JPH04231877A - クラミジア菌または淋菌測定用の免疫学的組成物及び診断試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クラミジア抗原または
淋菌抗原に向けた酵素標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメント
を含んでなる診断試験キットまたは緩衝化組成物に関す
る。本発明はまた、その緩衝化組成物を使用する前記抗
原類の迅速かつ正確な測定方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術】近年では、動物またはヒトにおける感染
物質の存在または量を検出するのにイムノアッセイが使
用されるようになってきた。アッセイを有用ならしめる
には、高度の信頼性を維持しながら特定の感染物質を検
出しなければならない。これには、殆どの場合に菌体類
の特有な抗原の単離および対応する抗体と前記抗原との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、相当安価で、使用が簡単であり、そして迅速であ
ることも必要である。

【０００３】イムノアッセイによって検出することがで
きる生菌体の１つは、クラミジアレス（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａｌｅｓ）目、クラミジアセエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｃｅａｅ　）属の２つの菌種の１つであるクラミジア・
トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　　ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ　）（本明細書では、「Ｃ．トラコマチス」
という）である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性
リンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を初め
とする多くのヒトの眼および性器の疾病の原因となるこ
の種に属する１５以上の菌株が存在する。Ｃ．トラコマ
チスに由来する感染症は、普遍的な世代間で蔓延し、そ
のため非淋菌性尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人
存在すると信じられる。

【０００４】淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
　）属、特にＮ．ゴノローエ（Ｎ．　　ｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ　）に属する細菌に起因する性器接触で一般に
伝播される疾病である。この疾病は年に数千の人間を疾
病にかからせ、たとえ抗生物質がその蔓延の抑制に役立
っているとはいえ、いまだ世界の多くの地域の人々の間
で伝染性の疾病として存続している。この細菌の検出お
よび処置の重要性は、十分に認識されている。Ｎ．メニ
ンギチジス（Ｎ．　　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およ
びＮ．ラクタミカ（Ｎ．　　ｌａｃｔａｍｉｃａ　）も
また、無視できない医療上および診断上の対象の菌種で
ある。

【０００５】これらの疾病の広く蔓延する性質のため、
クラミジア菌体および淋菌菌体の検出に関する迅速、簡
便かつ信頼性のある試験を入手することに相当な興味が
存在する。クラミジア菌体由来の抗原を検出しそして抽
出するための有用な方法を見い出すべく相当な数の研究
が行われてきた。固体支持体を使用して実施されるＣ．
トラコマチスおよびＮ．ゴノローエ用アッセイは、米国
特許第　４，４９７，８９９号および同　４，４９７，
９００号明細書に記載されている。記載されたアッセイ
は、それらの菌体から抗原を抽出する工程およびそれを
裸の固体支持体上に塗布する工程により行われている。 次に、この塗布された抗原は、１種は適当に標識されて
いる１種または２種のいずれかの抗体により検出されて
いる。このアッセイの主な特徴は、どのような材料にも
処理されていないか、または塗布もされていない付着用
の固体支持体を使用することにある。抗原の付着は、支
持体上に抗原の吸着を起こさせるのに十分長い時間その
塗布支持体をインキュベーションすることにより達成さ
れていることが明らかである。この吸着時間は、加温（
３７℃）下で少なくとも３０分である。米国特許第　４
，４９７，８９９号明細書に記載されるアッセイ全体は
、少なくとも３時間かけて行われる。 Ｎ．ゴノローエに対する類似するアッセイが米国特許第
　４，４９７，９００号明細書に記載されている。

【０００６】クラミジア抗原および淋菌抗原に対する他
のアッセイはヨーロッパ特許公開第０３２５０４５号に
記載されているが、このアッセイの時間の長さは高温（
３７℃）で９０分までである。高い信頼性を有しそして
室温で行うことのできるクラミジア菌体または淋菌菌体
用のより迅速な試験を手に入れることが望まれるであろ
う。

【０００７】このような改良は１９９０年６月１５日公
開の特開平２−１５６１５７号公報に記載されそして特
許請求されている。イオン的に帯電した支持体はクラミ
ジア抗原または淋菌抗原を引きつけ、これらの抗原を迅
速かつ感度よく検出することを可能にすることが見い出
された。しかしながら、ある種の生物学的被検体、具体
的には膨大な量の全血、粘液または成分を含むものにつ
いてはさらなる改良が必要であった。従って、１９９０
年８月２１日公開の特開平２−２１０２６３号公報に記
載の改良が行れた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述の出願では相当な
改良が公表されているとはいえ、依然としてアッセイを
さらに早める（すなわち、２０分未満にする）必要性が
存在する。ユーザーがクラミジア感染症や淋菌感染症の
迅速な診断や処置についてより都合がよくそして適する
アッセイを見い出すには、従来のアッセイのプロトコー
ルから可能な限り多くの工程を省略することが望まれる
であろう。さらに、アッセイで使用されるペルオキシダ
ーゼ標識抗体結合物は、ある程度の安定性（すなわち、
保存寿命）を有するが、さらなる安定性とより長期の保
存寿命についての欲求が存在する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】既知のアッセイに付随す
る課題は、次の各工程を含んでなるクラミジア抗原また
は淋菌抗原の測定方法によって解決される。 Ａ．被検体由来のクラミジア抗原または淋菌抗原とその
抗原と反応性のどのような生物学的化合物も実質的に含
まない微孔質膜とを接触してその膜に前記抗原を直接バ
インディングさせる工程、 Ｂ．５分以内に、そのバインディングした抗原と、それ
ぞれクラミジア抗原または淋菌抗原へ免疫学的に向けた
酵素標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含んでなる免疫
組成物とを接触して前記膜にバインディングした標識免
疫複合体を形成する工程、ならびに Ｃ．工程Ｂの接触１０分以内に、前記膜上にバインディ
ングした標識複合体の存在またはその量を測定する工程
。

【００１０】この発明はまた、クラミジア菌体もしくは
淋菌菌体またはそれらの抗原成分のいずれかに向けた酵
素標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含んでなる緩衝化
免疫組成物も提供する。さらに、前記緩衝化免疫組成物
を含んでなるクラミジア菌体または淋菌菌体の測定に有
用な診断試験キットも提供する。

