JPH04234900A - α−アミラーゼ阻害物質 - Google Patents
α−アミラーゼ阻害物質Info
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- JPH04234900A JPH04234900A JP13325991A JP13325991A JPH04234900A JP H04234900 A JPH04234900 A JP H04234900A JP 13325991 A JP13325991 A JP 13325991A JP 13325991 A JP13325991 A JP 13325991A JP H04234900 A JPH04234900 A JP H04234900A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、小麦種子ないしは小麦粉からの
新規なα−アミラーゼ阻害物質に関する。
新規なα−アミラーゼ阻害物質に関する。
【０００２】α−アミラーゼは各種生物に広く存在する
加水分解酵素でヒトに関して云えば主として唾液腺およ
び膵臓から由来し、その動態は各種疾病特に膵炎、耳下
腺炎、肝疾患、ある種の癌等の病態により健康時と比較
して大きく変動することが知られている。従ってこれら
の病態を正しく診断するためには、総アミラーゼ活性定
量だけでなく、唾液腺および膵臓由来のα−アミラーゼ
アイソザイムの正確な逐次的動向を把握することが望ま
れている。
加水分解酵素でヒトに関して云えば主として唾液腺およ
び膵臓から由来し、その動態は各種疾病特に膵炎、耳下
腺炎、肝疾患、ある種の癌等の病態により健康時と比較
して大きく変動することが知られている。従ってこれら
の病態を正しく診断するためには、総アミラーゼ活性定
量だけでなく、唾液腺および膵臓由来のα−アミラーゼ
アイソザイムの正確な逐次的動向を把握することが望ま
れている。
【０００３】従来臨床検査の場でヒトのα−アミラーゼ
アイソザイムの分別定量には電気泳動法が用いられてい
るが、この方法は非常に煩瑣であり迅速に検体を処理す
る方法としては難点が多く、更に結果の判定には熟練を
要し、容易な方法とは云い難い。この問題点の解決とし
て小麦粉由来のアミラーゼ阻害物質を用いての分析方法
がオドンネル氏らによって研究されてきたが、いまだ満
足するものでなく実用的でなかった〔Ｊ． Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ． ２３， ５６０〜５６６（１９７７）参
照〕。
アイソザイムの分別定量には電気泳動法が用いられてい
るが、この方法は非常に煩瑣であり迅速に検体を処理す
る方法としては難点が多く、更に結果の判定には熟練を
要し、容易な方法とは云い難い。この問題点の解決とし
て小麦粉由来のアミラーゼ阻害物質を用いての分析方法
がオドンネル氏らによって研究されてきたが、いまだ満
足するものでなく実用的でなかった〔Ｊ． Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ． ２３， ５６０〜５６６（１９７７）参
照〕。
【０００４】本発明者らは、上記従来の欠点にかんがみ
て鋭意研究の結果、小麦粉を給源としてヒト体液中のα
−アミラーゼの分別定量に有用なα−アミラーゼ阻害物
質を取得することに成功した。
て鋭意研究の結果、小麦粉を給源としてヒト体液中のα
−アミラーゼの分別定量に有用なα−アミラーゼ阻害物
質を取得することに成功した。
【０００５】本発明によれば、小麦種子または小麦粉中
の水溶性区分よりの抽出液を少くとも含水有機溶媒での
沈殿処理、加熱処理、アニオン交換クロマト処理、ゲル
濾過クロマト処理およびカチオン交換クロマト処理から
なる一連の工程により精製することにより新規且つ有用
なα−アミラーゼ阻害物質が提供されるものである。
の水溶性区分よりの抽出液を少くとも含水有機溶媒での
沈殿処理、加熱処理、アニオン交換クロマト処理、ゲル
濾過クロマト処理およびカチオン交換クロマト処理から
なる一連の工程により精製することにより新規且つ有用
なα−アミラーゼ阻害物質が提供されるものである。
【０００６】本発明によるα−アミラーゼ阻害物質をう
るための原料となる小麦種子または小麦粉は硬質小麦、
内地小麦、軟質小麦、デュラム小麦ないしはそれらより
由来する強力小麦粉、中力小麦粉、薄力小麦粉の種類お
よび等級を問わない。含有量の差異こそあれすべての小
