JPH04233456A - 分析物濃度の測定方法及び装置 - Google Patents

分析物濃度の測定方法及び装置

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JPH04233456A
JPH04233456A JP3200773A JP20077391A JPH04233456A JP H04233456 A JPH04233456 A JP H04233456A JP 3200773 A JP3200773 A JP 3200773A JP 20077391 A JP20077391 A JP 20077391A JP H04233456 A JPH04233456 A JP H04233456A
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fluorescence
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Henry K Hui
ヘンリー　ケイ．ヒュイ
Samuel D Riccitelli
サミュエル　ディー．　リッシテリ
Terry J Lumsden
テリー　ジェイ．ラムスデン
Iii George A Divers
ジョージ　エイ．　ダイバーズ，ザ　サード
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Puritan Bennett Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明は、一般的に言えば、流体混合物
中の分析物の濃度の測定に関し、もっと具体的に言えば
ハロタンを含有していることもある流体試料中の酸素の
濃度の測定に関する。
【０００２】
【関連技術の説明】生命維持装置がより複雑化してくる
につれて、危篤の患者の身体機能のパラメーターをリア
ルタイムに監視することが重要になってきた。監視すべ
き重要なパラメーターの中には、血液の化学に関するも
の、詳しく言えば患者の血液の酸素、二酸化炭素及びｐ
Ｈ状態がある。これらのパラメーターを監視するために
様々な技術が提案されており、一つの特に有望な技術は
、測定すべき分析物を検出しそしてこの分析物の濃度に
比例して信号を離れた場所へ伝送する脈管内センサーの
利用である。これらの機能を果すために用いることがで
きるであろう多数の概念があるとは言うものの、そのよ
うな装置は、一定の螢光染料の出力がその染料がさらさ
れる溶液中に存在している分析物の濃度に比例して抑制
される現象を有利に利用することができる。そのような
概念は、広範囲にわたって研究されており、そして、血
管内へ挿入されてその末端部に一定量の螢光染料を含有
している光ファイバーに関係して開発されていて、螢光
染料には光ファイバーの近い方の端部より光源からの第
一の波長の光が照射される。染料からの発光は、励起の
ために用いられた周波数とは異なる周波数であるのが普
通であり、そして染料の出力は光ファイバーの末端部か
ら手元の端部の近くの検出手段まで光ファイバーを通し
て伝えられる。このような装置は、文献や多数の米国特
許明細書に記載されている。この現象を利用する一つの
特に有利な構造は、Ｂｕｃｋｌｅｓの米国特許第４３２
１０５７号明細書に記載されたものであって、これでは
、センサーエレメントが光ファイバーの一部に沿って配
置されていて、このように配置されたセンサーエレメン
トの長手方向に沿って累積的に信号の抑制が起こる。こ
のようなセンサーを使用する前と使用している間の較正
は、容易に処理されない問題であり、そして、センサー
材料の有効性を低下させ、あるいは測定すべき分析物に
対する直線性と感度に影響を及ぼす試薬が存在している
場合には、特に困難である。センサーを使用している間
にそれを較正するのを助けるために種々の技術が提案さ
れているが、一つの特にうるさい問題は、麻酔薬が投与
された患者において遭遇するであろうような、ハロタン
の存在下でそのようなセンサーの感度が低下することで
あった。ハロタンは、外科手術の間に麻酔薬としてしば
しば使われる普通の吸入麻酔薬であって、酸素感受性の
指示薬染料の螢光効果をやはり抑制するので、これは、
脈管内酸素センサー系の設計者にとって容易ならない問
題点を提起している。従って、血液の酸素量を脈管内で
検出するために用いられる螢光指示薬に及ぼすハロタン