【００１１】さらにまた、クラミジア抗原もしくは淋菌
抗原と、それらのいずれかに向けた酵素標識Ｆ（ａｂ′
）２フラグメントを含んでなる緩衝化組成物とを接触し
た後、未複合体化酵素標識フラグメントまたは前記抗原
によって形成した前記酵素標識フラグメントの酵素標識
複合体のいずれかを測定することを含んでなるクラミジ
ア抗原もしくは淋菌抗原の測定方法も提供する。

【００１２】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
は、いずれかの適当な医療または診断上の技術を使用し
て患者から得られた生物学的被検体中のＣ．トラコマチ
ス（もしくは他のクラミジア種）の存在またはＮ．ゴノ
ローエ（もしくは他の淋菌種）の存在を測定する方法を
含んでなる。このような被検体としては、例えば、患者
の頸管、尿道、咽喉または肛門および滑液または病巣由
来の流体もしくは滑液のような体液から得られる綿棒被
検体が挙げられる。こうして得られる生物学的被検体は
、測定されるべきクラミジア抗原または淋菌抗原（ある
いはそれらの混合物）を含む細菌を含有することが予測
される。

【００１３】このアッセイは、自然のままのクラミジア
菌体または淋菌菌体上の抗原部位の検出を行うことがで
きるが、アッセイ感度を高めるにはそれらの菌体から抗
原成分（例えば、リポ多糖もしくはタンパク質）を抽出
することが一般に望ましい。菌体を溶解し、含まれる抗
原を遊離させるための標準的な技法、例えば溶媒希釈も
しくは高ｐＨ溶菌液、酵素処理、加熱および音波処理も
しくは遠心のような物理的攪拌を使用することができる
。 アニオン洗浄剤またはドデシル硫酸ナトリウムおよびデ
スオキシコール酸ナトリウムのような塩の使用も既知で
ある。

【００１４】好ましい態様では、本発明を使用してクラ
ミジアのリポ多糖（糖脂質グループ）抗原を検出するこ
とができる。もう一つの態様では、検出される抗原が全
構成外層膜タンパク質の６０％を占めるクラミジア菌体
の主要外層膜タンパク質であってもよい。さらにもう一
つの態様では、本発明を使用して１種以上の淋菌抗原（
ＩＡもしくはＩＢタンパク質）、あるいは１種以上の淋
菌株に由来する抗原混合物を検出することができる。

【００１５】好ましい抽出組成物は、アルコールアミン
またはその塩を含み、高ｐＨを有するものである。この
好ましい組成物のより詳細は、例との関連で下記に示す
。 さらに、抽出工程でプロテアーゼを使用して全血および
粘液を分解することが好ましい場合もある。これは、後
述の例２で具体的に説明する。菌体から抗原がひとたび
抽出されてしまえば、必須ではないが、次の処理をする
前に被検体を予備濾過して細胞残屑、粒状物および他の
不要物を除去することが望ましい。予備濾過は、ある型
式のフィルターを備えた適当な容器中で実施することが
できる。

【００１６】抽出された抗原は、平均細孔サイズ１〜１
０μｍ、好ましくは５μｍを有するポリマー微孔質膜と
接触される。この膜は、アッセイ中にその保全性を維持
できるいずれか適当な材料、限定されるものでないが焼
結ガラス、多孔質セルロース材料、多孔質ポリマーフィ
ルムおよびフィルター材料、繊維織物および当該技術分
野で既知の他の材料から作製することができる。好まし
くは、この膜は、ポリマー主鎖に反復アミド基を有する
長鎖合成ポリマーであるポリアミドから調製される。こ
れらは、一般にジアミンとジカルボン酸のコポリマーま
たはアミノ酸のラクタムのホモポリマーである。限定さ
れるものでないが、代表的な材料としては、ポリヘキサ
メチレンドデカンジアミド（ナイロン６１２）、ポリヘ
キサメチレンアジパミド（ナイロン６６）、ポリ−ε−
カプロラクタム（ナイロン６）、ポリヘキサメチレンセ
バカミド（ナイロン６１０）、およびポリ−７−アミノ
ヘプタノアミド（ナイロン７）ならびにそれらの混合物
が挙げられる。これらの膜は、場合によってイオン電荷
を担持する膜を使用できるが、非イオン性が好ましい。 しかしながら、これらの膜はクラミジア抗原または淋菌
抗原と反応性のどのような生物学的化合物も実質的に含
まないことが必須である。

【００１７】有用な膜材料のさらなる詳細およびそれら
の作製の詳細は当該技術分野で既知である。有用な膜は
、特開平２−２１０２６３号および同２−１５６１５７
号公報に記載されている。好ましいポリアミド微孔質膜
としては、Ｂｉｏｄｙｎｅ（商標）ＡまたはＬｏＰｒｏ
ｄｙｎｅ（商標）膜のようなＰａｌｌ　Ｃｏｒｐ　によ
って製造販売されているナイロン６６膜が挙げられる。

【００１８】この発明の実施に際し、場合によって前記
膜は少なくとも２０ｍｇ／ｍ２　の量の１種以上の界面
活性剤を塗布するか、またはそれで処理することができ
る。限定されるものでないが、有用な界面活性剤として
は、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオ
ン界面活性剤が挙げられ、非イオン界面活性剤が好まし
い。本明細書で記載する微孔質膜は、アッセイを行うた
めに他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。別法と
して、好ましくは、アッセイを実施できそしてすべての
流体を収容できる使い捨て試験デバイス中に微孔質膜を
固定する。試験デバイスの有用な形状は当該技術分野で
既知である。

【００１９】抗原と微孔質膜との接触と殆ど同時に抗原
は微孔質膜にバインディングする。抗原は、他のタンパ
ク質、細胞成分、全血もしくは粘液または被検体中に存
在する可能性のある他の残滓あるいはアッセイで使用す
る試薬類に比べ膜に優先的にバインディングされる。接
触の５分以内、好ましくは１〜６以内にバインディング
していない（未バインディング）抗原をバインディング
した抗原から分離し、次いでバインディングした抗原を
この発明の免疫組成物と接触させて支持体上に直接バイ
ンディングした免疫複合体を形成する。この接触前また
は接触と同時に流体およびバインディングしていない物
質を除去してもよい。必要によって分離洗浄液を使用し
てもよい。アッセイを使い捨て試験デバイスを使用して
行う場合には、被検体中の流体および未バインディング
物質（例えば、全血および粘液成分）は、抗原が膜にバ
インディングされる時間中に膜を通過して適当なコンパ
ートメントに集められる。

