JPH04235998A - ペプチド合成溶媒用の添加剤及びその添加剤を使用したペプチドの合成方法 - Google Patents
ペプチド合成溶媒用の添加剤及びその添加剤を使用したペプチドの合成方法Info
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- JPH04235998A JPH04235998A JP3005253A JP525391A JPH04235998A JP H04235998 A JPH04235998 A JP H04235998A JP 3005253 A JP3005253 A JP 3005253A JP 525391 A JP525391 A JP 525391A JP H04235998 A JPH04235998 A JP H04235998A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド合成の際、ア
ミノ基に結合している保護基の脱落を防止するために、
溶媒に添加する添加剤及びその添加剤を使用したペプチ
ド合成方法に関するものである。
ミノ基に結合している保護基の脱落を防止するために、
溶媒に添加する添加剤及びその添加剤を使用したペプチ
ド合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】異種類のアミノ酸の間でペプチドの化学
合成をした場合、異種類のアミノ酸が所望の順番でペプ
チド鎖を伸長させるとは限らない。そこで一方のアミノ
酸のα−アミノ基を何らかの方法で保護しα−カルボキ
シル基を活性化し、他方のアミノ酸のアミノ基と縮合す
る。さらにペプチド鎖を伸長させるには、この保護基を
何らかの方法で選択的に切断して次のカルボキシル成分
と縮合させればよい。ペプチドの化学合成は、この縮合
と、α−アミノ保護基の選択的除去の二つの操作の繰り
返しでなされる。従って、保護基は必要なときには切断
されなければならないが、それ以外のときには副反応を
防止する意味で強固に結合していなければならない。例
えば縮合反応中に導入するアミノ酸の保護基が切断され
てしまうと、アミノ酸が２量体、３量体の形で結合する
恐れがあり、保存中に保護基が切断されてしまうと反応
性の高いアミノ基が異常反応を起こす恐れもある。いず
れにしても目的のペプチドは得られ難い。特に長鎖ペプ
チドでは反応回数が多くなるので、各段階の反応は高収
率で行なわれないと目的物が得られにくい。
合成をした場合、異種類のアミノ酸が所望の順番でペプ
チド鎖を伸長させるとは限らない。そこで一方のアミノ
酸のα−アミノ基を何らかの方法で保護しα−カルボキ
シル基を活性化し、他方のアミノ酸のアミノ基と縮合す
る。さらにペプチド鎖を伸長させるには、この保護基を
何らかの方法で選択的に切断して次のカルボキシル成分
と縮合させればよい。ペプチドの化学合成は、この縮合
と、α−アミノ保護基の選択的除去の二つの操作の繰り
返しでなされる。従って、保護基は必要なときには切断
されなければならないが、それ以外のときには副反応を
防止する意味で強固に結合していなければならない。例
えば縮合反応中に導入するアミノ酸の保護基が切断され
てしまうと、アミノ酸が２量体、３量体の形で結合する
恐れがあり、保存中に保護基が切断されてしまうと反応
性の高いアミノ基が異常反応を起こす恐れもある。いず
れにしても目的のペプチドは得られ難い。特に長鎖ペプ
チドでは反応回数が多くなるので、各段階の反応は高収
率で行なわれないと目的物が得られにくい。
【０００３】このようなペプチドの化学合成は、溶液状
態でなされる液相法、または不溶性担体上で順次ペプチ
ド鎖を伸長していく固相法で行なわれる。これら合成に
使用する溶媒としては試薬の溶解性、反応性に優れたＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドなどが挙げられる。
態でなされる液相法、または不溶性担体上で順次ペプチ
ド鎖を伸長していく固相法で行なわれる。これら合成に
使用する溶媒としては試薬の溶解性、反応性に優れたＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドなどが挙げられる。
【０００４】アミノ酸の保護基としては、酸で切断され
るｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ、以下Ｂｏｃと記す）基、または塩基
で切断される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ、以下Ｆｍｏｃと記す）基の二つが使用されて
いる。それぞれの保護基をα−アミノ保護基に使用する
ペプチド合成方法は、Ｂｏｃ法及びＦｍｏｃ法と呼ばれ
る。Ｆｍｏｃ法は、Ｂｏｃ法に比べて以下のような利点
を持っているので、最近ではペプチド合成でＦｍｏｃ法
がよく使用されている。すなわちＦｍｏｃ法は、トリプ
トファンのように酸に不安定なアミノ酸をもつペプチド
合成でＢｏｃ法より有利である。また、合成の最終段階
で全保護基を除去するにあたり、トリフルオロ酢酸によ
る処理のような温和な酸処理で切断される側鎖保護基や
、固相法で使用される樹脂を使用することができ、Ｂｏ
ｃ法のようにフッ化水素のような強酸を必要とする方法
より副反応の起こる可能性が少ない。
るｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ、以下Ｂｏｃと記す）基、または塩基
で切断される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ、以下Ｆｍｏｃと記す）基の二つが使用されて
いる。それぞれの保護基をα−アミノ保護基に使用する
ペプチド合成方法は、Ｂｏｃ法及びＦｍｏｃ法と呼ばれ
る。Ｆｍｏｃ法は、Ｂｏｃ法に比べて以下のような利点
を持っているので、最近ではペプチド合成でＦｍｏｃ法
がよく使用されている。すなわちＦｍｏｃ法は、トリプ
トファンのように酸に不安定なアミノ酸をもつペプチド
