合体の調製 ウサギ抗ビオチン抗体および直接可視標識からなる結合
体を以下の手順で調製した。１％塩化金溶液を蒸留水で
調製した。ついで、この溶液（１０ｍｌ）に蒸留水（５
００ｍｌ）を加えた。得られた溶液を加熱沸騰させ、１
％クエン酸ナトリウム（８．０ｍｌ）を加えた。この溶
液を加熱し、溶液の色が赤味がかった紫色になるまで撹
拌した。ついで、このコロイド状金を冷却し、使用する
ときまで４°Ｃで貯蔵した。

【００９９】ウサギ抗ビオチン抗体（１００μｌ；１ｍ
ｇ／ｍｌ）を１０％ＢＳＡ溶液（１００μｌ）と混合し
た。上記コロイド状金（２０ｍｌ）を１５０ｍＭホウ酸
塩緩衝液（２．０ｍｌ、ｐＨ８．０８）と混合した。つ
いで、緩衝コロイド状金を上記抗ビオチン抗体／ＢＳＡ
溶液に加え、室温で１０分間混合した。反応混合物に１
０％ＢＳＡ溶液（６００μｌ）を加えて反応停止させた
。この混合物を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離に
かけ、上澄み液を除き、ペレットを０．２％ＰＥＧを含
有する１５ｍＭホウ酸塩で１：１に再懸濁してコロイド
状金／ウサギ抗ビオチン抗体結合体を生成させた。最終
的な結合体の濃度は８０μｇ／ｍｌであった。ついで、
この結合体をトリス緩衝食塩希釈液（ＴＢＳ：３．０％
カゼインを含有する０．１ｍＭトリス［ヒドロキシメチ
ル］アミノメタンアセテート［０．９％食塩水、ｐＨ７
．８］）と１：１５の比で混合した。

【０１００】（ｂ）試験ストリップの調製以下の手順に
従って試験ストリップを調製した。捕捉部位には、ビオ
チン化ウサギ血清アルブミン捕捉試薬（ビオチン−ＲＳ
Ａ）（結合体の抗ビオチン抗体成分に特異的に結合する
ものを選択した）が含まれていた。このビオチン−ＲＳ
Ａを調製するため、ホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ８．０）中
の２％ＲＳＡ溶液を調製した。Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン；５３．３ｍｇ）
をジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）中に溶解し、こ
の溶液（１００μｌ）を上記２％ＲＳＡ溶液（１．０ｍ
ｌ）に加えた。この反応混合物を室温で２時間混合した
。混合物を０．９％食塩水に対して一夜透析し、ついで
食塩水を変え、混合物をさらに２時間透析した。ついで
、混合物を２００ｍＭホウ酸塩（ｐＨ８．４）に対して
３時間透析した。ついで、得られたビオチン−ＲＳＡ捕
捉試薬をＴＢＳ希釈液（０．５ｍｇ／ｍｌ；０．１％Ｂ
ＳＡ、１．０％ショ糖および０．００３％フェノールレ
ッドを含有）と混合した。

【０１０１】結合体回収部位には結合体回収試薬として
ヒトＩｇＧ（ＨＩｇＧ；シグマ、セントルイス、ＭＯ）
が含まれていた。この試薬は、分析対象物およびそれに
結合した結合物を結合させることにより結合体を間接的
に固定化するものを選択した。結合体回収試薬を、捕捉
試薬に用いたのと同じ希釈液と混合した。