麦の胚乳部分には所望のα−アミラーゼ阻害物質が含ま
れている。
るための原料となる小麦種子または小麦粉は硬質小麦、
内地小麦、軟質小麦、デュラム小麦ないしはそれらより
由来する強力小麦粉、中力小麦粉、薄力小麦粉の種類お
よび等級を問わない。含有量の差異こそあれすべての小
麦の胚乳部分には所望のα−アミラーゼ阻害物質が含ま
れている。
【０００７】本発明によるα−アミラーゼ阻害物質の取
得方法としては次の工程によって行なえる。
得方法としては次の工程によって行なえる。
【０００８】原料としての小麦または小麦粉を原料に対
し３〜１０倍量の水好ましくは精製水で１〜５時間室温
において撹拌してα−アミラーゼ阻害物質の抽出を行な
う。所定の時間撹拌した後、例えば遠心分離、傾瀉、濾
過等の適宜な操作で上澄みを採取する。この上澄みは真
空または常圧下での加熱により処理される。通常約５０
°〜７０℃において１０分ないし１時間の加熱が行なわ
れる。７０℃で３０分の加熱が好ましい。所望によって
はこの加熱処理された液を再び遠心分離、傾瀉または濾
過等の操作に付して上澄みを採取する。
し３〜１０倍量の水好ましくは精製水で１〜５時間室温
において撹拌してα−アミラーゼ阻害物質の抽出を行な
う。所定の時間撹拌した後、例えば遠心分離、傾瀉、濾
過等の適宜な操作で上澄みを採取する。この上澄みは真
空または常圧下での加熱により処理される。通常約５０
°〜７０℃において１０分ないし１時間の加熱が行なわ
れる。７０℃で３０分の加熱が好ましい。所望によって
はこの加熱処理された液を再び遠心分離、傾瀉または濾
過等の操作に付して上澄みを採取する。
【０００９】ここで加熱処理された抽出液（またはその
上澄み）を水性アセトン、エタノールまたはメタノール
のような含水有機溶媒〔濃度４０〜７０％（ｖ／ｖ）〕
で処理して生成する沈殿物を除去し、得られた残留液に
更に上記溶媒を加えて溶媒濃度９０％（ｖ／ｖ）とし且
つその混合物を低温（０〜１０℃）に放置して沈殿を形
成させ、そして得られた沈殿を採取しそしてこれを精製
水に溶解させる。次いで、得られた溶液をｐＨ６．５〜
８．５のトリス塩酸緩衝液（イオン濃度０．００５〜０
．５）で平衡にしたアガロース系弱陰イオン交換体すな
わちファルマシア社の商品であるＤＥＡＥセファロース
のカラムに通して吸着させる。溶出はｐＨ７．０〜７．
８においてＮａＣｌで塩濃度を増大させたトリス塩酸緩
衝液で行う。溶出液をゲル濾過用担体例えばセファデッ
クス（ファルマシア社の商品名）、バイオゲル（バイオ
ラッド社の商品名）またはウルトロゲル（ＬＫＢ社の商
品名）好ましくはセファデックスＧ−７５（ファルマシ
ア社の商品名）を使用してゲル濾過クロマトグラフにか
ける。濾過速度の遅い部分（分子量２０，０００〜３０
，０００）を採取する。その後、得られる生成物をアガ
ロース系弱陽イオン交換体すなわちファルマシア社の商
品であるＣＭ−セファロースによる処理を行い、次いで
溶出物を上記と同じゲル濾過用担体を使用してゲル濾過
クロマトグラフにかけた後凍結乾燥して目的物を得る。
上澄み）を水性アセトン、エタノールまたはメタノール
のような含水有機溶媒〔濃度４０〜７０％（ｖ／ｖ）〕
で処理して生成する沈殿物を除去し、得られた残留液に
更に上記溶媒を加えて溶媒濃度９０％（ｖ／ｖ）とし且
つその混合物を低温（０〜１０℃）に放置して沈殿を形
成させ、そして得られた沈殿を採取しそしてこれを精製
水に溶解させる。次いで、得られた溶液をｐＨ６．５〜
８．５のトリス塩酸緩衝液（イオン濃度０．００５〜０
．５）で平衡にしたアガロース系弱陰イオン交換体すな
わちファルマシア社の商品であるＤＥＡＥセファロース
のカラムに通して吸着させる。溶出はｐＨ７．０〜７．
８においてＮａＣｌで塩濃度を増大させたトリス塩酸緩
衝液で行う。溶出液をゲル濾過用担体例えばセファデッ
クス（ファルマシア社の商品名）、バイオゲル（バイオ
ラッド社の商品名）またはウルトロゲル（ＬＫＢ社の商
品名）好ましくはセファデックスＧ−７５（ファルマシ
ア社の商品名）を使用してゲル濾過クロマトグラフにか
ける。濾過速度の遅い部分（分子量２０，０００〜３０
，０００）を採取する。その後、得られる生成物をアガ
ロース系弱陽イオン交換体すなわちファルマシア社の商
品であるＣＭ−セファロースによる処理を行い、次いで
溶出物を上記と同じゲル濾過用担体を使用してゲル濾過
クロマトグラフにかけた後凍結乾燥して目的物を得る。