合成でＢｏｃ法より有利である。また、合成の最終段階
で全保護基を除去するにあたり、トリフルオロ酢酸によ
る処理のような温和な酸処理で切断される側鎖保護基や
、固相法で使用される樹脂を使用することができ、Ｂｏ
ｃ法のようにフッ化水素のような強酸を必要とする方法
より副反応の起こる可能性が少ない。
【０００５】図１はＦｍｏｃ基を使用したペプチドの合
成経路を示している。図１において使用する異種類のア
ミノ酸はＡとＢの２種類であり、目的とするペプチドは
Ａ−Ｂである。図１でＢアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏ
ｃ基により保護されている。このＢアミノ酸のカルボキ
シル基は、樹脂に結合することにより他のアミノ基と反
応しないように保護されていて、合成終了までこの結合
は離れない。次に、Ｂアミノ酸中のアミノ基を保護して
いるＦｍｏｃ基は、ピペリジンを２０％含有した溶媒中
で除去される。Ａアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏｃ基に
より保護されている。溶媒中でＡアミノ酸の活性化した
カルボキシル基と、Ｂアミノ酸中のアミノ基とを縮合さ
せて結合する。このＡアミノ酸とＢアミノ酸の縮合反応
を繰り返してペプチドＡ−Ｂを生成する。そして、最後
にＡアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基と
、Ｂアミノ酸中のカルボキシル基に結合している樹脂を
脱離させて、所望のペプチドが得られる。
成経路を示している。図１において使用する異種類のア
ミノ酸はＡとＢの２種類であり、目的とするペプチドは
Ａ−Ｂである。図１でＢアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏ
ｃ基により保護されている。このＢアミノ酸のカルボキ
シル基は、樹脂に結合することにより他のアミノ基と反
応しないように保護されていて、合成終了までこの結合
は離れない。次に、Ｂアミノ酸中のアミノ基を保護して
いるＦｍｏｃ基は、ピペリジンを２０％含有した溶媒中
で除去される。Ａアミノ酸中のアミノ基はＦｍｏｃ基に
より保護されている。溶媒中でＡアミノ酸の活性化した
カルボキシル基と、Ｂアミノ酸中のアミノ基とを縮合さ
せて結合する。このＡアミノ酸とＢアミノ酸の縮合反応
を繰り返してペプチドＡ−Ｂを生成する。そして、最後
にＡアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基と
、Ｂアミノ酸中のカルボキシル基に結合している樹脂を
脱離させて、所望のペプチドが得られる。
【０００６】前記Ｆｍｏｃ法では合成用溶媒としてＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミドやＮ−メチル−２−ピロリド
ンを使用するのが一般的である。
Ｎ−ジメチルホルムアミドやＮ−メチル−２−ピロリド
ンを使用するのが一般的である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】前記のペプチド合成中
において、Ａアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍ
ｏｃ基が脱離すると前記した副反応を生じてＡ−Ａ−Ｂ
、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂのような不純なペプチドが生成される
ことになる。従って、ペプチド合成中においては、Ａア
ミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基が安定に
保持されなければならない。
において、Ａアミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍ
ｏｃ基が脱離すると前記した副反応を生じてＡ−Ａ−Ｂ
、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂのような不純なペプチドが生成される
ことになる。従って、ペプチド合成中においては、Ａア
ミノ酸中のアミノ基に結合しているＦｍｏｃ基が安定に
保持されなければならない。
【０００８】本発明者らは前記の溶媒を用いると縮合反
応の間は保持されていなければならないＡアミノ酸中の
アミノ基に結合したＦｍｏｃ基が脱離し、不純なペプチ
ドを生成してしまうことを発見した。このＦｍｏｃ基脱
離による副反応は合成サイクルすべてに係ってくるため
、それによって生じる不純ペプチドは合成サイクルの数
を基準にすると指数関数的に増加する。従ってこの副反
応は、これまで長鎖ペプチドの合成が困難だった原因の
中でも極めて重要なものであることが判明した。ペプチ
ド鎖が長くなりアミノ酸残基の増加に伴って高純度のペ
プチドを得ることが困難になる。
応の間は保持されていなければならないＡアミノ酸中の
アミノ基に結合したＦｍｏｃ基が脱離し、不純なペプチ
ドを生成してしまうことを発見した。このＦｍｏｃ基脱
離による副反応は合成サイクルすべてに係ってくるため
、それによって生じる不純ペプチドは合成サイクルの数
を基準にすると指数関数的に増加する。従ってこの副反
応は、これまで長鎖ペプチドの合成が困難だった原因の
中でも極めて重要なものであることが判明した。ペプチ
ド鎖が長くなりアミノ酸残基の増加に伴って高純度のペ
プチドを得ることが困難になる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ようなＦｍｏｃ基脱離による副反応を起こす原因につい
て究明した。その結果、Ｆｍｏｃ基がルイス塩基によっ
て脱離されることから考察し、溶媒そのものの塩基性が
その最大の要因であることが解った。なお、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを溶媒とした場合は、水分によりギ
酸とジメチルアミンに分解することが知られているので