の影響を実質的に減らし又はなくすための手段又は方法
を見いだすことができれば好都合であろう。
【０００３】
【発明の概要】ハロタン又は他の麻酔薬の存在下での血
液の酸素量の検出は、真剣な技術的努力を呼び起こす。 ハロタンは外科手術の過程でしばしば使用される麻酔ガ
スであり、また手術中及び手術後の血液酸素量の監視は
きわどい患者の管理期間中に身体を監視及び維持するた
めに使用される近代的な生命維持装置の有効性を保証す
るのに決定的に重要であるので、本発明は、ハロタンに
さらされた患者にあって脈管内で使用するためのより安
定且つ正確な酸素センサーを結果として与える改良され
た方法及び装置を提供する。
【０００４】本発明に従う装置は、酸素感度を異にする
少なくとも２種の染料をポリマーマトリックスに配置す
ることを包含する。これらの２種の染料は、類似の又は
異なる励起周波数を有することができるが、発光周波数
をはっきりと異にする。両方の染料とも酸素感受性であ
るが、それらの感度は異なり、そしてこれらの二つの染
料は、それらの構造上の類似点ゆえに化学的に相容性と
なるように選ばれ、従って同じ技術を使ってポリマーマ
トリックス中に固定される。これらの染料は個々に酸素
感受性であってハロタンの存在にもやはり感受性である
とは言え、二つの染料からの発光の比率を、血液中に存
在しているハロタンに対する感度を最小限にしながら酸
素濃度の指標として使用することができることが分った
。
【０００５】簡単に且つ一般的に述べれば、ハロタンの
存在下で酸素を測定するための本発明は、特定波長の光
を照射されると既知の波長の螢光を発する第一の指示薬
染料を含有し、且つこの第一の染料に照射するために使
用される波長と類似の又は異なる特定波長の光を照射さ
れると異なる発光波長の螢光を発する第二の指示薬染料
を含有するマトリックスを有するセンサーを包含する。 第一及び第二の指示薬染料の螢光は、酸素の存在によっ
て程度を異にして抑制されるが、これらの指示薬染料の
螢光はハロタンにより同様の程度まで抑制される。マト
リックス中の指示薬染料に適切な波長の光を照射するた
めの手段が用意され、結果として生じる指示薬染料の異
なる螢光波長の螢光の強度を測定するための手段が用意
される。指示薬染料の異なる波長の螢光の強度の比を求
め、それにより測定された試料中の酸素の濃度を指示す
るための手段も用意される。
【０００６】指示薬を活性化することができる、少なく
とも１種の他の成分を含有している混合物中の分析物の
濃度を測定する方法は、分析物に対する感度が相違して
いて、且つ、混合物中に含有された測定しようとするも
のではない成分に対する感度が類似していることが分っ
ている複数の指示薬を選ぶことを包含する。この方法は
更に、指示薬を活性化させ、これらの指示薬の出力を測
定し、これらの指示薬の出力の比率を求めて指示薬の出
力の相対値を表す信号を作り出し、そして分析物の濃度
とこれらの指示薬を既知濃度の分析物を含有している混
合物に同時にさらした時のこれらの指示薬の出力の相対
値との予め測定された関係に基づいて当該分析物の濃度
を測定することを包含する。
【０００７】本発明の他の側面及び利点は、本発明の特
徴を例として説明する以下の詳しい説明と添付の図面か
ら明らかになろう。
【０００８】
【好ましい態様の詳しい説明】本発明は、所定波長の光
にさらされると、酸素により異なる程度まで抑制され、
且つハロタンにより同じ程度に抑制される螢光を示す複
数の指示薬染料を含有している単一層のマトリックスを
利用する装置及び方法でもって体現される。指示薬染料
の異なる酸素抑制感度により影響を受ける少なくとも二
つの異なる特定波長範囲にわたり螢光の強度を測定する
ことにより、そしてこれらの指示薬染料の螢光の強度の
比を求めることによって、酸素が存在するために消滅す
る螢光の標準化された測定値を、染料の指示薬を分離す
る必要なしに、且つ複雑な計算の必要なしに、測定する
ことができる。本発明は指示薬の種々の組み合わせを受
け入れることができるとは言うものの、ハロタンの存在
下での血液中の酸素の効果的且つ正確な測定を、二つの
そのような螢光染料を使って行うことができる。
【０００９】次に添付の図面、詳しく言うと図１を参照
すれば、光源２は、光ファイバー１０のコネクター８へ
レンズ系６により焦点が合わされる出力光ビーム４を供
給し、光ファイバー１０がこの光ビームを当該光ファイ