【００１０】このようにして得られる本発明のα−アミ
ラーゼ阻害物質の理化学的性状は次のとおりである。
ラーゼ阻害物質の理化学的性状は次のとおりである。
【００１１】１） 水または希薄塩溶液に可溶、メタ
ノール、エタノール、アセトン、クロロホルムおよびヘ
キサンに不溶。 ２） 紫外吸収Ｅ２７９（１％）＝１２．８（水溶液
中１ｃｍ）、λｍａｘ・２７９ｎｍ ３） 分子量 超遠心法により２３，０００〜２３
，８００、ゲル濾過法により２４，０００。 ４） Ｄａｖｉｓ氏等の方法によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２１， ４０
４（１９６４）参照〕における泳動度は０．５３に単一
バンドを示す。 ５） Ｏａｔｈ氏等の方法によるＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ５０， １９０〜７（１９７３）参照〕においては
分子量１３，０００の単一のバンドを与える。 ６） 蛋白質であり、そのアミノ酸組成は次のものを
含有している。（イソロイシンを２．３３とする）リジ
ン ４．５５
ヒスチジン １．１１
アルギニン ７．６６
アスパラギン酸 ６．９７スレ
オニン ３．４２セリ
ン ６．９４
グルタミン酸 １１．４８プロ
リン ７．７１グ
リシン ９．４１
アラニン １２．０８
バリン ７．
９５イソロイシン ２．３
３ロイシン ８．
１８チロシン ４
．１０フェニルアラニン １．６１
７） ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの本物質
の飽和曲線はそれぞれを５０％阻害する本物質の所要量
比が１：２５０以上であることを示す（図１参照）。
ノール、エタノール、アセトン、クロロホルムおよびヘ
キサンに不溶。 ２） 紫外吸収Ｅ２７９（１％）＝１２．８（水溶液
中１ｃｍ）、λｍａｘ・２７９ｎｍ ３） 分子量 超遠心法により２３，０００〜２３
，８００、ゲル濾過法により２４，０００。 ４） Ｄａｖｉｓ氏等の方法によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２１， ４０
４（１９６４）参照〕における泳動度は０．５３に単一
バンドを示す。 ５） Ｏａｔｈ氏等の方法によるＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ５０， １９０〜７（１９７３）参照〕においては
分子量１３，０００の単一のバンドを与える。 ６） 蛋白質であり、そのアミノ酸組成は次のものを
含有している。（イソロイシンを２．３３とする）リジ
ン ４．５５
ヒスチジン １．１１
アルギニン ７．６６
アスパラギン酸 ６．９７スレ
オニン ３．４２セリ
ン ６．９４
グルタミン酸 １１．４８プロ
リン ７．７１グ
リシン ９．４１
アラニン １２．０８
バリン ７．
９５イソロイシン ２．３
３ロイシン ８．
１８チロシン ４
．１０フェニルアラニン １．６１
７） ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの本物質
の飽和曲線はそれぞれを５０％阻害する本物質の所要量
比が１：２５０以上であることを示す（図１参照）。
【００１２】上記のとおり本発明のα−アミラーゼ阻害
物質は分子量ならびに電気泳動において特異な性状を有
する新規な蛋白質である。
物質は分子量ならびに電気泳動において特異な性状を有
する新規な蛋白質である。
【００１３】また、このα−アミラーゼ阻害物質は、岩
永氏等の方法〔蛋白、核酸、酵素１５，１０３７〜５４
（１９７０）参照〕によりＮ−末端を分析するとセリン
の存在が認められる。
永氏等の方法〔蛋白、核酸、酵素１５，１０３７〜５４
（１９７０）参照〕によりＮ−末端を分析するとセリン
の存在が認められる。
【００１４】そして、それを構成するアミノ酸には前記
のものの他に、１／２シスチン、メチオニンおよびトリ
プトファンの存在が確認されている。
のものの他に、１／２シスチン、メチオニンおよびトリ
プトファンの存在が確認されている。
【００１５】本発明のα−アミラーゼ阻害物質はヒトの
唾液腺α−アミラーゼに対して極めて特異的に阻害作用
を示し、一方ヒトの膵臓α−アミラーゼに対する阻害作
用は極めて微弱である。更に本発明による生成物は広域
な酵素濃度範囲で唾液腺型α−アミラーゼおよび膵臓型
α−アミラーゼアイソザイムに対する阻害比が大きな値