【００２０】完全抗体分子（抗体分子の全体）は消化に
使用される試薬に応じて各種のフラグメントに破砕する
ことができる。分子全体はＦｃ（または結晶化しやすい
部位）領域とＦａｂ（または抗体の結合性部位）領域と
して知られるものから構成されている。ペプシンもしく
はパパインまたは他の類似の消化性酵素による消化はＦ
ｃ　フラグメントから一価の　Ｆａｂ′フラグメントお
よび二価の（Ｆａｂ′）２フラグメントを開裂する。単
に二価のフラグメントのみが望まれる場合、精製法を利
用して、例えばクロマトグラフィーによって完全な分子
からそれを分離することができる。

【００２１】このアッセイで使用される抗体フラグメン
トは、１種以上のクラミジア菌株または淋菌株（目的の
微生物が何んであるかに応じて）と特異的な免疫反応性
を有する。この発明の組成物は目的の微生物の菌株１種
以上の抗原１種以上にそれぞれ向けられる複数のＦ（ａ
ｂ′）２フラグメントを含むことができる。これらのフ
ラグメントはポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体のいずれかから得ることができる。ポリクローナル
抗体は商業的に入手可能であるか、または検出すべき菌
株に共通の抗原を用いる既知法により各種動物で調製で
きる。好ましくは目的のフラグメントを調製するのに使
用される抗体は、市販のものかまたは標準的なハイブリ
ドーマ法を用いて調製される。

【００２２】この発明で有用なＦ（ａｂ′）２フラグメ
ントは、標準的なペプシン消化により抗体分子全体から
Ｆｃ　部分を除去して調製することができる。Ｐａｒｋ
ａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　，　５
３，　１３３（１９８２）　および米国特許第　４，８
１４，４３３号に従う失活パパインによる消化も有用で
ある。 フラグメントが形成されると、Ｆ（ａｂ′）２フラグメ
ントを他のフラグメントから単離する必要がある。クロ
マトグラフィーがこの目的で使用できるが、他の方法も
知られている。好ましくは、完全なクラミジア抗体また
は淋菌抗体はペプシンで処理してＦ（ａｂ′）２フラグ
メントと　Ｆａｂ′フラグメントに分子を開裂する。次
に、得られた混合物は適当な方法、例えばクロマトグラ
フィーおよび透析により精製して純粋のＦ（ａｂ′）２
を得る。

【００２３】これらのフラグメントは既知の方法を用い
て適当な酵素で標識することができる。限定されるもの
でないが、有用な酵素標識としては、ペルオキシダーゼ
、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ
、リゾチーム、マルトデヒドロゲナーゼ、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびβ−アミラーゼが挙
げられる。ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファ
ターゼが好ましく、ペルオキシダーゼが最も好ましい。

【００２４】Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを標識する好
ましい方法では、そのフラグメントをスクシニミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレートと反応させてＦ（ａｂ′）２フラグメン
ト試薬を生成する。酵素、例えばペルオキシダーゼでは
、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物と反応させて
反応性メルカプト部分を含有する酵素試薬を生成する。 次に、この部分に前記Ｆ（ａｂ′）２試薬を反応させて
この発明のアッセイで使用するのに好ましい酵素標識免
疫試薬を生成する。この手順のさらなる詳細は下記例１
に示す。

【００２５】クラミジア抗体または淋菌抗体は、さらに
膜上の非特異的相互作用を低減する非免疫タンパク質１
種以上を含んでなる免疫組成物中のものとしてアッセイ
系に供給することができる。「非免疫タンパク質」とは
、感知できる程度までは目的の抗原と免疫反応によるバ
インディングしないタンパク質を意味する。有用な非免
疫タンパク質は周知であり、それらとしては、例えば、
カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清およびブタガン
マグロブリンが挙げられる。このような組成物の特に有
用な成分としては、前記のタンパク質および両性界面活
性剤が挙げられる。免疫組成物は、当該技術分野で既知
の適当な緩衝剤を使用して一般にｐＨ６〜８に緩衝化さ
れる。

【００２６】バインディングした抗原を免疫組成物と接
触すると膜上でほぼ瞬時にバインディングした免疫複合
体が形成される。この複合体の形成を促進するには、膜
と試薬類を１５〜３０℃の温度で１０分以内インキュベ
ーションすることができる。好ましくは、インキュベー
ションは１８〜２５℃（すなわち、室温）で１〜３分間
行れる。これらの温和なインキュベーションは、米国特
許第　４，４９７，８９９号（前述）の裸の支持体への
クラミジア抗原の吸着が必要なように記載されており、
３７℃において３０分間の条件と著しい相違がある。

【００２７】このインキュベーション後、複合体形成の
開始１０分以内（好ましくは、１〜３分以内）にバイン
ディングした複合体は、一般にｐＨ７〜１２の洗液で１
回以上洗浄される。このような洗液はアッセイのいずれ
かの時点で１回以上使用することができる。好ましくは
、この溶液はバインディングした複合体から未バインデ
ィング物質を分離するのに役立つ界面活性剤１種以上を
含む。 特に有用な界面活性剤はカチオン界面活性剤である。

【００２８】洗浄後、バインディングした標識複合体は
、適当に検出される。一般に、微孔質膜上のバインディ
ングした標識複合体を検出するには、適当な色素生成組
成物をその複合体と接触する。この組成物は、酵素が存
在する場合にその酵素が直接もしくは間接的に検出可能
な色素を生成するように酵素の基質を含む。色素は、酵
素作用によって活性化される単一化合物であるか、ある
いは２種以上の化合物の酵素作用から生成されるかまた
は２種以上の化合物に由来する中間から生成することも
できる。適当な基質は当業者にとって容易に明らかなも
のであろう。