バーの末端部のセンサーモジュール１２へ伝送する。こ
の光源は好ましくは、センサーモジュールへ供給される
光の波長範囲を制御するための励起フィルターを含む。 センサーモジュール１２は、測定すべき濃度の酸素を含
有する例えば血液の如き流体１４中に配置するのに適合
している。手術を受ける患者を麻酔する間に使用される
吸入ガスにはハロタンが含まれていることがあるので、
上記の流体も一定濃度のハロタンを含有していて差支え
ない。センサーモジュール１２は、第一の染料物質１５
と第二の染料物質１７（図３）とを、典型的にはシリコ
ーンであり、より具体的に言えばポリジメチルシロキサ
ンでよいポリマーマトリックス１６に取入れる。図２に
例示されるように、染料の指示薬を固定するマトリック
ス材料１６は一般に、光ファイバー材料１８を取囲む。 マトリックス材料中の指示薬染料からの螢光を発した光
をレンズ系２２へ伝送するための出力光ファイバー２０
も、センサーモジュールに接続され、そしてレンズ系２
２は、おのおのが測定すべき光の種々の出力波長に対し
て感度のある二つ以上の検出器２６を有する検出器アレ
ー２４へ指示薬染料からの螢光を発した光の焦点を合わ
せる。実際には、これらの検出器は同じものでよく、ま
た各特定指示薬染料からの螢光の強度を励起光に応じて
測定するためにフィルターを具備することができる。ま
た、励起光路及び出力光路のために別々の光ファイバー
が例示されてはいるけれども、当業者は、実際には両方
の光路のために単一の光ファイバーを使って装置を簡略
化してもよいということを認めよう。検出器の電気出力
は、ケーブル２８を介して計算機３０へ供給され、この
計算機は検出器の電気出力を受取り、そして流体試料中
に存在している酸素分析物の割合を個々の検出器により
検出された螢光強度信号の比率に基づいて決定する。
【００１０】下記において検討するように、酸素濃度の
計算は、試料にさらされた２種又は３種以上の染料につ
いて試料中に酸素が存在しているために螢光が抑制され
る程度間の関係に基づいている。実際には、計算機によ
り実行される計算は、代表的濃度の分析物と異物質とに
さらされた場合における指示薬の出力の実験測定値に基
づくか、あるいはそのような関係から認められ又は計算
される現象の数学的又は算術的表現に基づいて行うこと
ができる。どちらの場合にも、計算は、血液化学監視装
置で使用される種類の機器に適応可能な比較的小さな計
算機の、十分に能力内である。計算機の出力側には、試
料中の酸素濃度を直接指示するため、計器３２の形をし
た又は他の手段を用意することができる。
【００１１】図２と３について述べれば、光伝導材料１
８は、光源からの光を当該光伝導材料の周りのマトリッ
クス１６に固定された指示薬の染料物質１５及び１７へ
透過させる。センサープローブで使用するための適当な
装置は、光伝導材料を取囲むシリコーンマトリックス、
例えば架橋したポリジメチルシロキサンマトリックスへ
化学的に取入れられた、例えばコロネンやデカシクレン
といったような染料指示薬を用いることを包含する。酸
素の透過可能な膜３４は、マトリックスを覆って、酸素
と染料指示薬とを混じり合わせて流体試料からの酸素に
より染料指示薬の螢光反応を抑制するのを可能にしなが
ら、望まれない大きな分子を排除する。
【００１２】シリコーンマトリックスにおいて、コロネ
ンは第一の染料指示薬として好ましく用いられ、またデ
カシクレンは第二の染料指示薬として好ましく用いられ
る。これらの二つの染料は、それらの構造上の同一性の
ために化学的に相容性であって、そのため両方とも同じ
技術で同じポリマーマトリックスに固定することができ
る。これらの染料は、それらの酸素に対する感度が異な
り、且つハロタンに対する感度が同程度であるため典型
的な指示薬染料として選択された。同様の特性を有する
他の染料も使用して差支えなく、それらは類似の又は異
なる励起周波数を有することができるが、好ましくは明
らかに別個の発光周波数を有するべきである。コロネン
及びデカシクレンの染料指示薬は、両者とも３６６±２
０ｎｍで好ましく励起され、そしてこれらの二つの染料
指示薬からの螢光放射は、コロネン及びデカシクレンの
螢光波長にそれぞれ相当するおおよそ４３０±２０ｎｍ
及びおおよそ５２０±２５ｎｍに集中する。あるいはま
た、コロネンをおおよそ３６６±２５ｎｍで励起させ、
そしてデカシクレンをおおよそ４２０±２０ｎｍの光で