をとりうるのでヒトの体液をはじめとした各種臨床検体
のα−アミラーゼアイソザイムの分別定量のための優れ
た手段となりうるものである。
唾液腺α−アミラーゼに対して極めて特異的に阻害作用
を示し、一方ヒトの膵臓α−アミラーゼに対する阻害作
用は極めて微弱である。更に本発明による生成物は広域
な酵素濃度範囲で唾液腺型α−アミラーゼおよび膵臓型
α−アミラーゼアイソザイムに対する阻害比が大きな値
をとりうるのでヒトの体液をはじめとした各種臨床検体
のα−アミラーゼアイソザイムの分別定量のための優れ
た手段となりうるものである。
【００１６】既にオドンネル氏等は、小麦粉中にヒトの
唾液腺型α−アミラーゼを脾臓型のそれよりも強く阻害
するα−アミラーゼ阻害物質を報告し、この物質を利用
した臨床検体中のα−アミラーゼアイソザイムの分別定
量の可能性を示している〔Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ２３， ５６０〜５６６（１９７７）〕。 しかしながらオドンネル氏等の報告したα−アミラーゼ
阻害物質はその電気泳動の易動度において、本物質が０
．５３であるのに対して０．２０であり、著るしく相違
している。また両α−アミラーゼアイソザイムに対する
阻害比が本発明の物質に比してオドンネル氏等のものは
極度に狭く分別定量に好適とは云えない。すなわち、オ
ドンネル氏等のα−アミラーゼ阻害物質の両アミラーゼ
アイソザイムに対する５０％阻害比が高々１００に過ぎ
ないのに対し本物質は２００〜３００の高い阻害比をと
りうる。一例を示せば図１から明らかになるように１５
ＩＵの唾液腺型α−アミラーゼを５０％阻害する本物質
の必要量は約０．３μｇであるのに対して１５ＩＵのヒ
ト膵液α−アミラーゼを５０％阻害するためには本発明
のα−アミラーゼ阻害物質約７０〜８０μｇを必要とし
た。更にヒトの唾液腺型および膵臓型のα−アミラーゼ
の存在量比を変動させた検体に本発明の物質を作用させ
た場合、定量されうるα−アミラーゼ実測値は膵臓型α
−アミラーゼの存在量と極めて高い相関関係をとりうる
ことが判明した。従って本発明のα−アミラーゼ阻害物
質はアミラーゼ分別定量に際して極めて有効かつ簡便な
方法を提供する。
唾液腺型α−アミラーゼを脾臓型のそれよりも強く阻害
するα−アミラーゼ阻害物質を報告し、この物質を利用
した臨床検体中のα−アミラーゼアイソザイムの分別定
量の可能性を示している〔Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ２３， ５６０〜５６６（１９７７）〕。 しかしながらオドンネル氏等の報告したα−アミラーゼ
阻害物質はその電気泳動の易動度において、本物質が０
．５３であるのに対して０．２０であり、著るしく相違
している。また両α−アミラーゼアイソザイムに対する
阻害比が本発明の物質に比してオドンネル氏等のものは
極度に狭く分別定量に好適とは云えない。すなわち、オ
ドンネル氏等のα−アミラーゼ阻害物質の両アミラーゼ
アイソザイムに対する５０％阻害比が高々１００に過ぎ
ないのに対し本物質は２００〜３００の高い阻害比をと
りうる。一例を示せば図１から明らかになるように１５
ＩＵの唾液腺型α−アミラーゼを５０％阻害する本物質
の必要量は約０．３μｇであるのに対して１５ＩＵのヒ
ト膵液α−アミラーゼを５０％阻害するためには本発明
のα−アミラーゼ阻害物質約７０〜８０μｇを必要とし
た。更にヒトの唾液腺型および膵臓型のα−アミラーゼ
の存在量比を変動させた検体に本発明の物質を作用させ
た場合、定量されうるα−アミラーゼ実測値は膵臓型α
−アミラーゼの存在量と極めて高い相関関係をとりうる
ことが判明した。従って本発明のα−アミラーゼ阻害物
質はアミラーゼ分別定量に際して極めて有効かつ簡便な
方法を提供する。
【００１７】以下に本発明のα−アミラーゼ阻害物質の
製造および使用方法を実施例により詳述する。
製造および使用方法を実施例により詳述する。
【００１８】実施例１
小麦粉３ｋｇに精製水９ｌを加えて１時間ゆるやかに撹
拌し、そして遠心分離により上清７ｌを得た。得られた
上清を５００ｍｌに濃縮しそしてこの溶液を７０℃にお
いて３０分加熱処理した。生成した不溶物を遠心分離に
より除去した。得られた透明な上澄み液に最終濃度が６
０％（ｖ／ｖ）になるように無水エタノールを加えそし
て生成した不溶物を遠心分離により除去した。得られた