【００２９】特に好ましい態様では、酵素標識がペルオ
キシダーゼであり、アッセイのある時点で過酸化水素と
適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を生成す
る。例えば、有用な色素生成組成物には、トリアリール
イミダゾールロイコ染料またはペルオキシダーゼおよび
過酸化水素の存在下で反応して色素を生成する他の化合
物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用により色素
を提供するように反応する化合物）を含む。

【００３０】色素生成組成物の添加は、バインディング
した複合体の洗浄後比較的迅速に、すなわち一般に２分
以内、好ましくはその直後に行れる。場合によって、試
薬類が許容する場合にはインキュベーションして色素の
検出を早めてもよい。次に、得られた色素は標準的な装
置および操作によって検出して視覚的もしくは分光光度
計の読み取り行う。

【００３１】クラミジア抗原の測定に好ましい方法は次
の工程を含んでなる： Ａ．抽出したクラミジア抗原とその抗原と反応性のどの
ような生物学的化合物も実質的に含まないポリアミド微
孔質膜とを接触してその膜に前記抗原を直接バインディ
ングする工程、 Ｂ．２分以内に、バインディングした抗原から未バイン
ディング物質を分離し、次いでこのバインディングした
抗原とそのクラミジア抗原に免疫学的に向けられた酵素
標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含んでなる免疫組成
物とを接触して前記膜にバインディングした標識免疫複
合体を形成する工程、 Ｃ．洗浄工程、ならびに Ｄ．前記複合体と標識した酵素の基質を含む色素生成組
成物とを接触させる工程、（工程Ｂ〜Ｄの方法は１０分
未満に行われる）。

【００３２】本発明の診断試験キットは、本明細書で開
示する免疫組成物および一種以上の他の成分の組成物、
溶液またはアッセイを実施するための備品を含んでなる
。例えば、それらには一般に、別々の容器に入れられた
標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含んでなる免疫組成
物および適当な色素生成組成物を含む。キットの任意構
成要素としては、洗液、抽出組成物、抽出装置、綿棒も
しくは他の被検体採取手段、使い捨てデバイス（それに
固定された微孔質膜を含む）および当業者に既知の他の
ものが挙げられ、すべて適当な包装または容器に入れら
れる。

【００３３】

【実施例】以下の例は、本発明を具体的に説明するため
のものであって、その範囲を限定する目的で提示するも
のでない。すべてのパーセンテージは別に指示しない限
り重量基準である。

【００３４】例１：免疫組成物の調製 この例は、Ｃ．トラコマチス（Ｃ　．ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉｓ　）のリポ多糖抗原に向けられたＦ（ａｂ′）２
抗体を含む本発明の免疫組成物の調製を説明する。 材　　料 Ｆ（ａｂ′）２抗−クラミジアフラグメントを調製する
のに用いる抗体は、リン酸緩衝溶液としてシータス社（
Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ．）　から入手されるクラミジア
リポ多糖抗原に向けられた１０Ｇ９モノクローナル抗体
（６．９６ｍｇ／ｍＬ，　ｐＨ７．２）であった。

【００３５】ペプシンは、シグマ化学社（Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）から入手した（カタログＮ
ｏ．６８８７、９００　ユニット／タンパク質のｍｇ）
。 フラグメントの調製 抗−クラミジア抗体（６．９６ｍｇ／ｍＬ）　のリン酸
緩衝溶液（１４ｍＬ）を、分子量３０，０００カットオ
フ膜とクエン酸緩衝液（５６ｍＬ、０．１モル濃度、ｐ
Ｈ４．１）を用いてアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮器に
よって透析した。最終容量は、クエン酸緩衝液１ｍＬ当
り１０．８ｍｇを含有する溶液９ｍＬであった。この溶
液をペプシン（クエン酸緩衝液１ｍＬ当り２．５ｍｇ含
有液１．１６９ｍＬ）と混合し、得られた混合物を３７
℃で２時間回転させた。トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（１モル濃度、ｐＨ１０．８）でｐＨ
７に高め、この溶液を分子量３０，０００カットオフ膜
とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（２
０ミリモル濃度、ｐＨ８）を用いるアミコン濃縮器で透
析した。得られた溶液（約３０ｍＬ）は精製するまで４
℃で保存した。

【００３６】この生成物を、最初にトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（２５〜３０ｍＬ、２０ミ
リモル濃度、ｐＨ８）、次いでこの緩衝液（２５ｍＬ）
と塩化ナトリウム（０．７５モル濃度）を用いるＤＥＡ
Ｅ−セファロースカラムで精製した。抗体フラグメント
を含む画分（ＯＤ２８０）　を集め、２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸（２５ミリモル濃度、ｐＨ６．
５）に対して透析してＦ（ａｂ′）２フラグメントおよ
びＦ（ａｂ′）フラグメントの合計２１．８ｇを得た。

【００３７】これらのフラグメントを、　ＡＢｘカラム
および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（３０
ｍＬ、２５ミリモル濃度、ｐＨ５．６）、次いで硫酸ア
ンモニウム（０．５モル濃度）および酢酸ナトリウム（
０．０２モル濃度）からなる溶液（３０ｍＬ）　での溶
離を用いるクロマトグラフィーによって分離した。Ｆ（
ａｂ′）２フラグメントを含む画分を集め、それらを合
わせ、次いでアミコン濃縮器でリン酸緩衝溶液に対して
透析して純粋なＦ（ａｂ′）２フラグメント（１３．８
５ｍｇ）　を得た。 標識フラグメントの調製 工程Ａ：セイヨウワサビペルオキシダーゼ（乾燥重量１
００ｍｇ）を４℃で炭酸ナトリウム緩衝液（１３．４ｍ
Ｌ、０．１モル濃度、ｐＨ９．５）に溶解し、４℃以下
で１時間乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１７．４
ｍｇ／ｍＬの　３００μＬ）中Ｓ−アセチルメルカプト
コハク酸無水物と反応させた。この混合物を、予じめ脱
イオン蒸留水で１０分間湿めらしたＳｐｅｃｔｒｏ　Ｐ
ｏｒ（商標）透析バッグにピペットで移した。次に、こ
のバッグを反応混合物容量の５０倍のリン酸緩衝溶液（
ｐＨ７．４）中に置き、約４時間４℃でゆっくり攪拌し
た。この溶液をアミコン濃縮器で濃縮して目的の中間体
（１８．６ｍｇ／ｍＬ）を得た。