【０１０２】捕捉試薬および結合体回収試薬をニトロセ
ルロースシート上に送り込むのに試薬ジェットを用いた
。ニトロセルロースシートの一方の端（すなわち、近位
末端）から１０ｍｍの位置に水平な線（幅０．０３イン
チ）で捕捉試薬（ビオチン−ＲＳＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ
）を１回で適用した。試料からのＩｇＭリウマチ因子分
析対象物（抗ＩｇＧ抗体）は、結合体への結合に対して
ビオチン捕捉試薬と競合した。シートの同端から１２．
５ｍｍ、１５ｍｍおよび１７．５ｍｍの位置に水平な線
（幅０．０３インチ）でＨＩｇＧ（５．０ｍｇ／ｍｌ）
の３つの結合体回収部位を適用した。第一の結合体回収
部位は２回で、第二および第三の結合体回収部位は１回
で適用した。ＨＩｇＧ結合体回収試薬は分析対象物を結
合することができ、それゆえ捕捉部位を通過してきた分
析対象物が結合した結合体を固定化することができた。 シートを空気乾燥し、ストリップ（４×５０ｍｍ）にカ
ッティングして捕捉部位および３つの結合体回収部位ま
たはバーがストリップの幅を横切るようにした。使用す
るときまで、これらストリップを乾燥剤とともに貯蔵し
た。

【０１０３】（ｃ）補助結合成分の調製ビオチン化ＨＩ
ｇＧ補助結合成分を以下の手順で調製した。ＨＩｇＧ溶
液（１．０ｍｌ；蒸留水中に１．０ｍｇ／ｍｌ）をＮＨ
Ｓ−ビオチン溶液（１００μｌ；蒸留水中に１０ｍｇ／
ｍｌ）と混合した。反応混合物を４°Ｃで２時間混合し
た。ＴＢＳ（１１０μｌ；１００ｍＭトリス、２００ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）を加えて反応停止させた。 混合物をＴＢＳ（２０ｍＭトリス、２００ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０８）に対して一夜透析した。ついで、得
られたビオチン−ＨＩｇＧ補助結合成分をＴＢＳ希釈液
（１％ＰＥＧ含有）と１：２５の比で混合して最終濃度
を１μｇ／ｍｌとした。この補助結合成分は、結合反応
中に存在するビオチンの量を増加させることにより分析
対象物に間接的に結合される結合体の量を増加させるた
めにアッセイ中で使用した。すなわち、分析対象物は補
助結合成分のＨＩｇＧ部分に結合し、複数の結合体構造
が補助結合成分のビオチン成分に結合する。

【０１０４】分析対象物は、結合体への結合に対して捕
捉試薬と競合する。分析対象物および捕捉試薬は結合体
の同じ部位では結合しないが、結合体のウサギ抗ビオチ
ン抗体部分に分析対象物が結合すると抗ビオチン抗体は
影響を受けて、補助特異的結合成分のビオチンかまたは
捕捉部位のビオチンのいずれかが結合できなくなる。

【０１０５】試料中に分析対象物が存在しないと、ビオ
チン／抗ビオチン結合により結合体／補助結合成分複合
体および遊離の結合体の両方が捕捉部位に固定化された
。試料中に分析対象物が存在していると、結合体／補助
結合成分複合体、結合体／補助結合成分／分析対象物複
合体、結合体／分析対象物複合体および遊離の結合体が
反応混合物中に存在する。分析対象物の濃度が増加する
と、結合体／補助結合成分／分析対象物複合体の濃度お
よび結合体／分析対象物複合体の濃度が増加し、これら
複合体は捕捉部位を通過し、分析対象物を介して結合体
回収部位のＨＩｇＧに結合する。

【０１０６】（ｄ）アッセイプロトコール試料（１５μ
ｌ）、結合体（７．５μｌ）および補助結合成分（７．
５μｌ）をウエル中で混合して試験溶液とし、ストリッ
プの近位末端をウエル中に入れて試験溶液をストリップ
中を移動させて捕捉部位および回収部位に到達させた。 ８分後、ストリップと取り出して空気乾燥した。 試料には、１つのリウマチ因子（ＲＦ）陰性血清試料と
５つのＲＦ陽性試料とが含まれていた。ついで、実施例
１と同様にして、反射スキャナー上、５４０ｎｍにてス
トリップをスキャンした。アッセイ結果を表４に示す。