透明な液に更に濃度が９０％（ｖ／ｖ）になるように無
水エタノールを加え一晩放置して沈殿を形成させた。生
成した沈殿物を遠心分離によって採取し、９９％エタノ
ールで２回洗浄し、そして室温で減圧乾燥した。かくし
て２３ｇの粗α−アミラーゼ阻害物質を得た。
拌し、そして遠心分離により上清７ｌを得た。得られた
上清を５００ｍｌに濃縮しそしてこの溶液を７０℃にお
いて３０分加熱処理した。生成した不溶物を遠心分離に
より除去した。得られた透明な上澄み液に最終濃度が６
０％（ｖ／ｖ）になるように無水エタノールを加えそし
て生成した不溶物を遠心分離により除去した。得られた
透明な液に更に濃度が９０％（ｖ／ｖ）になるように無
水エタノールを加え一晩放置して沈殿を形成させた。生
成した沈殿物を遠心分離によって採取し、９９％エタノ
ールで２回洗浄し、そして室温で減圧乾燥した。かくし
て２３ｇの粗α−アミラーゼ阻害物質を得た。
【００１９】次いで０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に上記粗乾固物を１０％濃度で溶解させ８．５
ｌの樹脂量を含むＤＥＡＥ−セファロースカラムに通塔
してα−アミラーゼ阻害物質を吸着させた。次にこのカ
ラムを最初０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）
１７ｌで洗浄し続いて同じ緩衝液中に０．０Ｍから０．
２Ｍの塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性物質
の溶出を行ない１０．２ｌの溶出液を得た。この溶液を
減圧濃縮して７５ｍｌのα−アミラーゼ阻害物質を含む
液を得た。この液を０．０５Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ
５．０）を用いてセファデックスＧ−７５のゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行ない４１４ｍｌの活性区分を含む
溶液を得た。更に続いてこの液をＣＭ−セファロースに
通し、最初に１．５ｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５
．０）で洗浄し、次いで同じ緩衝液に０．０Ｍより０．
３Ｍの塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性画分
を溶出した。 得られた活性画分５３１ｍｌを減圧濃縮した。得られた
濃縮液をセファデックスＧ−２５ゲル濾過クロマトで脱
塩した後６０９ｍｌの蛋白含有溶出液を得た。得られた
溶液を凍結乾燥して２０ｍｇの乾固物を得た。このもの
は先の理化学的性状に示すとおり分子量ならびに電気泳
動において特異な性状を有する新規なα−アミラーゼ阻
害物質であった。得られたα−アミラーゼ阻害物質のヒ
ト唾液α−アミラーゼおよびヒト膵液α−アミラーゼに
対する５０％阻害比は約２５０：１であった。また阻害
活性は１５０ＡＩＵ／ｍｇ蛋白であった。
８．０）に上記粗乾固物を１０％濃度で溶解させ８．５
ｌの樹脂量を含むＤＥＡＥ−セファロースカラムに通塔
してα−アミラーゼ阻害物質を吸着させた。次にこのカ
ラムを最初０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）
１７ｌで洗浄し続いて同じ緩衝液中に０．０Ｍから０．
２Ｍの塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性物質
の溶出を行ない１０．２ｌの溶出液を得た。この溶液を
減圧濃縮して７５ｍｌのα−アミラーゼ阻害物質を含む
液を得た。この液を０．０５Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ
５．０）を用いてセファデックスＧ−７５のゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行ない４１４ｍｌの活性区分を含む
溶液を得た。更に続いてこの液をＣＭ−セファロースに
通し、最初に１．５ｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５
．０）で洗浄し、次いで同じ緩衝液に０．０Ｍより０．
３Ｍの塩化ナトリウムを連続勾配で含む溶液で活性画分
を溶出した。 得られた活性画分５３１ｍｌを減圧濃縮した。得られた