【００３８】リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中で調製さ
れたばかりの中間体（２．６１ｍＬ、１８．６ｍｇ／ｍ
Ｌを含有する溶液）を、室温で２時間リン酸緩衝液（０
．２５モル濃度、ｐＨ７．５）中のヒドロキシルアミン
（０．６５２ｍＬ、０．２５モル濃度）とエチレンジア
ミン四酢酸（０．００１モル濃度）を含有する溶液と反
応させることによって保護基を脱離した。得られた酵素
試薬を、　ＰＤ−１０カラムおよび溶離液としてリン酸
緩衝溶液（ｐＨ７．４）を用いるクロマトグラフィーに
よって精製した。

【００３９】工程Ｂ：前記の精製したＦ（ａｂ′）２フ
ラグメント（リン酸緩衝溶液１ｍＬ当り２．５ｍｇの溶
液　１３．８５ｍｇ）　を、スクシニミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍＬ当り１６
．７ｍｇの　１３０．２μＬ）と混合し、次いで４℃で
２時間振盪した。得られた生成物を、ＰＤ−１０カラム
およびリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を溶離液として用
いるクロマトグラフィーによって精製した。

【００４０】工程Ｃ：前記工程Ａで調製した酵素試薬（
リン酸緩衝溶液１ｍＬ当り１８．６ｍｇの溶液２．６ｍ
Ｌ）と、工程Ｂで調製した生成物（リン酸緩衝溶液１ｍ
Ｌ当り１．３２ｍｇの溶液１０．５ｍＬ）　とを混合し
、濃度をＦ（ａｂ′）２フラグメントの約１ｍｇ／ｍＬ
に調整し、次いでこの混合物を２５℃で約１５時間回転
させた。得られた酵素−標識フラグメントの結合体を、
分子量１０，０００カットオフ膜を備えるアミコン濃縮
器を用い２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝
液（４０μＬ、２５ミリモル濃度、ｐＨ５．６）に対し
て透析した。次に、得られた生成物（５ｍＬ）を　ＡＢ
ｘカラムを用い、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホ
ン酸、次いで硫酸アンモニウム（０．５モル濃度）およ
び酢酸ナトリウム（２０ミリモル濃度）（ｐＨ６．７）
のグラジエント溶液（３０ｍＬ）で溶離して精製した。 約０．６の吸光度比（４０３／２８０）を示す画分を集
めて目的のペルオキシダーゼ標識フラグメント４．８５
ｍｇを得た。

【００４１】この標識フラグメントを、マーシオレート
（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）　防腐剤（０．０１％）を
含むリン酸緩衝溶液中４℃で保存した（０．２％溶液、
ｐＨ７．４）。標識フラグメントの分子量範囲は約　１
３５〜約２５０　キロダルトンであった。 例２：クラミジア・トラコマチスのアッセイこの例は、
本発明の実施を具体的に説明し、それを完全な抗体を酵
素標識したものを用いるアッセイと比較する。さらに、
本発明を２種の抗体、すなわち未標識抗クラミジア抗体
および酵素標識抗−抗体を使用するアッセイと比較する
。 使用する材料 以下の材料および組成物をアッセイで使用した。

【００４２】この発明の実施に際して使用した微孔質膜
は、未荷電で未塗布のナイロン６６膜、ＬｏＰｒｏｄｙ
ｎｅ（商標）微孔質膜（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ．）である
。この膜を使い捨て試験デバイスの３つの試験ウェルの
各々に取り付けた。試験用被検体は、頸管内綿棒を用い
て女性患者から得た。各被検体は、対照膜または本発明
の界面活性剤塗布膜をそれぞれ担持する別々の試験デバ
イスで試験した。

【００４３】抽出管を使用して被検体からクラミジア抗
原を抽出し、この管はその内部の離れ離れになった場所
に（１）チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）防腐剤
（０．０１％）を有するトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（１．６５モル濃度溶液２０μＬ、ｐ
Ｈ１１）ならびに（２）アジ化ナトリウム（１．５４ミ
リモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（５．４ミリモ
ル濃度）、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサン
ジオン（２１．４ミリモル濃度）、ジチオスレイトール
（０．１８８モル濃度）およびポリ（アクリルアミド）
（６．３５％）を有する２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸（１０ミリモル濃度溶液５０μＬ、ｐＨ６）
の乾燥塗布物を有する。

【００４４】組成物１は、１０ミリモル濃度２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（ｐＨ６）、塩化
ナトリウム（５０ミリモル濃度）、塩化カルシウム（５
ミリモル濃度）、１，２−プロパンジオール（１０％ｗ
／ｖ）およびチメロサール（０．０１％）中にＡｍｉｄ
ｅｃｋ（商標）プロテアーゼ（４ｍｇ／ｍＬ、　１７０
ユニット／ｍｇ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ，　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．から入
手可能）を含めた。

【００４５】抽出組成物は、エタノールアミン塩酸（０
．４７モル濃度）、塩化ナトリウム（０．２７モル濃度
）、チメロサール（３０ミリモル濃度）、エチレンジア
ミン四酢酸（５０ミリモル濃度）、Ｅｍｃｏｌ（商標）
ＣＣ−３６カチオン界面活性剤（ｗｉｔｃｏ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ製０．４５％）および水酸化ナトリウム（０．
６６規定、ｐＨ１３．５になるまで）を含めた。組成物
２は、過酸化水素（水中１２％）、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（１０μモル濃度）およびチメロサール（０．
０１％）を含めた。