、このジメチルアミンがＦｍｏｃ基脱離の原因ではない
かとも考えられた。しかし水分含量及びジメチルアミン
ともにＦｍｏｃ基脱離の主要原因ではないことが確認で
きた。
ようなＦｍｏｃ基脱離による副反応を起こす原因につい
て究明した。その結果、Ｆｍｏｃ基がルイス塩基によっ
て脱離されることから考察し、溶媒そのものの塩基性が
その最大の要因であることが解った。なお、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを溶媒とした場合は、水分によりギ
酸とジメチルアミンに分解することが知られているので
、このジメチルアミンがＦｍｏｃ基脱離の原因ではない
かとも考えられた。しかし水分含量及びジメチルアミン
ともにＦｍｏｃ基脱離の主要原因ではないことが確認で
きた。
【００１０】そこで本発明者らは、以下の二通りの考え
で溶媒の塩基性を緩和することを試みた。
で溶媒の塩基性を緩和することを試みた。
【００１１】一つは合成用溶媒として塩基性のない、他
の溶媒を探索することである。メチルセロソルブ、カル
ビトール、ジグライム、テトラメチル尿素が副反応を起
こさない溶媒であるが、合成に使用する保護アミノ酸の
溶解性が良くないのでこの方法は不適当である。
の溶媒を探索することである。メチルセロソルブ、カル
ビトール、ジグライム、テトラメチル尿素が副反応を起
こさない溶媒であるが、合成に使用する保護アミノ酸の
溶解性が良くないのでこの方法は不適当である。
【００１２】二つ目の方法は、添加剤を加えることによ
ってＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−
ピロリドンの塩基性を抑制し、Ｆｍｏｃ基脱離を防ごう
というものである。検討した結果、ルイス酸の添加が有
効であることがわかり、例えばＮ−ヒドロキシベンゾト
リアゾールやＮ−ヒドロキシサクシンイミドはこの目的
に使用する添加剤として優れた試薬であることを見い出
した。
ってＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−
ピロリドンの塩基性を抑制し、Ｆｍｏｃ基脱離を防ごう
というものである。検討した結果、ルイス酸の添加が有
効であることがわかり、例えばＮ−ヒドロキシベンゾト
リアゾールやＮ−ヒドロキシサクシンイミドはこの目的
に使用する添加剤として優れた試薬であることを見い出
した。
【００１３】前記の知見の下になされた本発明のペプチ
ド合成溶媒用の添加剤は、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロ
キシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベ
ンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤
である。アミノ基が保護基に結合している第１のアミノ
酸中のカルボキシル基と第２のアミノ酸中のアミノ基と
を結合させてペプチドを合成する際、第１のアミノ酸を
溶解しているルイス塩基性溶媒に添加され、アミノ基が
保護基から外れることを防止する。
ド合成溶媒用の添加剤は、１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロ
キシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベ
ンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤
である。アミノ基が保護基に結合している第１のアミノ
酸中のカルボキシル基と第２のアミノ酸中のアミノ基と
を結合させてペプチドを合成する際、第１のアミノ酸を
溶解しているルイス塩基性溶媒に添加され、アミノ基が
保護基から外れることを防止する。
【００１４】前記したアミノ基の保護基は、９−フルオ
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
【００１５】前記したルイス塩基性溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチ
ル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミ
ドから選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチ
ル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミ
ドから選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。
【００１６】同じく本発明のペプチド合成溶媒用の添加
剤を使用したペプチド合成方法は、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３
−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２
，３−ベンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類
の添加剤を添加したルイス塩基性溶媒中に、アミノ基が
保護基に結合している第１のアミノ酸を溶解する。次に
、その第１のアミノ酸中のカルボキシル基を第２のアミ
ノ酸のアミノ基と結合させて後、第１のアミノ酸中のア
ミノ基に結合した保護基を外すのである。
剤を使用したペプチド合成方法は、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３
−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２
，３−ベンゾトリアジンから選ばれる少なくとも１種類
の添加剤を添加したルイス塩基性溶媒中に、アミノ基が
保護基に結合している第１のアミノ酸を溶解する。次に
、その第１のアミノ酸中のカルボキシル基を第２のアミ
ノ酸のアミノ基と結合させて後、第１のアミノ酸中のア