励起させてもよい。この場合、デカシクレンの螢光は４
８０±２０ｎｍで監視することができる。いずれの場合
にも、螢光の強度は検出器によって異なる波長範囲で測
定され、そしてこれらの螢光放射信号が螢光強度の比を
測定するため計算機により利用される。螢光強度は、酸
素の不存在下での各染料指示薬物質の螢光強度（ＦＯ　
）　を測定するために使用することができ、また酸素濃
度の異なる二つ以上の流体試料から採取された螢光強度
測定値からシュテルン−ホルマー定数を求めることがで
きる。較正後、螢光強度比を使って試料中の酸素濃度を
、流体試料中のハロタンの濃度にかかわらず直接指示す
ることができる。 一般には、本発明の装置は酸素濃度を測定するのに正確
であり、且つ最高でおよそ３％までのハロタン濃度まで
はハロタンでの抑制による影響を受けない、ということ
が分っている。
【００１３】図４に例示されるように、異なる酸素分圧
でのコロネン及びデカシクレンの螢光強度信号出力を使
って、酸素分圧の信頼できる指標であることが分ってい
る螢光強度信号の比を求めることができる。この図にお
いて、上方の線４２は種々の酸素レベルでのデカシクレ
ンの螢光強度を表し、下方の線４４は同じ酸素レベルで
のコロネンの信号出力を示している。これらの二つの発
光信号の比が、中央の線４６で指示されている。この中
央の線により表される信号比の利点は、両方の染料指示
薬がハロタンによる螢光反応の抑制に対して同じ程度に
感受性であることから、このパラメーターがハロタンの
存在に対して比較的不感受性であることである。
【００１４】図５〜７に示したグラフは、螢光信号の比
をどのように使用して、ハロタンの存在に対して比較的
不感受性である酸素分圧の信頼できる指標を得ることが
できるかを更に例示する。図５において、線５０ａ，ｂ
，ｃ，ｄ及び５２ａ，ｂ，ｃ，ｄは、空気中の種々のハ
ロタン濃度での時間に関するコロネンの螢光信号を表し
、線５４ａ，ｂ，ｃ，ｄ及び５６ａ，ｂ，ｃ，ｄはデカ
シクレンの螢光信号を表す。線５０ａ〜ｄは、空気中に
それぞれ０．５％，１％，３％及び５％のハロタンとい
うガス試料濃度での、コロネンの較正レベルを示し、ま
た線５２ａ〜ｄはコロネンの螢光強度信号を示す。コロ
ネンの信号測定値が横ばいになる時には、プローブは、
ハロタンガス試料混合物を変える前に標準化されたガス
混合物で再較正された。同様に、線５４ａ〜ｄは、空気
中にそれぞれ０．５％，１％，３％及び５％のハロタン
というガス試料濃度での、デカシクレンの較正レベルを
示し、また線５６ａ〜ｄはデカシクレンの螢光強度信号
を示す。コロネンはハロタンの濃度の変動に対してより
感受性であるけれども、コロネン及びデカシクレンの螢
光強度はハロタンの存在によって同様の程度に影響を受
ける、ということが分る。
【００１５】図６では、図５から取られたコロネンから
の螢光強度信号を図５から取られたデカシクレンからの
信号で除した比の値が、空気中にそれぞれ０．５％，１
％，３％及び５％のハロタンというガス試料濃度の範囲
にわたって線５８ａ〜ｄで比較的安定である、というこ
とが分る。図６の比に対応する酸素の分圧（ｍｍＨｇを
単位とする）を、図７のグラフに示す。空気中に０．５
％，１％，３％及び５％のハロタンというガス試料濃度
に対応する線６０ａ〜ｄは比較的安定であり、酸素の測
定値に相当する分圧は約１５０ｍｍＨｇから約１６５ｍ
ｍＨｇまでの範囲にわたる、といことが分る。
【００１６】ここに記載された発明の実施の際には、様
々な他の構造上の細部や方法工程を使用してもよい、と
いうことを認識すべきである。例えば、装置は照射とセ
ンサーモジュールからのデータの収集のためそれぞれ個
別の光ファイバーの形で例示されてはいるけれども、当
業者は、多重時間系やビームの分割を含めた他の方法を
使用して、この装置を一定の用途のために単純化し又は
変更することができることを認めよう。
【００１７】前述の事柄より、本発明の特別の形態が例
示されそして説明されてはいるけれども、本発明の精神
及び範囲から逸脱することなしに様々な改変を行うこと
ができるということは明白であろう。従って、特許請求
の範囲の記載によるのは除いて、本発明を限定するつも
りはない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の模式図である。
【図２】本発明の装置のセンサー構成部品の拡大断面斜
視図である。