濃縮液をセファデックスＧ−２５ゲル濾過クロマトで脱
塩した後６０９ｍｌの蛋白含有溶出液を得た。得られた
溶液を凍結乾燥して２０ｍｇの乾固物を得た。このもの
は先の理化学的性状に示すとおり分子量ならびに電気泳
動において特異な性状を有する新規なα−アミラーゼ阻
害物質であった。得られたα−アミラーゼ阻害物質のヒ
ト唾液α−アミラーゼおよびヒト膵液α−アミラーゼに
対する５０％阻害比は約２５０：１であった。また阻害
活性は１５０ＡＩＵ／ｍｇ蛋白であった。
【００２０】実施例２
実施例１で得られたα−アミラーゼ阻害物質１ｍｇを１
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶解した（試験Ａ）。一
方精製したヒト唾液腺型α−アミラーゼ（Ｓ−ＡＭＹ）
と、ヒト膵液から精製したヒト膵臓型α−アミラーゼ（
Ｐ−ＡＭＹ）を、それぞれ５０ｍＭの塩化ナトリウムお
よび０．５ｍＭの塩化カルシウムおよび５％の牛血清ア
ルブミン（フラクションＶ）を含む５０ｍＭの燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）によりそれぞれ１００ｕ／ｌに希釈し
た。次いでＰ−ＡＭＹとＳ−ＡＭＹを表１に示す種々の
割合で混合して３０μｌの検体を調製した。
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶解した（試験Ａ）。一
方精製したヒト唾液腺型α−アミラーゼ（Ｓ−ＡＭＹ）
と、ヒト膵液から精製したヒト膵臓型α−アミラーゼ（
Ｐ−ＡＭＹ）を、それぞれ５０ｍＭの塩化ナトリウムお
よび０．５ｍＭの塩化カルシウムおよび５％の牛血清ア
ルブミン（フラクションＶ）を含む５０ｍＭの燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）によりそれぞれ１００ｕ／ｌに希釈し
た。次いでＰ−ＡＭＹとＳ−ＡＭＹを表１に示す種々の
割合で混合して３０μｌの検体を調製した。
【００２１】
【表１】
【００２２】混合した検体Ｎｏ．１〜９の各３０μｌに
１０μｌの試液Ａを添加混合しこれを室温で３０分間保
温した（予備反応）。次いで自動分析機（アボット社製
型式ＡＢＡ−１００）により酵素法〔第１化学（株）製
アミラーゼ測定キット〕でα−アミラーゼ活性を測定し
た。 なお対照として試験Ａの代りに精製水１０μｌを添加混
合したもののα−アミラーゼ活性を測定した。これから
Ｐ−ＡＭＹおよびＳ−ＡＭＹ両方のα−アミラーゼアイ
ソザイムの分別定量のための検量線を得た（図２参照）
。
１０μｌの試液Ａを添加混合しこれを室温で３０分間保
温した（予備反応）。次いで自動分析機（アボット社製
型式ＡＢＡ−１００）により酵素法〔第１化学（株）製
アミラーゼ測定キット〕でα−アミラーゼ活性を測定し
た。 なお対照として試験Ａの代りに精製水１０μｌを添加混
合したもののα−アミラーゼ活性を測定した。これから
Ｐ−ＡＭＹおよびＳ−ＡＭＹ両方のα−アミラーゼアイ
ソザイムの分別定量のための検量線を得た（図２参照）
。
【００２３】ここで得られた検量線を用いて人血清中の
α−アミラーゼアイソザイムの分別定量を行なう。下記
に示す１１例の人血清各３０μｌについて試液Ａを１０
μｌずつ添加混合しそして室温で３０分間予備反応をさ
せる。これを前記と同様の測定法でα−アミラーゼ活性
を測定する。また対照として１１例の人血清３０μｌに
ついて精製水各１０μｌを添加混合し、そしてそれらの
α−アミラーゼ活性を測定する。その結果は表２のとお
りである。
α−アミラーゼアイソザイムの分別定量を行なう。下記
に示す１１例の人血清各３０μｌについて試液Ａを１０
μｌずつ添加混合しそして室温で３０分間予備反応をさ
せる。これを前記と同様の測定法でα−アミラーゼ活性
を測定する。また対照として１１例の人血清３０μｌに
ついて精製水各１０μｌを添加混合し、そしてそれらの
α−アミラーゼ活性を測定する。その結果は表２のとお
りである。
【００２４】
【表２】
【００２５】本発明のα−アミラーゼ阻害物質を用いる
α−アミラーゼの分別定量法では電気泳動法〔「臨床化
学」第５巻第１１８頁（１９７６）〕に比べて簡易な操
作で迅速にα−アミラーゼの分別定量ができた。
α−アミラーゼの分別定量法では電気泳動法〔「臨床化
学」第５巻第１１８頁（１９７６）〕に比べて簡易な操
作で迅速にα−アミラーゼの分別定量ができた。
【図１】唾液α−アミラーゼおよび膵臓α−アミラーゼ