ミノ基に結合した保護基を外すのである。
【００１７】前記したアミノ基の保護基は、９−フルオ
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。
【００１８】前記のルイス塩基性溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒である。
【００１９】前記の添加剤が１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールであるときは、その添加量は前記溶媒１リット
ル中、少なくとも０．５ミリモル必要である。
アゾールであるときは、その添加量は前記溶媒１リット
ル中、少なくとも０．５ミリモル必要である。
【００２０】前記の添加剤がＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドであるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中
、少なくとも１００ミリモル必要である。
ミドであるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中
、少なくとも１００ミリモル必要である。
【００２１】前記の添加剤が３−ヒドロキシ−３，４−
ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
であるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中、少
なくとも０．５ミリモルで必要である。
ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
であるときは、その添加量は前記溶媒１リットル中、少
なくとも０．５ミリモルで必要である。
【００２２】ペプチドのＦｍｏｃ合成法で、溶媒中に添
加剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒ
ドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３
−ベンゾトリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、
またはこれらの混合物を加えることにより、Ｆｍｏｃ基
の脱離を抑制することができる。
加剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒ
ドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３
−ベンゾトリアジン、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、
またはこれらの混合物を加えることにより、Ｆｍｏｃ基
の脱離を抑制することができる。
【００２３】前記添加剤の添加量は、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールでは０．５ミリモル以上で効果が認め
られ、１ミリモルで実用レベルにおいて有効であるが、
１ミリモル以上添加しても効果は同じである。また、Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドでは１００ミリモル以上で
効果が認められ、１０００ミリモルで実用レベルで有効
であるが、１０００ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキ
ソ−１，２，３−ベンゾトリアジンでは０．５ミリモル
以上で効果が認められ、１ミリモルで実用レベルにおい
て有効であるが、１ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。これらの添加剤はラセミ化抑制剤として、これ
までペプチドの合成で常用されてきた試薬であり、この
添加剤を加えることによって合成反応に支障をきたす恐
れはない。
ンゾトリアゾールでは０．５ミリモル以上で効果が認め
られ、１ミリモルで実用レベルにおいて有効であるが、
１ミリモル以上添加しても効果は同じである。また、Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドでは１００ミリモル以上で
効果が認められ、１０００ミリモルで実用レベルで有効
であるが、１０００ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキ
ソ−１，２，３−ベンゾトリアジンでは０．５ミリモル
以上で効果が認められ、１ミリモルで実用レベルにおい
て有効であるが、１ミリモル以上添加しても効果は同じ
である。これらの添加剤はラセミ化抑制剤として、これ
までペプチドの合成で常用されてきた試薬であり、この
添加剤を加えることによって合成反応に支障をきたす恐
れはない。
【００２４】アミノ酸誘導体のα−カルボキシル基の活
性化中間体として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエ
ステルを経由する縮合反応もよく知られている。この方
法を用いた反応では１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
が生成物として溶液中に放出され、アミノ酸のペンタフ
ルオロフェニルエステルと触媒として１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを当量加える方法がある。しかし、こ
の量だけでは高純度のペプチドが得られず、やはりこれ
以外に添加する必要がある。
性化中間体として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエ
ステルを経由する縮合反応もよく知られている。この方
法を用いた反応では１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