【０１０７】得られた結果は、試料中の分析対象物の量
が少なくなればなるほど捕捉部位で捕捉される結合体の
量は少なくなり、それゆえ、捕捉部位でのシグナルは結
合体回収部位でのシグナルに比べて大きくなることを示
していた。それゆえ、ＲＦ陰性の試料を試験したストリ
ップでは捕捉部位にのみ検出可能なシグナルが認められ
た。試料中の分析対象物の量が増加すると、生成される
結合体／補助結合成分／分析対象物複合体および結合体
／分析対象物複合体の量が多くなり、それゆえ、一層多
くの結合した結合体が捕捉部位を通過し、結合体回収部
位で固定化されて検出可能なシグナルの増加が示される
。表４に示すように、試料中の分析対象物の量が多くな
ればなるほど、検出可能なシグナルを有する結合体回収
部位の数は多くなり、および／または各部位でのシグナ
ルは大きくなる。

【０１０８】 　　　　　　表４（リウマチ因子アッセイ）　　相対反
射率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＲＦ試料力価　　（５４１ｎｍにおける単位）　　　
０　　　　２０　　　　１６０　　　　１２８０　　　
　１０２４０　　　８１９２０　　　　捕捉部位　　　
　　　　　　　　　　　　　１０９　　１００　　　９
４．３３　　　７８．３　　　　　５４．６　　　　５
２．１　　　　結合体回収部位 　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　
　　　０　　　５．９　　　３３．０　　　　４８．７
　　　　　７２．９　　　　４５．４　　　　　　　　
　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　
０　　　　　０　　　　　　　８．２　　　　　１０．
７　　　　１４．７　　　　　　　　　　３　　　　　
　　　　　　　　　　　　０　　　　０　　　　　０　
　　　　　　０　　　　　　　　６．９　　　　　８．
５