に対する本発明の物質（ＷＡＩ−５３）の阻害曲線を示
す図である。
に対する本発明の物質（ＷＡＩ−５３）の阻害曲線を示
す図である。
【図２】本発明の物質を使用するα−アミラーゼの分別
定量のための膵臓のアミラーゼ検量曲線を示す図である
。
定量のための膵臓のアミラーゼ検量曲線を示す図である
。
Claims (1)
- 【請求項１】 以下の理化学的性状：１） 水また
は希薄塩溶液に可溶、メタノール、エタノール、アセト
ン、クロロホルムおよびヘキサンに不溶、２） 紫外
吸収Ｅ２７９（１％）＝１２．８（水溶液中１ｃｍ）、
λｍａｘ・２７９ｎｍ ３） 分子量 超遠心法により２３，０００〜２３
，８００、ゲル濾過法により２４，０００、 ４） Ｄａｖｉｓ氏等の方法によるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＡｎｎａｌｓＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２１， ４０４
（１９６４）参照〕における泳動度は０．５３に単一バ
ンドを示す、 ５） Ｏａｔｈ氏等の方法によるＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動〔Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ５０， １９０〜７（１９７３）参照〕においては
分子量１３，０００の単一のバンドを与える、 ６） 蛋白質であり、そのアミノ酸組成は次のものを
含有している：（イソロイシンを２．３３とする）リジ
ン ４．５５
ヒスチジン １．１１
アルギニン ７．６６
アスパラギン酸 ６．９７スレ
オニン ３．４２セリ
ン ６．９４
グルタミン酸 １１．４８プロ
リン ７．７１グ
リシン ９．４１
アラニン １２．０８
バリン ７．
９５イソロイシン ２．３
３ロイシン ８．
１８チロシン ４
．１０フェニルアラニン １．６１
７） ヒト唾液腺および膵臓各アミラーゼとの本物質
の飽和曲線はそれぞれを５０％阻害する本物質の所要量
比が１：２５０以上であることを具備するα−アミラー
ゼ阻害物質を示す。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13325991A JPH04234900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | α−アミラーゼ阻害物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13325991A JPH04234900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | α−アミラーゼ阻害物質 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56018549A Division JPS57140727A (en) | 1981-02-10 | 1981-02-10 | Novel alpha-amylase inhibitor substance |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04234900A true JPH04234900A (ja) | 1992-08-24 |
| JPH0543718B2 JPH0543718B2 (ja) | 1993-07-02 |
Family
ID=15100439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13325991A Granted JPH04234900A (ja) | 1991-05-10 | 1991-05-10 | α−アミラーゼ阻害物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04234900A (ja) |
-
1991
- 1991-05-10 JP JP13325991A patent/JPH04234900A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0543718B2 (ja) | 1993-07-02 |
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