【００４６】洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩衝液（０．０５
モル濃度、ｐＨ１０）、Ｅｍｃｏｌ（商標）　ＣＣ−９
カチオン界面活性剤（０．７５％）およびチメロサール
（０．０１％）を含めた。組成物３は、リン酸緩衝溶液
（ｐＨ７．２）中に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ
に結合したクレアチンキナーゼ−ＭＢ　Ｆ（ａｂ　′）
２抗体フラグメント（５μｇ／ｍＬ）、カゼイン（０．
０１％）、Ｌｏｎｚａｉｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤
（０．０１％）およびチメロサール（０．０１％）を含
めた。この組成物を各試験デバイスの試験ウェル中で負
対照として使用した。標識フラグメントは、抗−クラミ
ジアフラグメントに対する上記例１に記載したのと同様
な方法で調製した。しかしながら、最終クロマトグラフ
ィーは標準的な　ＡＢｘカラムよりむしろ標準的なＤＥ
ＡＥカラムを用いて行った。溶離緩衝液は、（１）トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（２０ミリモル濃
度、ｐＨ８）および（２）塩化ナトリウム（０．７５モ
ル濃度）含有のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（２０ミリモル濃度、ｐＨ８）を使用した。

【００４７】上記例１で調製した標識フラグメント（溶
液１ｍＬ当り４μｇ、最終濃度）を、リン酸緩衝溶液（
ｐＨ７．２）中カゼイン（０．０５％）、Ｌｏｎｚａｉ
ｎｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．０１％）およびチ
メロサール（０．０１％）を有する溶液に混合した。色
素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ
フェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イ
ミダゾールロイコ染料（０．００８％）、ポリ（ビニル
ピロリドン）（１％）、リン酸ナトリウム（１０ミリモ
ル濃度、ｐＨ６．８）、ジエチレントリアミン五酢酸（
１０マイクロモル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニ
リド（２ミリモル濃度）および過酸化水素（１０ミリモ
ル濃度）を含めた。 アッセイ 各被検体のアッセイでは、組成物１（７滴）を抽出デバ
イスに加え、各被検体を含む患者の綿棒をそのデバイス
内に置いて１０秒間回転し、次いで室温にて１分間イン
キュベーションした。次に、この抽出組成物を、１０秒
間再び回転させた前記綿棒入りデバイスに加え、そして
室温で１分間インキュベーションを再び行った。次に、
組成物２を加え、綿棒を再び１０秒間回転させ、次いで
室温で２分間３度目のインキュベーションを行った。そ
の管を絞ることにより綿棒を絞り、次いで取り除いた。 この抽出工程には約４〜５分要した。

【００４８】抽出されたリポ多糖抗原を含む得られた溶
液をピペットを使用してデバイスから採取し、予備濾過
し、次いで使い捨て試験デバイスの各ウェルに移した（
ウェル当り４滴）。ウェル中の微孔質膜を通して流体を
排出した。次に、各ウェルを洗液（ウェル当り４滴）で
洗浄した。次に、組成物３（２滴）を各試験デバイスの
ウェルの１つに加えた（負対照ウェルとみなす）。この
発明の免疫組成物（２滴）を各デバイスの残りの２つの
ウェルの各々に加えた。これらの２つのウェルの１つ（
正対照ウェルとみなす）は、膜上に乾燥クラミジアリポ
多糖抗原を含めた。

【００４９】室温で２分間インキュベーション後、洗浄
工程を２度繰り返した。色素生成組成物を加え、室温で
３分インキュベーション後、各試験デバイス中の試験試
料ウェルは、その膜上に高濃度の可視性色素を示し、Ｃ
．トラコマチスの陽性の検出を示した。抽出物が試験デ
バイスに加えられたときからこのアッセイは、約５分未
満かかり、このことは特開平２−２１０２６３号公報に
記載されたアッセイに一般に要する１２分よりも相当短
縮されている。抽出時間を含めたとしても、全アッセイ
には約９分未満要するにすぎず、このことは特開平２−
２１０２６３号のアッセイまたは米国特許第　４，４９
７，８９９号のアッセイのいずれと比較しても遙かに迅
速である。 例３：相対的な安定性試験 この例は、この発明で使用する酵素標識フラグメントの
安定性を、抗体の全体を酵素標識したものの安定性と比
較する。 材　　料：上記例１に記載したように調製したペルオキ
シダーゼ標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントをメディック
ス・ジェネラル・コンジュゲート・ダイリューエント（
Ｍｅｄｉｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｄ
ｉｌｕｅｎｔ）　で希釈（１μｇ／ｍＬ）し、３７℃で
４９日間インキュベーションした。

【００５０】Ｃ．トラコマチスのリポ多糖抗原に向けら
れた抗体の全体をペルオキシダーゼ標識したものは、Ｙ
ｏｓｈｉｔａｋｅ　ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，　１０１　，　３９５（１９７９）　の方法で調製し
、上述のようにメディックス・ジェネラル・コンジュゲ
ート・ダイリューエントで希釈し、３７℃で４７日間イ
ンキュベーションした。クラミジア抗原溶液は、リン酸
緩衝溶液（ｐＨ７．２）中クラミジア血清型Ｇのエレメ
ンタル小体を含み、そしてウシ血清アルブミン（０．１
ｍｇ／ｍＬ）を含めた。

【００５１】妨害バックグランド組成物は、全血（２５
μＬ）、ブタのムチン（２０μＬリン酸緩衝溶液１ｍＬ
当り　１２５ｍｇ）、ＨＬ６０細胞（５μＬ、リン酸緩
衝溶液１ｍＬ当り５×１０７　個細胞、ｐＨ７．２）を
含めた。総容量は５０μＬであった。この組成物を使用
前に予備濾過した。ブランクのバックグランド溶液は、
リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２）中ウシ血清アルブミン（
０．１ｍｇ／ｍＬ）を含めた。

【００５２】試験デバイス、抽出デバイスならびに他の
組成物および溶液は、上記例２に記載したものと同じで
あった。 アッセイ：クラミジア抗原溶液（妨害バックグランド組
成物およびブランクのバックグランド溶液）を用いて２
つの同様なアッセイ操作を行った。一つの操作はペルオ
キシダーゼ標識Ｆ（ａｂ′）２試薬（本発明）を用いて
実施し、もう一つは抗体の全体をペルオキシダーゼ標識
したもの（対照）を用いて実施した。個別のＳｕｒｅＣ
ｅｌｌ（商標）試験デバイス中で各溶液を用いて二重試
験を行った。 本発明の試験：エレメンタリー小体を抽出デバイスに加
え、次いで組成物１の７滴（約　２８０μＬ）　を加え
た後、そのデバイスを１分間室温でインキュベーション
した。 抽出溶液（２８０μＬ）　をそのデバイスに加え、次い
でさらに１分間室温でインキュベーションした。次に、
組成物２（７滴）を加え、そのデバイスを１分間室温で
インキュベーションした。得られた抽出液をピペットで
デバイスから採取し、試料（１６０μＬ、抗原　５００
ｐｇ含有）をＳｕｒｅ　Ｃｅｌｌ（商標）　試験デバイ
ス中の２種の二重試験ウェルそれぞれに加えた。