が生成物として溶液中に放出され、アミノ酸のペンタフ
ルオロフェニルエステルと触媒として１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールを当量加える方法がある。しかし、こ
の量だけでは高純度のペプチドが得られず、やはりこれ
以外に添加する必要がある。
【００２５】
【発明の効果】本発明のペプチド合成溶媒用の添加剤を
加えることにより、ペプチドの合成のためにアミノ酸の
アミノ基に結合した保護基の脱離を防止することができ
る。従って長鎖のペプチドの合成や全自動合成機を用い
たペプチド合成のように、溶媒中に保護基に結合したア
ミノ酸を長時間放置するような場合でも、その間、保護
基が脱離することなく副反応が防止できるので、純度が
高いペプチドを得ることができる。
加えることにより、ペプチドの合成のためにアミノ酸の
アミノ基に結合した保護基の脱離を防止することができ
る。従って長鎖のペプチドの合成や全自動合成機を用い
たペプチド合成のように、溶媒中に保護基に結合したア
ミノ酸を長時間放置するような場合でも、その間、保護
基が脱離することなく副反応が防止できるので、純度が
高いペプチドを得ることができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。
【００２７】実施例１
図１において、Ｂに相当するアミノ酸にグリシン（Ｇｌ
ｙ）を使用し、グリシンのＮ末端アミノ基をＦｍｏｃ基
で保護する（以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂と記す。ま
た、以下の実験例でもこのような結合物質を同様に表す
）。グリシンはα−アミノ保護基としてのＦｍｏｃ基が
他のアミノ酸と比べて最も切断されやすく、比較するモ
デルとして適当である。
ｙ）を使用し、グリシンのＮ末端アミノ基をＦｍｏｃ基
で保護する（以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂と記す。ま
た、以下の実験例でもこのような結合物質を同様に表す
）。グリシンはα−アミノ保護基としてのＦｍｏｃ基が
他のアミノ酸と比べて最も切断されやすく、比較するモ
デルとして適当である。
【００２８】８５ｍｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂に、以
下の溶媒を加えて前記の試料を三個調整した。第１の試
料は０．５ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを８０ミリリットル、第２の試料は
１ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールを添加したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８
０ミリリットル加えた。第３の試料は比較として添加剤
を全く加えないＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８０ミ
リリットル加えた。
下の溶媒を加えて前記の試料を三個調整した。第１の試
料は０．５ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドを８０ミリリットル、第２の試料は
１ミリモル濃度となるように１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールを添加したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８
０ミリリットル加えた。第３の試料は比較として添加剤
を全く加えないＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを８０ミ
リリットル加えた。
【００２９】切断されて溶媒中に遊離したＦｍｏｃ基に
由来する３０４ｎｍの吸光度を測定することにより、Ｆ
ｍｏｃ基の溶媒中における安定性を経時的に調べた。同
様にして２０％のピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド中でＦｍｏｃ基を完全に切断したときの３０
４ｎｍの吸光度を１００としてＦｍｏｃ切断の割合を計
算した。図２にその結果を示してある。
由来する３０４ｎｍの吸光度を測定することにより、Ｆ
ｍｏｃ基の溶媒中における安定性を経時的に調べた。同
様にして２０％のピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド中でＦｍｏｃ基を完全に切断したときの３０
４ｎｍの吸光度を１００としてＦｍｏｃ切断の割合を計
算した。図２にその結果を示してある。
【００３０】前記の溶媒としてジメチルスルホキシド、
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドを使用した場合も同様に１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの添加効果が確かめられた。
Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホル
トリアミドを使用した場合も同様に１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの添加効果が確かめられた。
【００３１】また、前記溶媒のグレードを変えて１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールの添加効果を調べた。市販
のペプチド合成グレードＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、特
級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）及び
一級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）の