【０１０９】本発明の二重読み取りシステムおよび任
意の多価結合体は、種々のタイプの固相結合アッセイに
適用することができる。しかしながら、当業者であれば
、他の固相物質および抗原または抗体以外の他の分析対
象物にも本発明を適用し得ることが評価されるであろう
。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　種々の濃度のベンゾイルエクゴニンを用い
て本発明のアッセイを行った場合の捕捉部位および再捕
捉部位でのシグナルを示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中の分析対象物の存在または量の
   決定法であって、（ａ）その中を該分析対象物、および
   標識に結合した特異的結合成分からなる結合体が移動す
   ることのできる固相であって、連続流体流接触において
   該結合体およびその複合体よりなる群から選ばれたもの
   を固定化および比較表示するための少なくとも２つの定
   められた検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）該結合
   体への結合に対して分析対象物と競合し得る固定化捕捉
   試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）該結合体および
   その複合体よりなる群から選ばれたものを結合し得る、
   該捕捉試薬とは異なる固定化結合体回収試薬からなる結
   合体回収部位であって、該捕捉部位を通って移動してき
   た該結合体または結合体複合体を結合する部位からなる
   固相に該試料を接触させ、（ｂ）試料を該検出部位を移
   動させ、ついで（ｃ）該捕捉部位および該結合体回収部
   位の両方に固定化された結合体を検出して分析対象物の
   存在または量を決定することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための装置であって、その中を該分析対象物、
   および標識に結合した特異的結合成分からなる結合体が
   移動することのできる固相であって、連続流体流接触に
   おいて該結合体およびその複合体よりなる群から選ばれ
   たものを固定化および比較表示するための少なくとも２
   つの定められた検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）
   該結合体への結合に対して分析対象物と競合し得る固定
   化捕捉試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）該結合体
   およびその複合体よりなる群から選ばれたものを結合し
   得る、該捕捉試薬とは異なる固定化結合体回収試薬から
   なる結合体回収部位であって、該捕捉部位を通って移動
   してきた該結合体または結合体複合体を結合する部位か
   らなる固相、からなることを特徴とする装置。
3. 【請求項３】　　試料中の分析対象物の存在または量の
   決定法であって、（ａ）その中を該分析対象物、および
   標識に結合した特異的結合成分からなる結合体が移動す
   ることのできる固相であって、連続流体流接触において
   該結合体およびその複合体よりなる群から選ばれたもの
   を固定化および比較表示するための少なくとも２つの定
   められた検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）分析対
   象物と結合体とが競合的に結合する固定化捕捉試薬から
   なる捕捉部位、および（ｉｉ）該標識、該結合体に特有
   のエピトープおよび補助特異的結合成分よりなる群から
   選ばれたものを結合し得る、該捕捉試薬とは異なる固定
   化結合体回収試薬からなる結合体回収部位であって、該
   捕捉部位を通って移動してきた該結合体または結合体複
   合体を結合する部位からなる固相に該試料を接触させ、
   （ｂ）試料を該検出部位を移動させ、ついで（ｃ）該捕
   捉部位および該結合体回収部位の両方に固定化された結
   合体を検出して分析対象物の存在または量を決定するこ
   とを特徴とする方法。
4. 【請求項４】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための装置であって、その中を該分析対象物、
   および標識に結合した特異的結合成分からなる結合体が
   移動することのできる固相であって、連続流体流接触に
   おいて該結合体およびその複合体よりなる群から選ばれ
   たものを固定化および比較表示するための少なくとも２
   つの定められた検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）
   分析対象物と結合体とが競合的に結合する固定化捕捉試
   薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）該標識、該結合体
   に特有のエピトープおよび補助特異的結合成分よりなる
   群から選ばれたものを結合し得る、該捕捉試薬とは異な
   る固定化結合体回収試薬からなる結合体回収部位であっ
   て、該捕捉部位を通って移動してきた該結合体または結
   合体複合体を結合する部位からなる固相、からなること
   を特徴とする装置。
5. 【請求項５】　　試料中の分析対象物の存在または量の
   決定法であって、（ａ）連続流体流接触において該結合
   体およびその複合体よりなる群から選ばれたものを固定
   化および比較表示するための少なくとも２つの定められ
   た検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）該結合体への
   結合に対して分析対象物と競合し得る固定化捕捉試薬か
   らなる捕捉部位、および（ｉｉ）分析対象物、分析対象
   物複合体および分析対象物特異的補助結合成分よりなる
   群から選ばれたものを結合し得る、該捕捉試薬とは異な
   る固定化結合体回収試薬からなる結合体回収部位であっ
   て、該捕捉部位を通って移動してきた該結合体または結
   合体複合体を結合する部位からなり、その中を該分析対
   象物、および該分析対象物に特異的な結合部位および該
   捕捉試薬に特異的な結合部位を有する特異的結合成分に
   結合した標識からなる結合体であって、分析対象物と該