【００５３】試験デバイスの膜を通して試料を排液した
後、各ウェルを洗液（各　２５０μＬ）で２回洗浄した
。ペルオキシダーゼ標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメント溶
液（１滴）を両試験ウェルに加え、排液し、次いでデバ
イスを２分間室温でインキュベーションした。再度試験
ウェルを２回洗浄（各２５０μＬ）し、排液した。これ
らの試験ウェルに色素生成組成物（２滴）を加え、室温
で３分間インキュベーションした後、膜上の色素を視覚
的に読み取り、値が０から１０まで上昇する段階的色標
（０は目視できる色素がないことを表し、１０は最も高
い色素濃度を表す）を参考に評価した。

【００５４】妨害バックグランド組成物およびブランク
のバックグランド溶液は、試験試料について上述のよう
に抽出し、個別の試験デバイスの二重試験ウェルに加え
（各ウェルに対し　１６０μＬ）、次いで上述のように
アッセイした。結果は、二重試験の平均値として下記表
に示す。 対照試験：抽出した抗原の別の部分（各　１６０μＬ）
、妨害バックグランド組成物およびブランクのバックグ
ランド溶液を、上記のような個別のＳｕｒｅ　Ｃｅｌｌ
（商標）試験デバイスの二重試験ウェルに加え、抗体の
全体をペルオキシダーゼ標識したもの（１滴）を用いて
上述のようにアッセイした。アッセイの結果を二重試験
の平均値として下記表に示す。

【００５５】

【表１】 この表が示す結果は、クラミジアのエレメンタリー小体
を使用するアッセイは同様であるが、対照試験のバック
グランドは本発明の試験のバックグランドより相当高い
ことを明らかにする。このことは、前記標識フラグメン
トが抗体の全体を標識したものより一定時間を通じて遙
かに安定であることを示す。 例４：クラミジア・トラコマチスのアッセイにおける緩
衝化組成物の使用 この例は、不適切なものを除く以外は、米国特許出願第
　５２２，４４１号（１９９０年５月１１日出願）に対
応するわが国への特許出願の例１〜５に準ずる。この例
は、ヘム含有タンパク質を有する好ましい組成物中での
抗体フラグメントの使用を具体的に示す。 材　　料：クラミジア抗原溶液は、ウシ血清アルブミン
（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．
２）中にクラミジア血清型Ｇのエレメンタリー小体を含
めた。ブランク対照溶液は、抗原を含まないリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７．２）中にウシ血清アルブミン（０．１ｍ
ｇ／ｍＬ）を含めた。

【００５６】Ｓｕｒｅ　Ｃｅｌｌ（商標）使い捨てデバ
イスは、各試験ウェル中に未塗布ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（
商標）微孔質膜を含有せしめて使用した。抽出管は、そ
れらの内部のところどころに（１）チメロサール防腐剤
（０．０１％）を有するトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（１．６５モル濃度溶液２０μＬ、ｐ
Ｈ１１）、ならびに（２）２−（Ｎ−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸（１０ミリモル濃度、５０μＬ溶液、ｐＨ
６）、アジ化ナトリウム（１．５４ミリモル濃度）、エ
チレンジアミン四酢酸（５．４ミリモル濃度）、５，５
−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（２１．４
ミリモル濃度）　、ジチオスレイトール（１８８ミリモ
ル濃度）　およびポリ（アクリルアミド）（６．３５％
）からなる乾燥塗布物を有し、前記エレメンタリー小体
からクラミジア抗原を抽出するのに使用した。

【００５７】組成物１は、１０ミリモル濃度の２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ６）、塩
化ナトリウム（５０ミリモル濃度）、塩化カルシウム（
５ミリモル濃度）、１，２−プロパンジオール（１０％
ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．０１％）中にＡｍｉ
ｄｅｃｋ（商標）プロテアーゼ（４ｍｇ／ｍＬ、　１７
０ユニット／ｍｇ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ，　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．　から
入手可能）を含めた。

【００５８】抽出組成物は、エタノールアミン塩酸（０
．４７モル濃度）、塩化ナトリウム（０．２７モル濃度
）、チメロサール（３０ミリモル濃度）、エチレンジア
ミン四酢酸（５０ミリモル濃度）、Ｅｍｃｏｌ（商標）
ＣＣ−３６カチオン界面活性剤（０．４５％）および水
酸化ナトリウム（０．６６規定、ｐＨ１３．５になるま
で）を含めた。組成物２は、過酸化水素（水中１２％）
、ジエチレントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度
）およびチメロサール（０．０１％）を含めた。

【００５９】洗液は、３−シクロヘキシルアミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸緩衝液（０．０５
モル濃度、ｐＨ１０）、Ｅｍｃｏｌ（商標）ＣＣ−９カ
チオン界面活性剤（０．７５％）およびチメロサール（
０．０１％）を含めた。色素生成組成物は、３−（４−
ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（
４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（０．
００８％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、リン
酸ナトリウム（１０ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、ジエ
チレントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４
′−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および
過酸化水素（１０ミリモル濃度）を含めた。

【００６０】５種の緩衝化組成物（本明細書では組成物
Ｉ〜Ｖと称する）は、上述のように調製した標識フラグ
メント（最終濃度４μｇ／ｍＬ溶液）を、ヘム含有タン
パク質（以下に記載するように０．１１〜１．２５ｍｇ
／ｍＬ）　、カゼイン（０．０５％）、Ｌｏｎｚａｉｎ
ｅ（商標）Ｃ両性界面活性剤（０．０１％）およびチメ
ロサール（０．０１％）とリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．２
）中で混合することによって調製した。これらの組成物
のどれにもフェノール系電子移動剤である４′−ヒドロ
キシアセトアニリドを含めなかった。