各溶媒を使用して上記と同様にして行なったが、どのグ
レードの溶媒においても１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールの添加効果が確認された。
ドロキシベンゾトリアゾールの添加効果を調べた。市販
のペプチド合成グレードＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、特
級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）及び
一級Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬社製）の
各溶媒を使用して上記と同様にして行なったが、どのグ
レードの溶媒においても１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールの添加効果が確認された。
【００３２】実施例２
グリシン（Ｇｌｙ）とロイシン（Ｌｅｕ） を使用し、
アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ− 樹脂と記す）
をモデルペプチドとして選んだ。ロイシンは、アミノ酸
分析の際の基準とするためである。Ｆｍｏｃ固相合成法
で、溶媒として１ミリモル濃度となるように１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用し、図１のＢに相当す
るＨ２ Ｎ−Ｌｅｕ−樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を０．２５ミリモルと、Ａに相当す
るＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰＦＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ 社製）を０．５ミリモルと、それと当量の１−
ヒドロキシベンゾトリアゾールを加え、カップリング反
応を室温で８時間行なった。Ｆｍｏｃ基の除去を２０％
ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で行な
い、Ｈ２ Ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−樹脂を得た。この操作
を繰り返してアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ−
樹脂と記す）を調製した。合成した（Ｇ）１０Ｌ− 樹
脂を塩酸で１１０℃、２４時間加水分解後、アミノ酸分
析計でアミノ酸組成を調べた。
アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ− 樹脂と記す）
をモデルペプチドとして選んだ。ロイシンは、アミノ酸
分析の際の基準とするためである。Ｆｍｏｃ固相合成法
で、溶媒として１ミリモル濃度となるように１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（同仁化学製）を添加したＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用し、図１のＢに相当す
るＨ２ Ｎ−Ｌｅｕ−樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を０．２５ミリモルと、Ａに相当す
るＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰＦＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ 社製）を０．５ミリモルと、それと当量の１−
ヒドロキシベンゾトリアゾールを加え、カップリング反
応を室温で８時間行なった。Ｆｍｏｃ基の除去を２０％
ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で行な
い、Ｈ２ Ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−樹脂を得た。この操作
を繰り返してアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ であるペプチド樹脂（（Ｇ）１０Ｌ−
樹脂と記す）を調製した。合成した（Ｇ）１０Ｌ− 樹
脂を塩酸で１１０℃、２４時間加水分解後、アミノ酸分
析計でアミノ酸組成を調べた。
【００３３】アミノ酸分析の結果は、Ｌｅｕ（１）：１
．００ 、Ｇｌｙ（１０）：１０．３７ であり、カッ
プリング反応中にＦｍｏｃ基が殆ど脱離されなかったこ
とを示している。
．００ 、Ｇｌｙ（１０）：１０．３７ であり、カッ
プリング反応中にＦｍｏｃ基が殆ど脱離されなかったこ
とを示している。
【００３４】比較例１
実施例１の第３の試料の場合と同様の実験を、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド以外の溶媒について行なった。溶
媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの他、ジメチルスル
ホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、及びヘキサメ
チルホスホルトリアミドについて同様に行なった。図３
にその結果を示す。
ジメチルホルムアミド以外の溶媒について行なった。溶
媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの他、ジメチルスル
ホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、及びヘキサメ
チルホスホルトリアミドについて同様に行なった。図３
にその結果を示す。
【００３５】比較例２
比較例１で溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを
使用したものについて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に水１％加えて同様にして行ない、Ｆｍｏｃ基切断と水
分の関係を調べた。
使用したものについて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に水１％加えて同様にして行ない、Ｆｍｏｃ基切断と水
分の関係を調べた。
【００３６】Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは水の存在
によりギ酸とジメチルアミンに分解することが知られて
いる。Ｆｍｏｃ基は塩基により切断されるのでこのジメ
チルアミンが原因ではないかと考えられるので、水分に
よるＦｍｏｃ基切断の影響を調べることがこの実験の目
的である。水の添加量を１％としたのは、通常、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドに含まれる水分は１％未満であ
り水分の影響を調べるには十分な量であると考えられる
ためである。
によりギ酸とジメチルアミンに分解することが知られて
いる。Ｆｍｏｃ基は塩基により切断されるのでこのジメ
チルアミンが原因ではないかと考えられるので、水分に
よるＦｍｏｃ基切断の影響を調べることがこの実験の目
的である。水の添加量を１％としたのは、通常、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドに含まれる水分は１％未満であ
り水分の影響を調べるには十分な量であると考えられる
ためである。
【００３７】Ｆｍｏｃ基切断の程度は、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドのみの系とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドに水１％を加えた系とでは差は認められなかった。従
って、Ｆｍｏｃ基の切断は水分によるものではないこと
がわかった。
ルホルムアミドのみの系とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドに水１％を加えた系とでは差は認められなかった。従
って、Ｆｍｏｃ基の切断は水分によるものではないこと
がわかった。
【００３８】また、ジメチルアミンの定量を常法により
、ジニトロフルオロベンゼンを使用し、３８１ｎｍの吸
光度を測定して行なった。実験中、ジメチルアミンは僅
かに増加するが、Ｆｍｏｃ基切断とは比例関係にはなか
った。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのみの系と
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに水１％を加えた系と
を比較してもジメチルアミンの発生量に差は殆ど認めら
れなかった。この結果は、ジメチルアミンの存在がＦｍ
ｏｃ基切断の直接的な要因ではないことを示している。
、ジニトロフルオロベンゼンを使用し、３８１ｎｍの吸
光度を測定して行なった。実験中、ジメチルアミンは僅
かに増加するが、Ｆｍｏｃ基切断とは比例関係にはなか
った。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのみの系と
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに水１％を加えた系と
を比較してもジメチルアミンの発生量に差は殆ど認めら
れなかった。この結果は、ジメチルアミンの存在がＦｍ
ｏｃ基切断の直接的な要因ではないことを示している。
【００３９】比較例３
実施例２において溶媒として、１−ヒドロキシベンゾト
リアゾールを全く添加していないＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミドを使用した他は、カップリングを同様にして行
なった。アミノ酸分析の結果は、Ｌｅｕ（１）：１．０
０ 、Ｇｌｙ（１０）：１１．１７ であり、カップリ
ング反応中にＦｍｏｃ基が脱離したため、目的数以上の
アミノ酸が導入されたと考えられる。なお、ペンタフル
オロフェニル／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの効
果は現れていない。
リアゾールを全く添加していないＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミドを使用した他は、カップリングを同様にして行
なった。アミノ酸分析の結果は、Ｌｅｕ（１）：１．０
０ 、Ｇｌｙ（１０）：１１．１７ であり、カップリ
ング反応中にＦｍｏｃ基が脱離したため、目的数以上の
アミノ酸が導入されたと考えられる。なお、ペンタフル
オロフェニル／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの効
果は現れていない。
【図１】保護基を使用したペプチドの合成経路を示す図
である。
である。
【図２】本発明の添加剤を溶媒に添加した場合にアミノ
酸から脱離した保護基の量を示す図である。
酸から脱離した保護基の量を示す図である。
【図３】溶媒に添加剤を添加しない場合にアミノ酸から
脱離した保護基の量を示す図である。
脱離した保護基の量を示す図である。
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＨＯＢＴは１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＭＳＯはジメチル
スルホキシド、ＮＭＰはＮ−メチル−２−ピロリドン、
ＨＭＰＡはヘキサメチルホスホルトリアミドである。
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＭＳＯはジメチル
スルホキシド、ＮＭＰはＮ−メチル−２−ピロリドン、