【図３】本発明の装置のセンサー構成部品の構成の模式
断面図である。
【図４】種々の酸素濃度での二つの指示薬染料の信号出
力とこれらの信号出力の比とを表すグラフである。
【図５】空気中の種々のハロタン量でのコロネン及びデ
カシクレンの螢光信号出力を表すグラフである。
【図６】図５の信号出力の比を表すグラフである。
【図７】種々のハロタン量が本発明の装置で測定した酸
素の分圧に及ぼす影響を表すグラフである。
【符号の説明】
２…光源 １０…光ファイバー １２…センサーモジュール １４…流体 １５…第一の染料物質 １６…ポリマーマトリックス １７…第二の染料物質 １８…光ファイバー材料 ２０…出力光ファイバー ２６…検出器 ３０…計算機 ３２…計器 ３４…透過性膜

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　異物をも含有している溶液中の測定す
    べき分析物の濃度を測定する方法であって測定すべき分
    析物に対する感度が相違しており、異物に対する感度が
    類似している複数の指示薬であって、それらをポリマー
    マトリックスへ固定するのを可能にするのに十分な化学
    構造の相容性を有する染料指示薬を選ぶこと、これらの
    指示薬が固定されているマトリックスへ上記溶液をさら
    すこと、上記指示薬を活性化すること、当該指示薬の出
    力を測定すること、これらの指示薬の出力の比に相当す
    る信号を得ること、そして、当該溶液中の上記分析物の
    濃度を上記の出力比と溶液中の分析物濃度との予め求め
    られた関係に基づいて測定すること、を含む測定方法。
  2. 【請求項２】　　前記指示薬がそれらを活性化するため
    に使用される周波数と異なる周波数の信号を発する螢光
    指示薬である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】　　前記分析物が酸素、そして前記異物が
    ハロタンである、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】　　前記指示薬が、これらの指示薬を分散
    させることのできる、分析物が透過可能なマトリックス
    と相容性である、請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】　　前記指示薬がコロネン及びデカシクレ
    ンを含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】　　前記マトリックスが、ポリジメチルシ
    ロキサン、架橋したポリジメチルシロキサン、並びにこ
    れらの架橋した誘導体及び共重合体からなる群より選ば
    れた透過性シリコーン膜材料である、請求項５記載の方
    法。
  7. 【請求項７】　　当該溶液中の上記分析物の濃度を上記
    の出力比と溶液中の分析物濃度との予め求められた関係
    に基づいて測定するという前記の工程が、前記指示薬を
    、関心を持たれた濃度範囲内で種々の濃度の前記分析物
    及び異物を含有している溶液へさらし、そしてそれらか
    らの出力を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】　　少なくとも１種の異物を含有している
    溶液中の分析物の濃度を測定するための装置であって、
    当該分析物の存在により出力が変化する複数の指示薬で
    あって、更に当該異物の少なくとも１種の存在に対して
    類似した感度を有するものを含むセンサー手段、上記指
    示薬を活性化するための手段、これらの指示薬の出力を
    測定するための手段、これらの指示薬の出力の相対値を
    求めるための手段、そしてこれらの指示薬の出力の上記
    相対値から測定すべき分析物の濃度を求める手段、を含
    んでなる測定装置。
  9. 【請求項９】　　前記指示薬が測定すべき分析物の存在
    下ではその出力が抑制される螢光指示薬である、請求項
    ８記載の装置。
  10. 【請求項１０】　　前記指示薬の出力の周波数スペクト
    ルが互いに異なる、請求項９記載の装置。
  11. 【請求項１１】　　前記指示薬のうちの一つがコロネン
    である、請求項１０記載の装置。
  12. 【請求項１２】　　前記指示薬のうちの一つがデカシク