【００６１】組成物Ｉ，　ＩＩ，　ＩＩＩ，　ＩＶ　お
よびＶは次の量のヘム含有タンパク質を含めた： 組成物Ｉ　　：ミオグロビン　０．１２５ｍｇ／ｍＬ。 組成物ＩＩ　　：ミオグロビン　０．２５　ｍｇ／ｍＬ
。 組成物ＩＩＩ　：ミオグロビン　１．２５　ｍｇ／ｍＬ
。 組成物ＩＶ　　：シトクロームＣ　０．１１ｍｇ　／ｍ
Ｌ。

【００６２】 組成物Ｖ　　：シトクロームＣ　０．２３ｍｇ　／ｍＬ
。 アッセイ操作：組成物Ｉ〜Ｖの各々に次のアッセイ操作
を施した。組成物１（８滴）、次いでエレメンタリー小
体を抽出管に加え、５〜１０秒間混合した。次に、この
管および内容物を室温（１８〜２５℃）で１分間インキ
ュベーションした。抽出組成物（８滴）を管の内容物と
５〜１０秒混合し、次いで室温で１分間インキュベーシ
ョンした。次に、組成物２（８滴）を加え５〜１０秒混
合し、次いで管の内容物と室温で２分間インキュベーシ
ョンした。

【００６３】得られた抽出リポ多糖抗原を含む溶液をそ
の管からピペットを用いて採取し、予備濾過し、次いで
Ｓｕｒｅ　Ｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイスの各
ウェルに移した（１６０μＬ、ウェル当り抗原　５００
ｐｇを含有）　。流体をウェルの微孔質膜を通して排液
した。次に、各ウェルを洗液（各　２５０μＬ）で２回
洗浄し、次いで排液した。次に、各組成物Ｉ〜Ｖ（各１
滴）を試験ウェル（抗原を加えたデバイスの）に加え、
次いで２分間室温でインキュベーションして各ウェルの
膜上に免疫複合体を形成した。

【００６４】色素生成組成物（２滴）を加え、室温で３
分インキュベーション後、膜上に形成された色素を０〜
１０の値（０は色素濃度がないことを示し、１０は最高
の色素濃度を示す）を有する段階的色標に対して評価し
た。 組成物Ｉ〜Ｖを用いる試験のそれぞれは、試験ウェル中
に抗原の存在に由来する許容できる濃度シグナルを示し
た。

【００６５】

【発明の効果】この発明の方法はクラミジア菌体または
淋菌菌体の検出に際して非常に迅速であり、１５分未満
要するにすぎず、抗原の抽出が起った後は特に迅速、す
なわち１０分未満要するにすぎない。また、このアッセ
イは複数のクラミジア菌株または淋菌菌株の存在下で正
確な結果を与える信頼性があり、かつ使用も簡単である
。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．　　ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓ　）のリポ多糖抗原の検出に特に有用である。 しかしながら、ナイゼリア・ゴノローエ（Ｎ．　　ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）由来のタンパク質ＩＡおよびＩ
Ｂの迅速検出にも有用である。

【００６６】さらに、この発明は標識された免疫試薬が
安定であるので改良された保存寿命を有する。これは、
イムノアッセイにおいて抗体の全体を標識したものに代
え標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを用いることによっ
て達成される。これらのフラグメントは、クラミジア菌
体もしくは淋菌菌体またはそれらの抗原成分に向けられ
ている。このフラグメントは酵素標識に結合されるので
、本アッセイでは単一の免疫試薬が必要であるにすぎな
い。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ａ．被検体由来のクラミジア抗原また
   は淋菌抗原とその抗原と反応性のどのような生物学的化
   合物も実質的に含まない微孔質膜とを接触してその膜に
   前記抗原を直接バインディングさせる工程、Ｂ．５分以
   内に、そのバインディングした抗原と、それぞれクラミ
   ジア抗原または淋菌抗原へ免疫学的に向けた酵素標識Ｆ
   （ａｂ′）２フラグメントを含んでなる免疫組成物とを
   接触して前記膜にバインディングした標識免疫複合体を
   形成する工程、ならびに Ｃ．工程Ｂの接触１０分以内に、前記膜上にバインディ
   ングした標識複合体の存在またはその量を測定する工程
   、を含んでなるクラミジア抗原または淋菌抗原の測定方
   法。
2. 【請求項２】　　Ａ．抽出したクラミジア抗原とその抗
   原と反応性のどのような生物学的化合物も実質的に含ま
   ないポリアミド微孔質膜とを接触してその膜に前記抗原
   を直接バインディングさせる工程、 Ｂ．２分以内に、バインディングした抗原から未バイン
   ディング物質を分離し、次いでそのバインディングした
   抗原と、前記クラミジア抗原へ免疫学的に向けた酵素標
   識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを含んでなる免疫組成物
   とを接触して前記膜上にバインディングした標識免疫複
   合体を形成する工程、 Ｃ．洗浄工程、ならびに Ｄ．前記複合体と前記酵素標識の基質を含んでなる色素
   生成組成物とを接触させる工程、を含んでなるクラミジ
   ア抗原の測定方法であって、工程Ｂから工程Ｄまでを１
   ０分未満で実施する方法。
3. 【請求項３】　　クラミジア菌体もしくは淋菌菌体また
   はそれらの抗原成分のいずれかに向けた酵素標識Ｆ（ａ
   ｂ′）２フラグメントを含んでなる緩衝化免疫組成物。
4. 【請求項４】　　クラミジア菌体もしくは淋菌菌体また
   はそれらの抗原成分のいずれかに向けた酵素標識Ｆ（ａ
   ｂ′）２フラグメントを含んでなる緩衝化免疫組成物を
   含むクラミジア菌体または淋菌菌体の測定に有用な診断
   試験キット。
5. 【請求項５】　　クラミジア抗原もしくは淋菌抗原と、
   それらのいずれかに向けた酵素標識Ｆ（ａｂ′）２フラ
   グメントを含んでなる緩衝化組成物とを接触した後、未
   複合体化酵素標識フラグメントまたは前記抗原によって
   形成した前記酵素標識フラグメントの酵素標識複合体の
   いずれかを測定することを含んでなるクラミジア抗原も
   しくは淋菌抗原の測定方法。