ＨＭＰＡはヘキサメチルホスホルトリアミドである。
Claims (9)
- 【請求項１】 １−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロキシ−３
，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリ
アジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤であって
、アミノ基が保護基に結合している第１のアミノ酸中の
カルボキシル基と第２のアミノ酸中のアミノ基と結合さ
せてペプチドを合成する際の、第１のアミノ酸を溶解し
ているルイス塩基性溶媒に添加され、該保護基がアミノ
基から外れることを防止するペプチド合成溶媒用の添加
剤。 - 【請求項２】 前記保護基が９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル基であることを特徴とする請求項１に
記載のペプチド合成溶媒用の添加剤。 - 【請求項３】 前記ルイス塩基性溶媒がＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒であることを特徴
とする請求項１に記載のペプチド合成溶媒用の添加剤。 - 【請求項４】 １−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド及び３−ヒドロキシ−３
，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリ
アジンから選ばれる少なくとも１種類の添加剤を添加し
たルイス塩基性溶媒中に、アミノ基が保護基に結合して
いる第１のアミノ酸を溶解し、その第１のアミノ酸中の
カルボキシル基を第２のアミノ酸のアミノ基と結合させ
て後、第１のアミノ酸中のアミノ基に結合した保護基を
外すことを特徴とするペプチドの合成方法。 - 【請求項５】 前記保護基が９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル基であることを特徴とする請求項４に
記載のペプチドの合成方法。 - 【請求項６】 前記ルイス塩基性溶媒がＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル
−２−ピロリドン及びヘキサメチルホスホルトリアミド
から選ばれる少なくとも１種類の溶媒であることを特徴
とする請求項４に記載のペプチドの合成方法。 - 【請求項７】 前記添加剤が１−ヒドロキシベンゾト
リアゾールであり、その添加量が前記溶媒１リットル中
、少なくとも０．５ミリモルであることを特徴とする請
求項４に記載のペプチドの合成方法。 - 【請求項８】 前記添加剤がＮ−ヒドロキシサクシン
イミドであり、その添加量が前記溶媒１リットル中、少
なくとも１００ミリモルであることを特徴とする請求項
４に記載のペプチドの合成方法。 - 【請求項９】 前記添加剤が３−ヒドロキシ−３，４
−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジ
ンであり、その添加量が前記溶媒１リットル中、少なく
とも０．５ミリモルであることを特徴とする請求項４に
記載のペプチドの合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3005253A JPH04235998A (ja) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | ペプチド合成溶媒用の添加剤及びその添加剤を使用したペプチドの合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3005253A JPH04235998A (ja) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | ペプチド合成溶媒用の添加剤及びその添加剤を使用したペプチドの合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04235998A true JPH04235998A (ja) | 1992-08-25 |
Family
ID=11606056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3005253A Pending JPH04235998A (ja) | 1991-01-21 | 1991-01-21 | ペプチド合成溶媒用の添加剤及びその添加剤を使用したペプチドの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04235998A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2357755A (en) * | 1999-10-14 | 2001-07-04 | Brad Chem Technology Ltd | Corrosion inhibiting formulations |
-
1991
- 1991-01-21 JP JP3005253A patent/JPH04235998A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2357755A (en) * | 1999-10-14 | 2001-07-04 | Brad Chem Technology Ltd | Corrosion inhibiting formulations |
| GB2357755B (en) * | 1999-10-14 | 2003-09-10 | Brad Chem Technology Ltd | Improvements in and relating to corrosion inhibiting formulations |
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