    レンである、請求項１０記載の装置。
  13. 【請求項１３】　　前記分析物が酸素、その前記異物が
    ハロタンである、請求項９記載の装置。
  14. 【請求項１４】　　前記指示薬が分析物を透過可能なマ
    トリックスに含まれている、請求項９記載の装置。
  15. 【請求項１５】　　前記マトリックスが、ポリジメチル
    シロキサン、架橋したポリジメチルシロキサン、並びに
    それらの架橋した誘導体及び共重合体からなる群より選
    ばれた透過性シリコーン膜材料を含んでなる、請求項１
    ４記載の装置。
  16. 【請求項１６】　　測定すべき流体試料中の分析物質の
    濃度を別の物質の存在下において測定するための装置で
    あって、当該試料にさらされるのに適合した透過性マト
    リックスを有し、このマトリックスは第一の励起エネル
    ギーにさらされると第一の発光波長の螢光を示す第一の
    指示薬物質を含有しており、またこのマトリックスは第
    二の励起エネルギーにさらされると上記第一の発光波長
    と異なる第二の発光波長の螢光を示す第二の指示薬物質
    を含有していて、上記分析物質が上記第一の指示薬物質
    及び上記第二の指示薬物質の螢光を程度を異にして抑制
    し、そして上記別の物質が上記第一の指示薬物質及び上
    記第二の指示薬物質の螢光を同じ程度に抑制するセンサ
    ー手段、上記第一の指示薬物質と上記第二の指示薬物質
    とに上記第一及び第二の励起エネルギーを供給するため
    の手段、上記第一及び第二の発光波長の螢光の強度を測
    定するための手段、そして、上記第一及び第二の発光波
    長の螢光の強度の比を求めて当該試料中の上記分析物質
    の濃度の指示を決定するための手段、を含んでなる測定
    装置。
  17. 【請求項１７】　　前記分析物質が酸素、そして前記別
    の物質が麻酔剤である、請求項１６記載の装置。
  18. 【請求項１８】　　前記分析物質が酸素、そして前記別
    の物質がハロタンである、請求項１６記載の装置。
  19. 【請求項１９】　　前記第一の指示薬物質がコロネンで
    ある、請求項１６記載の装置。
  20. 【請求項２０】　　前記第二の指示薬物質がデカシクレ
    ンである、請求項１６記載の装置。
  21. 【請求項２１】　　前記マトリックスが、ポリジメチル
    シロキサン、架橋したポリジメチルシロキサン、並びに
    それらの架橋した誘導体及び共重合体からなる群より選
    ばれた透過性シリコーン膜材料を含んでなる、請求項１
    ６記載の装置。
  22. 【請求項２２】　　測定すべき流体試料中の分析物質の
    濃度を別の物質の存在下において測定するための方法で
    あって、第一の励起エネルギーを、この第一の励起エネ
    ルギーにさらされると第一の発光波長の螢光を示す第一
    の指示薬物質に供給する工程、第二の励起エネルギーを
    、この第二の励起エネルギーにさらされると上記第一の
    発光波長と異なる第二の発光波長の螢光を示す第二の指
    示薬物質に供給し、上記分析物質が上記第一の指示薬物
    質及び上記第二の指示薬物質の螢光を程度を異にして抑
    制し、そして上記別の物質が上記第一の指示薬物質及び
    上記第二の指示薬物質の螢光を同じ程度に抑制する工程
    、上記第一及び第二の波長の螢光の強度を測定する工程
    、そして、上記第一及び第二の発光波長の螢光の強度の
    比を求めて当該流体試料中の上記分析物質の濃度の指示
    を決定する工程、を含む測定方法。
  23. 【請求項２３】　　前記分析物質が酸素、そして前記別
    の物質が麻酔剤である、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】　　前記分析物質が酸素、そして前記別
    の物質がハロタンである、請求項２２記載の方法。
  25. 【請求項２５】　　前記第一の指示薬物質がコロネンで
    ある、請求項２２記載の方法。
  26. 【請求項２６】　　前記第二の指示薬物質がデカシクレ
    ンである、請求項２２記載の方法。
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