   結合体とが結合すると該捕捉試薬と該結合体との結合は
   抑制され、該結合体と該捕捉試薬とが結合すると分析対
   象物と該結合体との結合が抑制される結合体が移動する
   ことのできる固相に試料を接触させ、（ｂ）試料を該検
   出部位を移動させ、ついで（ｃ）該捕捉部位および該結
   合体回収部位の両方に固定化された結合体を検出して分
   析対象物の存在または量を決定することを特徴とする方
   法。
6. 【請求項６】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための装置であって、連続流体流接触において
   該結合体およびその複合体よりなる群から選ばれたもの
   を固定化および比較表示するための少なくとも２つの定
   められた検出部位を有し、該検出部位が、（ｉ）該結合
   体への結合に対して分析対象物と競合し得る固定化捕捉
   試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）分析対象物、分
   析対象物複合体および分析対象物特異的補助結合成分よ
   りなる群から選ばれたものを結合し得る、該捕捉試薬と
   は異なる固定化結合体回収試薬からなる結合体回収部位
   であって、該捕捉部位を通って移動してきた該結合体ま
   たは結合体複合体を結合する部位からなり、その中を該
   分析対象物、および該分析対象物に特異的な結合部位お
   よび該捕捉試薬に特異的な結合部位を有する特異的結合
   成分に結合した標識からなる結合体であって、分析対象
   物と該結合体とが結合すると該捕捉試薬と該結合体との
   結合は抑制され、該結合体と該捕捉試薬とが結合すると
   分析対象物と該結合体との結合が抑制される結合体が移
   動することのできる固相、からなる装置。
7. 【請求項７】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための試験キットであって、（ａ）その中を該
   分析対象物、および標識に結合した特異的結合成分から
   なる結合体が移動することのできる固相であって、（ｉ
   ）該結合体への結合に対して分析対象物と競合し得る固
   定化捕捉試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）該結合
   体およびその複合体よりなる群から選ばれたものを結合
   し得る、該捕捉試薬とは異なる固定化結合体回収試薬か
   らなる結合体回収部位であって、該捕捉部位を通って移
   動してきた該結合体または結合体複合体を結合する部位
   からなる少なくとも２つの定められた検出部位を有する
   固相、および（ｂ）該標識により検出可能なシグナルを
   生成するのに有効な量のシグナル生成系の他の成分から
   なるキット。
8. 【請求項８】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための試験キットであって、（ａ）その中を該
   分析対象物、および標識に結合した特異的結合成分から
   なる結合体が移動することのできる固相であって、連続
   流体流接触において該結合体およびその複合体よりなる
   群から選ばれたものを固定化および比較表示するための
   少なくとも２つの定められた検出部位を有し、該検出部
   位が、（ｉ）分析対象物と結合体とが競合的に結合する
   固定化捕捉試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）該結
   合体およびその複合体よりなる群から選ばれたものを結
   合し得る、該捕捉試薬とは異なる固定化結合体回収試薬
   からなる結合体回収部位であって、該捕捉部位を通って
   移動してきた該結合体または結合体複合体を結合する部
   位からなる固相、および（ｂ）該標識により検出可能な
   シグナルを生成するのに有効な量のシグナル生成系の他
   の成分からなるキット。
9. 【請求項９】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための試験キットであって、（ａ）連続流体流
   接触において該結合体およびその複合体よりなる群から
   選ばれたものを固定化および比較表示するための少なく
   とも２つの定められた検出部位を有し、該検出部位が、
   （ｉ）該結合体への結合に対して分析対象物と競合し得
   る固定化捕捉試薬からなる捕捉部位、および（ｉｉ）分
   析対象物、分析対象物複合体および分析対象物特異的補
   助結合成分よりなる群から選ばれたものを結合し得る、
   該捕捉試薬とは異なる固定化結合体回収試薬からなる結
   合体回収部位であって、該捕捉部位を通って移動してき
   た該結合体または結合体複合体を結合する部位からなり
   、その中を該分析対象物、および該分析対象物に特異的
   な結合部位および該捕捉試薬に特異的な結合部位を有す
   る特異的結合成分に結合した標識からなる結合体であっ
   て、分析対象物と該結合体とが結合すると該捕捉試薬と
   該結合体との結合は抑制され、該結合体と該捕捉試薬と
   が結合すると分析対象物と該結合体との結合が抑制され
   る結合体が移動することのできる固相、および（ｂ）該
   標識により検出可能なシグナルを生成するのに有効な量
   のシグナル生成系の他の成分からなるキット。
10. 【請求項１０】　　試料中の分析対象物の存在または量
    を決定するための試験ストリップ装置であって、その中
    を、標識に直接または間接的に結合した特異的結合成分
    からなる結合体、および分析対象物が移動することがで
    きる固相からなり、（ａ）分析対象物、該結合体および
    結合体複合体よりなる群から選ばれたものと結合し得る
    固定化捕捉試薬からなる捕捉部位、および（ｂ）該捕捉
    試薬とは異なり該固相上に固定化されたまたは固定化さ
    れるべき結合体回収試薬であって、該捕捉試薬を通って
    移動してきた該結合体およびその複合体よりなる群から
    選ばれたものを結合し得る結合体回収試薬からなる結合
    体回収部位からなる少なくとも２つの定められたアッセ
    イ検出部位を有し、該検出部位が連続流体流接触にあり
    該部位に直接または間接的に固定化された結合体の固定
    化および比較表示をすることができることを特徴とする
    装置。